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Bioengineering

फाइब्रोब्लास्ट सक्रियण का अध्ययन करने के लिए 3 डी बायोप्रिंटिंग फोटोटेनेबल हाइड्रोगेल

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65639
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3
1Department of Bioengineering, University of Colorado Denver | Anschutz Medical Campus, 2Department of Pediatrics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Division of Pulmonary Sciences and Critical Care Medicine, Department of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

यह लेख बताता है कि बाह्य मैट्रिक्स कठोरता और फाइब्रोब्लास्ट सक्रियण का अध्ययन करने के लिए 3 डी बायोप्रिंट फोटोटेनेबल हाइड्रोगेल कैसे करें।

Abstract

प्रकाश जोखिम के जवाब में फोटोटेनेबल हाइड्रोगेल स्थानिक और अस्थायी रूप से बदल सकते हैं। सेल-कल्चर प्लेटफार्मों में इस प्रकार के बायोमैटेरियल्स को शामिल करना और गतिशील रूप से परिवर्तनों को ट्रिगर करना, जैसे कि माइक्रोएनवायरनमेंटल कठोरता में वृद्धि, शोधकर्ताओं को फाइब्रोटिक रोग की प्रगति के दौरान होने वाले बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) में परिवर्तन ों को मॉडल करने में सक्षम बनाता है। इसमें, जिलेटिन समर्थन स्नान के भीतर दो अनुक्रमिक पोलीमराइजेशन प्रतिक्रियाओं में सक्षम एक फोटोटेनेबल हाइड्रोगेल बायोमटेरियल 3 डी बायोप्रिंटिंग के लिए एक विधि प्रस्तुत की गई है। निलंबित हाइड्रोगेल (फ्रेश) बायोप्रिंटिंग के फ्रीफॉर्म रिवर्सिबल एम्बेडिंग की तकनीक को माइकल अतिरिक्त प्रतिक्रिया की सुविधा के लिए समर्थन स्नान के पीएच को समायोजित करके अनुकूलित किया गया था। सबसे पहले, पॉली (एथिलीन ग्लाइकॉल)-अल्फा मेथैक्रिलेट (पीईजीएमए) युक्त बायोइंक को नरम हाइड्रोगेल बनाने के लिए सेल-डिग्रेडेबल क्रॉसलिंकर के साथ ऑफ-स्टोइकोमेट्री पर प्रतिक्रिया दी गई थी। इन नरम हाइड्रोजेल को बाद में फोटोइनिटर और प्रकाश के संपर्क में लाया गया ताकि अप्रयुक्त समूहों के होमोपोलीमराइजेशन को प्रेरित किया जा सके और हाइड्रोगेल को कठोर किया जा सके। इस प्रोटोकॉल में 3 डी संरचनाओं के भीतर फाइब्रोब्लास्ट सक्रियण का आकलन करने के लिए हाइड्रोगेल संश्लेषण, 3 डी बायोप्रिंटिंग, फोटोस्टिकनिंग और एंडपॉइंट लक्षण वर्णन शामिल हैं। यहां प्रस्तुत विधि शोधकर्ताओं को विभिन्न प्रकार की सामग्रियों को 3 डी बायोप्रिंट करने में सक्षम बनाती है जो पीएच-उत्प्रेरित पोलीमराइजेशन प्रतिक्रियाओं से गुजरती हैं और ऊतक होमियोस्टैसिस, बीमारी और मरम्मत के विभिन्न मॉडलों को इंजीनियर करने के लिए लागू की जा सकती हैं।

Introduction

3 डी बायोप्रिंटिंग एक परिवर्तनकारी तकनीक है जो शोधकर्ताओं को 3 डी वॉल्यूम के भीतर कोशिकाओं और बायोमैटेरियल्स को ठीक से जमा करने और जैविक ऊतकों की जटिल पदानुक्रमित संरचना को फिर से बनाने में सक्षम बनाती है। पिछले एक दशक में, 3 डी बायोप्रिंटिंग में प्रगति ने मानव हृदय के ऊतकों को हराया है1, गुर्दे के ऊतकों के कार्यात्मक मॉडल2, फेफड़े के भीतर गैस विनिमय के मॉडल3, और कैंसर अनुसंधान के लिए ट्यूमर मॉडल4। एम्बेडेड 3 डी बायोप्रिंटिंग तकनीकों के आविष्कार, जैसे कि फ्रीफॉर्म रिवर्सिबल एम्बेडिंग ऑफ सस्पेंडेड हाइड्रोगेल (फ्रेश) बायोप्रिंटिंग ने जटिल नरम ऊतक संरचनाओं जैसे फुफ्फुसीय रक्त वाहिकाओं5 और यहां तक कि मानव हृदय6 को 3 डी में पुन: पेश करना संभव बना दिया है। समर्थन स्नान में बारीकी से पैक किए गए जिलेटिन माइक्रोपार्टिकल्स जैसी सामग्री होती है जो बिंघम प्लास्टिक के रूप में कार्य करती है और मुद्रण के बाद बायोइंक के इच्छित आकार और संरचना को बनाए रखती है। एक बार जब मुद्रित निर्माण जम जाता है, तो समर्थन स्नान को 37डिग्री सेल्सियस तक तापमान बढ़ाकर भंग किया जा सकता है।

एक हालिया समीक्षा लेख ने उन सामग्रियों को संक्षेप में प्रस्तुत किया है जिन्हें फ्रेश तकनीक का उपयोग करके विभिन्न प्रकाशनों में 3 डी बायोप्रिंट किया गया है। ये स्वाभाविक रूप से व्युत्पन्न सामग्री कोलेजन टाइप 1 से लेकर मेथैक्रिलेटेड हाइलूरोनिक एसिड तक होती है और कई अलग-अलग गेलेशन तंत्रका प्रतिनिधित्व करती है। इस 3 डी बायोप्रिंटिंग तकनीक का उपयोग करके किए गए अधिकांश शोध अध्ययन स्थैतिक बायोमैटेरियल्स को नियोजित करते हैं जो बाहरी उत्तेजनाओं के जवाब में नहीं बदलते हैं। डायनामिक फोटोटेनेबल हाइड्रोगेल बायोमैटेरियल्स का उपयोग हमारी प्रयोगशाला और अन्य 8,9,10,11,12 द्वारा विभिन्न प्रकार के फाइब्रोटिक रोगों को मॉडल करने के लिए किया गया है। स्थैतिक बायोमैटेरियल्स के विपरीत, फोटोटेनेबल बायोइंक कम लोचदार मापांक मूल्य के साथ एक नरम मॉडल बनाने की अनुमति देते हैं और बाद में सूक्ष्म पर्यावरणीय कठोरता में वृद्धि के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं का पता लगाने के लिए कठोर हो जाते हैं।

फाइब्रोोटिक रोगों को बाह्य मैट्रिक्स उत्पादन में वृद्धि की विशेषता है जो निशान और कठोरता का कारण बन सकतीहै। ऊतक कठोरता प्रभावित ऊतक की आगे की चोट और विनाश शुरू कर सकती है, जिससे स्थायी अंग क्षति और यहां तक कि मृत्यु भी हो सकती है; फाइब्रोटिक विकार दुनिया भर में मृत्यु दर के एक तिहाई के लिए जिम्मेदार हैं। फाइब्रोब्लास्ट इस रोग अवस्था14,15 में अतिरिक्त और असामान्य बाह्य मैट्रिक्स का उत्पादन करते हैं। बढ़े हुए फाइब्रोब्लास्ट प्रसार और बाह्य मैट्रिक्स जमाव ऊतक को और कठोर करते हैं और एक प्रोफिब्रोटिक सकारात्मक प्रतिक्रिया लूप 16,17,18,19 को सक्रिय करते हैं। फाइब्रोब्लास्ट सक्रियण का अध्ययन फाइब्रोोटिक रोगों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। यहां हम मानव फुफ्फुसीय धमनी उच्च रक्तचाप (पीएएच) को एक फाइब्रोटिक विकार के उदाहरण के रूप में प्रस्तुत करते हैं जिसमें 3 डी बायोप्रिंटिंग का उपयोग करके रक्त वाहिका की 3 डी ज्यामिति की नकल करना और फोटोटेनेबल हाइड्रोगेल की गतिशील कठोरता क्षमताओं का परिचय देना महत्वपूर्ण है। पीएएच एक ऐसी स्थिति है जिसमें मुख्य फुफ्फुसीय धमनियों में दबाव सामान्य स्तर को पार कर जाता है और हृदय पर तनाव लागू करता है, जिससे मानव फुफ्फुसीय धमनी एडवेंटियल फाइब्रोब्लास्ट (एचपीएएएफ) सक्रियण बढ़ जाता है और रक्त वाहिका के ऊतकों 16,17,18,19 को कठोर कर देता है। एक फोटोटेनेबल पॉली (एथिलीन ग्लाइकॉल)-अल्फा मेथैक्रिलेट (पीईजीएमए) बायोइंक फॉर्मूलेशन संरचनाओं में अस्थायी कठोरता की अनुमति देता है और स्वस्थ ऊतक और रोग की प्रगति 5,8,9,10 दोनों को मॉडल करने में मदद करता है। इस अनूठी विशेषता का फायदा उठाने से 3 डी में सूक्ष्म पर्यावरणीय कठोरता के जवाब में एचपीएएएफ सक्रियण और प्रसार की मात्रा का ठहराव संभव हो सकता है और इस बीमारी में शामिल सेलुलर तंत्र में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को 3 डी मॉडल बनाने की अनुमति देगा जो रोग की प्रगति या ऊतक की मरम्मत के दौरान बाह्य माइक्रोएन्वायरमेंट में परिवर्तन को पुन: उत्पन्न करता है और फाइब्रोब्लास्ट सक्रियण का अध्ययन करता है।

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Protocol

1. पीईजीएमए संश्लेषण और लक्षण वर्णन।

नोट: पॉली (एथिलीन ग्लाइकॉल)-अल्फा मेथैक्रिलेट (पीईजीएमए) संश्लेषण को हेवावासम एट अल से अनुकूलित किया गया था और नमीमुक्त परिस्थितियों में प्रदर्शन किया गया था।

  1. अभिकारकों का वजन करें।
    नोट: उदाहरण के लिए, 5 ग्राम 10 किलोग्राम / मोल 8-आर्म पीईजी-हाइड्रॉक्सिल (पीईजी-ओएच) और 0.38 ग्राम सोडियम हाइड्राइड (एनएएच) का वजन करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. 250 एमएल श्लेंक फ्लास्क में एक स्टिर बार जोड़ें और आर्गन के साथ शुद्ध करें।
  3. श्लेंक फ्लास्क के भीतर विघटन के लिए आवश्यक निर्जल टेट्राहाइड्रोफ्यूरान (टीएचएफ) की सबसे कम मात्रा में पीईजी-ओएच को भंग करें।
    नोट: लगभग 80 एमएल टीएचएफ 5 ग्राम पीईजी-ओएच को भंग कर देगा। पीईजी-ओएच को भंग करने के लिए आवश्यक टीएचएफ की न्यूनतम मात्रा जोड़ें।
  4. प्रतिक्रिया मिश्रण में 3 गुना मोलर अतिरिक्त एनएएच जोड़ें और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर हिलाएं।
  5. श्लेंक फ्लास्क में 6 गुना मोलर अतिरिक्त एथिल 2-(ब्रोमोमिथाइल) एक्रिलेट (ईबीआरएमए, सामग्री की तालिका देखें) ड्रॉपवाइज जोड़ें और प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्रतिक्रिया पोत को कवर करें। लगभग 48 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया को हिलाएं।
    नोट: 5 ग्राम पीईजी-ओएच और 0.38 ग्राम एनएएच के लिए, इस प्रतिक्रिया के लिए 3.68 एमएल ईबीआरएमए का उपयोग करें।
  6. प्रतिक्रिया को बुझाने के लिए 1 एन एसिटिक एसिड की कुछ बूंदें जोड़ें। निस्पंदन सहायता के माध्यम से समाधान को वैक्यूम फ़िल्टर करें।
    नोट: एसिटिक एसिड जोड़ने से गैस के बुलबुले पैदा होंगे। बुलबुले बनना बंद होने पर एसिटिक एसिड की बूंदों को जोड़ना बंद कर दें क्योंकि यह इंगित करता है कि मिश्रण सफलतापूर्वक बुझ गया है।
  7. छानना एक रोटरी बाष्पीकरणीय पर केंद्रित करें और 4 डिग्री सेल्सियस डायथाइल ईथर में अवक्षेपित करें। अवक्षेप को 12-18 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से संरक्षित छोड़ दें।
  8. बुचनर फ़नल में एक व्हाटमैन फ़िल्टर पेपर जोड़ें। धीरे-धीरे फिल्टर पेपर पर प्रतिक्रिया मिश्रण डालें और डायथाइल ईथर से अवक्षेप को अलग करने के लिए वैक्यूम सक्शन का उपयोग करें। एक सूखे और साफ निस्पंदन फ्लास्क में अवक्षेप इकट्ठा करें।
  9. कमरे के तापमान पर कम से कम 5 घंटे या रात भर के लिए उत्पाद को वैक्यूम सुखाएं और आवश्यक विआयनीकृत पानी की न्यूनतम मात्रा में घुल जाएं। घुलित उत्पाद को डायलिसिस ट्यूबिंग में स्थानांतरित करें ( सामग्री की तालिका देखें) और कम से कम चार दिनों के लिए 3.5 एल विआयनीकृत पानी के खिलाफ डायलाइज़ करें। डायलिसिस के पानी को हर 12 घंटे में बदलें।
    नोट: वैक्यूम सुखाने के बाद उत्पाद पूरी तरह से सूखे शुद्ध सफेद ठोस पाउडर के रूप में दिखाई देगा।
  10. उत्पाद को फ्लैश-फ्रीज करें और लगभग 72 घंटे के लिए या जब तक यह पूरी तरह से सूख न जाए तब तक लियोफिलाइज करें।
  11. क्लोरोफॉर्म डी (सीडीसीएल3) में उत्पाद को घोलें। एक प्रोटोकॉल के साथ 1एच एनएमआर का उपयोग करके नमूना चलाएं जो 2.5 सेकंड विश्राम समय के साथ 248 स्कैन करता है।
  12. सीडीसीएल3 विलायक शिखर को 7.26 पीपीएम पर कैलिब्रेट करके उत्पाद की कार्यात्मकता और शुद्धता को सत्यापित करें। पीईजी बैकबोन प्रोटॉन (डी 3.71) के लिए शिखर को एकीकृत करें और एकीकरण को 114 तक कैलिब्रेट करें।
  13. शेष चोटियों को एकीकृत करें: PEGaMA 1 H NMR (300 MHz, CDCl 3): d (ppm) 1.36(t, 3H, CH 3-),3.71 (s, 114H, PEG CH 2-CH2), 4.29 (t, s, 4H, -CH2-C(O)-O-O, -O-CH 2-C(=CH2)-5.93 (q, 1H, -C =CH2)चित्र 1)।
    नोट: "ए" (चित्रा 1) के रूप में लेबल किए गए दो चोटियों का औसत और औसत पीईजीएमए कार्यात्मकता प्रतिशत प्राप्त करने के लिए 100 से गुणा करें।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटॉन एनएमआर ने सफल पीईजीएमए कार्यात्मकता की पुष्टि की। एनएमआर विश्लेषण क्लोरोफॉर्म-डी (सीडीसीएल3) में किया गया था और 96.5% के कार्यात्मककरण को दिखाया गया था। PEGaMA 1 H NMR (300 MHz, CDCl3): d (ppm) 1.36(t, 3H, CH 3-),3.71 (s, 114H, PEG CH 2-CH2-CH2), 4.29 (t, s, 4H, -CH2-C(O)-O-O, -O-CH 2-C(=CH2)-5.93 (q, 1H, -C =CH 2), 5.93 (q, 1H, -C =CH 2), 6.93 (q, 1H, -C = CH 2) कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

2. मॉडल डिजाइन और 3 डी बायोप्रिंटर सेटअप

नोट: एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 3 डी प्रिंटर ( सामग्री की तालिका देखें) को थर्मोप्लास्टिक एक्सट्रूडर को कस्टम-निर्मित सिरिंज पंप एक्सट्रूडर के साथ बदलकर संशोधित किया गया था और हिंटन एट अल .20 से अनुकूलित किया गया था। ओपन-सोर्स डिज़ाइन ऑनलाइन उपलब्ध हैं: https://3d.nih.gov/users/awfeinberg.

  1. फ्यूजन 360 सॉफ्टवेयर खोलें ( सामग्री की तालिका देखें) और एक 3 डी कंप्यूटर-एडेड खोखले सिलेंडर डिजाइन बनाएं।
    नोट: एक डाउनलोड करने योग्य फ़ाइल जिसका उपयोग इस चरण के लिए किया जा सकता है और रक्त वाहिका ज्यामिति की नकल करता है, पूरक फ़ाइल 1 में पाया जा सकता है।
  2. फ़ाइल सहेजें और इसे Slic3r सॉफ़्टवेयर के भीतर खोलें ( सामग्री की तालिका देखें)। दो बार जांचें कि सभी पैरामीटर वांछित हैं, और फिर निर्यात जी-कोड बटन दबाएं। G-कोड को कंप्यूटर पर सहेजें।
  3. Pronterface सॉफ़्टवेयर खोलें ( सामग्री की तालिका देखें) और जी-कोड फ़ाइल अपलोड करें।
    नोट: Pronterface सॉफ्टवेयर बायोप्रिंटर के साथ इंटरफेस करता है और पर्याप्त हार्डवेयर इनपुट नियंत्रण प्रदान करता है। एक प्रयोग करने योग्य जी-कोड फ़ाइल पूरक फ़ाइल 2 में पाई जा सकती है।
  4. बायोप्रिंटर और सभी संबंधित भागों को सड़न रोकनेवाला तकनीकों का उपयोग करके जैव सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में स्थानांतरित करें।
  5. प्रिंटिंग ग्लास सिरिंज में 30 ग्राम 0.5 "लंबाई की कुंद सुई टिप ( सामग्री की तालिका देखें) को इकट्ठा करें और एक तरफ सेट करें।
  6. बायोप्रिंटर के पावर कॉर्ड को आउटलेट में प्लग करें। इसे चालू करने के लिए बायोप्रिंटर के सामने लाल पावर बटन दबाएं। कंप्यूटर और बायोप्रिंटर के बीच यूनिवर्सल सीरियल बस (यूएसबी) कॉर्ड कनेक्ट करें और सुनिश्चित करें कि सभी तार कनेक्शन स्थापित और प्लग इन हैं।

3. समर्थन स्नान और अभिकर्मकों की तैयारी

नोट: सड़न रोकनेवाला तकनीकों का उपयोग करके जैव सुरक्षा कैबिनेट में सभी चरणों का पालन करें।

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) को छोड़कर, एसएमबीएम बेसल मीडियम (सीसी -3181) और एसएमजीएम -2 सिंगलकोट सप्लीमेंट (सीसी -4149) से युक्त सेल कल्चर माध्यम तैयार करें। उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. सेल कल्चर माध्यम के 50 एमएल को एलिकोट करें और कम-सीरम मीडिया बनाने के लिए एफबीएस (सीसी -4149) ( सामग्री की तालिका देखें) के 1% वी / वी जोड़ें। उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. विलायक के रूप में एफबीएस के बिना बाँझ सेल कल्चर मीडिया का उपयोग करके निर्माता के निर्देशों के अनुसार जिलेटिन घोल पाउडर को फिर से निलंबित करें ( सामग्री की तालिका देखें)। उपयोग करने से तुरंत पहले, जिलेटिन घोल के अंतिम पीएच को पीएच 9 में 2 एम पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड (केओएच) और / या 2 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) का उपयोग करके पीएच मीटर का उपयोग करके आवश्यकतानुसार समाधान पीएच को समायोजित करें।
  4. सुई के बिना सिरिंज का उपयोग करके प्रति कुएं 1 मिलीलीटर जिलेटिन घोल का उपयोग करके 24-वेल प्लेट के कुओं की वांछित संख्या को भरें, जिनमें से प्रत्येक लगभग आधा भरा हुआ है।
    नोट: समान रूप से कुओं के केंद्र को भरें और पुष्टि करें कि कोई एयर पॉकेट मौजूद नहीं है। माइक्रोपार्टिकल घोल को समान रूप से वितरित करने में मदद करने के लिए प्लेट को टैप करें। प्रत्येक बायोप्रिंट आकार और आकार को समायोजित करने के लिए आवश्यकतानुसार घोल की ऊंचाई और मात्रा को समायोजित करें। उपयोगकर्ता जिलेटिन घोल को प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करने के लिए एक घर का बना सिरिंज बना सकते हैं। यह 50 एमएल टेस्ट ट्यूब में एक सही आकार के सिरिंज प्लंजर को जोड़कर किया जा सकता है जिसमें पहले से ही नीचे कॉम्पैक्ट जिलेटिन घोल होता है। प्लंजर डालते समय, हवा से बचने में मदद करने के लिए टेस्ट ट्यूब के साथ एक छोटा गाइड तार डालें, और फिर प्लंजर जिलेटिन घोल के संपर्क में आने पर इसे हटा दें। उपयोग करने से तुरंत पहले, जिलेटिन घोल को बाहर निकालने के लिए एक छेद बनाने के लिए रेजर ब्लेड से टेस्ट ट्यूब की नोक काट दें और प्लंजर पर दबाएं।
  5. भरे हुए 24-वेल प्लेट को बायोप्रिंटर चरण के केंद्र पर रखें और इसे मंच पर सुरक्षित करें।
    नोट: चित्रा 2 एक जेनेरिक बायोप्रिंटर सेटअप दिखाता है। प्लेटफॉर्म पर 24-वेल प्लेट को सुरक्षित करने और आंदोलन को रोकने के लिए प्रिंट स्टेज के चारों ओर एक रबर बैंड रखें।

Figure 2
चित्रा 2: मूल 3 डी बायोप्रिंटिंग सेटअप। बायोप्रिंटर को एक बाँझ वातावरण जैसे कि जैव सुरक्षा कैबिनेट के भीतर स्थापित किया गया था, और प्रिंटहेड को इकट्ठा किया गया था ताकि ग्लास सिरिंज और सुई को लंबवत रूप से नीचे समर्थन स्नान मुद्रण क्षेत्र में उतारा जा सके। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

4. सेल संस्कृति

नोट: सड़न रोकनेवाला तकनीकों का उपयोग करके जैव सुरक्षा कैबिनेट में सभी चरणों का पालन करें।

  1. एचपीएएएफ कोशिकाओं को पिघलाएं (व्यावसायिक रूप से प्राप्त, सामग्री की तालिका देखें) और निर्माता के निर्देशों के अनुसार एसएमबीएम बेसल मीडियम (सीसी -3181) और सभी एसएमजीएम -2 सिंगलकोट सप्लीमेंट्स (सीसी -4149) युक्त टी -75 ऊतक संस्कृति-उपचारित प्लास्टिक फ्लास्क में उनका विस्तार करें (सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: अनुयायी कोशिकाओं के लिए मानक सेल कल्चर प्रोटोकॉल का उपयोग किया जाना चाहिए, कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर बनाए रखना और हर कुछ दिनों में मीडिया को फिर से भरना चाहिए।
  2. एक बार जब एचपीएएएफ ~ 80-90% कंफ्लुएंसी तक पहुंच जाते हैं, तो मीडिया को एस्पिरेट करें और फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ एक बार कोशिकाओं को कुल्ला करें।
  3. प्रत्येक टी -75 फ्लास्क में लगभग 4 मिलीलीटर प्रीवार्म्ड 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए जोड़ें। फ्लास्क को झुकाएं ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि पूरे सेल कल्चर की सतह 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान के साथ कवर की गई है। फ्लास्क को 37 डिग्री सेल्सियस पर 3-5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और सेल डिटेचमेंट की जांच करें।
  4. एक बार जब कोशिकाएं तैर रही हों, तो प्रत्येक फ्लास्क में डलबेकको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) के कम से कम 6 एमएल जोड़ें और कोशिकाओं को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. कोशिकाओं को पेलेट करने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। सेल पेलेट से सतह पर तैरनेवाला को एस्पिरेट करें और 1000 μL पिपेट का उपयोग करके एफबीएस के साथ 1-3 एमएल मीडिया में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, जिससे एकल-सेल निलंबन सुनिश्चित हो।
  6. सेल निलंबन के 10 μL को एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। 10 μL Tripan Blue घोल डालें और अच्छी तरह मिलाएँ। उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके हेमोसाइटोमीटर के भीतर कोशिकाओं की गणना करने के लिए इस मिश्रण के 10 μL का उपयोग करें।
    नोट: 4 x 106 कोशिकाओं / एमएल अंतिम बायोइंक एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए, बायोइंक के प्रत्येक 200 μL के लिए 800,000 फाइब्रोब्लास्ट अलग रखे गए थे।

5. हाइड्रोजेल बायोइंक की तैयारी

नोट: बायोइंक तैयारी डेविस-हॉल एट अल .5 से अनुकूलित की गई थी। बायोइंक में सेल संग्रह और पुन: निलंबन के बीच समय को कम करने के लिए चरण 5.1-5.2 को चरण 4.1-4.3 के समानांतर पूरा किया जा सकता है। एक सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग करके जैव सुरक्षा कैबिनेट में कदम उठाएं।

  1. 0.2 μm सिरिंज फ़िल्टर का उपयोग करके 20 mM tris (2-कार्बोक्सीथाइल) फॉस्फीन (TCEP, सामग्री की तालिका देखें) pH 7 समाधान और बाँझ फ़िल्टर तैयार करें। उपयोग करने से तुरंत पहले, आवश्यकतानुसार समाधान पीएच को समायोजित करने के लिए 2 एम कोएच और / या 2 एम एचसीएल जोड़ें। पीएच मीटर के साथ मापें और तदनुसार समायोजित करें।
    नोट: टीसीईपी डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड को कम करता है।
  2. एफबीएस के बिना बाँझ सेल कल्चर मीडिया में पुन: निलंबित पीईजीएमए का 0.25 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक समाधान तैयार करें, 1,4-डिथियोथ्रेइटोल (डीटीटी), एमएमपी 2-डिग्रेडेबल क्रॉसलिंकर और सीजीआरजीडीएस (आरजीडी) पेप्टाइड के 250 एमएम स्टॉक समाधान (सामग्री की तालिका देखें), 20 एमएम बाँझ टीसीईपी में सभी को निलंबित करें, और पॉली (एथिलीन ऑक्साइड) (पीईओ) के 15 डब्ल्यूटी% स्टॉक समाधान को आसुत (डीआई) पानी में आवश्यकतानुसार उपयोग करें।
  3. एक गाइड के रूप में तालिका 1 का पालन करते हुए, पीईजीएमए, डीटीटी, एमएमपी 2-डिग्रेडेबल क्रॉसलिंकर, पीईओ, सीजीआरजीडीएस और कम-सीरम सेल कल्चर मीडिया की संबंधित मात्रा को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में फाइब्रोब्लास्ट के साथ मिलाएं।
    नोट: सेल कल्चर मीडिया को जोड़ने के बाद पीएच स्ट्रिप्स के साथ पीएच की जांच करने की सिफारिश की जाती है क्योंकि इस संयोजन के परिणामस्वरूप पीएच 6.2 के बहुत करीब होना चाहिए। यदि आगे पीएच समायोजन की आवश्यकता होती है, तो इस बात का ट्रैक रखें कि अग्रदूत समाधान के पीएच को समायोजित करने के लिए कितनी अतिरिक्त मात्रा की आवश्यकता है। अंतिम पीएच समायोजन के दौरान जोड़े गए किसी भी वॉल्यूम को छोड़कर शेष सेल कल्चर मीडिया वॉल्यूम को जोड़कर कुल वॉल्यूम को 200 μL तक लाएं।
  4. कोशिकाओं को एकल कोशिकाएं सुनिश्चित करने के लिए एक सकारात्मक विस्थापन पिपेट का उपयोग करके बायोइंक को एक साथ मिलाएं और 3 डी बायोप्रिंटिंग के दौरान आधार-उत्प्रेरित पोलीमराइजेशन को रोकने के लिए अंतिम अग्रदूत समाधान पीएच 6.2 की पुष्टि करें।
  5. प्लंजर को हटाकर और सेंट्रीफ्यूज ट्यूब से सिरिंज में बायोइंक को स्थानांतरित करने के लिए संलग्न 15 गेज 1.5 "लंबाई कुंद सुई टिप ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ एक अलग सिरिंज का उपयोग करके बायोइंक को ग्लास सिरिंज में लोड करें, समाधान के भीतर हवा के बुलबुले बनाने से बचने के लिए सावधान रहें।
  6. प्रिंट हेड के भीतर ग्लास सिरिंज रखें और प्रिंट हेड घटकों को संलग्न करें ताकि सब कुछ मजबूती से इकट्ठा हो और मुद्रण के लिए तैयार हो।
    नोट: इस बिंदु पर, प्रिंट हेड के भीतर ग्लास सिरिंज में मुद्रण के लिए 30 गेज 0.5 "लंबाई कुंद सुई टिप जुड़ी होनी चाहिए।

   

घटक स्टॉक समाधान एकाग्रता जोड़ने के लिए राशि
PEGαMA 0.25 मिलीग्राम / 140 μL
DTT 250 mM 12.24 μL
एमएमपी 2 डिग्रेडेबल क्रॉसलिंकर 250 mM 5.25 μL
RGD 250 mM 1.6 μL
पीईओ 15 wt% 33.33 μL
सक्रियण मीडिया और / या पीएच समायोजन अभिकर्मक - 7.58 μL
फाइब्रोब्लास्ट - 800000 सेल

तालिका 1: बायोइंक (हाइड्रोगेल अग्रदूत समाधान और फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं) के 200 μL तैयार करने के लिए आवश्यक उदाहरण वॉल्यूम।

6.3D बायोप्रिंटिंग

नोट: सड़न रोकनेवाला तकनीकों का उपयोग करके जैव सुरक्षा कैबिनेट में सभी चरणों का पालन करें।

  1. प्रोन्टरफेस सॉफ्टवेयर के भीतर दिशात्मक तीर का उपयोग करके, मैन्युअल रूप से एक्सट्रूज़न सुई की स्थिति को एक कुएं के केंद्र में और समर्थन स्नान घोल के भीतर समायोजित करें। सुई की नोक के नीचे कम से कम 1 मिमी समर्थन स्नान घोल छोड़ दें।
    नोट: सॉफ्टवेयर में यह बताने की कोई क्षमता नहीं है कि सुई अंतरिक्ष के भीतर कहां है। सॉफ्टवेयर के भीतर तीरों को मैन्युअल रूप से क्लिक करके सुई को स्थानांतरित करना पूरी तरह से उपयोगकर्ता पर निर्भर है (उदाहरण के लिए, ऊपर तीर पर क्लिक करने से सुई प्रिंटिंग प्लेटफॉर्म से ऊपर या दूर हो जाएगी, आदि)। सुई को सावधानी से पैंतरेबाज़ी करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि यह कुएं की किसी भी सीमा से नहीं टकराएगा।
  2. एक बार जब सुई की नोक कुएं के भीतर घोल के केंद्र में स्थित हो जाती है, तो प्रोन्टरफेस के भीतर स्टार्ट बटन दबाएं और संरचनाओं को प्राप्त करने के लिए प्रिंट के पूरा होने की प्रतीक्षा करें, जैसा कि चित्रा 3 ए में दिखाया गया है।
    नोट: प्रदान की गई फ़ाइल (पूरक फ़ाइल 1) का उपयोग करके एक निर्माण को बायोप्रिंट करने के लिए, इसमें लगभग 3 मिनट लगेंगे। सुई को उन्मुख करने और स्थानांतरित करने में लगभग 5 मिनट लगते हैं और फिर शुरू से अंत तक पूरी तरह से एक निर्माण प्रिंट करते हैं।
  3. चरण 6.1-6.2 को तब तक दोहराएं जब तक कि वांछित बायोप्रिंटेड संरचनाओं की संख्या पूरी न हो जाए।
    नोट: किसी भी असफल प्रिंट के लिए आवश्यकता से अधिक निर्माण करने की सिफारिश की जाती है। यदि विफलता होती है, तो अगले कुएं पर जाएं, सब कुछ रीसेट करें, और चरण 6.1-6.2 को फिर से दोहराएं।
  4. कमरे के तापमान पर अच्छी तरह से प्लेट छोड़ दें और मुद्रण समाप्त होने के बाद इसे बीएससी में 1 घंटे के लिए कवर करें ताकि फोटोटेनेबल हाइड्रोगेल के बेस-उत्प्रेरित पोलीमराइजेशन की अनुमति मिल सके।
  5. 3 डी बायोप्रिंटेड संरचनाओं वाली वेल प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस बाँझ इनक्यूबेटर में रखें और उन्हें समर्थन स्नान घोल को पिघलाने के लिए 12-18 घंटे के लिए छोड़ दें।

Figure 3
चित्र 3: प्रायोगिक योजनाबद्ध। इस प्रोटोकॉल को तीन प्रमुख चरणों में वर्णित किया गया था: (ए) फुफ्फुसीय वाहिका की नकल करने के लिए एम्बेडेड कोशिकाओं के साथ 3 डी बायोप्रिंटिंग पीईजीएमए खोखले ट्यूब। (बी) सेलुलर माइक्रोएन्वायरमेंट को कठोर करने के लिए होमोपोलीमराइजेशन प्रतिक्रिया की फोटोशुरुआत। (ग) प्रसार और सक्रियण के लिए सेलुलर मार्करों का आकलन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

7.3D बायोप्रिंटेड निर्माण संस्कृति और फोटोकठोरीकरण

नोट: सभी चरणों को सड़न रोकनेवाली तकनीकों का उपयोग करके जैव सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना चाहिए।

  1. 0.2 μm सिरिंज फ़िल्टर का उपयोग करके पीबीएस और बाँझ फ़िल्टर में 2.2 mM लिथियम फिनाइल-2,4,6-ट्राइमिथाइलबेंज़ोइलफॉस्फीनेट (LAP) स्टॉक समाधान (सामग्री की तालिका देखें) तैयार करें। एलएपी समाधान को प्रकाश से सुरक्षित रखें।
  2. 12-18 घंटे के बाद, बायोप्रिंटेड संरचनाओं के आसपास के मीडिया को बदलें। मैन्युअल रूप से कुओं के भीतर मीडिया और पिघला हुआ जिलेटिन समर्थन स्नान को हटा दें और सावधान रहें कि बायोप्रिंटेड संरचनाओं को परेशान न करें।
    नोट: प्लेट को 45 ° कोण पर पकड़ते समय धीरे-धीरे मीडिया को हटाना सहायक होता है ताकि कुएं के भीतर निर्माण उभरे और देखा जा सके। एक स्पष्ट हाइड्रोगेल सिलेंडर सफल प्रिंट (चित्रा 4 ए) के साथ प्रत्येक कुएं में पहचाना जाना चाहिए।
  3. प्रत्येक कुएं में कम-सीरम मीडिया की एक उपयुक्त मात्रा जोड़ें।
    नोट: 24-वेल प्लेट के लिए, प्रति कुएं 700 μL मीडिया को पूरी तरह से बायोप्रिंटेड संरचनाओं को कवर करना चाहिए। आवश्यकतानुसार समायोजित करें।
  4. प्लेट को इनक्यूबेटर में वापस करें और हर 3 दिनों में या प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार नमूने पर मीडिया बदलें।
  5. वांछित कठोरता समय बिंदु से चौबीस घंटे पहले, नमूनों से मीडिया को हटा दें और उन्हें 2.2 एमएम बाँझ एलएपी के साथ पूरक कम-सीरम मीडिया के साथ प्रतिस्थापित करें।
    नोट: संरचना को फ्लोरोसेंटली लेबल करने के लिए, पीबीएस में 3 डी बायोप्रिंटेड संरचनाओं को रात भर 10 μM methacrylooxyethyl thyocarbamoyl Rhodamine B (सामग्री के टी सक्षम देखें) के साथ पूरक करें, फिर संरचना को फ्लोरोसेंटली लेबल करने के लिए चरण 7.6 में वर्णितके रूप में कठोर हो जाएं। टीआरआईटीसी फिल्टर (चित्रा 4 बी, सी) का उपयोग करके अतिरिक्त रोडामाइन और छवि को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए पीबीएस में स्थानांतरित करें।
  6. वांछित कठोरता समय बिंदु पर, कुओं से आधे मीडिया को हटा दें और प्लेट को यूवी प्रकाश के तहत ढक्कन बंद कर दें। यूवी प्रकाश चालू करें और ओमनीक्योर (सामग्री की तालिका देखें) और 365 एनएम बैंडपास फिल्टर (चित्रा 3 बी) का उपयोग करके 5 मिनट के लिए 10 mW / cm2 365 nm प्रकाश लागू करके इन संरचनाओं को कठोर करें।
    नोट: कोशिकाओं को यूवी प्रकाश में उजागर करने से पहले प्रकाश की तीव्रता सही होने की पुष्टि करने के लिए रेडियोमीटर / फोटोमीटर का उपयोग करें।
  7. इन कुओं से शेष मीडिया को हटा दें और प्रत्येक कुएं में ताजा कम-सीरम मीडिया जोड़ें। प्लेट को इनक्यूबेटर में वापस करें।
  8. इनक्यूबेटर से प्लेट को बाहर निकालें और चरण 9 के बाद वांछित समय बिंदु पर फाइब्रोब्लास्ट सक्रियण अध्ययन करें।

Figure 4
चित्रा 4: 3 डी-बायोप्रिंटेड हाइड्रोगेल संरचनाओं ने समय के साथ सेल व्यवहार्यता का समर्थन किया। (ए) 24-वेल प्लेट में 3 डी-मुद्रित हाइड्रोगेल संरचना की तस्वीर। (बी) फ्लोरोसेंटली लेबल पीईजीएमए 3 डी-मुद्रित हाइड्रोगेल की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण। स्केल बार = 1 मिमी। उच्च आवर्धन माइक्रोस्कोपी ने फ्रेश बायोप्रिंटिंग सपोर्ट बाथ में जिलेटिन माइक्रोपार्टिकल्स द्वारा प्रेरित हाइड्रोगेल संरचना के भीतर छिद्र दिखाए। (सी) 3 डी-मुद्रित पीईजीएमए ट्यूब जिसमें फ्लोरोसेंटली लेबल वाले कठोर क्षेत्र होते हैं, को एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण के रूप में प्रदर्शित 100 μm z-स्टैक) पर चित्रित किया जाता है, ने 3 डी में कठोरता पर स्थानिक नियंत्रण दिखाया। स्केल बार = 500 μm. (D) जीवित /मृत परख द्वारा मापा गया 3D-बायोप्रिंटेड संरचनाओं में HPAAF व्यवहार्यता। 300 μm मोटाई और 4 × 106 कोशिकाओं / mL के साथ संरचनाओं ने हर समय बिंदु पर अन्य सभी स्थितियों से बेहतर प्रदर्शन किया। व्यवहार्यता 7 वें दिन चरम पर पहुंच गई। इस स्थिति और समय बिंदु को भविष्य के प्रयोगों के लिए चुना गया था। कॉलम एसईएम, एन = 3 ± माध्य दिखाते हैं। *, पी < 0.05, एनोवा, टुकी एचएसडी। (ई) 3 डी संरचनाओं में कोशिकाओं की प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियां 7 वें दिन जीवित / मृत अभिकर्मक से सनी होती हैं, जो सबसे बड़ी समग्र व्यवहार्यता के साथ समय बिंदु है। कैल्सीन एएम ने जीवित कोशिकाओं को हरे रंग में चिह्नित किया और प्रोपिडियम आयोडाइड ने मृत कोशिकाओं को लाल रंग में चिह्नित किया। दाएँ स्तंभ से पता चलता है कि सबसे अच्छा प्रदर्शन करने वाली स्थिति में एक समान सेल वितरण और जीवित कोशिकाओं का उच्च प्रतिशत था। स्केल बार = 500 μm। डेविस-हॉल एट अल.5 से अनुमति के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

8. फाइब्रोब्लास्ट व्यवहार्यता का आकलन

  1. वांछित व्यवहार्यता समय बिंदुओं पर, कैल्सीन एएम और प्रोपिडियम आयोडाइड का उपयोग करके दाग लगाएं ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: संक्षेप में, मीडिया को प्रत्येक कुएं से हटा दिया जाना चाहिए और संरचनाओं को बाँझ पीबीएस से धोया जाना चाहिए। एक रॉकर पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के लिए एक जीवित / मृत धुंधला घोल में संरचनाओं को इनक्यूबेट करें। इमेजिंग पर जीवित या मृत कोशिकाओं की पहचान करने के लिए धुंधला समाधान में कैल्सीन एएम (1: 1000 कमजोर पड़ना) और प्रोपिडियम आयोडाइड (1: 1000 कमजोर पड़ना) होना चाहिए।
  2. संरचनाओं को बाँझ पीबीएस में स्थानांतरित करें और तुरंत एक कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर छवि बनाएं। प्रति समय बिंदु प्रति नमूना तीन अलग-अलग 100 μm z-स्टैक छवियां प्राप्त करें और जीवित कोशिकाओं के औसत प्रतिशत के रूप में व्यवहार्यता व्यक्त करें (चित्रा 4 डी, ई)।

9. फाइब्रोब्लास्ट सक्रियण का आकलन।

  1. पीबीएस में 3% डब्ल्यू / वी बोवाइन सीरम एल्बुमिन (बीएसए) और 0.1% वी / वी ट्वीन 20 तैयार करें। इस समाधान को इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) समाधान के रूप में संदर्भित किया जाएगा।
  2. वांछित समय बिंदुओं पर, नमूना कुओं से मीडिया को हटा दें और पीबीएस के साथ संरचनाओं को कुल्ला करें। पीबीएस को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ बदलें और इन नमूनों को एक रॉकर पर 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। फिर, पीबीएस में 100 एमएम ग्लाइसिन के साथ 4% पीएफए को बदलें और इन नमूनों को कमरे के तापमान (आरटी) पर एक रॉकर पर 15 मिनट के लिए छोड़ दें।
  3. इसके बाद, इन नमूनों को ऊतक-टेक क्रायोमोल्ड्स में स्थानांतरित करें, नमूने को इष्टतम काटने के तापमान (ओसीटी) समाधान (सामग्री की तालिका देखें) के साथ पूरी तरह से कवर करें, और ओसीटी को 4 डिग्री सेल्सियस पर 12-18 घंटे के लिए नमूनों में फैलाने की अनुमति दें।
  4. तरल नाइट्रोजन का उपयोग करके 2-मिथाइलब्यूटेन में ओसीटी-भिगोए गए नमूनों को फ्लैश-फ्रीज करें। तरल नाइट्रोजन के साथ एक स्टायरोफोम बॉक्स या अन्य उपयुक्त कंटेनर भरें और फिर तरल नाइट्रोजन के भीतर 2-मिथाइलब्यूटेन से भरा दूसरा कंटेनर रखें ताकि यह कम से कम आधा डूब जाए। तरल नाइट्रोजन कूल्ड 2-मिथाइलब्यूटेन में ओसीटी-कवर नमूने वाले प्रत्येक क्रायोमोल्ड को पकड़ने के लिए बल का उपयोग करें जब तक कि स्पष्ट रूप से जमे हुए न हों। इन नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है जब तक कि वे क्रायोसेक्शन के लिए तैयार न हों।
    सावधानी: तरल नाइट्रोजन को संभालते समय व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) जैसे कोल्ड प्रोटेक्टेंट दस्ताने, एक कोल्ड प्रोटेक्टेंट एप्रन और क्रायोजेनिक सेफ्टी किट (सामग्री की तालिका देखें) में प्रदान की गई फेस शील्ड का उपयोग किया जाना चाहिए।
  5. -22 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए ओसीटी नमूनों को क्रायोसेक्शन करें और सकारात्मक रूप से चार्ज ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड में 10 μm मोटी स्लाइस संलग्न करें। प्रत्येक 3 डी हाइड्रोगेल नमूने के लिए प्रति स्लाइड कम से कम 3-5 क्रायोसेक्शन के साथ तीन माइक्रोस्कोप स्लाइड तैयार करें।
    नोट: माइक्रोस्कोप स्लाइड को इस बिंदु पर -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है यदि एक स्टॉपिंग पॉइंट के रूप में आवश्यक हो।
  6. क्रायोसेक्शन को स्लाइड्स का पालन करने में मदद करने के लिए 15 मिनट के लिए बर्फ-ठंडे एसीटोन में क्रायोसेक्शन को ठीक करें। किसी भी शेष ओसीटी को हटाने के लिए धीरे से आरटी पानी के साथ क्रायोसेक्शन को कुल्ला करें। इन नमूनों को सूखने दें और हाइड्रोफोबिक पेन के साथ क्रायोसेक्शन की रूपरेखा तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  7. 10 मिनट के लिए पीबीएस में 0.2% वी / वी ट्राइटन एक्स -100 के साथ कमरे के तापमान पर नमूने को पेर्मेबिलाइज करें और फिर आरटी पर 1 घंटे के लिए पीबीएस में 5% बीएसए डब्ल्यू / वी वाले अनुभागों को अवरुद्ध करें।
  8. आईएफ समाधान में प्राथमिक माउस एंटी-ह्यूमन अल्फा चिकनी मांसपेशी एक्टिन (1:250 कमजोर पड़ना) ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें। इन विभाजित नमूनों को प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। नमूने को आईएफ घोल के साथ 3 गुना धो लें।
  9. आईएफ समाधान में द्वितीयक बकरी एंटी-माउस एलेक्सा फ्लुर 555 एंटीबॉडी (1:250 कमजोर पड़ने) और एक्टिनग्रीन 488 रेडीप्रोब ( सामग्री की तालिका देखें) की दो बूंदों वाले आईएफ समाधान में अनुभागों को इनक्यूबेट करें। नमूनों को प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ बाद के सभी चरणों के लिए कवर करें और द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान को आरटी पर 1 घंटे के लिए नमूनों पर रहने दें।
  10. अनुभाग 3x को IF घोल से धो लें। उन्हें आरटी में 15 मिनट के लिए डीआई पानी में 300 एनएम 4', 6-डायमिडिनो-2-फिलिंडोल (डीएपीआई) में इनक्यूबेट करें।
  11. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीफैड अभिकर्मक के 10 μL का उपयोग करके ( सामग्री की तालिका देखें), मानक विधियों का उपयोग करके अनुभागों को कवर करें।
    नोट: माउंटेड स्लाइड्स को इमेजिंग के लिए आवश्यक होने तक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में प्रकाश से संरक्षित किया जा सकता है।
  12. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (चित्रा 3 सी और चित्रा 5 बी) का उपयोग करके क्रायोसेक्शन की छवि बनाएं। 10x उद्देश्य का उपयोग करके प्रति स्लाइड तीन यादृच्छिक वर्गों की छवि बनाएं।
    नोट: छवियों को DAPI, FITC, और TRITC चैनलों में लिया जाना चाहिए।
  13. छवियों को इमेजजे (एनआईएच) में अपलोड करें। फाइब्रोब्लास्ट सक्रियण (चित्रा 5 ए) के माप के रूप में एएसएमए पॉजिटिव कोशिकाओं के प्रतिशत को प्रत्येक क्षेत्र के लिए सेल नाभिक की कुल संख्या से विभाजित करके निर्धारित करें।

Figure 5
चित्रा 5: फुफ्फुसीय धमनी एडवेंटाइटिस के 3 डी-बायोप्रिंटेड मॉडल में फाइब्रोब्लास्ट सक्रियण । (ए) नरम और कठोर 3 डी हाइड्रोगेल में फाइब्रोटिक सक्रियण को एएसएमए अभिव्यक्ति द्वारा मापा जाता है। नरम संरचनाओं में कोशिकाओं की तुलना में कठोर संरचनाओं में एचपीएएएफ एएसएमए के लिए काफी अधिक सकारात्मक थे। कॉलम एसईएम, एन = 3 ± माध्य का प्रतिनिधित्व करते हैं। *, पी < 0.05, मैन-व्हिटनी यू परीक्षण। (बी) नरम और कठोर 3 डी हाइड्रोगेल में एएसएमए, एक्टिन और डीएपीआई के लिए इम्यूनोस्टेनिंग की प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियां। कठोर संरचनाओं में एचपीएएएफ ने नरम संरचनाओं में कोशिकाओं की तुलना में अधिक प्रचलित एएसएमए इम्यूनोफ्लोरेसेंस दिखाया। स्केल बार = 250 μm. (C) ईडीयू सकारात्मकता द्वारा मापा नरम और कठोर 3 डी बायोप्रिंटेड संरचनाओं में फाइब्रोब्लास्ट प्रसार। नरम संरचनाओं में कोशिकाओं की तुलना में कठोर संरचनाओं में एचपीएएएफ ईडीयू के लिए काफी अधिक सकारात्मक थे। कॉलम एसईएम, एन = 3 ± माध्य का प्रतिनिधित्व करते हैं। *, पी < 0.05, मैन-व्हिटनी यू परीक्षण। (डी) नरम और कठोर 3 डी हाइड्रोगेल में ईडीयू और होचस्ट डाई के लिए इम्यूनोस्टेनिंग की प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियां। कठोर संरचनाओं में एचपीएएएफ ने नरम संरचनाओं में कोशिकाओं की तुलना में अधिक प्रचलित ईडीयू इम्यूनोफ्लोरेसेंस दिखाया। स्केल बार = 300 μm। डेविस-हॉल एट अल.5 से अनुमति के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

10. फाइब्रोब्लास्ट प्रसार का आकलन

  1. वांछित प्रसार समय बिंदु से चौबीस घंटे पहले, प्रत्येक कुएं से सेल कल्चर मीडिया को हटा दें और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल प्रसार किट से 10 μM EdU समाधान के साथ पूरक कम-सीरम मीडिया के साथ बदलें ( सामग्री की तालिका देखें)। रात भर के इनक्यूबेशन के लिए नमूने को इनक्यूबेटर में वापस करें।
  2. वांछित प्रसार समय बिंदु पर, एक रॉकर पर 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 4% पीएफए का उपयोग करके ईडीयू के साथ इनक्यूबेट किए गए नमूने को ठीक करें। पीबीएस में 100 एमएम ग्लाइसिन के साथ 4% पीएफए समाधान को बदलें और कम से कम 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूने को इनक्यूबेट करें। 30 मिनट के लिए उपयुक्त एकाग्रता पर होचस्ट जोड़ें और फिर पीबीएस के साथ 2 x संरचनाओं को धो लें।
    नोट: नमूने इमेजिंग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से संरक्षित किया जा सकता है।
  3. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप और सुझाए गए सेल प्रसार किट निर्माता सेटिंग्स और फिल्टर (चित्रा 3 सी और चित्रा 5 डी) का उपयोग करके सभी निश्चित और संग्रहीत ईडीयू नमूनों की छवि बनाएं। प्रति नमूना तीन अलग-अलग 100 μm z-स्टैक छवियां प्राप्त करें और इनमें से प्रत्येक z-स्टैक्स से अधिकतम अनुमान बनाएं। ईडीयू-पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या की गणना करके और अधिकतम प्रक्षेपण छवियों (चित्रा 5 सी) के भीतर होचस्ट काउंटरस्टेन द्वारा पहचाने गए कोशिकाओं की कुल संख्या से विभाजित करके एचपीएएएफ प्रसार को मापें।

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल बताता है कि मानव ऊतकों की नकल करने वाले ज्यामिति में फाइब्रोब्लास्ट सक्रियण का अध्ययन करने के लिए गतिशील और अस्थायी कठोरता में सक्षम संरचनाओं को बनाने के लिए एक समर्थन स्नान के भीतर 3 डी बायोप्रिंट फोटोटेनेबल हाइड्रोगेल कैसे करें। सबसे पहले, प्रोटोकॉल ने समझाया कि इस फोटोटेनेबल पॉलिमर सिस्टम की रीढ़ पीईजीएमए को कैसे संश्लेषित किया जाए। परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी माप ने 96.5% (चित्रा 1) पर सफल पीईजीएमए कार्यात्मकता दिखाई। इस प्रक्रिया के लिए 90% या उससे अधिक के कार्यात्मकमान स्वीकार्य हैं। इसके बाद, फुफ्फुसीय वाहिका की नकल करने के लिए एक खोखले सिलेंडर का 3 डी सीएडी मॉडल बनाने के तरीके पर विवरण प्रस्तुत किए गए हैं। एक डाउनलोड करने योग्य 3 डी सीएडी मॉडल पूरक फ़ाइल 1 में प्रदान किया गया है, जबकि इस डिजाइन के लिए संबंधित जी-कोड पूरक फ़ाइल 2 में उपलब्ध है। इस सीएडी मॉडल ने निम्नलिखित आयामों के साथ निर्माण का उत्पादन किया: 4 मिमी ऊंचाई, 4 मिमी आंतरिक व्यास, और 300 μm दीवार मोटाई।

बायोप्रिंटर स्थापित करने के लिए निर्देश प्रस्तुत किए गए हैं (चित्रा 2)। प्रिंट हेड को सुरक्षित रूप से इकट्ठा करना और इसे बांधना ताकि ग्लास सिरिंज और सुई एक्सट्रूड बायोइंक सीधे नीचे दिए गए समर्थन स्नान वाले कुएं में एक महत्वपूर्ण कदम है (चित्रा 2 और चित्रा 3 ए)। तालिका 1 बायोइंक घटकों के लिए स्टॉक सांद्रता तैयार करने के लिए आवश्यक जानकारी प्रदान करती है और प्रतिनिधि परिणामों के रूप में इन अध्ययनों में उपयोग की जाने वाली बायोइंक संरचना को प्राप्त करने के लिए सही मात्रा प्रदान करती है। अंतिम बायोइंक फॉर्मूलेशन 70:30 डीटीटी: एमएमपी 2-डिग्रेडेबल क्रॉसलिंकर्स, 2 एमएम सीजीआरजीडीएस और 2.5 डब्ल्यूटी% पीईओ के 0.375 मोलर अनुपात (अल्फा: थिओल) के साथ 17.5 डब्ल्यूटी% पीईजीएमए था। यह प्रतिक्रिया सहसंयोजक रूप से सिस्टीन पर एक मुक्त थिओल और एक अल्फा मोइटी के बीच प्रतिक्रिया के माध्यम से हाइड्रोगेल नेटवर्क के भीतर सीजीआरजीडीएस पेप्टाइड को बांधती है। बायोइंक और सपोर्ट बाथ स्लरी समाधानों के पीएच को क्रमशः 6.2 और 9 के मूल्यों में समायोजित किया गया था। एक अम्लीय बायोइंक और बुनियादी समर्थन स्नान घोल के इस संयोजन ने 3 डी बायोप्रिंटेड संरचनाओं के पोलीमराइजेशन की सुविधा प्रदान की और बेलनाकार संरचनाओं को बनाए रखा (चित्रा 4 ए-सी)। दिन 7 पर, 91 ± 2% कोशिकाओं को जीवित दाग दिया गया और दिन 14 तक, 85 ± 3% अभी भी व्यवहार्य थे (एसईएम, एनोवा, ट्यूकी एचएसडी ± औसत) और पी < 0.05 (चित्रा 4 डी, ई) के साथ सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण थे।

अंत में, इस प्रोटोकॉल ने विस्तार से बताया कि कैसे 3 डी बायोप्रिंटेड संरचनाओं को द्वितीयक पोलीमराइजेशन प्रतिक्रिया के फोटोदीक्षा (चित्रा 3 बी) के माध्यम से कठोर किया जाए। डेविस-हॉल एट अल की मूल पांडुलिपि ने समानांतर प्लेट रिओलॉजी के माध्यम से प्रदर्शित किया कि 3 डी बायोप्रिंटेड संरचनाओं में 4.7 ± 0.09 केपीए का प्रारंभिक लोचदार मापांक था और फोटोइनिश्ड कठोरता के बाद 12.8 ± 0.47 केपीए5 तक बढ़ गया। फाइब्रोब्लास्ट सक्रियण का मूल्यांकन 7 वें दिन अल्फा चिकनी मांसपेशी एक्टिन (एएसएमए) को व्यक्त करने वाले फाइब्रोब्लास्ट की संख्या को निर्धारित करके किया गया था। कठोर हाइड्रोगेल संरचनाओं के भीतर फाइब्रोब्लास्ट का एक बड़ा प्रतिशत नरम नमूने (65 ± 4%) (एसईएम, मैन-व्हिटनी यू परीक्षण ± औसत) की तुलना में पी < 0.05 (चित्रा 5 ए, बी) के सांख्यिकीय महत्व के साथ सक्रिय (88 ± 2%) था। इसी तरह, कठोर संरचनाओं में 66 ± 6% फाइब्रोब्लास्ट ्स ईडीयू के लिए सकारात्मक थे, एक प्रसार मार्कर, नरम स्थिति में 39 ± 6% फाइब्रोब्लास्ट (मतलब ± एसईएम, मैन-व्हिटनी यू परीक्षण) पी < 0.05 (चित्रा 5 सी, डी) के सांख्यिकीय महत्व के साथ। साथ में, ये परिणाम समर्थन करते हैं कि एक कठोर माइक्रोएन्वायरमेंट ने 3 डी बायोप्रिंटेड मॉडल के भीतर फाइब्रोटिक सक्रियण मार्करों में काफी वृद्धि की है।

पूरक फ़ाइल 1: कंप्यूटर-एडेड डिज़ाइन (सीएडी) फ़ाइल। फ़ाइल में 4 मिमी ऊंचाई, 4 मिमी आंतरिक व्यास और 300 μm मोटाई का एक सिलेंडर ज्यामिति है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: G-कोड फ़ाइल। फ़ाइल 4 मिमी ऊंचाई, 4 मिमी आंतरिक व्यास और 300 μm मोटाई के सिलेंडर ज्यामिति से जुड़ी है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

नियंत्रित प्रकाश जोखिम के जवाब में दोहरे चरण के पोलीमराइजेशन प्रतिक्रियाएं स्थानिक और लौकिक नियंत्रण के साथ बायोमैटेरियल्स को कठोर कर सकती हैं। कई अध्ययनों नेविभिन्न प्लेटफार्मों 5,8,9,10,11,21,22,23 में सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन का मूल्यांकन करने के लिए इस तकनीक का उपयोग किया है। विशेष रूप से, फोटोमास्क या दो-फोटॉन उत्तेजना विधियों का उपयोग 3 डी-बायोप्रिंटेड निर्माण के असतत वर्गों को कठोर करने के लिए किया जा सकता है और जांच की जा सकती है कि कोशिकाएं सीमित क्षेत्रों या इंटरफेस में गतिशील कठोरता का जवाब कैसे देती हैं जैसा कि हमारे पिछले प्रकाशनों 5,8 में वर्णित है। सेल प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए सार्थक टाइमपॉइंट चुनना महत्वपूर्ण है। यहां,सक्रियण अध्ययन को सक्षम करने के लिए एमएमपी-डिग्रेडेबल फोटोटेनेबल हाइड्रोगेल के भीतर फाइब्रोब्लास्ट को फैलने की अनुमति देने के बाद संरचनाओं को कठोर कर दिया गया था। यह प्रोटोकॉल बताता है कि कैसे एक फोटोटेनेबल हाइड्रोगेल बायोइंक विकसित किया जाए और बायोइंक और सपोर्ट बाथ संयोजन का उपयोग करके 3 डी बायोप्रिंटेड निर्माण बनाया जाए जिसने पीएच-उत्प्रेरित पोलीमराइजेशन प्रतिक्रिया शुरू की। फुफ्फुसीय वाहिका की नकल करने के लिए डिज़ाइन किए गए अलग-अलग ज्यामिति के साथ 3 डी बायोप्रिंटेड संरचनाओं के पोलीमराइजेशन को बुनियादी समर्थन स्नान घोल में अम्लीय बायोइंक को बाहर निकालकर सुविधाजनक बनाया गया था। विवो ऊतक में कठोरता फाइब्रोसिस की एक पहचान विशेषता है और यह व्यापक रूप से स्थापित है कि सेलुलर माइक्रोएन्वायरमेंट के भीतर यांत्रिक परिवर्तन रोग की प्रगति के शक्तिशाली चालक हैं 10,23,24,25. इसलिए, यह प्रोटोकॉल और मंच फाइब्रोटिक रोगजनन में शामिल मेकेनोसेंसेटिव सेलुलर तंत्र के बारे में महत्वपूर्ण विवरण प्रदान करने में जबरदस्त क्षमता रखता है। निर्माण ज्यामिति और गुणों को बदलने की क्षमता, कठोरता शुरू करने के लिए विशिष्ट समय बिंदु निर्धारित करना, और यह तय करना कि बायोइंक में किस प्रकार की कोशिकाओं को शामिल करना है, इस विधि के निर्विवाद लाभ हैं। इन चरों को अन्य पीएच-उत्प्रेरित बायोमैटेरियल्स और अन्य जैविक अनुप्रयोगों के लिए प्रासंगिक सूक्ष्म पर्यावरणीय कठोरता के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए तैयार किया जा सकता है।

पीईजीएमए को बायोइंक बैकबोन के रूप में चुना गया था क्योंकि यह हाइड्रोलाइटिक रूप से स्थिर है और पॉली (एथिलीन ग्लाइकॉल) मेथैक्रिलेट (पीईजीएमए) 5,8,9 जैसे अन्य आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले दोहरे चरण पोलीमराइजेशन सिस्टम की तुलना में अधिक प्रतिक्रियाशील है। एक एमएमपी 2-डिग्रेडेबल पेप्टाइड अनुक्रम को एक क्रॉसलिंकर के रूप में शामिल किया गया था ताकि एडवेंटियल फाइब्रोब्लास्ट ्स को एमएमपी 2 एंडोपेप्टिडेस का उत्पादन करने की अनुमति मिल सके ताकि बाह्य माइक्रोएन्वायरमेंट26 को फिर से तैयार किया जा सके। हमारे समूह और अन्य लोगों ने दिखाया है कि सेल-डिग्रेडेबल क्रॉसलिंकर की उपस्थिति फाइब्रोब्लास्ट प्रसार में सुधार करती है और सक्रियण 5,27 के लिए आवश्यक एक विशेषता है। उच्च PEGaMA कार्यात्मकता इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है, खासकर जब अव्यक्त किए गए AMPA समूह क्लिक-रसायन विज्ञान सुविधा को सक्षम करते हैं। 95% से ऊपर कार्यात्मकता के साथ PEGaMA सबसे अच्छा है, लेकिन 90% कार्यात्मक PEGaMA ने इस प्रोटोकॉल के साथ काम किया है। यदि पीईजीएमए का कार्यात्मककरण वांछित से कम है, तो इसके परिणामस्वरूप असंगत पोलीमराइजेशन हो सकता है, खासकर जब उच्च सेल घनत्व होता है। इस चुनौती को दूर करने के लिए, सेल गोली की मात्रा को ध्यान में रखने और तालिका 1 में जोड़े गए सेल कल्चर मीडिया और पीएच समायोजन अभिकर्मकों की मात्रा से इस मात्रा को घटाने की सिफारिश की जाती है। समर्थन स्नान में एयर पॉकेट, सिरिंज में समय से पहले पोलीमराइजेशन, या ऊपर वर्णित विभिन्न समाधानों के गलत पीएच मान अन्य सामान्य विफलता तंत्र हैं जो इस प्रोटोकॉल के साथ देखे गए हैं।

बायोइंक और सपोर्ट बाथ पीएच में समायोजन प्रत्येक प्रयोग के लिए व्यक्तिगत रूप से बैच-टू-बैच भिन्नता या समय के साथ पीएच में परिवर्तन के लिए किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, जब पीएच 7 टीसीईपी का उपयोग कुछ पीईजीएमए बैचों के साथ इन बायोइंक घटकों को फिर से निलंबित करने के लिए किया गया था, तो समग्र बायोइंक पीएच को 6.2 के बजाय 7-7.5 के करीब समायोजित करने की आवश्यकता थी। पिछला काम दर्शाता है कि 6.2-9 से पीएच समायोजित मीडिया के संपर्क में आने वाले फाइब्रोब्लास्ट इन पीएच परिवर्तनों का सामना कर सकते हैं और व्यवहार्यताबनाए रख सकते हैं। इसके अतिरिक्त, पिछले काम से पता चला है कि कोशिकाओं के भीतर एम्बेडेड कोशिकाओं के साथ हाइड्रोगेल को पॉलीमराइज़ करने के लिए उपयोग किए जाने वाले नियंत्रित यूवी प्रकाश एक्सपोजर का सेल व्यवहार्यता पर न्यूनतम प्रभाव पड़ता है और फाइब्रोब्लास्ट ट्रांसस्क्रिप्टम 8,9,10,28 को नहीं बदलता है। हालांकि, अगर कम सेल व्यवहार्यता को मापा जाता है, तो पीएच समायोजन इस समस्या को हल करने के लिए उठाया गया पहला कदम होना चाहिए। यह अच्छी तरह से स्थापित है कि पीएच का सेल व्यवहार्यता 5,9,29 पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है, इसलिए उपयोगकर्ताओं को विशिष्ट सेल लाइनों के साथ समान व्यवहार्यता परीक्षण करना चाहिए जो पीएच समायोजन के प्रति अधिक संवेदनशील हो सकते हैं। इसके अतिरिक्त, बड़े पैमाने पर प्रयोगों का प्रयास करने से पहले, छोटे बैच आकार के साथ इस प्रोटोकॉल के किसी भी विचलन का परीक्षण करने का सुझाव दिया जाता है।

वर्तमान में, इन-हाउस बायोप्रिंटर में केवल एक एक्सट्रूज़न प्रिंटहेड है और सुई को मैन्युअल रूप से उन्मुख करने और प्रत्येक नमूने के लिए प्रिंट कमांड देने के लिए महत्वपूर्ण समय-गहन उपयोगकर्ता इनपुट की आवश्यकता होती है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बायोप्रिंटर30,31,32 इन सीमाओं को संबोधित करते हैं लेकिन काफी अधिक महंगे हैं। भविष्य के काम का उद्देश्य सभी तीन अलग-अलग फुफ्फुसीय वाहिका परतों (ट्यूनिका इंटिमा, ट्यूनिका मीडिया और ट्यूनिका एडवेंटिटिया) को फिर से बनाने के लिए एक अलग सेल प्रकार वाले कई परत संरचनाओं को प्रिंट करना है। दूसरों द्वारा किया गया काम पहले से ही साबित कर रहा है कि गैर-फोटोटेनेबल सामग्री के साथ यह बायोप्रिंटिंग तकनीक उन्नत और ज्यामितीय रूप से जटिल मॉडल का उत्पादन कर सकती है, जिसमें रक्त वाहिका संरचनाओं और पूरे मानव हृदय 6,7,20,33 को विभाजित करना शामिल है। इस प्रोटोकॉल में प्रदान की गई विधियों को विभिन्न बायोप्रिंटर के साथ पुन: पेश किया जा सकता है। यह शोधकर्ताओं को विभिन्न प्रकार की सामग्रियों को 3 डी बायोप्रिंट करने में सक्षम करेगा जो पीएच-उत्प्रेरित पोलीमराइजेशन प्रतिक्रियाओं से गुजरते हैं और ऊतक होमियोस्टैसिस, बीमारी और मरम्मत के किसी भी संख्या में मॉडल इंजीनियर करते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है। इस पांडुलिपि के कुछ हिस्सों को आईओपी प्रकाशन https://doi.org/10.1088/1758-5090/aca8cf की अनुमति से © पुन: प्रस्तुत किया गया है। 5 सभी अधिकार सुरक्षित.

Acknowledgments

एडम फीनबर्ग (कार्नेगी मेलन विश्वविद्यालय) और उन लोगों को स्वीकार करना चाहते हैं जिन्होंने 3 डी बायोप्रिंटिंग ओपन-सोर्स कार्यशाला की मेजबानी की। इन व्यक्तियों ने फ्रेश बायोप्रिंटिंग की तकनीकों को सीखना और इन अध्ययनों के लिए उपयोग किए जाने वाले 3 डी बायोप्रिंटर का निर्माण करना संभव बना दिया। इसके अतिरिक्त, लेखक Biorender.com को स्वीकार करना चाहते हैं, जिसका उपयोग इस पांडुलिपि में आंकड़े बनाने के लिए किया गया था। इस काम को कई समूहों या वित्त पोषण स्रोतों द्वारा समर्थित किया गया था, जिसमें रोज कम्युनिटी फाउंडेशन (डीडीएच और सीएमएम), कोलोराडो पल्मोनरी वैस्कुलर डिजीज रिसर्च अवार्ड (डीडीएच और सीएमएम), अवार्ड 1941401 (सीएमएम) के तहत नेशनल साइंस फाउंडेशन, अवार्ड डब्ल्यू 81एक्सडब्ल्यूएच -20-1-0037 (सीएमएम) के तहत सेना विभाग, पुरस्कार आर 21 CA252172 (सीएमएम) के तहत एनआईएच का राष्ट्रीय कैंसर संस्थान शामिल है। कोलोराडो विश्वविद्यालय में महिला स्वास्थ्य अनुसंधान के लिए लुडमैन फैमिली सेंटर (डीडीएच और सीएमएम), राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान आर 01 HL080396 (सीएमएम), आर 01 HL153096 (सीएमएम), एफ 31 HL151122 (डीडीएच), और टी 32 HL072738 (डीडीएच और एटी) के तहत पुरस्कार आर01 (सीएमएम), आर 01 (सीएमएम), एफ 31 (डीडीएच), और टी 32 (डीडीएच और एटी)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AccuMax Radiometer/Photometer Kit Spectronics Corporation XPR-3000 To measure light intensity, used for photostiffening
Acetic Acid  Fisher Scientific BP2401-500 Used during PEGaMA synthesis
Acetone Fisher Scientific A184 Used with the cryosections
ActinGreen 488 ReadyProbes Fisher Scientific R37110 Used for staining
Aluminum Foil Reynolds F28028
Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) Sigma-Aldrich 401757-1L Used during PEGaMA synthesis
Argon Compressed Gas Airgas AR R300 Used during PEGaMA synthesis
8 Arm Poly(ethylene glycol)-hydroxyl (PEG-OH) JenKem Technology 8ARM-PEG-10K Used during PEGaMA synthesis
365 nm Bandpass Filter Edmund Optics 65-191 Used for photostiffening
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP9700-100 Used during staining process
Buchner Funnel Quark Glass QFN-8-14 Used during PEGaMA synthesis
Calcein AM Invitrogen 65-0853-39 Used during staining process
Celite 545 (Filtration Aid) EMD Millipore CX0574-1 Used during PEGaMA synthesis
Charged Microscope Slides Globe Scientific 1358W
Chloroform-d Sigma-Aldrich 151823-10X0.75ML Used to characterize PEGaMA
Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit Invitrogen C10637 Used for staining
50 mL Conical Tubes CELLTREAT 667050B
Cryogenic Safety Kit Cole-Parmer EW-25000-85
Cryostat Leica CM 1850-3-1
Dialysis Tubing Repligen 132105
4’,6-Diamidino-2-Phylindole (DAPI) Sigma-Aldrich D9542-1MG Used for staining
Diethyl Ether Fisher Scientific E1384 Used during PEGaMA synthesis
1,4-Dithiothreitol (DTT)  Sigma-Aldrich 10197777001 Bioink component
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Cytiva SH30271.FS
Filter Paper Whatman 1001-090 Used during PEGaMA synthesis
Freezone 2.5L Freeze Dry System Labconco LA-2.5LR Lyophilizer
Fusion 360 Autodesk N/A Software download
2.5 mL Gastight Syringe Hamilton 81420 Used for bioprinting
15 Gauge 1.5" IT Series Tip Jensen Global JG15-1.5X Used for bioprinting
30 Gauge 0.5" HP Series Tip Jensen Global JG30-0.5HPX Used for bioprinting
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 555 Antibody Fisher Scientific A21422 Used for staining
Glycine Fisher Scientific C2H5NO2 Used during staining process
Hemocytometer Fisher Scientific 1461
Hoechst Thermo Scientific 62249 Used during staining process
Human Pulmonary Artery Adventitial Fibroblasts (HPAAFs) AcceGen ABC-TC3773  From a 2-year-old male patient
Hydrochloric Acid (HCl) Fisher Scientific A144-500 Used to pH adjust solutions
ImageJ National Institutes of Health (NIH) N/A Free software download
ImmEdge® Pen Vector Laboratories H-4000 Used during staining process
Incubator VWR VWR51014991
LifeSupport Gelatin Microparticle Slurry (Gelatin Slurry) Advanced Biomatrix 5244-10GM Used for bioprinting
Light Microscope Olympus CKX53 Inverted light microscope
Lithium Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinate (LAP) Sigma-Aldrich 900889-5G Photoinitiator used for photostiffening
Liquid Nitrogen N/A N/A
LulzBot Mini 2  LulzBot N/A Bioprinter adapted
Methacryloxyethyl Thiocarbamoyl Rhodamine B  Polysciences Inc. 669775-30-8
2-Methylbutane Sigma-Aldrich M32631-4L
Microman Capillary Pistons CP1000 VWR 76178-166 Positive displacement pipette tips
MMP2 Degradable Crosslinker (KCGGPQGIWGQGCK) GL Biochem N/A Bioink component
Mouse Anti-Human αSMA Monoclonal Antibody Fisher Scientific MA5-11547 Used for staining
OmniCure Series 2000  Lumen Dynamics S2000-XLA UV light source used for photostiffening
Paraformaldehyde (PFA)  Electron Microscopy Sciences 15710 Used to fix samples
pH Meter Mettler Toledo  FP20 
pH Strips Cytiva 10362010
Phosphate Buffered Saline (PBS) Hyclone Laboratories, Inc. Cytiva SH30256.FS
Pipette Set Fisher Scientific 14-388-100
10 µL Pipette Tips USA Scientific 1120-3710
20 µL Pipette Tips USA Scientific 1183-1510
200 µL Pipette Tips USA Scientific 1111-0700
1000 µL Pipette Tips USA Scientific 1111-2721
Poly(Ethylene Glycol)-Alpha Methacrylate (PEGαMA) N/A N/A Refer to manuscript for synthesis steps
Poly(Ethylene Oxide) (PEO) Sigma-Aldrich 372773-250G Bioink component
Positive Displacement Pipette Fisher Scientific FD10004G 100-1000 µL
Potassium Hydroxide (KOH) Sigma-Aldrich 221473-500G Used to pH adjust solutions
ProLong Gold Antifade Reagent Invitrogen P36930 Used during staining process
Pronterface All3DP N/A Software download
Propidium Iodide Sigma-Aldrich P4864-10ML Used for staining
RGD Peptide (CGRGDS) GL Biochem N/A Bioink component
Rocker VWR 10127-876
Rotary Evaporator  Thomas Scientific 11100V2022 Used during PEGaMA synthesis
Rubber Band Staples 808659
Schlenk Flask  Kemtech America F902450 Used during PEGaMA synthesis
Slic3r Slic3r N/A Software download
Smooth Muscle Cell Growth Medium-2 (SmGM-2) BulletKit Lonza CC-3182 Kit contains CC-3181 and CC-4149 components
Sodium Hydride  Sigma-Aldrich 223441-50G Used during PEGaMA synthesis
Sorvall ST 40R Centrifuge Fisher Scientific 75-004-525
Stir Bar VWR 58948-091
Syringe Filter VWR 28145-483 Used to sterile filter solutions
T-75 Tissue-Cultured Treated Flask VWR 82050-856 Used for cell culture work
Tissue-Tek Cyromold Sakura 4557
Tissue-Tek O.C.T Compound (OCT) Sakura 4583
Tris(2-Carboxyethyl) Phosphine (TCEP) Sigma-Aldrich C4706-2G
Triton X-100 Fisher Bioreagents C34H622O11 Used during staining process
Trypan Blue Sigma-Aldrich T8154-20ML Used for cell culture work
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25-300-062 Used for cell culture work
Tween 20 Fisher Bioreagents C58H114O26 Used during staining process
Upright Microscope Olympus BX63F Fluorescent microscope capabilities
Water Bath PolyScience WBE20A11B
24-Well Tissue Culture Plates Corning 3527

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Tanneberger, A. E., Blair, L., Davis-Hall, D., Magin, C. M. 3D Bioprinting Phototunable Hydrogels to Study Fibroblast Activation. J. Vis. Exp. (196), e65639, doi:10.3791/65639 (2023).

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