Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

3D bioprinting fototunable hydrogeler for å studere fibroblastaktivering

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65639
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3
1Department of Bioengineering, University of Colorado Denver | Anschutz Medical Campus, 2Department of Pediatrics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Division of Pulmonary Sciences and Critical Care Medicine, Department of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

Denne artikkelen beskriver hvordan du 3D bioprint fototunable hydrogeler for å studere ekstracellulær matriksavstivning og fibroblastaktivering.

Abstract

Fototunable hydrogeler kan transformere romlig og tidsmessig som respons på lyseksponering. Inkorporering av disse typer biomaterialer i cellekulturplattformer og dynamisk utløsende endringer, for eksempel økende mikromiljøstivhet, gjør det mulig for forskere å modellere endringer i den ekstracellulære matrisen (ECM) som oppstår under fibrotisk sykdomsprogresjon. Her presenteres en metode for 3D-bioprinting av et fototunable hydrogelbiomateriale som er i stand til to sekvensielle polymerisasjonsreaksjoner i et gelatinstøttebad. Teknikken med Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels (FRESH) bioprinting ble tilpasset ved å justere pH i støttebadet for å lette en Michael-addisjonsreaksjon. Først ble bioblekket som inneholdt poly (etylenglykol) -alfametakrylat (PEGαMA) reagert off-støkiometri med en cellenedbrytbar tverrbinder for å danne myke hydrogeler. Disse myke hydrogelene ble senere utsatt for fotoinitator og lys for å indusere homopolymerisering av uomsatte grupper og stive hydrogelen. Denne protokollen dekker hydrogelsyntese, 3D-bioprinting, fotostivering og endepunktkarakteriseringer for å vurdere fibroblastaktivering i 3D-strukturer. Metoden som presenteres her gjør det mulig for forskere å 3D-bioprinte en rekke materialer som gjennomgår pH-katalyserte polymerisasjonsreaksjoner og kan implementeres for å konstruere ulike modeller av vevshomeostase, sykdom og reparasjon.

Introduction

3D-bioprinting er en transformativ teknologi som gjør det mulig for forskere å nøyaktig deponere celler og biomaterialer i 3D-volumer og gjenskape den komplekse hierarkiske strukturen til biologiske vev. I løpet av det siste tiåret har fremskritt innen 3D-bioprinting skapt bankende humant hjertevev1, funksjonelle modeller av nyrevev2, modeller av gassutveksling i lunge3 og tumormodeller for kreftforskning4. Oppfinnelsen av innebygde 3D-bioprintingsteknikker, for eksempel Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogel (FRESH) bioprinting, har gjort det mulig å reprodusere komplekse bløtvevstrukturer som lungeblodkar5 og til og med menneskehjerte6 i 3D. FRESH 3D-bioprinting muliggjør lag-for-lag-utskrift av myke bioblekk med lav viskositet gjennom ekstrudering i et støttebad for skjærtynning. Støttebadet består av et materiale som tettpakkede gelatinmikropartikler som fungerer som en Bingham-plast og opprettholder den tiltenkte formen og strukturen til bioblekket etter utskrift. Når den trykte konstruksjonen har størknet, kan støttebadet løses opp ved å øke temperaturen til 37 °C7.

En nylig oversiktsartikkel oppsummerte materialene som har blitt 3D-bioprintet i ulike publikasjoner ved hjelp av FRESH-teknikk. Disse naturlig avledede materialene spenner fra kollagen type I til metakrylert hyaluronsyre og representerer flere forskjellige geleringsmekanismer7. De fleste forskningsstudier utført ved hjelp av denne 3D-bioprintingsteknikken bruker statiske biomaterialer som ikke endres som respons på ytre stimuli. Dynamiske fototunable hydrogel biomaterialer har blitt brukt av vårt laboratorium og andre 8,9,10,11,12 for å modellere en rekke fibrotiske sykdommer. I motsetning til statiske biomaterialer tillater fototunable bioinks at en myknet modell med lavere elastisk modulverdi opprettes og senere stivnes for å utforske cellulære responser på økning i mikromiljøavstivning.

Fibrotiske sykdommer er preget av en økning i den ekstracellulære matriksproduksjonen som kan forårsake arrdannelse og stivning13. Vevsavstivning kan initiere ytterligere skade og ødeleggelse av det berørte vevet, forårsaker permanent organskade og til og med død; Fibrotiske lidelser er ansvarlig for en tredjedel av dødeligheten over hele verden. Fibroblaster produserer overflødig og avvikende ekstracellulær matrise i denne sykdomstilstanden14,15. Økt fibroblastproliferasjon og ekstracellulær matriksavsetning stiver vevet ytterligere og aktiverer en profibrotisk positiv tilbakemeldingssløyfe16,17,18,19. Å studere fibroblastaktivering er viktig for å forstå fibrotiske sykdommer. Her presenterer vi human pulmonal arteriell hypertensjon (PAH) som et eksempel på en fibrotisk lidelse der det er viktig å etterligne 3D-geometrien til blodkaret ved hjelp av 3D-bioprinting og introdusere de dynamiske avstivningsegenskapene til fototjusterbare hydrogeler. PAH er en tilstand der trykket i de viktigste lungearteriene overgår normale nivåer og påfører belastning på hjertet, øker human pulmonal arterie adventitial fibroblast (HPAAF) aktivering og stiver blodkarvevet16,17,18,19. En fototunable poly (etylenglykol)-alfametakrylat (PEGαMA) bioblekkformulering muliggjør tidsmessig stivning i konstruksjoner og hjelper til med å modellere både sunt vev og sykdomsprogresjon 5,8,9,10. Utnyttelse av denne unike egenskapen muliggjør kvantifisering av HPAAF-aktivering og spredning som respons på mikromiljøavstivning i 3D, og kan gi verdifull innsikt i de cellulære mekanismene som er involvert i denne sykdommen. Protokollen beskrevet her vil tillate forskere å lage 3D-modeller som rekapitulerer endringer i det ekstracellulære mikromiljøet under sykdomsprogresjon eller vevsreparasjon og studerer fibroblastaktivering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. PEGαMA-syntese og karakterisering

MERK: Poly (etylenglykol)-alfametakrylat (PEGαMA) syntese ble tilpasset fra Hewawasam et al . og utført under fuktfrie forhold9.

  1. Vei reaktantene.
    MERK: Vei for eksempel ut 5 g 10 kg / mol 8-arm PEG-hydroksyl (PEG-OH) og 0,38 g natriumhydrid (NaH) (se materialfortegnelse).
  2. Tilsett en rørestang til 250 ml Schlenk-kolbe og rens med argon.
  3. Oppløs PEG-OH i det laveste volumet av vannfri tetrahydrofuran (THF) som kreves for oppløsning i Schlenk-kolben.
    MERK: Omtrent 80 ml THF vil oppløse 5 g PEG-OH. Legg til den minimale mengden THF som kreves for å oppløse PEG-OH.
  4. Tilsett 3 ganger molaroverskudd NaH til reaksjonsblandingen og rør ved romtemperatur (RT) i 30 minutter.
  5. Tilsett 6 ganger molaroverskudd etyl 2- (brometyl)akrylat (EBrMA, se materialfortegnelse) dråpevis til Schlenk-kolben og dekk reaksjonsbeholderen med aluminiumsfolie for å beskytte den mot lys. Rør reaksjonen ved romtemperatur i ca. 48 timer.
    MERK: For 5 g PEG-OH og 0,38 g NaH, bruk 3,68 ml EBrMA for denne reaksjonen.
  6. Tilsett noen dråper 1 N eddiksyre for å slukke reaksjonen. Vakuumfiltrer løsningen gjennom et filtreringshjelpemiddel.
    MERK: Tilsetning av eddiksyre vil produsere gassbobler. Slutt å tilsette eddiksyredråper når bobler slutter å dannes, da dette indikerer at blandingen har blitt slukket vellykket.
  7. Konsentrer filtratet på en roterende fordamper og felles ut i 4 °C dietyleter. La bunnfallet være beskyttet mot lys ved 4 °C i 12-18 timer.
  8. Legg til et Whatman-filterpapir i en Buchner-trakt. Hell reaksjonsblandingen langsomt over filterpapiret og bruk vakuumsug for å skille bunnfallet fra dietyleter. Samle bunnfallet i en tørr og ren filtreringskolbe.
  9. Vakuumtørk produktet i minst 5 timer eller over natten ved romtemperatur og oppløs i minimum volum avionisert vann som trengs. Overfør det oppløste produktet til dialyseslangen (se materialfortegnelsen) og dialyser mot 3,5 liter avionisert vann i minst fire dager. Bytt dialysevann hver 12.
    MERK: Produktet vil fremstå som helt tørt rent hvitt fast pulver etter vakuumtørking.
  10. Blitzfrys produktet og frys ned i ca. 72 timer eller til det er helt tørt.
  11. Løs opp produktet i kloroform D (CDCl3). Kjør prøven med 1H NMR med en protokoll som utfører 248 skanninger med 2,5 s avslapningstid.
  12. Kontroller produktets funksjonalisering og renhet ved å kalibrere CDCl 3-løsningsmiddeltopp til 7,26 spm. Integrer toppen for PEG-ryggradsprotoner (d3.71) og kalibrer integrasjonen til 114.
  13. Integrer de resterende toppene: PEGαMA 1 H NMR (300 MHz, CDCl 3): d (ppm) 1,36(t, 3H, CH 3-),3,71 (s, 114H, PEG CH 2-CH 2), 4,29 (t, s, 4H, -CH 2-C (O) -O-O, -O-CH 2-C (= CH 2)-), 5,93 (q, 1H, -C = CH 2), 6,34 (q, 1H, -C = CH 2) og sammenlign integrasjonen for αMA-alkenendegruppens topper til forventet verdi (1H) basert på PEG-ryggradskalibreringen (Figur 1).
    MERK: Gjennomsnitt de to toppene merket som "a" (figur 1) og multipliser med 100 for å oppnå gjennomsnittlig PEGαMA-funksjonaliseringsprosent.

Figure 1
Figur 1: Proton NMR bekreftet vellykket PEGαMA-funksjonalisering. NMR-analyse ble utført i kloroform-D (CDCl3) og viste funksjonalisering hos 96,5 %. PEGαMA 1 H NMR (300 MHz, CDCl3): d (ppm) 1,36(t, 3H, CH 3-),3,71 (s, 114H, PEG CH 2-CH 2), 4,29 (t, s, 4H, -CH 2-C (O) -O-O, -O-CH2-C (= CH 2)-), 5,93 (q, 1H, -C = CH 2), 6,34 (q, 1H, -C = CH 2). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

2. Modelldesign og 3D bioprinteroppsett

MERK: En kommersielt tilgjengelig 3D-skriver (se materialfortegnelse) ble modifisert ved å erstatte termoplastekstruderen med en spesialbygd sprøytepumpeekstruder og tilpasset fra Hinton et al.20. Open-source design er tilgjengelig online: https://3d.nih.gov/users/awfeinberg.

  1. Åpne Fusion 360-programvaren (se Materialliste) og lag en 3D-datamaskinassistert hul sylinderdesign.
    MERK: En nedlastbar fil som kan brukes til dette trinnet og etterligner blodkargeometri, finner du i tilleggsfil 1.
  2. Lagre filen og åpne den i Slic3r-programvaren (se Materialfortegnelse). Dobbeltsjekk at alle parametrene er som ønsket, og trykk deretter på eksporter G-kode-knappen. Lagre G-koden på datamaskinen.
  3. Åpne Pronterface-programvaren (se Materialfortegnelse) og last opp G-kodefilen.
    MERK: Pronterface-programvaren grensesnitt med bioprinteren og gir tilstrekkelig maskinvareinngangskontroll. En brukbar G-kodefil finner du i tilleggsfil 2.
  4. Overfør bioprinteren og alle tilhørende deler til et biosikkerhetsskap (BSC) ved hjelp av aseptiske teknikker.
  5. Monter en 30 G 0,5" lang butt nålespiss (se Materialfortegnelse) til sprøyten i trykkglasset og sett den til side.
  6. Koble strømledningen til bioprinteren til en stikkontakt. Trykk på den røde strømknappen foran på bioprinteren for å slå den på. Koble USB-ledningen (Universal Serial Bus) mellom datamaskinen og bioprinteren, og kontroller at alle ledningstilkoblinger er opprettet og koblet til.

3. Forberedelse av støttebadet og reagenser

MERK: Utfør alle trinnene i et biosikkerhetsskap ved hjelp av aseptiske teknikker.

  1. Forbered cellekulturmedium bestående av SmBM Basal Medium (CC-3181) og SmGM-2 SingleQuots kosttilskudd (CC-4149), unntatt føtalt bovint serum (FBS), i henhold til produsentens instruksjoner. Oppbevares ved 4 °C inntil bruk.
  2. Aliquot 50 ml av cellekulturmediet og tilsett 1% v / v av FBS (CC-4149) (se materialfortegnelse) for å lage et lavserummedium. Oppbevares ved 4 °C inntil bruk.
  3. Balanser gelatinslampulveret i henhold til produsentens instruksjoner ved bruk av sterile cellekulturmedier uten FBS som oppløsningsvæske (se materialfortegnelsen). Umiddelbart før bruk, juster den endelige pH i gelatinslammet til pH 9 ved hjelp av 2 M kaliumhydroksid (KOH) og/eller 2 M saltsyre (HCl) for å justere oppløsningens pH etter behov ved hjelp av en pH-måler.
  4. Fyll ønsket antall brønner på en 24-brønns plate, hver omtrent halvfull, med 1 ml gelatinoppslemming per brønn ved hjelp av en sprøyte uten nål.
    MERK: Fyll midten av brønnene jevnt og bekreft at det ikke finnes luftlommer. Trykk på platen for å fordele mikropartikkeloppslemmingen jevnt. Juster høyden og volumet av slam per brønn etter behov for å imøtekomme hver bioprintstørrelse og form. Brukere kan lage en hjemmelaget sprøyte for å overføre gelatinoppslemmingen til hver brønn. Dette kan gjøres ved å tilsette et sprøytestempel av riktig størrelse i et 50 ml reagensrør som allerede inneholder den komprimerte gelatinslammet nederst. Mens du setter inn stempelet, setter du inn en liten føringsledning ved siden av reagensrøret for å hjelpe luft å slippe ut, og fjern den deretter når stempelet er i kontakt med gelatinoppslemmingen. Umiddelbart før bruk, kutt av tuppen av reagensrøret med et barberblad for å lage et hull som gelatinoppslemmingen kan ekstrudere ut av og trykke ned på stempelet.
  5. Plasser den fylte 24-brønnsplaten på midten av bioprintertrinnet og fest den til scenen.
    MERK: Figur 2 viser et generisk bioprinteroppsett. Plasser et gummibånd rundt utskriftstrinnet for å feste en 24-brønns plate til plattformen og forhindre bevegelse.

Figure 2
Figur 2: Grunnleggende 3D-bioprinting-oppsett. Bioprinteren ble satt opp i et sterilt miljø som et biosikkerhetsskap, og skrivehodet ble montert slik at glasssprøyten og nålen ble senket vertikalt ned i utskriftsområdet for støttebadet nedenfor. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

4. Cellekultur

MERK: Utfør alle trinnene i et biosikkerhetsskap ved hjelp av aseptiske teknikker.

  1. Tine HPAAF-celler (kommersielt oppnådd, se materialtabell) og utvide dem ut i T-75 vevskulturbehandlede plastflasker som inneholder SmBM Basal Medium (CC-3181) og alle SmGM-2 SingleQuots-kosttilskudd (CC-4149) i henhold til produsentens instruksjoner (se materialfortegnelse).
    MERK: Standard cellekulturprotokoller for adherente celler bør brukes, opprettholde cellene ved 37 ° C og 5% CO2 og etterfylle media noen få dager.
  2. Når HPAAFene har nådd ~ 80-90% konfluens, aspirer mediet og skyll cellene en gang med fosfatbufret saltvann (PBS).
  3. Tilsett ca. 4 ml forvarmet 0,05 % trypsin-EDTA til hver T-75-kolbe. Vipp kolben for å sikre at hele cellekulturoverflaten er dekket med 0,05% Trypsin-EDTA-løsning. Inkuber kolbene i 3-5 min ved 37 °C og sjekk om celleløsningen.
  4. Når cellene er flytende, legg til minst 6 ml Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) til hver kolbe og overfør cellene til et 50 ml konisk rør.
  5. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 300 x g i 5 minutter ved romtemperatur for å pelletere cellene. Aspirer supernatanten fra cellepelleten og resuspender cellene i 1-3 ml medier med FBS ved hjelp av en 1000 μL pipette, noe som sikrer en encellesuspensjon.
  6. Overfør 10 μL av cellesuspensjonen til et mikrosentrifugerør. Tilsett 10 μL Trypan Blue-oppløsning og bland godt. Bruk 10 μL av denne blandingen til å telle celler i et hemocytometer ved hjelp av et omvendt lysmikroskop.
    MERK: For å oppnå en 4 x 106 celler / ml endelig bioblekkkonsentrasjon, ble 800 000 fibroblaster satt til side for hver 200 μL bioblekk.

5. Fremstilling av hydrogelbioblekk

MERK: Bioblekkpreparat ble tilpasset fra Davis-Hall et al.5. Trinn 5.1-5.2 kan gjennomføres parallelt med trinn 4.1-4.3 for å minimere tiden mellom celleinnsamling og resuspensjon i bioblekket. Utfør trinn i et biosikkerhetsskap ved hjelp av en aseptisk teknikk.

  1. Forbered en 20 mM tris(2-karboksyetyl) fosfin (TCEP, se materialfortegnelse) pH 7-løsning og sterilt filter ved hjelp av et 0,2 μm sprøytefilter. Umiddelbart før bruk, tilsett 2 M KOH og/eller 2 M HCl for å justere oppløsningens pH etter behov. Mål med pH-måler og juster deretter.
    MERK: TCEP reduserer disulfidbindinger.
  2. Klargjør en 0,25 mg/ml stamløsning av PEGαMA resuspendert i sterile cellekulturmedier uten FBS, 250 mM stamløsninger av 1,4-dithiothreitol (DTT), MMP2-nedbrytbar kryssbinder og CGRGDS (RGD) peptid (se materialfortegnelse), resuspendering av alt i 20 mM steril TCEP, og en 15 vekt% stamløsning av poly (etylenoksid) (PEO) i destillert (DI) vann ved bruk av pipetter etter behov.
  3. Etter tabell 1 som en veiledning, kombiner de respektive mengdene som trengs av PEGαMA, DTT, MMP2-nedbrytbar kryssbinder, PEO, CGRGDS og lavserumcellekulturmedier sammen med fibroblastene i et 50 ml konisk rør.
    MERK: Det anbefales å kontrollere pH med pH-striper etter å ha tilsatt alle unntatt cellekulturmediet, da denne kombinasjonen bør resultere i at pH er svært nær 6,2. Hvis det er nødvendig med ytterligere pH-justeringer, må du holde oversikt over hvor mye ekstra volum som er nødvendig for å justere pH-verdien til forløperløsningen. Få opp det totale volumet til 200 μL ved å legge til det gjenværende cellekulturmedievolumet minus eventuelt volum som tilføres under den endelige pH-justeringen.
  4. Bland bioblekket sammen ved hjelp av en pipette med positiv fortrengning for å sikre at cellene er enkeltceller og bekreft at den endelige forløperløsningen er pH 6,2 for å forhindre basekatalysert polymerisering under 3D-bioprinting.
  5. Legg bioblekket i glasssprøyten ved å fjerne stempelet og bruk en separat sprøyte med en 15 gauge 1,5" lang butt nålespiss (se materialfortegnelsen) festet for å overføre bioblekket fra sentrifugerøret til sprøyten, og pass på at det ikke dannes luftbobler i oppløsningen.
  6. Plasser glasssprøyten i skrivehodet og fest skrivehodekomponentene slik at alt er godt montert og klart for utskrift.
    MERK: På dette tidspunktet skal glasssprøyten i skrivehodet ha en 30 gauge 0,5 "lengde stump nålespiss festet til den for utskrift.

   

Komponent Konsentrasjon av lagerløsning Beløp å legge til
PEGαMA 0,25 mg/ml 140 μL
DTT 250 mM 12,24 μL
MMP2 nedbrytbar tverrbinder 250 mM 5,25 μL
RGD 250 mM 1,6 μL
PEO 15 vekt% 33,33 μL
Aktiveringsmedier og/eller pH-justeringsreagenser - 7,58 μL
Fibroblaster - 800000 celler

Tabell 1: Eksempelvolum som kreves for å fremstille 200 μL bioblekk (hydrogelforløperløsning og fibroblastceller).

6.3D bioprinting

MERK: Utfør alle trinnene i et biosikkerhetsskap ved hjelp av aseptiske teknikker.

  1. Bruk retningspilene i Pronterface-programvaren til å justere ekstruderingsnålens posisjon manuelt inn i midten av en brønn og i oppslemmingen på støttebadet. La det ligge minst 1 mm støttebadeslam under kanylespissen.
    MERK: Programvaren har ingen evne til å fortelle hvor nålen er i rommet. Det er helt opp til brukeren å bevege nålen ved å manuelt klikke på pilene i programvaren (f.eks. ved å klikke på pil opp vil nålen flyttes opp eller bort fra utskriftsplattformen osv.). Manøvrer nålen forsiktig for å sikre at den ikke treffer noen grenser av brønnen.
  2. Når nålespissen er plassert i midten av slammet i brønnen, trykker du på startknappen i Pronterface og venter til utskriften er fullført for å oppnå konstruksjoner, som vist i figur 3A.
    MERK: For å bioprinte en konstruksjon ved hjelp av den medfølgende filen (tilleggsfil 1), vil det ta omtrent 3 minutter. Det tar ca. 5 min å orientere og bevege nålen og deretter skrive ut en konstruksjon helt fra start til slutt.
  3. Gjenta trinn 6.1-6.2 til antall ønskede bioprintede konstruksjoner er oppfylt.
    MERK: Det anbefales å lage flere konstruksjoner enn nødvendig for å ta hensyn til eventuelle mislykkede utskrifter. Hvis det oppstår feil, flytter du til neste brønn, tilbakestiller alt og gjentar trinn 6.1-6.2 igjen.
  4. La brønnplaten stå ved romtemperatur og dekk den i BSC i 1 time etter at utskriften er ferdig for å tillate basekatalysert polymerisering av den fototjusterbare hydrogelen.
  5. Plasser brønnplaten med 3D-bioprintede konstruksjoner i en 37 °C steril inkubator og la dem stå i 12-18 timer for å smelte bort oppslemmingen fra støttebadet.

Figure 3
Figur 3: Eksperimentell skjematisk. Denne protokollen ble beskrevet i tre hovedtrinn: (A) 3D bioprinting PEGαMA hule rør med innebygde celler for å etterligne lungevaskulatur. (B) Fotoinitiering av homopolymerisasjonsreaksjon for å stive det cellulære mikromiljøet. (C) Vurdering av cellulære markører for spredning og aktivering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

7.3D bioprintet konstruksjonskultur og fotostivning

MERK: Alle trinn skal utføres i et biosikkerhetsskap ved hjelp av aseptiske teknikker.

  1. Klargjør 2,2 mM litiumfenyl-2,4,6-trimetylbenzoylfosfat (LAP) (se materialfortegnelse) stamløsning i PBS og sterilt filter ved hjelp av et 0,2 μm sprøytefilter. Hold LAP-løsningen beskyttet mot lys.
  2. Etter 12-18 timer, bytt media rundt bioprintede konstruksjoner. Fjern mediet og smeltet gelatinstøttebad manuelt i brønnene, og vær forsiktig så du ikke forstyrrer de biotrykte konstruksjonene.
    MERK: Det er nyttig å sakte fjerne mediet mens du holder platen i en 45 ° vinkel, slik at konstruksjonene kommer ut i brønnen og kan sees. En klar hydrogelsylinder skal kunne identifiseres i hver brønn med vellykket utskrift (figur 4A).
  3. Legg til et passende volum av lavserummedier til hver brønn.
    MERK: For en 24-brønns plate bør 700 μL medier per brønn helt dekke de biotrykte konstruksjonene. Juster etter behov.
  4. Sett platen tilbake til inkubatoren og bytt media på prøvene hver 3. dag eller i samsvar med eksperimentell design.
  5. Tjuefire timer før ønsket avstivningstidspunkt, fjern media fra prøvene og erstatt dem med lavserummedier supplert med 2,2 mM steril LAP.
    MERK: For å fluorescerende merke strukturen, svulme 3D bioprintede konstruksjoner i PBS supplert med 10 μM metakryloksyetyltiokarbamoyl rhodamin B (se Table of Materials) over natten, og stivne deretter som beskrevet i trinn 7.6 for å fluorescerende merke strukturen. Overfør til PBS i 2 dager ved 4 °C for å fjerne overflødig rhodamin og bilde med et TRITC-filter (figur 4B,C).
  6. Ved ønsket avstivningstidspunkt, fjern halvparten av mediet fra brønnene som skal stivne, og plasser platen med lokket av under UV-lys. Slå på UV-lyset og stiv disse konstruksjonene ved å påføre 10 mW/cm2 365 nm lys i 5 minutter ved hjelp av Omnicure (se materialfortegnelse) og et 365 nm båndpassfilter (figur 3B).
    MERK: Bruk radiometeret / fotometeret for å bekrefte at lysintensiteten er riktig før du utsetter celler for UV-lys.
  7. Fjern de gjenværende mediene fra disse brønnene og tilsett nye lavserummedier til hver brønn. Sett platen tilbake til inkubatoren.
  8. Ta ut platen fra inkubatoren og utfør fibroblastaktiveringsstudien på ønsket tidspunkt etter trinn 9.

Figure 4
Figur 4: 3D-bioprintede hydrogelstrukturer støttet cellens levedyktighet over tid. (A) Fotografi av 3D-printet hydrogelstruktur i en 24-brønns plate. (B) Projeksjon av maksimal intensitet av fluorescerende merket PEGαMA 3D-trykt hydrogel. Skala bar = 1 mm. Høyere forstørrelsesmikroskopi viste porer i hydrogelstrukturen indusert av gelatinmikropartikler i FRESH bioprinting-støttebadet. (C) 3D-printet PEGαMA-rør med fluorescerende merkede avstivede regioner avbildet på et konfokalmikroskop (100 μm z-stack vist som en maksimal intensitetsprojeksjon) viste romlig kontroll over avstivning i 3D. Skalastang = 500 μm. (D) HPAAF-levedyktighet i 3D-bioprintede konstruksjoner målt med Live/Dead-analyser. Konstruksjoner med 300 μm tykkelse og 4 × 106 celler / ml utkonkurrerte alle andre forhold på hvert tidspunkt. Levedyktigheten toppet seg på dag 7. Denne tilstanden og tidspunktet ble valgt for fremtidige eksperimenter. Kolonner viser gjennomsnitt ± SEM, n = 3. *, p < 0,05, ANOVA, Tukey HSD. (E) Representative konfokale bilder av celler i 3D-konstruksjoner farget med levende / dødt reagens på dag 7, tidspunktet med størst total levedyktighet. Kalcein AM merket levende celler i grønt og propidiumjodid merket døde celler i rødt. Kolonnen lengst til høyre viser at tilstanden som ga best resultater, hadde en jevn cellefordeling og en høy prosentandel levende celler. Skala bar = 500 μm. Gjengitt med tillatelse fra Davis-Hall et al.5. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

8. Vurderingen av fibroblast levedyktighet

  1. Ved ønskede levedyktighetstidspunkter, flekk med kalcein AM og propidiumjodid (se materialtabell).
    MERK: For å oppsummere, bør media fjernes fra hver brønn og konstruksjonene skal skylles med steril PBS. Inkuber konstruksjonene i en levende / død fargeløsning i 40 minutter ved 37 ° C på en vippe. Fargeløsningen skal inneholde kalcein AM (1:1000 fortynning) og propidiumjodid (1:1000 fortynning) for å identifisere levende eller døde celler ved avbildning.
  2. Overfør konstruksjonene til steril PBS og umiddelbart bilde på et konfokal fluorescensmikroskop. Skaff deg tre forskjellige 100 μm z-stack-bilder per sampling per tidspunkt, og uttrykk levedyktighet som gjennomsnittlig prosentandel av levende celler (figur 4D,E).

9. Vurderingen av fibroblastaktivering

  1. Tilbered 3 % w/v bovint serumalbumin (BSA) og 0,1 % v/v Tween 20 i PBS. Denne løsningen vil bli referert til som immunfluorescens (IF) løsning.
  2. Ved ønskede tidspunkter, fjern media fra prøvebrønnene og skyll konstruksjonene med PBS. Bytt ut PBS med 4 % paraformaldehyd (PFA) og oppbevar disse prøvene ved 37 °C i 30 minutter på en vippe. Deretter erstatter du 4% PFA med 100 mM glycin i PBS og la disse prøvene ligge på en vippe ved romtemperatur (RT) i ytterligere 15 minutter.
  3. Deretter overfører du disse prøvene til Tissue-Tek Cryomolds, dekker prøven helt med optimal skjæretemperatur (OCT) løsning (se materialtabell), og lar OCT diffundere inn i prøvene i 12-18 timer ved 4 °C.
  4. Flash-fryse de OCT-gjennomvåt prøvene i 2-metylbutan ved hjelp av flytende nitrogen. Fyll en isoporboks eller annen passende beholder med flytende nitrogen og plasser deretter en annen beholder fylt med 2-metylbutan i det flytende nitrogenet slik at det er minst halvveis nedsenket. Bruk tang til å holde hver kryomold som inneholder en OKT-dekket prøve i flytende nitrogen avkjølt 2-metylbutan til synlig frossen. Disse prøvene kan oppbevares ved -80 °C til de er klare for kryoseksjon.
    FORSIKTIG: Personlig verneutstyr (PPE) som hansker som kuldebeskyttelseshansker, et kaldbeskyttelsesforkle og ansiktsskjerm som følger med kryogenisk sikkerhetssett (se materialfortegnelse) bør brukes ved håndtering av flytende nitrogen.
  5. Kryoseksjon de frosne OCT-prøvene ved -22 °C og fest 10 μm tykke skiver til positivt ladede glassmikroskoplysbilder. Forbered tre mikroskopglass med minst 3-5 kryoseksjoner per lysbilde for hver 3D-hydrogelprøve.
    MERK: Mikroskoplysbildene kan lagres på dette punktet ved -80 ° C om nødvendig som stopppunkt.
  6. Fest kryoseksjonene i iskald aceton i 15 minutter for å hjelpe kryoseksjonene til å feste seg til lysbildene. Skyll kryoseksjonene forsiktig med RT-vann for å fjerne gjenværende OCT. La disse prøvene tørke og skisser kryoseksjonene med en hydrofob penn (se materialfortegnelse).
  7. Permeabiliser prøvene ved romtemperatur med 0,2% v / v Triton X-100 i PBS i 10 minutter og blokker deretter seksjonene med 5% BSA w / v i PBS i 1 time ved RT.
  8. Legg til det primære antistoffet for anti-human alfa glatt muskelaktin (αSMA) (1:250 fortynning) (se materialfortegnelse) til IF-oppløsningen. Oppbevar disse snittprøvene med det primære antistoffet på over natten ved 4 °C. Skyll prøvene 3x med IF-oppløsning.
  9. Inkuber seksjonene i IF-oppløsningen som inneholder det sekundære geite-anti-mus Alexa Fluor 555-antistoffet (1:250 fortynning) og to dråper ActinGreen 488 ReadyProbe (se materialfortegnelse) per milliliter IF-oppløsning. Dekk prøvene for alle påfølgende trinn med aluminiumsfolie for å beskytte dem mot lys og la den sekundære antistoffløsningen forbli på prøvene i 1 time ved RT.
  10. Skyll seksjonene 3x med IF oppløsning. Inkuber dem i 300 nM 4',6-diamidino-2-fylindol (DAPI) i DI-vann i 15 minutter ved RT. Utfør en siste skylling av seksjonene 3x med DI-vann.
  11. Bruk 10 μL av et kommersielt tilgjengelig antifadereagens (se materialfortegnelse), dekk seksjonene ved hjelp av standardmetoder.
    MERK: De monterte lysbildene kan oppbevares beskyttet mot lys i en fryser på -80 °C til det er nødvendig for avbildning.
  12. Avbilde kryoseksjonene ved hjelp av et fluorescensmikroskop (figur 3C og figur 5B). Bilde tre tilfeldige seksjoner per lysbilde ved hjelp av et 10x-mål.
    MERK: Bilder bør tas i DAPI , FITC og TRITC kanaler.
  13. Last opp bildene til ImageJ (NIH). Kvantifiser prosentandelen av αSMA-positive celler som en måling av fibroblastaktivering (figur 5A) ved å dele det totale antallet αSMA-positive celler med det totale antall cellekjerner for hvert synsfelt.

Figure 5
Figur 5: Fibroblastaktivering i 3D-bioprintede modeller av pulmonal arteriell adventitia . (A) Fibrotisk aktivering i myke og avstivede 3D-hydrogeler målt ved αSMA-uttrykk. HPAAF i stivnede konstruksjoner var signifikant mer positive for αSMA enn celler i myke konstruksjoner. Kolonner representerer gjennomsnitt ± SEM, n = 3. *, p < 0,05, Mann-Whitney U test. (B) Representative konfokale bilder av immunfarging for αSMA, aktin og DAPI i myke og stivnede 3D-hydrogeler. HPAAF i stivnede konstruksjoner viste mer utbredt αSMA immunfluorescens enn celler i myke konstruksjoner. Skalastang = 250 μm. (C) Fibroblastproliferasjon i myke og avstivede 3D-bioprintede konstruksjoner målt ved EdU-positivitet. HPAAF i avstivede konstruksjoner var signifikant mer positive for EdU enn celler i myke konstruksjoner. Kolonner representerer gjennomsnitt ± SEM, n = 3. *, p < 0,05, Mann-Whitney U test. (D) Representative konfokale bilder av immunfarging for EdU og Hoechst fargestoff i myke og stivnede 3D-hydrogeler. HPAAF i stivnede konstruksjoner viste mer utbredt EdU-immunfluorescens enn celler i myke konstruksjoner. Skala bar = 300 μm. Gjengitt med tillatelse fra Davis-Hall et al.5. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

10. Vurderingen av fibroblastproliferasjon

  1. Tjuefire timer før et ønsket spredningstidspunkt, fjern cellekulturmedier fra hver brønn og erstatt med lavserummedier supplert med 10 μM EdU-oppløsning fra det kommersielt tilgjengelige celleproliferasjonssettet (se materialtabell). Returner prøvene til inkubatoren for inkubasjon over natten.
  2. Ved ønsket spredningstidspunkt, fikser prøvene inkubert med EdU ved bruk av 4% PFA ved 37 ° C i 30 minutter på en vippe. Erstatt 4 % PFA-oppløsningen med 100 mM glycin i PBS og inkuber prøver ved 37 °C i minst 15 minutter. Tilsett Hoechst i en passende konsentrasjon i 30 minutter og skyll deretter konstruksjonene 2x med PBS.
    MERK: Prøvene kan oppbevares beskyttet mot lys ved 4 °C frem til avbildning.
  3. Bilde alle faste og lagrede EdU-prøver ved hjelp av et fluorescensmikroskop og foreslåtte celleproliferasjonssett produsentinnstillinger og filtre (figur 3C og figur 5D). Skaff deg tre forskjellige 100 μm z-stack-bilder per sampling, og lag maksimale projeksjoner fra hver av disse z-stakkene. Mål HPAAF-proliferasjon ved å telle antall EdU-positive celler og dividere med det totale antall celler identifisert av Hoechst-motflekk innenfor de maksimale projeksjonsbildene (figur 5C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokollen beskriver hvordan man 3D bioprint fototunable hydrogeler i et støttebad for å skape konstruksjoner som er i stand til dynamisk og tidsmessig stivning for å studere fibroblastaktivering i geometrier som etterligner menneskelig vev. Først forklarte protokollen hvordan man syntetiserer PEGαMA, ryggraden i dette fototjusterbare polymersystemet. Kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopimålinger viste vellykket PEGαMA-funksjonalisering ved 96,5 % (figur 1). Funksjonaliseringsverdier på 90% eller høyere er akseptable for denne prosedyren. Deretter presenteres detaljer om hvordan du lager en 3D CAD-modell av en hul sylinder for å etterligne lungevaskulatur. En nedlastbar 3D CAD-modell finnes i tilleggsfil 1, mens den tilhørende G-koden for dette designet er tilgjengelig i tilleggsfil 2. Denne CAD-modellen produserte konstruksjoner med følgende dimensjoner: 4 mm høyde, 4 mm indre diameter og 300 μm veggtykkelse.

Instruksjoner for oppsett av bioprinteren er presentert (figur 2). Et kritisk trinn er et kritisk trinn å montere skrivehodet sikkert og feste det slik at glasssprøyten og nålen ekstruderer bioblekk direkte inn i en brønn som inneholder støttebadet nedenfor (figur 2 og figur 3A). Tabell 1 gir informasjonen som kreves for å forberede stamkonsentrasjoner for bioblekkkomponentene og de riktige volumene som skal kombineres for å oppnå bioblekksammensetningen som brukes gjennom disse studiene som representative resultater. Den endelige bioblekkformuleringen var 17,5 vekt% PEGαMA med 0,375 molratio (αMA:tiol) på 70:30 DTT:MMP2-nedbrytbare kryssbindere, 2 mM CGRGDS og 2,5 vekt% PEO. Denne reaksjonen binder kovalent CGRGDS-peptidet i hydrogelnettverket gjennom en reaksjon mellom en fri tiol på cystinen og en αMA-del. pH i bioblekk og støttebadeslamløsninger ble justert til verdier på henholdsvis 6,2 og 9. Denne kombinasjonen av et surt bioblekk og basisk støttebadoppslemming lettet polymerisasjonen av 3D-bioprintede konstruksjoner og opprettholdt de sylindriske strukturer (figur 4A-C). På dag 7 var 91 ± 2 % av cellene farget levende og ved dag 14 var 85 ± 3 % fortsatt levedyktige (gjennomsnittlig ± SEM, ANOVA, Tukey HSD) og statistisk signifikante med p < 0,05 (figur 4D,E).

Til slutt beskriver denne protokollen hvordan man stiver 3D-bioprintede konstruksjoner gjennom fotoinitiering (figur 3B) av sekundær polymerisasjonsreaksjon med uomsatte αMA-deler. Det originale manuskriptet av Davis-Hall et al. demonstrerte gjennom parallell platereologi at 3D-bioprintede konstruksjoner hadde en initial elastisk modul på 4,7 ± 0,09 kPa og økte etter fotoinitiert avstivning til 12,8 ± 0,47 kPa5. Fibroblastaktivering ble vurdert på dag 7 ved å kvantifisere antall fibroblaster som uttrykker alfa glatt muskelaktin (αSMA). En større prosentandel av fibroblastene i stivnede hydrogelkonstruksjoner ble aktivert (88 ± 2 %) sammenlignet med myke prøver (65 ± 4 %) (gjennomsnittlig ± SEM, Mann-Whitney U-test) med statistisk signifikans på p < 0,05 (figur 5A,B). Tilsvarende var 66 ± 6 % av fibroblastene i de avstivede konstruksjonene positive for EdU, en proliferasjonsmarkør, sammenlignet med 39 ± 6 % av fibroblastene i myk tilstand (gjennomsnittlig ± SEM, Mann-Whitney U-test) med en statistisk signifikans på p < 0,05 (figur 5C,D). Sammen støtter disse resultatene at et stivnet mikromiljø signifikant økte fibrotiske aktiveringsmarkører i 3D bioprintede modeller.

Tilleggsfil 1: Dataassistert konstruksjonsfil (CAD). Filen inneholder en sylindergeometri på 4 mm høyde, 4 mm indre diameter og 300 μm tykkelse. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 2: G-kodefil. Filen er knyttet til sylindergeometri på 4 mm høyde, 4 mm indre diameter og 300 μm tykkelse. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Totrinns polymerisasjonsreaksjoner som respons på kontrollert lyseksponering kan stive biomaterialer med romlig og tidsmessig kontroll. Flere studier har utnyttet denne teknikken for å evaluere cellematriseinteraksjoner i forskjellige plattformer 5,8,9,10,11,21,22,23. Mer spesifikt kan fotomasker eller to-foton eksitasjonsmetoder brukes til å stive diskrete seksjoner av en 3D-bioprintet konstruksjon og undersøke hvordan celler reagerer på dynamisk stivning i begrensede områder eller grensesnitt som beskrevet i våre tidligere publikasjoner 5,8. Å velge meningsfulle tidspunkter for å vurdere celleresponser er avgjørende. Her ble konstruksjoner stivnet etter å ha tillatt fibroblaster å spre seg i MMP-nedbrytbar fototunable hydrogel for å muliggjøre aktiveringsstudier8. Denne protokollen beskriver hvordan man utvikler et fototunable hydrogelbioblekk og lager 3D-bioprintede konstruksjoner ved bruk av bioblekk og støttebadkombinasjon som initierte en pH-katalysert polymerisasjonsreaksjon. Polymerisasjonen av 3D-bioprintede konstruksjoner med distinkte geometrier designet for å etterligne lungevaskulatur ble tilrettelagt ved å ekstrudere surt bioblekk til grunnleggende støttebadoppslemming. In vivo vevsavstivning er et kjennetegn ved fibrose, og det er allment etablert at mekaniske endringer i det cellulære mikromiljøet er potente drivere for sykdomsprogresjon 10,23,24,25. Derfor har denne protokollen og plattformen et enormt potensial i å gi viktige detaljer om de mekanosensitive cellulære mekanismene som er involvert i fibrotisk patogenese. Evnen til å endre konstruksjonsgeometrien og egenskapene, bestemme bestemte tidspunkter for å initiere avstivning, og bestemme hvilken type celler som skal inkluderes i bioblekket, er ubestridelige fordeler med denne metoden. Disse variablene kan skreddersys for å studere andre pH-katalyserte biomaterialer og effekten av mikromiljøavstivning som er relevant for andre biologiske anvendelser.

PEGαMA ble valgt som bioblekkryggrad fordi den er hydrolytisk stabil og mer reaktiv enn andre vanlige totrinns polymerisasjonssystemer som poly (etylenglykol) metakrylat (PEGMA) 5,8,9. En MMP2-nedbrytbar peptidsekvens ble inkludert som en kryssbinder for å tillate utilsiktede fibroblaster å produsere MMP2 endopeptidaser for å remodellere det ekstracellulære mikromiljøet26. Vår gruppe og andre har vist at tilstedeværelsen av cellenedbrytbar tverrbinder forbedrer fibroblastspredning og er en funksjon som er nødvendig for aktivering 5,27. Høy PEGαMA-funksjonalisering er avgjørende for suksessen til denne protokollen, spesielt ettersom de uomsatte αMA-gruppene aktiverer klikk-kjemi-funksjonen. PEGαMA med funksjonalisering over 95% er best, men 90% funksjonalisert PEGαMA har jobbet med denne protokollen. Hvis funksjonaliseringen av PEGαMA er lavere enn ønsket, kan det resultere i inkonsekvent polymerisering, spesielt når det er høy celletetthet. For å overvinne denne utfordringen anbefales det å ta hensyn til volumet av cellepelleten og trekke dette volumet fra volumet av cellekulturmediet og pH-justeringsreagenser tilsatt i tabell 1. Luftlommer i støttebadet, prematur polymerisering i sprøyten eller feil pH-verdier for de forskjellige løsningene beskrevet ovenfor er andre vanlige feilmekanismer som er observert med denne protokollen.

Justeringer av pH-verdien i bioblekket og støttebadet bør utføres individuelt for hvert eksperiment for å ta hensyn til batch-til-batch-variasjon eller endringer i pH over tid. For eksempel, når pH 7 TCEP ble brukt til å resuspendere disse bioblekkkomponentene med visse PEGαMA-batcher, måtte den totale bioblekk-pH justeres nærmere 7-7,5 i stedet for 6,2. Tidligere arbeid viser at fibroblaster utsatt for pH-justerte medier fra 6,2-9 kunne tåle disse pH-endringene og opprettholde levedyktighet5. I tillegg har tidligere arbeid vist at kontrollert UV-lyseksponering som brukes til å polymerisere hydrogeler med celler innebygd i, har minimal effekt på cellens levedyktighet og endrer ikke fibroblasttranskriptomet 8,9,10,28. Imidlertid, hvis levedyktighet med lav celle måles, bør pH-justering være det første trinnet som tas for å løse dette problemet. Det er veletablert at pH har en betydelig innvirkning på cellens levedyktighet 5,9,29, så brukere bør utføre lignende levedyktighetstester med spesifikke cellelinjer som kan være mer følsomme for pH-justeringer. I tillegg, før du prøver store eksperimenter, anbefales det å teste eventuelle avvik fra denne protokollen med små batchstørrelser.

For øyeblikket har den interne bioprinteren bare ett ekstruderingsskrivehode og krever betydelig tidkrevende brukerinput for å manuelt orientere nålen og gi utskriftskommandoer for hver prøve. Kommersielt tilgjengelige bioprintere30,31,32 adresserer disse begrensningene, men er betydelig dyrere. Fremtidig arbeid tar sikte på å skrive ut flere lagkonstruksjoner som inneholder en annen celletype for å gjenskape alle tre forskjellige lungekarlag (tunica intima, tunica media og tunica adventitia). Arbeid av andre viser allerede at denne bioprintingsteknikken med ikke-fototunable materialer kan produsere avanserte og geometrisk komplekse modeller, inkludert splitting av blodkarstrukturer og hele menneskets hjerte 6,7,20,33. Metodene i denne protokollen kan reproduseres med forskjellige bioprintere. Dette vil gjøre det mulig for forskere å 3D-bioprinte en rekke materialer som gjennomgår pH-katalyserte polymerisasjonsreaksjoner og konstruere et hvilket som helst antall modeller av vevshomeostase, sykdom og reparasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse. Deler av dette manuskriptet er gjengitt med tillatelse fra © IOP Publishing https://doi.org/10.1088/1758-5090/aca8cf. 5 Alle rettigheter forbeholdt.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne anerkjenne Dr. Adam Feinberg (Carnegie Mellon University) og de som var vertskap for 3D Bioprinting Open-Source Workshop. Disse personene gjorde det mulig å lære teknikkene for FRESH bioprinting og bygge 3D-bioprinteren som ble brukt til disse studiene. I tillegg ønsker forfatterne å anerkjenne Biorender.com, som ble brukt til å produsere figurer i dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av flere grupper eller finansieringskilder, inkludert Rose Community Foundation (DDH og CMM), en Colorado Pulmonary Vascular Disease Research Award (DDH og CMM), National Science Foundation under Award 1941401 (CMM), Department of the Army under Award W81XWH-20-1-0037 (CMM), National Cancer Institute of NIH under Award R21 CA252172 (CMM), Ludeman Family Center for Women's Health Research ved University of Colorado Anschutz Medical Campus (DDH og CMM), National Heart, Lung and Blood Institute of National Institutes of Health under Awards R01 HL080396 (CMM), R01 HL153096 (CMM), F31 HL151122 (DDH) og T32 HL072738 (DDH og AT).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AccuMax Radiometer/Photometer Kit Spectronics Corporation XPR-3000 To measure light intensity, used for photostiffening
Acetic Acid  Fisher Scientific BP2401-500 Used during PEGaMA synthesis
Acetone Fisher Scientific A184 Used with the cryosections
ActinGreen 488 ReadyProbes Fisher Scientific R37110 Used for staining
Aluminum Foil Reynolds F28028
Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) Sigma-Aldrich 401757-1L Used during PEGaMA synthesis
Argon Compressed Gas Airgas AR R300 Used during PEGaMA synthesis
8 Arm Poly(ethylene glycol)-hydroxyl (PEG-OH) JenKem Technology 8ARM-PEG-10K Used during PEGaMA synthesis
365 nm Bandpass Filter Edmund Optics 65-191 Used for photostiffening
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP9700-100 Used during staining process
Buchner Funnel Quark Glass QFN-8-14 Used during PEGaMA synthesis
Calcein AM Invitrogen 65-0853-39 Used during staining process
Celite 545 (Filtration Aid) EMD Millipore CX0574-1 Used during PEGaMA synthesis
Charged Microscope Slides Globe Scientific 1358W
Chloroform-d Sigma-Aldrich 151823-10X0.75ML Used to characterize PEGaMA
Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit Invitrogen C10637 Used for staining
50 mL Conical Tubes CELLTREAT 667050B
Cryogenic Safety Kit Cole-Parmer EW-25000-85
Cryostat Leica CM 1850-3-1
Dialysis Tubing Repligen 132105
4’,6-Diamidino-2-Phylindole (DAPI) Sigma-Aldrich D9542-1MG Used for staining
Diethyl Ether Fisher Scientific E1384 Used during PEGaMA synthesis
1,4-Dithiothreitol (DTT)  Sigma-Aldrich 10197777001 Bioink component
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Cytiva SH30271.FS
Filter Paper Whatman 1001-090 Used during PEGaMA synthesis
Freezone 2.5L Freeze Dry System Labconco LA-2.5LR Lyophilizer
Fusion 360 Autodesk N/A Software download
2.5 mL Gastight Syringe Hamilton 81420 Used for bioprinting
15 Gauge 1.5" IT Series Tip Jensen Global JG15-1.5X Used for bioprinting
30 Gauge 0.5" HP Series Tip Jensen Global JG30-0.5HPX Used for bioprinting
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 555 Antibody Fisher Scientific A21422 Used for staining
Glycine Fisher Scientific C2H5NO2 Used during staining process
Hemocytometer Fisher Scientific 1461
Hoechst Thermo Scientific 62249 Used during staining process
Human Pulmonary Artery Adventitial Fibroblasts (HPAAFs) AcceGen ABC-TC3773  From a 2-year-old male patient
Hydrochloric Acid (HCl) Fisher Scientific A144-500 Used to pH adjust solutions
ImageJ National Institutes of Health (NIH) N/A Free software download
ImmEdge® Pen Vector Laboratories H-4000 Used during staining process
Incubator VWR VWR51014991
LifeSupport Gelatin Microparticle Slurry (Gelatin Slurry) Advanced Biomatrix 5244-10GM Used for bioprinting
Light Microscope Olympus CKX53 Inverted light microscope
Lithium Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinate (LAP) Sigma-Aldrich 900889-5G Photoinitiator used for photostiffening
Liquid Nitrogen N/A N/A
LulzBot Mini 2  LulzBot N/A Bioprinter adapted
Methacryloxyethyl Thiocarbamoyl Rhodamine B  Polysciences Inc. 669775-30-8
2-Methylbutane Sigma-Aldrich M32631-4L
Microman Capillary Pistons CP1000 VWR 76178-166 Positive displacement pipette tips
MMP2 Degradable Crosslinker (KCGGPQGIWGQGCK) GL Biochem N/A Bioink component
Mouse Anti-Human αSMA Monoclonal Antibody Fisher Scientific MA5-11547 Used for staining
OmniCure Series 2000  Lumen Dynamics S2000-XLA UV light source used for photostiffening
Paraformaldehyde (PFA)  Electron Microscopy Sciences 15710 Used to fix samples
pH Meter Mettler Toledo  FP20 
pH Strips Cytiva 10362010
Phosphate Buffered Saline (PBS) Hyclone Laboratories, Inc. Cytiva SH30256.FS
Pipette Set Fisher Scientific 14-388-100
10 µL Pipette Tips USA Scientific 1120-3710
20 µL Pipette Tips USA Scientific 1183-1510
200 µL Pipette Tips USA Scientific 1111-0700
1000 µL Pipette Tips USA Scientific 1111-2721
Poly(Ethylene Glycol)-Alpha Methacrylate (PEGαMA) N/A N/A Refer to manuscript for synthesis steps
Poly(Ethylene Oxide) (PEO) Sigma-Aldrich 372773-250G Bioink component
Positive Displacement Pipette Fisher Scientific FD10004G 100-1000 µL
Potassium Hydroxide (KOH) Sigma-Aldrich 221473-500G Used to pH adjust solutions
ProLong Gold Antifade Reagent Invitrogen P36930 Used during staining process
Pronterface All3DP N/A Software download
Propidium Iodide Sigma-Aldrich P4864-10ML Used for staining
RGD Peptide (CGRGDS) GL Biochem N/A Bioink component
Rocker VWR 10127-876
Rotary Evaporator  Thomas Scientific 11100V2022 Used during PEGaMA synthesis
Rubber Band Staples 808659
Schlenk Flask  Kemtech America F902450 Used during PEGaMA synthesis
Slic3r Slic3r N/A Software download
Smooth Muscle Cell Growth Medium-2 (SmGM-2) BulletKit Lonza CC-3182 Kit contains CC-3181 and CC-4149 components
Sodium Hydride  Sigma-Aldrich 223441-50G Used during PEGaMA synthesis
Sorvall ST 40R Centrifuge Fisher Scientific 75-004-525
Stir Bar VWR 58948-091
Syringe Filter VWR 28145-483 Used to sterile filter solutions
T-75 Tissue-Cultured Treated Flask VWR 82050-856 Used for cell culture work
Tissue-Tek Cyromold Sakura 4557
Tissue-Tek O.C.T Compound (OCT) Sakura 4583
Tris(2-Carboxyethyl) Phosphine (TCEP) Sigma-Aldrich C4706-2G
Triton X-100 Fisher Bioreagents C34H622O11 Used during staining process
Trypan Blue Sigma-Aldrich T8154-20ML Used for cell culture work
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25-300-062 Used for cell culture work
Tween 20 Fisher Bioreagents C58H114O26 Used during staining process
Upright Microscope Olympus BX63F Fluorescent microscope capabilities
Water Bath PolyScience WBE20A11B
24-Well Tissue Culture Plates Corning 3527

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ahrens, J. H., et al. Programming cellular alignment in engineered cardiac tissue via bioprinting anisotropic organ building blocks. Advanced Materials. 34 (26), e2200217 (2022).
  2. Lin, N. Y. C., et al. Renal reabsorption in 3D vascularized proximal tubule models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (12), 5399-5404 (2019).
  3. Grigoryan, B., et al. Multivascular networks and functional intravascular topologies within biocompatible hydrogels. Science. 364 (6439), 458-464 (2019).
  4. Kang, Y., Datta, P., Shanmughapriya, S., Ozbolat, I. T. 3D bioprinting of tumor models for cancer research. ACS Applied Biomaterials. 3 (9), 5552-5573 (2020).
  5. Davis-Hall, D., Thomas, E., Pena, B., Magin, C. M. 3D-bioprinted, phototunable hydrogel models for studying adventitial fibroblast activation in pulmonary arterial hypertension. Biofabrication. 15 (1), (2022).
  6. Mirdamadi, E., Tashman, J. W., Shiwarski, D. J., Palchesko, R. N., Feinberg, A. W. FRESH 3D bioprinting of a full-size model of the human heart. ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (11), 6453-6459 (2020).
  7. Shiwarski, D. J., Hudson, A. R., Tashman, J. W., Feinberg, A. W. Emergence of FRESH 3D printing as a platform for advanced tissue biofabrication. APL Bioengineering. 5 (1), 010904 (2021).
  8. Petrou, C. L., et al. Clickable decellularized extracellular matrix as a new tool for building hybrid hydrogels to model chronic fibrotic diseases in vitro. Journal of Materials Chemistry B. 8 (31), 6814-6826 (2020).
  9. Hewawasam, R. S., Blomberg, R., Serbedzija, P., Magin, C. M. Chemical modification of human decellularized extracellular matrix for incorporation into phototunable hybrid hydrogel models of tissue fibrosis. ACS Applied Materials & Interfaces. 15 (12), 15071-15083 (2023).
  10. Saleh, K. S., et al. Engineering hybrid hydrogels comprised healthy or diseased decellularized extracellular matrix to study pulmonary fibrosis. Cellular and Molecular Bioengineering. 15 (5), 505-519 (2022).
  11. Guvendiren, M., Burdick, J. A. Stiffening hydrogels to probe short- and long-term cellular responses to dynamic mechanics. Nature Communications. 3, 792 (2012).
  12. Rosales, A. M., Vega, S. L., DelRio, F. W., Burdick, J. A., Anseth, K. S. Hydrogels with reversible mechanics to probe dynamic cell microenvironments. Angewandte Chemie International Edition English. 56 (40), 12132-12136 (2017).
  13. Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nature Medicine. 18 (7), 1028-1040 (2012).
  14. Huertas, A., Tu, L., Humbert, M., Guignabert, C. Chronic inflammation within the vascular wall in pulmonary arterial hypertension: more than a spectator. Cardiovascular Research. 116 (5), 885-893 (2020).
  15. Kendall, R. T., Feghali-Bostwick, C. A. Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators. Frontiers in Pharmacology. 5, 123 (2014).
  16. Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. The Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).
  17. Habiel, D. M., Hogaboam, C. Heterogeneity in fibroblast proliferation and survival in idiopathic pulmonary fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 5, 2 (2014).
  18. Hu, C. J., Zhang, H., Laux, A., Pullamsetti, S. S., Stenmark, K. R. Mechanisms contributing to persistently activated cell phenotypes in pulmonary hypertension. The Journal of Physiology. 597 (4), 1103-1119 (2019).
  19. Li, M., et al. Emergence of fibroblasts with a proinflammatory epigenetically altered phenotype in severe hypoxic pulmonary hypertension. The Journal of Immunology. 187 (5), 2711-2722 (2011).
  20. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform-reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).
  21. Brown, T. E., et al. Secondary photocrosslinking of click hydrogels to probe myoblast mechanotransduction in three dimensions. Journal of the American Chemical Society. 140 (37), 11585-11588 (2018).
  22. Ondeck, M. G., et al. Dynamically stiffened matrix promotes malignant transformation of mammary epithelial cells via collective mechanical signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3502-3507 (2019).
  23. Caliari, S. R., et al. Stiffening hydrogels for investigating the dynamics of hepatic stellate cell mechanotransduction during myofibroblast activation. Scientific Reports. 6, 21387 (2016).
  24. Liu, F., et al. Feedback amplification of fibrosis through matrix stiffening and COX-2 suppression. Journal of Cell Biology. 190 (4), 693-706 (2010).
  25. Tschumperlin, D. J., Ligresti, G., Hilscher, M. B., Shah, V. H. Mechanosensing and fibrosis. The Journal of Clinical Investigation. 128 (1), 74-84 (2018).
  26. Chelladurai, P., Seeger, W., Pullamsetti, S. S. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in pulmonary hypertension. European Respiratory Journal. 40 (3), 766-782 (2012).
  27. Caracena, T., et al. Alveolar epithelial cells and microenvironmental stiffness synergistically drive fibroblast activation in three-dimensional hydrogel lung models. Biomaterials Science. 10 (24), 7133-7148 (2022).
  28. Ruskowitz, E. R., DeForest, C. A. Proteome-wide analysis of cellular response to ultraviolet light for biomaterial synthesis and modification. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (5), 2111-2116 (2019).
  29. Kruse, C. R., et al. The effect of pH on cell viability, cell migration, cell proliferation, wound closure, and wound reepithelialization: In vitro and in vivo study. Wound Repair and Regeneration. 25 (2), 260-269 (2017).
  30. Filippi, M., et al. Perfusable biohybrid designs for bioprinted skeletal muscle tissue. Advanced Healthcare Materials. , e1500758 (2023).
  31. Matthiesen, I., et al. Astrocyte 3D culture and bioprinting using peptide-functionalized hyaluronan hydrogels. Science and Technology of Advanced Materials. 24 (1), 2165871 (2023).
  32. Xu, L., et al. Bioprinting a skin patch with dual-crosslinked gelatin (GelMA) and silk fibroin (SilMA): An approach to accelerating cutaneous wound healing. Materials Today Bio. 18, 100550 (2023).
  33. Bliley, J. M., Shiwarski, D. J., Feinberg, A. W. 3D-bioprinted human tissue and the path toward clinical translation. Science Translational Medicine. 14 (666), eabo7047 (2022).

Tags

3D-bioprinting fototunable hydrogeler fibroblastaktivering biomaterialer cellekulturplattformer ekstracellulær matrise (ECM) fibrotisk sykdomsprogresjon friform reversibel innebygging av suspenderte hydrogeler (FRESH) bioprinting polymerisasjonsreaksjoner gelatinstøttebad poly (etylenglykol)-alfametakrylat (PEG& 945; MA) cellenedbrytbar tverrbinder myke hydrogeler fotoinitator endepunktskarakteriseringer vevshomeostase sykdomsmodellering vevsreparasjon
3D bioprinting fototunable hydrogeler for å studere fibroblastaktivering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tanneberger, A. E., Blair, L.,… More

Tanneberger, A. E., Blair, L., Davis-Hall, D., Magin, C. M. 3D Bioprinting Phototunable Hydrogels to Study Fibroblast Activation. J. Vis. Exp. (196), e65639, doi:10.3791/65639 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter