Summary
Denne artikel beskriver, hvordan man 3D bioprinter fototjusterbare hydrogeler for at studere ekstracellulær matrixafstivning og fibroblastaktivering.
Abstract
Fototjusterbare hydrogeler kan transformere rumligt og tidsmæssigt som reaktion på lyseksponering. Inkorporering af disse typer biomaterialer i cellekulturplatforme og dynamisk udløsende ændringer, såsom øget mikromiljømæssig stivhed, gør det muligt for forskere at modellere ændringer i den ekstracellulære matrix (ECM), der opstår under fibrotisk sygdomsprogression. Heri præsenteres en metode til 3D-bioprint af et fototunable hydrogelbiomateriale, der er i stand til to sekventielle polymerisationsreaktioner i et gelatinestøttebad. Teknikken med Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels (FRESH) bioprint blev tilpasset ved at justere pH i støttebadet for at lette en Michael-additionsreaktion. Først blev bioblækket indeholdende poly(ethylenglycol)-alfamethacrylat (PEGαMA) omsat off-støkiometri med en cellenedbrydelig tværbinding til dannelse af bløde hydrogeler. Disse bløde hydrogeler blev senere udsat for fotoinitator og lys for at inducere homopolymerisation af ureagerede grupper og stive hydrogelen. Denne protokol dækker hydrogelsyntese, 3D-bioprint, fotostiffening og slutpunktskarakteriseringer til vurdering af fibroblastaktivering inden for 3D-strukturer. Metoden, der præsenteres her, gør det muligt for forskere at 3D-bioprinte en række materialer, der gennemgår pH-katalyserede polymerisationsreaktioner og kunne implementeres for at konstruere forskellige modeller af vævshomeostase, sygdom og reparation.
Introduction
3D-bioprint er en transformativ teknologi, der gør det muligt for forskere præcist at deponere celler og biomaterialer inden for 3D-volumener og genskabe den komplekse hierarkiske struktur af biologisk væv. I løbet af det sidste årti har fremskridt inden for 3D-bioprint skabt bankende humant hjertevæv1, funktionelle modeller af nyrevæv2, modeller for gasudveksling i lungen3 og tumormodeller til kræftforskning4. Opfindelsen af indlejrede 3D-bioprintteknikker, såsom Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogel (FRESH) bioprinting, har gjort det muligt at reproducere komplekse bløddelsstrukturer såsom lungeblodkar5 og endda menneskehjerte6 i 3D. FRESH 3D-bioprinting letter lag-for-lag-udskrivning af blødt bioblæk med lav viskositet gennem ekstrudering i et forskydningsfortyndende støttebad. Støttebadet består af et materiale såsom tæt pakkede gelatinemikropartikler, der fungerer som en Bingham-plast og opretholder den tilsigtede form og struktur af bioblækket efter udskrivning. Når den trykte konstruktion er størknet, kan støttebadet opløses væk ved at øge temperaturen til 37 °C7.
En nylig oversigtsartikel opsummerede de materialer, der er blevet 3D-bioprintet i forskellige publikationer ved hjælp af FRESH-teknik. Disse naturligt afledte materialer spænder fra kollagen type I til methacryleret hyaluronsyre og repræsenterer flere forskellige geleringsmekanismer7. De fleste forskningsundersøgelser udført ved hjælp af denne 3D-bioprintteknik anvender statiske biomaterialer, der ikke ændres som reaktion på eksterne stimuli. Dynamiske fototunable hydrogel biomaterialer er blevet brugt af vores laboratorium og andre 8,9,10,11,12 til at modellere en række fibrotiske sygdomme. I modsætning til statiske biomaterialer giver fototjusterbare bioblæk mulighed for at skabe en blødgjort model med lavere elastisk modulværdi og senere stivne for at udforske cellulære reaktioner på stigninger i mikromiljømæssig afstivning.
Fibrotiske sygdomme er kendetegnet ved en stigning i den ekstracellulære matrixproduktion, der kan forårsage ardannelse og stivhed13. Vævsafstivning kan indlede yderligere skade og ødelæggelse af det påvirkede væv, hvilket forårsager permanent organskade og endda død; Fibrotiske lidelser er ansvarlige for en tredjedel af dødeligheden på verdensplan. Fibroblaster producerer overskydende og afvigende ekstracellulær matrix i denne sygdomstilstand14,15. Øget fibroblastproliferation og ekstracellulær matrixaflejring stiver vævet yderligere og aktiverer en profibrotisk positiv feedback-sløjfe16,17,18,19. At studere fibroblastaktivering er afgørende for at forstå fibrotiske sygdomme. Her præsenterer vi human pulmonal arteriel hypertension (PAH) som et eksempel på en fibrotisk lidelse, hvor det er vigtigt at efterligne blodkarets 3D-geometri ved hjælp af 3D-bioprint og introducere de dynamiske afstivningsevner hos fototjusterbare hydrogeler. PAH er en tilstand, hvor trykket i de vigtigste lungearterier overstiger normale niveauer og lægger pres på hjertet, øger human pulmonal arterie adventitial fibroblast (HPAAF) aktivering og stiver blodkarrenevæv 16,17,18,19. En fototunable poly(ethylenglycol)-alpha methacrylat (PEGαMA) bioink-formulering giver mulighed for tidsmæssig afstivning i konstruktioner og hjælper med at modellere både sundt væv og sygdomsprogression 5,8,9,10. Udnyttelse af denne unikke funktion muliggør kvantificering af HPAAF-aktivering og spredning som reaktion på mikromiljømæssig afstivning i 3D og kan give værdifuld indsigt i de cellulære mekanismer, der er involveret i denne sygdom. Protokollen beskrevet her vil give forskere mulighed for at oprette 3D-modeller, der rekapitulerer ændringer i det ekstracellulære mikromiljø under sygdomsprogression eller vævsreparation og studerer fibroblastaktivering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. PEGαMA syntese og karakterisering
BEMÆRK: Poly(ethylenglycol)-alfamethacrylat (PEGαMA) syntese blev tilpasset fra Hewawasam et al . og udført under fugtfrie forhold9.
- Væg reaktanterne.
BEMÆRK: Afvej f.eks. 5 g 10 kg/mol 8-armet PEG-hydroxyl (PEG-OH) og 0,38 g natriumhydrid (NaH) (se materialetabel). - Tilsæt en rørestang til 250 ml Schlenk-kolbe og rens med argon.
- PEG-OH opløses i den laveste mængde vandfri tetrahydrofuran (THF), der kræves til opløsning i Schlenk-kolben.
BEMÆRK: Ca. 80 ml THF opløser 5 g PEG-OH. Tilsæt den minimale mængde THF, der kræves for at opløse PEG-OH. - Tilsæt 3 gange molært overskydende NaH til reaktionsblandingen og rør ved stuetemperatur (RT) i 30 minutter.
- Tilsæt 6 gange molært overskydende ethyl-2-(brommethyl)acrylat (EBrMA, se materialetabel) dråbevis til Schlenk-kolben og dæk reaktionsbeholderen med aluminiumsfolie for at beskytte den mod lys. Reaktionen omrøres ved stuetemperatur i ca. 48 timer.
BEMÆRK: For 5 g PEG-OH og 0,38 g NaH skal du bruge 3,68 ml EBrMA til denne reaktion. - Tilsæt et par dråber 1 N eddikesyre for at slukke reaktionen. Vakuumfiltrer opløsningen gennem et filtreringshjælpemiddel.
BEMÆRK: Tilsætning af eddikesyre vil producere gasbobler. Stop med at tilføje eddikesyredråber, når bobler holder op med at dannes, da dette indikerer, at blandingen er blevet slukket med succes. - Filtratet koncentreres på en rotationsfordamper og bundfældes i 4 °C diethylether. Lad bundfaldet være beskyttet mod lys ved 4 °C i 12-18 timer.
- Tilføj et Whatman-filterpapir til en Buchner-tragt. Reaktionsblandingen hældes langsomt over filterpapiret, og der suges vakuum til at adskille bundfaldet fra diethylether. Bundfaldet opsamles i en tør og ren filtreringskolbe.
- Produktet vakuumtørres i mindst 5 timer eller natten over ved stuetemperatur og opløses i det mindst mulige volumen deioniseret vand, der er nødvendigt. Overfør det opløste produkt til dialyseslanger (se materialetabel) og dialyser mod 3,5 liter deioniseret vand i mindst fire dage. Skift dialysevand hver 12. time.
BEMÆRK: Produktet vil fremstå som helt tørt, rent hvidt fast pulver efter vakuumtørring. - Lynfryse produktet og fryse det i ca. 72 timer, eller indtil det er helt tørt.
- Produktet opløses i chloroform D (CDCl3). Kør prøven ved hjælp af 1H NMR med en protokol, der udfører 248 scanninger med 2,5 s afslapningstid.
- Kontroller produktets funktionalisering og renhed ved at kalibrere CDCl3 opløsningsmiddelspids til 7,26 PPM. Integrer toppen for PEG-backbone-protoner (d3.71), og kalibrer integrationen til 114.
- Integrer de resterende toppe: PEGαMA 1 H NMR (300 MHz, CDCl 3): d (ppm) 1,36(t, 3H, CH 3-),3,71 (s, 114H, PEG CH 2-CH 2), 4,29 (t, s, 4H, -CH 2-C (O) -O-O, -O-CH2-C (=CH 2)-), 5,93 (q, 1H, -C = CH 2), 6,34 (q, 1H, -C = CH 2) og sammenlign integrationen for αMA-alkenendegruppens toppe med den forventede værdi (1H) baseret på PEG-backbonekalibreringen (Figur 1).
BEMÆRK: Gennemsnit de to toppe mærket som "a" (figur 1) og gang med 100 for at opnå den gennemsnitlige PEGαMA-funktionaliseringsprocent.
Figur 1: Proton NMR bekræftede vellykket PEGαMA-funktionalisering. NMR-analyse blev udført i chloroform-D (CDCl3) og viste funktionalisering på 96,5%. PEGαMA 1 H NMR (300 MHz, CDCl3): d (ppm) 1,36(t, 3H, CH 3-),3,71 (s, 114H, PEG CH 2-CH 2), 4,29 (t, s, 4H, -CH 2-C (O) -O-O, -O-CH2-C (=CH 2)-), 5,93 (q, 1H, -C = CH 2), 6,34 (q, 1H, -C = CH 2). Klik her for at se en større version af denne figur.
2. Modeldesign og opsætning af 3D-bioprinter
BEMÆRK: En kommercielt tilgængelig 3D-printer (se materialetabel) blev ændret ved at erstatte den termoplastiske ekstruder med en specialbygget sprøjtepumpeekstruder og tilpasset fra Hinton et al.20. Open source-design er tilgængelige online: https://3d.nih.gov/users/awfeinberg.
- Åbn Fusion 360-softwaren (se materialetabellen), og lav et 3D-computerstøttet hult cylinderdesign.
BEMÆRK: En fil, der kan downloades, og som kan bruges til dette trin og efterligner blodkargeometri, findes i Supplementary File 1. - Gem filen, og åbn den i Slic3r-softwaren (se Materialetabel). Dobbelttjek, at alle parametre er som ønsket, og tryk derefter på eksport-G-kodeknappen. Gem G-koden på computeren.
- Åbn Pronterface-softwaren (se materialetabellen), og upload G-kodefilen.
BEMÆRK: Pronterface-softwaren har grænseflader med bioprinteren og giver tilstrækkelig hardwareinputkontrol. En brugbar G-kodefil findes i supplerende fil 2. - Overfør bioprinteren og alle tilhørende dele til et biosikkerhedsskab (BSC) ved hjælp af aseptiske teknikker.
- Saml en 30 G 0,5" lang stump kanylespids (se materialetabel) til trykglassprøjten og sæt den til side.
- Sæt bioprinterens netledning i en stikkontakt. Tryk på den røde tænd/sluk-knap på forsiden af bioprinteren for at tænde den. Tilslut USB-ledningen (Universal Serial Bus) mellem computeren og bioprinteren, og sørg for, at alle ledningsforbindelser er etableret og tilsluttet.
3. Klargøring af støttebad og reagenser
BEMÆRK: Udfør alle trin i et biosikkerhedsskab ved hjælp af aseptiske teknikker.
- Forbered cellekulturmedium bestående af SmBM Basal Medium (CC-3181) og SmGM-2 SingleQuots kosttilskud (CC-4149), undtagen føtalt bovint serum (FBS), i henhold til producentens anvisninger. Opbevares ved 4 °C indtil brug.
- Der afprøves 50 ml cellekulturmedium, og der tilsættes 1 % v/v FBS (CC-4149) (se materialetabellen) for at fremstille et lavserummedie. Opbevares ved 4 °C indtil brug.
- Gelatinegyllepulveret resuspenderes i henhold til producentens anvisninger ved hjælp af sterile cellekulturmedier uden FBS som opløsningsmiddel (se materialetabellen). Umiddelbart før brug justeres gelatineopslæmningens endelige pH til pH 9 ved hjælp af 2 M kaliumhydroxid (KOH) og/eller 2 M saltsyre (HCl) for at justere opløsningens pH efter behov ved hjælp af et pH-meter.
- Fyld det ønskede antal huller i en plade med 24 huller, der hver er ca. halvt fuld, med 1 ml gelatineopslæmning pr. brønd ved hjælp af en sprøjte uden kanyle.
BEMÆRK: Fyld ensartet midten af brøndene og bekræft, at der ikke findes luftlommer. Bank let på pladen for at fordele mikropartikelopslæmningen jævnt. Juster højden og mængden af gylle pr. brønd efter behov for at imødekomme hver bioprintstørrelse og form. Brugere kan oprette en hjemmelavet sprøjte til at overføre gelatineopslæmningen til hver brønd. Dette kan gøres ved at tilføje et sprøjtestempel i korrekt størrelse i et 50 ml reagensglas, der allerede indeholder den komprimerede gelatineopslæmning i bunden. Mens du indsætter stemplet, skal du indsætte en lille styretråd langs reagensglasset for at hjælpe luften med at slippe ud, og fjern det derefter, når stemplet er i kontakt med gelatineopslæmningen. Umiddelbart før brug skæres spidsen af reagensglasset af med et barberblad for at skabe et hul, som gelatineopslæmningen kan ekstruderes ud af, og tryk ned på stemplet. - Placer den fyldte plade med 24 brønde på midten af bioprintertrinnet, og fastgør den til scenen.
BEMÆRK: Figur 2 viser en generisk bioprinteropsætning. Placer et elastik rundt om printtrinnet for at fastgøre en 24-brønds plade til platformen og forhindre bevægelse.
Figur 2: Grundlæggende opsætning af 3D-bioprint. Bioprinteren blev opstillet i et sterilt miljø såsom et biosikkerhedsskab, og skrivehovedet blev samlet, så glassprøjten og nålen blev lodret sænket ned i understøtningsbadsområdet nedenfor. Klik her for at se en større version af denne figur.
4. Cellekultur
BEMÆRK: Udfør alle trin i et biosikkerhedsskab ved hjælp af aseptiske teknikker.
- HPAAF-celler (kommercielt opnået, se materialetabel) og udvid dem i T-75 vævskulturbehandlede plastkolber indeholdende SmBM Basal Medium (CC-3181) og alle SmGM-2 SingleQuots kosttilskud (CC-4149) i henhold til producentens anvisninger (se materialetabel).
BEMÆRK: Standard cellekulturprotokoller for klæbende celler bør anvendes, idet cellerne opretholdes ved 37 °C og 5% CO2 og genopfyldes medierne med få dages mellemrum. - Når HPAAF'erne har nået ~ 80-90% sammenløb, skal du aspirere mediet og skylle cellerne en gang med fosfatbufret saltvand (PBS).
- Tilsæt ca. 4 ml forvarmet 0,05% trypsin-EDTA til hver T-75-kolbe. Vip kolben for at sikre, at hele cellekulturoverfladen er dækket med 0,05% Trypsin-EDTA-opløsning. Kolberne inkuberes i 3-5 minutter ved 37 °C, og det kontrolleres, om cellerne er frigjort.
- Når cellerne flyder, tilsættes mindst 6 ml Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) til hver kolbe og overføres cellerne til et 50 ml konisk rør.
- Centrifuger cellesuspensionen ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur for at pelletere cellerne. Supernatanten suges ud af cellepelleten, og cellerne resuspenderes i 1-3 ml medier med FBS ved hjælp af en 1000 μL pipette, hvilket sikrer en enkeltcellesuspension.
- 10 μL af cellesuspensionen overføres til et mikrocentrifugeglas. Tilsæt 10 μL Trypan Blue opløsning og bland godt. Brug 10 μL af denne blanding til at tælle celler i et hæmocytometer ved hjælp af et omvendt lysmikroskop.
BEMÆRK: For at opnå en 4 x 106 celler / ml endelig bioblækkoncentration blev der afsat 800.000 fibroblaster for hver 200 μL bioblæk.
5. Fremstilling af hydrogel bioink
BEMÆRK: Bioink-forberedelse blev tilpasset fra Davis-Hall et al.5. Trin 5.1-5.2 kan udføres parallelt med trin 4.1-4.3 for at minimere tiden mellem celleopsamling og resuspension i bioblækket. Udfør trin i et biosikkerhedsskab ved hjælp af en aseptisk teknik.
- Forbered en 20 mM tris(2-carboxyethyl)phosphin-pH-opløsning (TCEP, se materialetabel) pH 7-opløsning og sterilt filter ved hjælp af et 0,2 μm sprøjtefilter. Umiddelbart før brug tilsættes 2 M KOH og/eller 2 M HCl for at justere opløsningens pH efter behov. Mål med pH-meter og juster i overensstemmelse hermed.
BEMÆRK: TCEP reducerer disulfidbindinger. - Der fremstilles en 0,25 mg/ml stamopløsning af PEGαMA resuspenderet i sterile cellekulturmedier uden FBS, 250 mM stamopløsninger af 1,4-dithiothreitol (DTT), MMP2-nedbrydelig tværbinding og CGRGDS (RGD) peptid (se materialetabel), resuspendering af alt i 20 mM sterilt TCEP og en 15 vægt% stamopløsning af poly(ethylenoxid) (PEO) i destilleret vand (DI) med pipetter efter behov.
- Følg tabel 1 som vejledning, kombiner de respektive nødvendige mængder af PEGαMA, DTT, MMP2-nedbrydelig tværbinding, PEO, CGRGDS og lavserumcellekulturmedier sammen med fibroblasterne i et 50 ml konisk rør.
BEMÆRK: Det anbefales at kontrollere pH-værdien med pH-strimler efter tilsætning af alle undtagen cellekulturmediet, da denne kombination skulle resultere i, at pH-værdien er meget tæt på 6,2. Hvis der kræves yderligere pH-justeringer, skal du holde styr på, hvor meget ekstra volumen der er behov for for at justere pH-værdien af prækursoropløsningen. Det samlede volumen bringes op til 200 μL ved at tilføje det resterende cellekulturmedievolumen minus ethvert volumen, der er tilføjet under den endelige pH-justering. - Bland bioblækket sammen ved hjælp af en positiv fortrængningspipette for at sikre, at cellerne er enkeltceller, og bekræft, at den endelige forløberopløsning er pH 6,2 for at forhindre basekatalyseret polymerisering under 3D-bioprint.
- Læg bioblækket i glassprøjten ved at fjerne stemplet og bruge en separat sprøjte med en 15 gauge 1,5" længde stump nålespids (se materialetabellen) fastgjort til at overføre bioblækket fra centrifugeslangen til sprøjten, idet du er omhyggelig med at undgå at danne luftbobler i opløsningen.
- Placer glassprøjten i printhovedet, og fastgør printhovedkomponenter, så alt er fast samlet og klar til udskrivning.
BEMÆRK: På dette tidspunkt skal glassprøjten i printhovedet have en 30 gauge 0,5" længde stump nålespids fastgjort til den til udskrivning.
| Komponent | Koncentration af stamopløsning | Beløb, der skal tilføjes |
| PEGαMA | 0,25 mg/ml | 140 μL |
| DTT | 250 mM | 12,24 μL |
| MMP2 nedbrydelig crosslinker | 250 mM | 5,25 μL |
| RGD | 250 mM | 1,6 μL |
| PEO | 15 vægt% | 33,33 μL |
| Aktiveringsmedier og/eller pH-justeringsreagenser | - | 7,58 μL |
| Fibroblaster | - | 800000 celler |
Tabel 1: Eksempler på mængder, der kræves til fremstilling af 200 μL bioblæk (hydrogelprecursoropløsning og fibroblastceller).
6.3D Bioprinting
BEMÆRK: Udfør alle trin i et biosikkerhedsskab ved hjælp af aseptiske teknikker.
- Brug retningspilene i Pronterface-softwaren til manuelt at justere ekstruderingsnålens position i midten af en brønd og inden for opslæmningen til støttebadet. Efterlad mindst 1 mm støttebadslam under kanylespidsen.
BEMÆRK: Softwaren har ingen mulighed for at fortælle, hvor nålen er inden for rummet. Det er helt op til brugeren at flytte nålen ved manuelt at klikke på pilene i softwaren (f.eks. ved at klikke på pil op flyttes nålen op eller væk fra udskrivningsplatformen osv.). Manøvrer nålen forsigtigt for at sikre, at den ikke rammer nogen grænser for brønden. - Når nålespidsen er placeret i midten af gyllen i brønden, skal du trykke på startknappen i Pronterface og vente på, at udskriften er færdig for at opnå konstruktioner, som vist i figur 3A.
BEMÆRK: For at bioprinte en konstruktion ved hjælp af den medfølgende fil (supplerende fil 1) tager det ca. 3 minutter. Det tager ca. 5 minutter at orientere og flytte nålen og derefter udskrive en konstruktion helt fra start til slut. - Gentag trin 6.1-6.2, indtil antallet af ønskede bioprintede konstruktioner er nået.
BEMÆRK: Det anbefales at lave flere konstruktioner end nødvendigt for at tage højde for eventuelle mislykkede udskrifter. Hvis der opstår fejl, skal du flytte til det næste felt, nulstille alt og gentage trin 6.1-6.2 igen. - Lad brøndpladen stå ved stuetemperatur og dæk den i BSC i 1 time, efter at udskrivningen er afsluttet, for at muliggøre basekatalyseret polymerisation af den fototjusterbare hydrogel.
- Brøndpladen med 3D-bioprintede konstruktioner anbringes i en steril inkubator på 37 °C, og lad dem stå i 12-18 timer for at smelte opslæmningen til støttebadet væk.
Figur 3: Eksperimentelt skematisk. Denne protokol blev beskrevet i tre hovedtrin: (A) 3D bioprinting PEGαMA hule rør med indlejrede celler til efterligning af lungevaskulatur. (B) Fotoinitiering af homopolymerisationsreaktion for at stive det cellulære mikromiljø. C) Vurdering af cellulære markører for spredning og aktivering. Klik her for at se en større version af denne figur.
7.3D Bioprintet konstruktionskultur og photostiffening
BEMÆRK: Alle trin skal udføres i et biosikkerhedsskab ved hjælp af aseptiske teknikker.
- Forbered 2,2 mM lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat (LAP) (se materialetabel) stamopløsning i PBS og sterilt filter ved hjælp af et 0,2 μm sprøjtefilter. Hold LAP-opløsningen beskyttet mod lys.
- Efter 12-18 timer ændres mediet omkring de bioprintede konstruktioner. Fjern manuelt mediet og det smeltede gelatinestøttebad i brøndene, og pas på ikke at forstyrre de bioprintede konstruktioner.
BEMÆRK: Det er nyttigt langsomt at fjerne mediet, mens du holder pladen i en vinkel på 45 °, så konstruktionerne kommer frem i brønden og kan ses. En klar hydrogelcylinder skal kunne identificeres i hver brønd med vellykket udskrivning (figur 4A). - Der tilsættes en passende mængde medier med lavt serumindhold til hvert hul.
BEMÆRK: For en plade med 24 brønde skal 700 μL medier pr. brønd dække de bioprintede konstruktioner fuldstændigt. Juster efter behov. - Sæt pladen tilbage til inkubatoren og skift mediet på prøverne hver 3. dag eller i overensstemmelse med det eksperimentelle design.
- Fireogtyve timer før det ønskede afstivningstidspunkt fjernes medier fra prøverne og erstattes med medier med lavt serumindhold suppleret med 2,2 mM sterilt LAP.
BEMÆRK: For at fluorescerende mærke strukturen skal du svulme 3D-bioprintede konstruktioner i PBS suppleret med 10 μM methacryloxyethylthiocarbamoylrhodamin B (se Tstand of Materials) natten over og derefter stivne som beskrevet i trin 7.6 for fluorescerende at mærke strukturen. Overfør til PBS i 2 dage ved 4 °C for at fjerne overskydende rhodamin og billede ved hjælp af et TRITC-filter (figur 4B, C). - På det ønskede afstivningstidspunkt fjernes halvdelen af mediet fra hullerne, der skal afstives, og pladen placeres med låget af under UV-lys. Tænd UV-lyset, og afstiv disse konstruktioner ved at anvende 10 mW/cm,2 365 nm lys i 5 minutter ved hjælp af Omnicure (se materialetabel) og et 365 nm båndpasfilter (figur 3B).
BEMÆRK: Brug radiometeret/fotometeret til at bekræfte, at lysintensiteten er korrekt, før du udsætter cellerne for UV-lys. - De resterende medier fjernes fra disse huller, og der tilsættes friske medier med lavt serumindhold til hvert hul. Sæt pladen tilbage til inkubatoren.
- Tag pladen ud af inkubatoren og udfør fibroblastaktiveringsundersøgelsen på det ønskede tidspunkt efter trin 9.
Figur 4: 3D-bioprintede hydrogelstrukturer understøttede cellelevedygtighed over tid. (A) Fotografi af 3D-printet hydrogelstruktur i en plade med 24 brønde. (B) Maksimal intensitetsprojektion af fluorescerende mærket PEGαMA 3D-printet hydrogel. Vægtstang = 1 mm. Højere forstørrelsesmikroskopi viste porer i hydrogelstrukturen induceret af gelatinemikropartikler i FRESH bioprinting støttebadet. (C) 3D-printet PEGαMA-rør med fluorescerende mærkede stivnede områder afbildet på et konfokalmikroskop (100 μm z-stack vist som en maksimal intensitetsprojektion) viste rumlig kontrol over afstivning i 3D. Skalabjælke = 500 μm. (D) HPAAF-levedygtighed i 3D-bioprintede konstruktioner målt ved Live/Dead-assays. Konstruktioner med 300 μm tykkelse og 4 × 106 celler / ml overgik alle andre forhold på hvert tidspunkt. Levedygtigheden toppede på dag 7. Denne betingelse og tidspunkt blev valgt til fremtidige eksperimenter. Kolonner viser middelværdien ± SEM, n = 3. *, p < 0,05, ANOVA, Tukey HSD. (E) Repræsentative konfokale billeder af celler i 3D-konstruktioner farvet med levende/dødt reagens på dag 7, det tidspunkt med den største samlede levedygtighed. Calcein AM markerede levende celler i grønt og propidiumiodid markerede døde celler i rødt. Kolonnen længst til højre viser, at den bedst ydende tilstand havde en ensartet cellefordeling og en høj procentdel af levende celler. Skalabjælke = 500 μm. Gengivet med tilladelse fra Davis-Hall et al.5. Klik her for at se en større version af denne figur.
8. Vurdering af fibroblasts levedygtighed
- På de ønskede levedygtighedstider bejdes med calcein AM og propidiumiodid (se materialetabel).
BEMÆRK: For at opsummere skal medier fjernes fra hvert hul, og konstruktionerne skylles med steril PBS. Inkuber konstruktionerne i en levende/død farvningsopløsning i 40 minutter ved 37 °C på en vippe. Farvningsopløsningen skal indeholde calcein AM (1:1000 fortynding) og propidiumiodid (1:1000 fortynding) for at identificere levende eller døde celler ved billeddannelse. - Overfør konstruktionerne til steril PBS og afbild straks på et konfokal fluorescensmikroskop. Få tre forskellige 100 μm z-stack-billeder pr. prøve pr. tidspunkt, og udtryk levedygtighed som den gennemsnitlige procentdel af levende celler (figur 4D, E).
9. Vurdering af fibroblastaktivering
- Forbered 3% w/v bovin serumalbumin (BSA) og 0,1% v/v Tween 20 i PBS. Denne opløsning vil blive benævnt immunofluorescens (IF) opløsningen.
- På de ønskede tidspunkter fjernes medier fra prøvehullerne, og konstruktionerne skylles med PBS. Udskift PBS med 4% paraformaldehyd (PFA), og opbevar disse prøver ved 37 °C i 30 minutter på en vippeanordning. Udskift derefter 4% PFA med 100 mM glycin i PBS og lad disse prøver stå på en vippeknap ved stuetemperatur (RT) i yderligere 15 minutter.
- Derefter overføres disse prøver til Tissue-Tek Cryomolds, prøven dækkes fuldstændigt med optimal skæretemperatur (OCT) opløsning (se materialetabel), og OLT diffunderer ind i prøverne i 12-18 timer ved 4 °C.
- De OCT-gennemblødte prøver lynfryses i 2-methylbutan ved hjælp af flydende nitrogen. Fyld en styrofoamkasse eller anden passende beholder med flydende nitrogen, og anbring derefter en anden beholder fyldt med 2-methylbutan i det flydende nitrogen, så det er mindst halvvejs nedsænket. Brug pincet til at holde hver kryomol, der indeholder en OCT-dækket prøve, i flydende nitrogenkølet 2-methylbutan, indtil den er synligt frosset. Disse prøver kan opbevares ved -80 °C, indtil de er klar til kryosektion.
FORSIGTIG: Personlige værnemidler (PPE) såsom handsker til kuldebeskyttelse, et forklæde til beskyttelse mod kulde og ansigtsskærm, der følger med det kryogene sikkerhedssæt (se materialetabellen), skal bruges under håndtering af flydende nitrogen. - Kryosektion af de frosne OCT-prøver ved -22 °C og fastgør 10 μm tykke skiver til positivt ladede glasmikroskopglas. Forbered tre mikroskopglas med mindst 3-5 kryosektioner pr. dias for hver 3D-hydrogelprøve.
BEMÆRK: Mikroskopets dias kan opbevares på dette punkt ved -80 °C, hvis det er nødvendigt som stoppunkt. - Fastgør kryosektionerne i iskold acetone i 15 minutter for at hjælpe kryosektionerne med at klæbe til diasene. Kryosektionerne skylles forsigtigt med RT-vand for at fjerne eventuel resterende OCT. Lad disse prøver tørre og skitser kryosektionerne med en hydrofob pen (se materialetabel).
- Permeabiliser prøverne ved stuetemperatur med 0,2% v/v Triton X-100 i PBS i 10 minutter, og bloker derefter sektionerne med 5% BSA w/v i PBS i 1 time ved RT.
- Tilsæt det primære anti-humane alfa glatmuskelaktin (αSMA) antistof (1:250 fortynding) (se materialetabellen) til IF-opløsningen. Disse snitprøver med det primære antistof opbevares natten over ved 4 °C. Skyl prøverne 3x med IF-opløsning.
- Inkuber sektionerne i IF-opløsningen, der indeholder den sekundære ged-anti-mus Alexa Fluor 555-antistof (1:250 fortynding) og to dråber ActinGreen 488 ReadyProbe (se materialetabel) pr. milliliter IF-opløsning. Dæk prøverne til alle efterfølgende trin med aluminiumsfolie for at beskytte dem mod lys, og lad den sekundære antistofopløsning forblive på prøverne i 1 time ved RT.
- Skyl sektionerne 3x med IF-opløsning. Inkuber dem i 300 nM 4',6-diamidino-2-phylindol (DAPI) i DI-vand i 15 minutter ved RT. Udfør en sidste skylning af sektionerne 3x med DI-vand.
- Brug 10 μL af et kommercielt tilgængeligt antifadereagens (se materialetabel), dæksel sektionerne ved hjælp af standardmetoder.
BEMÆRK: De monterede dias kan opbevares beskyttet mod lys i en -80 °C fryser, indtil de skal bruges til billeddannelse. - Afbild kryosektionerne ved hjælp af et fluorescensmikroskop (figur 3C og figur 5B). Afbild tre tilfældige sektioner pr. slide ved hjælp af en 10x-målsætning.
BEMÆRK: Billeder skal tages i DAPI-, FITC- og TRITC-kanalerne. - Upload billederne til ImageJ (NIH). Kvantificer procentdelen af αSMA-positive celler som en måling af fibroblastaktivering (figur 5A) ved at dividere det samlede antal αSMA-positive celler med det samlede antal cellekerner for hvert synsfelt.
Figur 5: Fibroblastaktivering i 3D-bioprintede modeller af pulmonal arteriel adventitia . (A) Fibrotisk aktivering i bløde og stivnede 3D-hydrogeler målt ved αSMA-ekspression. HPAAF'er i stivnede konstruktioner var signifikant mere positive for αSMA end celler i bløde konstruktioner. Kolonner repræsenterer middelværdien ± SEM, n = 3. *, p < 0,05, Mann-Whitney U-test. (B) Repræsentative konfokale billeder af immunfarvning for αSMA, actin og DAPI i bløde og stivnede 3D-hydrogeler. HPAAF'er i stivnede konstruktioner viste mere udbredt αSMA-immunofluorescens end celler i bløde konstruktioner. Skalabjælke = 250 μm. (C) Fibroblastproliferation i bløde og stivnede 3D-bioprintede konstruktioner målt ved EdU-positivitet. HPAAF'er i stivnede konstruktioner var signifikant mere positive for EdU end celler i bløde konstruktioner. Kolonner repræsenterer middelværdien ± SEM, n = 3. *, p < 0,05, Mann-Whitney U-test. D) Repræsentative konfokale billeder af immunfarvning af EdU- og Hoechst-farvestof i bløde og stivnede 3D-hydrogeler. HPAAF'er i stivnede konstruktioner viste mere udbredt EdU-immunofluorescens end celler i bløde konstruktioner. Skalabjælke = 300 μm. Gengivet med tilladelse fra Davis-Hall et al.5. Klik her for at se en større version af denne figur.
10. Vurdering af spredning af fibroblaster
- Fireogtyve timer før et ønsket spredningstidspunkt fjernes cellekulturmedier fra hvert hul og erstattes med lavserummedier suppleret med 10 μM EdU-opløsning fra det kommercielt tilgængelige celleproliferationssæt (se materialetabel). Returner prøverne til inkubatoren til inkubation natten over.
- På det ønskede spredningstidspunkt fastgøres prøverne inkuberet med EdU med 4% PFA ved 37 °C i 30 minutter på en vippeanordning. 4% PFA-opløsningen erstattes med 100 mM glycin i PBS og inkubationsprøver ved 37 °C i mindst 15 minutter. Hoechst tilsættes i en passende koncentration i 30 minutter, hvorefter konstruktionerne skylles 2x med PBS.
BEMÆRK: Prøverne kan opbevares beskyttet mod lys ved 4 °C indtil billeddannelse. - Billede alle faste og lagrede EdU-prøver ved hjælp af et fluorescensmikroskop og foreslåede indstillinger og filtre for celleproliferationssæt (figur 3C og figur 5D). Hent tre forskellige 100 μm z-stack-billeder pr. prøve, og opret maksimale projektioner fra hver af disse z-stacks. Proliferation af HPAAF måles ved at tælle antallet af EDU-positive celler og dividere med det samlede antal celler, Hoechst har identificeret inden for de maksimale projektionsbilleder (figur 5C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol beskriver, hvordan man 3D-bioprinter fototjusterbare hydrogeler i et støttebad for at skabe konstruktioner, der er i stand til dynamisk og tidsmæssig afstivning til undersøgelse af fibroblastaktivering i geometrier, der efterligner humant væv. For det første forklarede protokollen, hvordan man syntetiserer PEGαMA, rygraden i dette fototable polymersystem. Målinger af kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi viste vellykket PEGαMA-funktionalisering ved 96,5% (figur 1). Funktionaliseringsværdier på 90% eller derover er acceptable for denne procedure. Dernæst præsenteres detaljer om, hvordan man opretter en 3D CAD-model af en hul cylinder for at efterligne lungevaskulatur. En downloadbar 3D CAD-model findes i supplerende fil 1, mens den tilknyttede G-kode til dette design er tilgængelig i supplerende fil 2. Denne CAD-model producerede konstruktioner med følgende dimensioner: 4 mm højde, 4 mm indvendig diameter og 300 μm vægtykkelse.
Instruktioner til opsætning af bioprinteren vises (figur 2). Sikker montering af printhovedet og fastgørelse af det, så glassprøjten og kanylen ekstruderer bioblæk direkte i en brønd, der indeholder støttebadet nedenfor, er et kritisk trin (figur 2 og figur 3A). Tabel 1 indeholder de oplysninger, der er nødvendige for at forberede lagerkoncentrationer for bioblækkomponenterne, og de korrekte mængder, der skal kombineres for at opnå den bioblæksammensætning, der anvendes i disse undersøgelser, som repræsentative resultater. Den endelige bioblækformulering var 17,5 vægt% PEGαMA med 0,375 molært forhold (αMA:thiol) på 70:30 DTT:MMP2-nedbrydelige tværbindinger, 2 mM CGRGDS og 2,5 vægt% PEO. Denne reaktion binder kovalent CGRGDS-peptidet i hydrogelnetværket gennem en reaktion mellem en fri thiol på cystinen og en αMA-del. PH-værdien af opløsninger af bioblæk og støttebadegylle blev justeret til værdier på henholdsvis 6,2 og 9. Denne kombination af en sur bioblæk og basisk støttebadslam lettede polymeriseringen af de 3D-bioprintede konstruktioner og opretholdt de cylindriske strukturer (figur 4A-C). På dag 7 var 91 ± 2% af cellerne farvet levende, og på dag 14 var 85 ± 3% stadig levedygtige (gennemsnit ± SEM, ANOVA, Tukey HSD) og statistisk signifikant med p < 0,05 (figur 4D, E).
Endelig beskrev denne protokol, hvordan man afstiver de 3D-bioprintede konstruktioner gennem fotoinitiering (figur 3B) af sekundær polymerisationsreaktion med ureagerede αMA-dele. Det originale manuskript af Davis-Hall et al. demonstrerede gennem parallel pladereologi, at de 3D-bioprintede konstruktioner havde et indledende elastisk modul på 4,7 ± 0,09 kPa og steg efter fotoinitieret afstivning til 12,8 ± 0,47 kPa5. Fibroblastaktivering blev vurderet på dag 7 ved at kvantificere antallet af fibroblaster, der udtrykker alfa glat muskelaktin (αSMA). En større procentdel af fibroblasterne i stivnede hydrogelkonstruktioner blev aktiveret (88 ± 2%) sammenlignet med bløde prøver (65 ± 4%) (gennemsnit ± SEM, Mann-Whitney U-test) med statistisk signifikans på p < 0,05 (figur 5A, B). Tilsvarende var 66 ± 6% af fibroblasterne i de stivnede konstruktioner positive for EdU, en proliferationsmarkør, sammenlignet med 39 ± 6% fibroblaster i blød tilstand (gennemsnit ± SEM, Mann-Whitney U-test) med en statistisk signifikans på p < 0,05 (figur 5C, D). Tilsammen understøtter disse resultater, at et afstivet mikromiljø signifikant øgede fibrotiske aktiveringsmarkører inden for 3D-bioprintede modeller.
Supplerende fil 1: CAD-fil (Computer-aided design). Filen indeholder en cylindergeometri på 4 mm højde, 4 mm indvendig diameter og 300 μm tykkelse. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2: G-kodefil. Filen er forbundet med cylindergeometri af 4 mm højde, 4 mm indvendig diameter, og 300 μm tykkelse. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Totrinspolymerisationsreaktioner som reaktion på kontrolleret lyseksponering kan stivne biomaterialer med rumlig og tidsmæssig kontrol. Flere undersøgelser har udnyttet denne teknik til at evaluere cellematrixinteraktioner i forskellige platforme 5,8,9,10,11,21,22,23. Mere specifikt kan fotomasker eller to-foton excitationsmetoder bruges til at stive diskrete sektioner af en 3D-bioprintet konstruktion og undersøge, hvordan celler reagerer på dynamisk afstivning i lukkede områder eller grænseflader som beskrevet i vores tidligere publikationer 5,8. Det er afgørende at vælge meningsfulde tidspunkter til vurdering af celleresponser. Her blev konstruktionerne stivnet efter at have tilladt fibroblaster at sprede sig inden for den MMP-nedbrydelige fototjusterbare hydrogel for at muliggøre aktiveringsundersøgelser8. Denne protokol beskriver, hvordan man udvikler en fototjusterbar hydrogel bioink og skaber 3D bioprintede konstruktioner ved hjælp af bioink og support bath kombination, der initierede en pH-katalyseret polymerisationsreaktion. Polymeriseringen af 3D-bioprintede konstruktioner med forskellige geometrier designet til at efterligne lungevaskulatur blev lettet ved ekstrudering af surt bioblæk til basisk støttebadslam. In vivo vævsafstivning er et kendetegn ved fibrose, og det er almindeligt fastslået, at mekaniske ændringer i det cellulære mikromiljø er potente drivkræfter for sygdomsprogression 10,23,24,25. Derfor har denne protokol og platform et enormt potentiale i at give nøgledetaljer om de mekanofølsomme cellulære mekanismer, der er involveret i fibrotisk patogenese. Evnen til at ændre konstruktionsgeometrien og egenskaberne, bestemme specifikke tidspunkter for at starte afstivning og beslutte, hvilken type celler der skal medtages i bioblækket, er ubestridelige fordele ved denne metode. Disse variabler kan skræddersys til at studere andre pH-katalyserede biomaterialer og virkningerne af mikromiljømæssig afstivning, der er relevante for andre biologiske anvendelser.
PEGαMA blev valgt som bioink-rygrad, fordi den er hydrolytisk stabil og mere reaktiv end andre almindeligt anvendte totrinspolymerisationssystemer såsom poly(ethylenglycol)methacrylat (PEGMA)5,8,9. En MMP2-nedbrydelig peptidsekvens blev inkluderet som en tværbinding for at tillade fremmede fibroblaster at producere MMP2-endopeptidaser for at ombygge det ekstracellulære mikromiljø26. Vores gruppe og andre har vist, at tilstedeværelsen af cellenedbrydelig tværbinding forbedrer fibroblastspredning og er en funktion, der er nødvendig for aktivering 5,27. Høj PEGαMA-funktionalisering er afgørende for denne protokols succes, især da de ureagerede αMA-grupper aktiverer klikkemifunktionen. PEGαMA med funktionalisering over 95% er bedst, men 90% funktionaliseret PEGαMA har arbejdet med denne protokol. Hvis funktionaliseringen af PEGαMA er lavere end ønsket, kan det resultere i inkonsekvent polymerisation, især når der er høj celletæthed. For at overvinde denne udfordring anbefales det at tage volumen af cellepellet i betragtning og trække dette volumen fra volumenet af cellekulturmediet og pH-justeringsreagenser, der er tilføjet i tabel 1. Luftlommer i støttebadet, for tidlig polymerisation i sprøjten eller forkerte pH-værdier for de forskellige opløsninger, der er beskrevet ovenfor, er andre almindelige fejlmekanismer, der er blevet observeret med denne protokol.
Justeringer af pH-værdien i bioblæk og støttebad bør udføres individuelt for hvert forsøg for at tage højde for batch-til-batch-variation eller ændringer i pH over tid. For eksempel, når pH 7 TCEP blev brugt til at resuspendere disse bioblækkomponenter med visse PEGαMA-batcher, skulle den samlede bioblæk pH justeres tættere på 7-7,5 i stedet for 6,2. Tidligere arbejde viser, at fibroblaster udsat for pH-justerede medier fra 6,2-9 kunne modstå disse pH-ændringer og opretholde levedygtighed5. Derudover har tidligere arbejde vist, at kontrolleret UV-lyseksponering, der anvendes til polymerisering af hydrogeler med celler indlejret i, har minimal effekt på cellelevedygtigheden og ikke ændrer fibroblasttranskriptomet 8,9,10,28. Men hvis lav cellelevedygtighed måles, bør pH-justering være det første skridt, der tages for at løse dette problem. Det er veletableret, at pH har en betydelig indvirkning på cellernes levedygtighed 5,9,29, så brugerne bør udføre lignende levedygtighedstest med specifikke cellelinjer, der kan være mere følsomme over for pH-justeringer. Derudover foreslås det at teste eventuelle afvigelser fra denne protokol med små batchstørrelser, før du forsøger store eksperimenter.
I øjeblikket har den interne bioprinter kun ét ekstruderingsprinthoved og kræver betydeligt tidskrævende brugerinput for manuelt at orientere nålen og give udskrivningskommandoer for hver prøve. Kommercielt tilgængelige bioprintere30,31,32 adresserer disse begrænsninger, men er betydeligt dyrere. Fremtidigt arbejde sigter mod at udskrive flere lagkonstruktioner, der indeholder en anden celletype for at genskabe alle tre forskellige lungekarlag (tunica intima, tunica media og tunica adventitia). Andres arbejde viser allerede, at denne bioprintteknik med ikke-fototerbare materialer kan producere avancerede og geometrisk komplekse modeller, herunder opdeling af blodkarstrukturer og hele det menneskelige hjerte 6,7,20,33. Metoderne i denne protokol kan gengives med forskellige bioprintere. Dette vil gøre det muligt for forskere at 3D-bioprinte en række materialer, der gennemgår pH-katalyserede polymerisationsreaktioner og konstruere et vilkårligt antal modeller af vævshomeostase, sygdom og reparation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre. Dele af dette manuskript er gengivet med tilladelse fra © IOP Publishing https://doi.org/10.1088/1758-5090/aca8cf. 5 Alle rettigheder forbeholdes.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Dr. Adam Feinberg (Carnegie Mellon University) og dem, der var vært for 3D Bioprinting Open-Source Workshop. Disse personer gjorde det muligt at lære teknikkerne til FRESH bioprint og bygge den 3D-bioprinter, der blev brugt til disse undersøgelser. Derudover vil forfatterne gerne anerkende Biorender.com, som blev brugt til at producere figurer i dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af flere grupper eller finansieringskilder, herunder Rose Community Foundation (DDH og CMM), en Colorado Pulmonary Vascular Disease Research Award (DDH og CMM), National Science Foundation under Award 1941401 (CMM), Department of the Army under Award W81XWH-20-1-0037 (CMM), National Cancer Institute of NIH under Award R21 CA252172 (CMM), Ludeman Family Center for Women's Health Research ved University of Colorado Anschutz Medical Campus (DDH og CMM), National Heart, Lung and Blood Institute of National Institutes of Health under Awards R01 HL080396 (CMM), R01 HL153096 (CMM), F31 HL151122 (DDH) og T32 HL072738 (DDH og AT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AccuMax Radiometer/Photometer Kit | Spectronics Corporation | XPR-3000 | To measure light intensity, used for photostiffening |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | BP2401-500 | Used during PEGaMA synthesis |
| Acetone | Fisher Scientific | A184 | Used with the cryosections |
| ActinGreen 488 ReadyProbes | Fisher Scientific | R37110 | Used for staining |
| Aluminum Foil | Reynolds | F28028 | |
| Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) | Sigma-Aldrich | 401757-1L | Used during PEGaMA synthesis |
| Argon Compressed Gas | Airgas | AR R300 | Used during PEGaMA synthesis |
| 8 Arm Poly(ethylene glycol)-hydroxyl (PEG-OH) | JenKem Technology | 8ARM-PEG-10K | Used during PEGaMA synthesis |
| 365 nm Bandpass Filter | Edmund Optics | 65-191 | Used for photostiffening |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9700-100 | Used during staining process |
| Buchner Funnel | Quark Glass | QFN-8-14 | Used during PEGaMA synthesis |
| Calcein AM | Invitrogen | 65-0853-39 | Used during staining process |
| Celite 545 (Filtration Aid) | EMD Millipore | CX0574-1 | Used during PEGaMA synthesis |
| Charged Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Chloroform-d | Sigma-Aldrich | 151823-10X0.75ML | Used to characterize PEGaMA |
| Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C10637 | Used for staining |
| 50 mL Conical Tubes | CELLTREAT | 667050B | |
| Cryogenic Safety Kit | Cole-Parmer | EW-25000-85 | |
| Cryostat | Leica | CM 1850-3-1 | |
| Dialysis Tubing | Repligen | 132105 | |
| 4’,6-Diamidino-2-Phylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Used for staining |
| Diethyl Ether | Fisher Scientific | E1384 | Used during PEGaMA synthesis |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 10197777001 | Bioink component |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Cytiva | SH30271.FS | |
| Filter Paper | Whatman | 1001-090 | Used during PEGaMA synthesis |
| Freezone 2.5L Freeze Dry System | Labconco | LA-2.5LR | Lyophilizer |
| Fusion 360 | Autodesk | N/A | Software download |
| 2.5 mL Gastight Syringe | Hamilton | 81420 | Used for bioprinting |
| 15 Gauge 1.5" IT Series Tip | Jensen Global | JG15-1.5X | Used for bioprinting |
| 30 Gauge 0.5" HP Series Tip | Jensen Global | JG30-0.5HPX | Used for bioprinting |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 555 Antibody | Fisher Scientific | A21422 | Used for staining |
| Glycine | Fisher Scientific | C2H5NO2 | Used during staining process |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 1461 | |
| Hoechst | Thermo Scientific | 62249 | Used during staining process |
| Human Pulmonary Artery Adventitial Fibroblasts (HPAAFs) | AcceGen | ABC-TC3773 | From a 2-year-old male patient |
| Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-500 | Used to pH adjust solutions |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | N/A | Free software download |
| ImmEdge® Pen | Vector Laboratories | H-4000 | Used during staining process |
| Incubator | VWR | VWR51014991 | |
| LifeSupport Gelatin Microparticle Slurry (Gelatin Slurry) | Advanced Biomatrix | 5244-10GM | Used for bioprinting |
| Light Microscope | Olympus | CKX53 | Inverted light microscope |
| Lithium Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889-5G | Photoinitiator used for photostiffening |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| LulzBot Mini 2 | LulzBot | N/A | Bioprinter adapted |
| Methacryloxyethyl Thiocarbamoyl Rhodamine B | Polysciences Inc. | 669775-30-8 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631-4L | |
| Microman Capillary Pistons CP1000 | VWR | 76178-166 | Positive displacement pipette tips |
| MMP2 Degradable Crosslinker (KCGGPQGIWGQGCK) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
| Mouse Anti-Human αSMA Monoclonal Antibody | Fisher Scientific | MA5-11547 | Used for staining |
| OmniCure Series 2000 | Lumen Dynamics | S2000-XLA | UV light source used for photostiffening |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Used to fix samples |
| pH Meter | Mettler Toledo | FP20 | |
| pH Strips | Cytiva | 10362010 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone Laboratories, Inc. | Cytiva SH30256.FS | |
| Pipette Set | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| 10 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1120-3710 | |
| 20 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1183-1510 | |
| 200 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-0700 | |
| 1000 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-2721 | |
| Poly(Ethylene Glycol)-Alpha Methacrylate (PEGαMA) | N/A | N/A | Refer to manuscript for synthesis steps |
| Poly(Ethylene Oxide) (PEO) | Sigma-Aldrich | 372773-250G | Bioink component |
| Positive Displacement Pipette | Fisher Scientific | FD10004G | 100-1000 µL |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473-500G | Used to pH adjust solutions |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | Used during staining process |
| Pronterface | All3DP | N/A | Software download |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | Used for staining |
| RGD Peptide (CGRGDS) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
| Rocker | VWR | 10127-876 | |
| Rotary Evaporator | Thomas Scientific | 11100V2022 | Used during PEGaMA synthesis |
| Rubber Band | Staples | 808659 | |
| Schlenk Flask | Kemtech America | F902450 | Used during PEGaMA synthesis |
| Slic3r | Slic3r | N/A | Software download |
| Smooth Muscle Cell Growth Medium-2 (SmGM-2) BulletKit | Lonza | CC-3182 | Kit contains CC-3181 and CC-4149 components |
| Sodium Hydride | Sigma-Aldrich | 223441-50G | Used during PEGaMA synthesis |
| Sorvall ST 40R Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-525 | |
| Stir Bar | VWR | 58948-091 | |
| Syringe Filter | VWR | 28145-483 | Used to sterile filter solutions |
| T-75 Tissue-Cultured Treated Flask | VWR | 82050-856 | Used for cell culture work |
| Tissue-Tek Cyromold | Sakura | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound (OCT) | Sakura | 4583 | |
| Tris(2-Carboxyethyl) Phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | C34H622O11 | Used during staining process |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | Used for cell culture work |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-062 | Used for cell culture work |
| Tween 20 | Fisher Bioreagents | C58H114O26 | Used during staining process |
| Upright Microscope | Olympus | BX63F | Fluorescent microscope capabilities |
| Water Bath | PolyScience | WBE20A11B | |
| 24-Well Tissue Culture Plates | Corning | 3527 |
References
- Ahrens, J. H., et al. Programming cellular alignment in engineered cardiac tissue via bioprinting anisotropic organ building blocks. Advanced Materials. 34 (26), e2200217 (2022).
- Lin, N. Y. C., et al. Renal reabsorption in 3D vascularized proximal tubule models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (12), 5399-5404 (2019).
- Grigoryan, B., et al. Multivascular networks and functional intravascular topologies within biocompatible hydrogels. Science. 364 (6439), 458-464 (2019).
- Kang, Y., Datta, P., Shanmughapriya, S., Ozbolat, I. T. 3D bioprinting of tumor models for cancer research. ACS Applied Biomaterials. 3 (9), 5552-5573 (2020).
- Davis-Hall, D., Thomas, E., Pena, B., Magin, C. M. 3D-bioprinted, phototunable hydrogel models for studying adventitial fibroblast activation in pulmonary arterial hypertension. Biofabrication. 15 (1), (2022).
- Mirdamadi, E., Tashman, J. W., Shiwarski, D. J., Palchesko, R. N., Feinberg, A. W. FRESH 3D bioprinting of a full-size model of the human heart. ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (11), 6453-6459 (2020).
- Shiwarski, D. J., Hudson, A. R., Tashman, J. W., Feinberg, A. W. Emergence of FRESH 3D printing as a platform for advanced tissue biofabrication. APL Bioengineering. 5 (1), 010904 (2021).
- Petrou, C. L., et al. Clickable decellularized extracellular matrix as a new tool for building hybrid hydrogels to model chronic fibrotic diseases in vitro. Journal of Materials Chemistry B. 8 (31), 6814-6826 (2020).
- Hewawasam, R. S., Blomberg, R., Serbedzija, P., Magin, C. M. Chemical modification of human decellularized extracellular matrix for incorporation into phototunable hybrid hydrogel models of tissue fibrosis. ACS Applied Materials & Interfaces. 15 (12), 15071-15083 (2023).
- Saleh, K. S., et al. Engineering hybrid hydrogels comprised healthy or diseased decellularized extracellular matrix to study pulmonary fibrosis. Cellular and Molecular Bioengineering. 15 (5), 505-519 (2022).
- Guvendiren, M., Burdick, J. A. Stiffening hydrogels to probe short- and long-term cellular responses to dynamic mechanics. Nature Communications. 3, 792 (2012).
- Rosales, A. M., Vega, S. L., DelRio, F. W., Burdick, J. A., Anseth, K. S. Hydrogels with reversible mechanics to probe dynamic cell microenvironments. Angewandte Chemie International Edition English. 56 (40), 12132-12136 (2017).
- Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nature Medicine. 18 (7), 1028-1040 (2012).
- Huertas, A., Tu, L., Humbert, M., Guignabert, C. Chronic inflammation within the vascular wall in pulmonary arterial hypertension: more than a spectator. Cardiovascular Research. 116 (5), 885-893 (2020).
- Kendall, R. T., Feghali-Bostwick, C. A. Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators. Frontiers in Pharmacology. 5, 123 (2014).
- Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. The Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).
- Habiel, D. M., Hogaboam, C. Heterogeneity in fibroblast proliferation and survival in idiopathic pulmonary fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 5, 2 (2014).
- Hu, C. J., Zhang, H., Laux, A., Pullamsetti, S. S., Stenmark, K. R. Mechanisms contributing to persistently activated cell phenotypes in pulmonary hypertension. The Journal of Physiology. 597 (4), 1103-1119 (2019).
- Li, M., et al. Emergence of fibroblasts with a proinflammatory epigenetically altered phenotype in severe hypoxic pulmonary hypertension. The Journal of Immunology. 187 (5), 2711-2722 (2011).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform-reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).
- Brown, T. E., et al. Secondary photocrosslinking of click hydrogels to probe myoblast mechanotransduction in three dimensions. Journal of the American Chemical Society. 140 (37), 11585-11588 (2018).
- Ondeck, M. G., et al. Dynamically stiffened matrix promotes malignant transformation of mammary epithelial cells via collective mechanical signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3502-3507 (2019).
- Caliari, S. R., et al. Stiffening hydrogels for investigating the dynamics of hepatic stellate cell mechanotransduction during myofibroblast activation. Scientific Reports. 6, 21387 (2016).
- Liu, F., et al. Feedback amplification of fibrosis through matrix stiffening and COX-2 suppression. Journal of Cell Biology. 190 (4), 693-706 (2010).
- Tschumperlin, D. J., Ligresti, G., Hilscher, M. B., Shah, V. H.
- Chelladurai, P., Seeger, W., Pullamsetti, S. S. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in pulmonary hypertension. European Respiratory Journal. 40 (3), 766-782 (2012).
- Caracena, T., et al. Alveolar epithelial cells and microenvironmental stiffness synergistically drive fibroblast activation in three-dimensional hydrogel lung models. Biomaterials Science. 10 (24), 7133-7148 (2022).
- Ruskowitz, E. R., DeForest, C. A. Proteome-wide analysis of cellular response to ultraviolet light for biomaterial synthesis and modification. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (5), 2111-2116 (2019).
- Kruse, C. R., et al. The effect of pH on cell viability, cell migration, cell proliferation, wound closure, and wound reepithelialization: In vitro and in vivo study. Wound Repair and Regeneration. 25 (2), 260-269 (2017).
- Filippi, M., et al. Perfusable biohybrid designs for bioprinted skeletal muscle tissue. Advanced Healthcare Materials. , e1500758 (2023).
- Matthiesen, I., et al. Astrocyte 3D culture and bioprinting using peptide-functionalized hyaluronan hydrogels. Science and Technology of Advanced Materials. 24 (1), 2165871 (2023).
- Xu, L., et al. Bioprinting a skin patch with dual-crosslinked gelatin (GelMA) and silk fibroin (SilMA): An approach to accelerating cutaneous wound healing. Materials Today Bio. 18, 100550 (2023).
- Bliley, J. M., Shiwarski, D. J., Feinberg, A. W. 3D-bioprinted human tissue and the path toward clinical translation. Science Translational Medicine. 14 (666), eabo7047 (2022).
