Summary
Den här artikeln beskriver hur man 3D-bioprintar fototunable hydrogeler för att studera extracellulär matrisförstyvning och fibroblastaktivering.
Abstract
Fototunable hydrogeler kan omvandlas rumsligt och tidsmässigt som svar på ljusexponering. Genom att inkorporera dessa typer av biomaterial i cellodlingsplattformar och dynamiskt utlösa förändringar, såsom ökad mikromiljöstyvhet, kan forskare modellera förändringar i den extracellulära matrisen (ECM) som uppstår under fibrotisk sjukdomsprogression. Här presenteras en metod för 3D-bioprintning av ett fototaverbart hydrogelbiomaterial som kan utföra två sekventiella polymerisationsreaktioner i ett gelatinstödbad. Tekniken för bioprinting med friformsreversibel inbäddning av suspenderade hydrogeler (FRESH) anpassades genom att justera pH-värdet i stödbadet för att underlätta en Michael-additionsreaktion. Först reagerade biobläcket som innehöll poly(etylenglykol)-alfa-metakrylat (PEGαMA) utanför stökiometrin med en cellnedbrytbar tvärbindare för att bilda mjuka hydrogeler. Dessa mjuka hydrogeler exponerades senare för fotoinitator och ljus för att inducera homopolymerisationen av oreagerade grupper och stelna hydrogelen. Detta protokoll täcker hydrogelsyntes, 3D-bioprinting, fotoförstyvning och endpoint-karakteriseringar för att bedöma fibroblastaktivering i 3D-strukturer. Metoden som presenteras här gör det möjligt för forskare att 3D-bioprinta en mängd olika material som genomgår pH-katalyserade polymerisationsreaktioner och kan implementeras för att konstruera olika modeller av vävnadshomeostas, sjukdom och reparation.
Introduction
3D-bioprinting är en transformativ teknik som gör det möjligt för forskare att exakt deponera celler och biomaterial i 3D-volymer och återskapa den komplexa hierarkiska strukturen hos biologiska vävnader. Under det senaste decenniet har framsteg inom 3D-bioprinting skapat slående mänsklig hjärtvävnad1, funktionella modeller av njurvävnad2, modeller för gasutbyte i lungan3 och tumörmodeller för cancerforskning4. Uppfinningen av inbäddade 3D-bioprintningstekniker, såsom Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogel (FRESH) bioprinting, har gjort det möjligt att reproducera komplexa mjukvävnadsstrukturer som lungblodkärl5 och till och med mänskligt hjärta6 i 3D. FRESH 3D-bioprinting underlättar lager-för-lager-utskrift av mjuka biobläck med låg viskositet genom extrudering i ett skjuvförtunnande stödbad. Stödbadet består av ett material som tätt packade gelatinmikropartiklar som fungerar som en Bingham-plast och bibehåller biobläckets avsedda form och struktur efter tryckning. När den tryckta konstruktionen har stelnat kan stödbadet lösas upp genom att temperaturen höjs till 37 °C7.
En nyligen publicerad översiktsartikel sammanfattade de material som har 3D-bioprintats i olika publikationer med hjälp av FRESH-teknik. Dessa naturligt framställda material sträcker sig från kollagen typ I till metakrylerad hyaluronsyra och representerar flera olika gelningsmekanismer7. De flesta forskningsstudier som utförs med denna 3D-bioprintningsteknik använder statiska biomaterial som inte förändras som svar på yttre stimuli. Dynamiska fototunable hydrogel-biomaterial har använts av vårt laboratorium och andra 8,9,10,11,12 för att modellera en mängd olika fibrotiska sjukdomar. Till skillnad från statiska biomaterial gör fototunable biobläck det möjligt att skapa en mjukare modell med lägre elasticitetsmodulvärde och senare stelna för att utforska cellulära svar på ökad mikromiljöförstyvning.
Fibrotiska sjukdomar kännetecknas av en ökning av produktionen av extracellulär matris som kan orsaka ärrbildning och stelhet13. Vävnadsstelhet kan initiera ytterligare skada och förstörelse av den påverkade vävnaden, vilket orsakar permanent organskada och till och med dödsfall; Fibrotiska sjukdomar står för en tredjedel av dödligheten i världen. Fibroblaster producerar överskott och avvikande extracellulär matris i detta sjukdomstillstånd14,15. Ökad fibroblastproliferation och extracellulär matrixavsättning gör vävnaden ytterligare stel och aktiverar en profibrotisk positiv återkopplingsslinga16,17,18,19. Att studera fibroblastaktivering är avgörande för att förstå fibrotiska sjukdomar. Här presenterar vi human pulmonell arteriell hypertension (PAH) som ett exempel på en fibrotisk sjukdom där det är viktigt att efterlikna blodkärlets 3D-geometri med hjälp av 3D-bioprinting och introducera den dynamiska förstyvningsförmågan hos fotoavstämbara hydrogeler. PAH är ett tillstånd där trycket i de viktigaste lungartärerna överstiger normala nivåer och belastar hjärtat, vilket ökar aktiveringen av humana lungartärer adventitial fibroblast (HPAAF) och stelnar blodkärlsvävnaderna16,17,18,19. En fotoavstämbar biobläckformulering av poly(etylenglykol)-alfametakrylat (PEGαMA) möjliggör temporal förstyvning i konstrukt och hjälper till att modellera både frisk vävnad och sjukdomsprogression 5,8,9,10. Att utnyttja denna unika egenskap möjliggör kvantifiering av HPAAF-aktivering och proliferation som svar på mikromiljöförstyvning i 3D och kan ge värdefull insikt i de cellulära mekanismer som är involverade i denna sjukdom. Protokollet som beskrivs här kommer att göra det möjligt för forskare att skapa 3D-modeller som rekapitulerar förändringar i den extracellulära mikromiljön under sjukdomsprogression eller vävnadsreparation och studera fibroblastaktivering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. PEGαMA-syntes och karakterisering
OBS: Syntesen av poly(etylenglykol)-alfametakrylat (PEGαMA) anpassades från Hewawasam et al . och utfördes under fuktfria förhållanden9.
- Väg reaktanterna.
OBS: Väg till exempel upp 5 g 10 kg/mol 8-armad PEG-hydroxyl (PEG-OH) och 0.38 g natriumhydrid (NaH) (se materialförteckning). - Tillsätt en omrörningsstång till 250 ml Schlenk-kolv och rensa med argon.
- Lös upp PEG-OH i den lägsta volym vattenfri tetrahydrofuran (THF) som krävs för upplösning i Schlenkkolven.
OBS: Cirka 80 ml THF löser upp 5 g PEG-OH. Tillsätt den minimala mängd THF som krävs för att lösa upp PEG-OH. - Tillsätt 3 gånger molöverskott NaH till reaktionsblandningen och rör om i rumstemperatur (RT) i 30 minuter.
- Tillsätt 6 gånger molaröverskott av etyl-2-(bromometyl)akrylat (EBrMA, se materialtabell) droppvis till Schlenkkolven och täck reaktionskärlet med aluminiumfolie för att skydda det från ljus. Rör om reaktionen i rumstemperatur i cirka 48 timmar.
OBS: För 5 g PEG-OH och 0.38 g NaH, använd 3.68 ml EBrMA för denna reaktion. - Tillsätt några droppar 1 N ättiksyra för att släcka reaktionen. Vakuumfiltrera lösningen genom ett filtreringshjälpmedel.
OBS: Tillsats av ättiksyra kommer att producera gasbubblor. Sluta tillsätta ättiksyradroppar när bubblor slutar bildas eftersom detta indikerar att blandningen har släckts framgångsrikt. - Koncentrera filtratet i en rotationsindunstare och fäll ut i 4 °C dietyleter. Låt fällningen vara skyddad från ljus vid 4 °C i 12-18 timmar.
- Lägg till ett Whatman-filterpapper i en Buchner-tratt. Häll långsamt reaktionsblandningen över filterpapperet och använd vakuumsugning för att separera fällningen från dietyleter. Samla fällningen i en torr och ren filtreringskolv.
- Vakuumtorka produkten i minst 5 timmar eller över natten i rumstemperatur och lös upp i minsta volym avjoniserat vatten som behövs. Överför den upplösta produkten till dialysslangen (se materialtabellen) och dialysera mot 3,5 l avjoniserat vatten i minst fyra dagar. Byt dialysvatten var 12:e timme.
OBS: Produkten kommer att se ut som helt torrt rent vitt fast pulver efter vakuumtorkning. - Snabbfrys produkten och frys den i cirka 72 timmar eller tills den är helt torr.
- Lös upp produkten i kloroform D (CDCl 3). Kör sample med 1H NMR med ett protokoll som utför 248 skanningar med 2.5 s relaxationstid.
- Verifiera produktens funktionalisering och renhet genom att kalibrera CDCl3 lösningsmedelstoppen till 7.26 PPM. Integrera toppen för PEG-stambensprotoner (d3.71) och kalibrera integrationen till 114.
- Integrera de återstående topparna: PEGαMA 1 H NMR (300 MHz, CDCl 3): d (ppm) 1,36(t, 3H, CH 3-),3,71 (s, 114H, PEG CH 2-CH 2), 4,29 (t, s, 4H, -CH 2-C(O)-O-O, -O-CH 2-C(=CH 2)-), 5,93 (q, 1H, -C=CH 2), 6,34 (q, 1H, -C=CH 2) och jämför integrationen för αMA-alkenändgruppstopparna med det förväntade värdet (1H) baserat på PEG-stamnätskalibreringen (Figur 1).
OBS: Medelvärde av de två topparna märkta som "a" (figur 1) och multiplicera med 100 för att få den genomsnittliga PEGαMA-funktionaliseringsprocenten.
Figur 1: Proton-NMR bekräftade framgångsrik PEGαMA-funktionalisering. NMR-analys utfördes i kloroform-D (CDCl 3) och visade funktionalisering på 96,5 %. PEGαMA 1 H NMR (300 MHz, CDCl3): d (ppm) 1,36(t, 3H, CH 3-),3,71 (s, 114H, PEG CH 2-CH 2), 4,29 (t, s, 4H, -CH 2-C(O)-O-O, -O-CH2-C(=CH 2)-), 5,93 (q, 1H, -C=CH 2), 6,34 (q, 1H, -C=CH 2). Klicka här för att se en större version av denna figur.
2. Modelldesign och 3D-bioprinterinställning
OBS: En kommersiellt tillgänglig 3D-skrivare (se materialförteckning) modifierades genom att ersätta den termoplastiska extrudern med en specialbyggd sprutpumpsextruder och anpassades från Hinton et al.20. Design med öppen källkod finns tillgänglig online: https://3d.nih.gov/users/awfeinberg.
- Öppna programvaran Fusion 360 (se Materialförteckning) och gör en 3D-datorstödd ihålig cylinderdesign.
OBS: En nedladdningsbar file som kan användas för detta steg och efterliknar blodkärlsgeometri finns i Supplement File 1. - Spara filen och öppna den i Slic3r-programvaran (se Materialförteckning). Dubbelkolla att alla parametrar är som önskat och tryck sedan på exportens G-kodsknapp. Spara G-koden på datorn.
- Öppna Pronterface-programvaran (se Materialförteckning) och ladda upp G-koden file.
OBS: Pronterface-programvaran samverkar med bioprintern och ger tillräcklig hårdvaruinmatningskontroll. En användbar G-kodsfil finns i tilläggsfil 2. - Överför bioprintern och alla tillhörande delar till ett biosäkerhetsskåp (BSC) med aseptisk teknik.
- Montera en 30 G 0.5" lång trubbig nålspets (se Materialtabell) på tryckglassprutan och lägg åt sidan.
- Anslut bioprinterns nätsladd till ett uttag. Tryck på den röda strömknappen på framsidan av bioprintern för att slå på den. Anslut USB-kabeln (Universal Serial Bus) mellan datorn och bioprintern och se till att alla kabelanslutningar är upprättade och anslutna.
3. Beredning av stödbad och reagenser
OBS: Utför alla steg i ett biosäkerhetsskåp med aseptisk teknik.
- Bered cellodlingsmedium bestående av SmBM Basal Medium (CC-3181) och SmGM-2 SingleQuots-tillskott (CC-4149), exklusive fetalt bovint serum (FBS), enligt tillverkarens instruktioner. Förvaras vid 4 °C fram till användning.
- Alikvot 50 ml av cellodlingssubstratet och tillsätt 1 % v/v FBS (CC-4149) (se materialförteckning) för att göra ett medium med låg serumhalt. Förvaras vid 4 °C fram till användning.
- Återsuspendera gelatinsuspensionspulvret enligt tillverkarens anvisningar med sterila cellodlingssubstrat utan FBS som spädningsvätska (se materialförteckningen). Omedelbart före användning, justera gelatinuppslamningens slutliga pH till pH 9 med hjälp av 2 M kaliumhydroxid (KOH) och/eller 2 M saltsyra (HCl) för att justera lösningens pH efter behov med hjälp av en pH-mätare.
- Fyll önskat antal brunnar på en 24-hålsplatta, var och en ungefär halvfull, med 1 ml gelatinslam per brunn med en spruta utan nål.
OBS: Fyll mitten av brunnarna jämnt och bekräfta att det inte finns några luftfickor. Knacka på plattan för att hjälpa till att fördela mikropartikeluppslamningen jämnt. Justera höjden och volymen på uppslamningen per brunn efter behov för att passa varje bioprintstorlek och form. Användare kan skapa en hemmagjord spruta för att överföra gelatinslammet till varje brunn. Detta kan göras genom att tillsätta en sprutkolv av rätt storlek i ett 50 ml provrör som redan innehåller den komprimerade gelatinslammen i botten. När du sätter i kolven, sätt in en liten guidekabel längs provröret för att hjälpa luft att komma ut, och ta sedan bort den när kolven är i kontakt med gelatinslammet. Omedelbart före användning, skär av spetsen på provröret med ett rakblad för att skapa ett hål för gelatinslammet att spruta ut ur och tryck ner kolven. - Placera den fyllda 24-hålsplattan i mitten av bioprintersteget och fäst den på scenen.
OBS: Figur 2 visar en generisk bioprinterinställning. Placera ett gummiband runt utskriftssteget för att fästa en 24-hålsplatta på plattformen och förhindra rörelse.
Figur 2: Grundläggande inställning av 3D-bioprintning. Bioprintern installerades i en steril miljö, t.ex. i ett biosäkerhetsskåp, och skrivhuvudet monterades så att glassprutan och nålen sänktes ner vertikalt i stödbadets tryckområde nedanför. Klicka här för att se en större version av denna figur.
4. Cellodling
OBS: Utför alla steg i ett biosäkerhetsskåp med aseptisk teknik.
- Tina HPAAF-celler (kommersiellt erhållna, se Materialförteckning) och expandera ut dem i T-75 vävnadskulturbehandlade plastkolvar innehållande SmBM Basal Medium (CC-3181) och alla SmGM-2 SingleQuots-tillskott (CC-4149) enligt tillverkarens anvisningar (se Materialförteckning).
OBS: Standardprotokoll för cellodling för vidhäftande celler bör användas, med bibehållen temperatur på 37 °C och 5 % CO2 och påfyllning av mediet med några dagars mellanrum. - När HPAAF har nått ~80-90 % sammanflöde, aspirera mediet och skölj cellerna en gång med fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS).
- Tillsätt cirka 4 ml förvärmd 0,05 % trypsin-EDTA till varje T-75-kolv. Luta kolven för att säkerställa att hela cellodlingens yta är täckt med 0,05 % trypsin-EDTA-lösning. Inkubera kolvarna i 3–5 minuter vid 37 °C och kontrollera om cellerna lossnar.
- När cellerna flyter, tillsätt minst 6 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) till varje kolv och överför cellerna till ett 50 ml koniskt rör.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 300 x g i 5 minuter vid rumstemperatur för att pelletera cellerna. Aspirera supernatanten från cellpelleten och återsuspendera cellerna i 1-3 ml media med FBS med hjälp av en 1000 μL pipett, vilket säkerställer en encellssuspension.
- Överför 10 μl av cellsuspensionen till ett mikrocentrifugrör. Tillsätt 10 μL Trypan Blue-lösning och blanda väl. Använd 10 μL av denna blandning för att räkna celler i en hemocytometer med hjälp av ett inverterat ljusmikroskop.
OBS: För att uppnå en slutlig biobläckkoncentration på 4 x 106 celler/ml avsattes 800 000 fibroblaster för varje 200 μL biobläck.
5. Beredning av hydrogelbiobläck
OBS: Biobläckberedningen anpassades från Davis-Hall et al.5. Steg 5.1-5.2 kan slutföras parallellt med steg 4.1-4.3 för att minimera tiden mellan cellinsamling och resuspension i biobläcket. Utför steg i ett biosäkerhetsskåp med hjälp av en aseptisk teknik.
- Bered en 20 mM tris(2-karboxetyl)fosfin (TCEP, se Materialtabell) pH 7-lösning och sterilt filter med ett 0,2 μm sprutfilter. Omedelbart före användning, tillsätt 2 M KOH och/eller 2 M HCl för att justera lösningens pH efter behov. Mät med pH-mätare och justera därefter.
OBS: TCEP minskar disulfidbindningar. - Bered en stamlösning på 0,25 mg/ml av PEGαMA som återsuspenderas i sterila cellodlingsmedier utan FBS, 250 mM stamlösningar av 1,4-ditiotreitol (DTT), MMP2-nedbrytbar tvärbindare och CGRGDS-peptid (RGD) (se materialförteckning), alltsammanhängande i 20 mM steril TCEP, och en 15 viktprocent stamlösning av polyetylenoxid (PEO) i destillerat vatten med hjälp av pipetter efter behov.
- Följ tabell 1 som vägledning, kombinera de respektive mängder som behövs av PEGαMA, DTT, MMP2-nedbrytbar tvärbindare, PEO, CGRGDS och cellodlingsmedia med låg serumhalt tillsammans med fibroblasterna i ett 50 ml koniskt rör.
OBS: Det rekommenderas att kontrollera pH med pH-remsor efter tillsats av alla utom cellodlingsmediet eftersom denna kombination bör resultera i att pH är mycket nära 6,2. Om ytterligare pH-justeringar krävs, håll reda på hur mycket ytterligare volym som behövs för att justera pH-värdet för prekursorlösningen. Höj den totala volymen till 200 μl genom att tillsätta den återstående cellodlingsmedievolymen minus eventuell volym som tillförts under den slutliga pH-justeringen. - Blanda biobläcket med en pipett för att säkerställa att cellerna är enskilda celler och bekräfta att den slutliga prekursorlösningen är pH 6,2 för att förhindra baskatalyserad polymerisation under 3D-bioprinting.
- Ladda biobläcket i glassprutan genom att ta bort kolven och använda en separat spruta med en 15 gauge 1,5" lång trubbig nålspets (se materialtabell) fäst för att överföra biobläcket från centrifugröret till sprutan, var noga med att undvika att bilda luftbubblor i lösningen.
- Placera glassprutan i skrivhuvudet och fäst skrivhuvudets komponenter så att allt är ordentligt monterat och klart för utskrift.
OBS: Vid denna tidpunkt bör glassprutan i skrivhuvudet ha en 30 gauge 0.5" längd trubbig nålspets fäst vid den för utskrift.
| Komponent | Koncentration av stamlösning | Belopp att lägga till |
| PEGαMA | 0.25 mg/ml | 140 μL |
| DTT | 250 mM | 12,24 μL |
| MMP2 Nedbrytbar tvärbindare | 250 mM | 5,25 μL |
| RGD | 250 mM | 1,6 μL |
| PEO | 15 viktprocent | 33,33 μL |
| Aktiveringsmedier och/eller pH-justeringsreagenser | - | 7,58 μL |
| Fibroblaster | - | 800000 celler |
Tabell 1: Exempel på volymer som krävs för beredning av 200 μl biobläck (hydrogelprekursorlösning och fibroblastceller).
6.3D bioprinting
OBS: Utför alla steg i ett biosäkerhetsskåp med aseptisk teknik.
- Använd riktningspilarna i Pronterface-programvaran för att manuellt justera extruderingsnålens position i mitten av en brunn och i stödbadslammet. Lämna minst 1 mm stödbadslam under nålspetsen.
OBS: Programvaran har ingen möjlighet att avgöra var nålen är i rymden. Det är helt upp till användaren att flytta nålen genom att manuellt klicka på pilarna i programvaran (t.ex. genom att klicka på uppåtpilen flyttas nålen uppåt eller bort från tryckplattformen, etc.). Manövrera nålen försiktigt för att säkerställa att den inte träffar några gränser i brunnen. - När nålspetsen är placerad i mitten av uppslamningen i brunnen, tryck på startknappen i Pronterface och vänta tills utskriften är klar för att uppnå konstruktioner, som visas i figur 3A.
OBS: För att bioprinta en konstruktion med hjälp av den medföljande filen (tilläggsfil 1) tar det cirka 3 minuter. Det tar ca 5 min att orientera och flytta nålen och sedan skriva ut en konstruktion helt från början till slut. - Upprepa steg 6.1-6.2 tills antalet önskade bioprintade konstruktioner är uppnått.
OBS: Vi rekommenderar att du gör fler konstruktioner än vad som behövs för att ta hänsyn till eventuella misslyckade utskrifter. Om fel inträffar, gå till nästa brunn, återställ allt och upprepa steg 6.1-6.2 igen. - Låt brunnsplattan stå i rumstemperatur och täck den i BSC i 1 timme efter att utskriften är klar för att möjliggöra baskatalyserad polymerisation av den fotoavstämbara hydrogelen.
- Placera brunnsplattan med 3D-bioprintade konstruktioner i en steril inkubator på 37 °C och låt dem stå i 12–18 timmar för att smälta bort stödbadslammet.
Figur 3: Experimentellt schema. Detta protokoll beskrevs i tre huvudsteg: (A) 3D-bioprintning av PEGαMA ihåliga rör med inbäddade celler för att efterlikna lungkärl. (B) Fotoinitiering av homopolymerisationsreaktion för att stelna den cellulära mikromiljön. (C) Bedömning av cellulära markörer för proliferation och aktivering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
7.3D bioprintad konstruktkultur och fotostiffening
OBS: Alla steg bör utföras i ett biosäkerhetsskåp med aseptisk teknik.
- Bered 2,2 mM litiumfenyl-2,4,6-trimetylbensoylfosfinat (LAP) (se materialtabell) stamlösning i PBS och sterilt filter med ett 0,2 μm sprutfilter. Håll LAP-lösningen skyddad från ljus.
- Efter 12-18 timmar byter du media som omger de bioprintade konstruktionerna. Ta bort mediet och det smälta gelatinets stödbad manuellt i brunnarna och var försiktig så att du inte stör de bioprintade konstruktionerna.
OBS: Det är bra att långsamt ta bort mediet samtidigt som du håller plattan i 45° vinkel så att konstruktionerna kommer ut i brunnen och kan ses. En klar hydrogelcylinder bör kunna identifieras i varje brunn med lyckat tryck (figur 4A). - Tillsätt en lämplig volym media med låg serumhalt i varje brunn.
OBS: För en platta med 24 brunnar bör 700 μL media per brunn helt täcka de bioprintade konstruktionerna. Justera efter behov. - Sätt tillbaka plattan i inkubatorn och byt media på proverna var 3:e dag eller i enlighet med försöksplanen.
- Tjugofyra timmar före den önskade förstyvningstidpunkten, ta bort media från proverna och ersätt dem med lågserummedia kompletterat med 2,2 mM steril LAP.
OBS: För att fluorescerande märka strukturen, svälla 3D-bioprintade konstruktioner i PBS kompletterat med 10 μM metakryloxietyltiokarbamoylrhodamin B (seMaterial som kan användas) över natten, styvna sedan enligt beskrivningen i steg 7.6 för att fluorescerande märka strukturen. Överför till PBS i 2 dagar vid 4 °C för att avlägsna överskott av rhodamin och bild med hjälp av ett TRITC-filter (Figur 4B,C). - Vid önskad förstyvningstid, ta bort hälften av mediet från brunnarna som ska styvas och placera plattan med locket av under UV-ljus. Slå på UV-ljuset och styva upp dessa konstruktioner genom att applicera 10 mW/cm2 365 nm ljus i 5 minuter med Omnicure (se Materialförteckning) och ett 365 nm bandpassfilter (Figur 3B).
OBS: Använd radiometern/fotometern för att bekräfta att ljusintensiteten är korrekt innan du utsätter celler för UV-ljus. - Ta bort de återstående medierna från dessa brunnar och tillsätt nya medier med låg serumhalt i varje brunn. Sätt tillbaka plattan i inkubatorn.
- Ta ut plattan ur inkubatorn och utför fibroblastaktiveringsstudien vid önskad tidpunkt enligt steg 9.
Figur 4: 3D-bioprintade hydrogelstrukturer stödde cellviabilitet över tid. (A) Fotografi av 3D-printad hydrogelstruktur i en 24-hålsplatta. (B) Projicering med maximal intensitet av fluorescerande märkt PEGαMA 3D-printad hydrogel. Skalstreck = 1 mm. Högre förstoringsmikroskopi visade porer i hydrogelstrukturen inducerade av gelatinmikropartiklar i FRESH-bioprintningsstödbadet. (C) 3D-printat PEGαMA-rör med fluorescerande märkta förstyvade områden avbildade på ett konfokalmikroskop (100 μm z-stack visas som en projektion med maximal intensitet) visade rumslig kontroll över förstyvning i 3D. Skalstapel = 500 μm. (D) HPAAF-viabilitet i 3D-bioprintade konstrukt mätt med levande/döda analyser. Konstruktioner med en tjocklek på 300 μm och 4 × 106 celler/ml överträffade alla andra förhållanden vid varje tidpunkt. Lönsamheten nådde sin topp dag 7. Detta tillstånd och denna tidpunkt valdes för framtida experiment. Kolumnerna visar medelvärdet ± SEM, n = 3. *, p < 0,05, ANOVA, Tukey HSD. (E) Representativa konfokalbilder av celler i 3D-konstruktioner färgade med levande/dött reagens vid dag 7, den tidpunkt som har den största totala viabiliteten. Calcein AM-märkta levande celler i grönt och propidiumjodid markerade döda celler i rött. Kolumnen längst till höger visar att det bäst presterande tillståndet hade en enhetlig cellfördelning och en hög andel levande celler. Skalstapel = 500 μm. Återges med tillstånd från Davis-Hall et al.5. Klicka här för att se en större version av denna figur.
8. Bedömning av fibroblasternas viabilitet
- Vid önskad livsduglighetstidpunkt, färga med calcein AM och propidiumjodid (se materialförteckning).
OBS: För att sammanfatta bör media avlägsnas från varje brunn och konstrukterna bör sköljas med steril PBS. Inkubera konstruktörerna i en levande/död färgningslösning i 40 minuter vid 37 °C på en vippa. Färgningslösningen ska innehålla calcein AM (1:1000 spädning) och propidiumjodid (1:1000 spädning) för att identifiera levande eller döda celler vid avbildning. - Överför konstrukten till steril PBS och avbilda omedelbart på ett konfokalt fluorescensmikroskop. Ta tre olika 100 μm z-stackbilder per prov per tidpunkt och ange viabilitet som den genomsnittliga procentandelen levande celler (figur 4D,E).
9. Bedömning av fibroblastaktivering
- Bered 3 % vikt/volymprocent bovint serumalbumin (BSA) och 0,1 % volymprocent Tween 20 i PBS. Denna lösning kallas immunofluorescenslösning (IF-lösning).
- Vid önskade tidpunkter, ta bort media från provbrunnarna och skölj konstruktionerna med PBS. Byt ut PBS mot 4 % paraformaldehyd (PFA) och förvara dessa prover vid 37 °C i 30 minuter på en vippa. Byt sedan ut 4 % PFA mot 100 mM glycin i PBS och lämna dessa prover på en vippa vid rumstemperatur (RT) i ytterligare 15 minuter.
- Överför sedan dessa prover till Tissue-Tek Cryomolds, täck provet helt med optimal skärtemperatur (OCT) lösning (se materialtabell) och låt OCT diffundera in i proverna i 12-18 timmar vid 4 °C.
- Snabbfrys de OCT-indränkta proverna i 2-metylbutan med flytande kväve. Fyll en frigolitlåda eller annan lämplig behållare med flytande kväve och placera sedan en andra behållare fylld med 2-metylbutan i det flytande kvävet så att den är minst halvvägs nedsänkt. Använd en pincett för att hålla varje kryomold som innehåller ett OCT-täckt prov i flytande kvävekylt 2-metylbutan tills det är synligt fruset. Dessa prover kan förvaras vid -80 °C tills de är redo för kryosektion.
VARNING: Personlig skyddsutrustning (PPE) som kallskyddshandskar, ett köldskyddsförkläde och ansiktsskydd som finns i det kryogena säkerhetskitet (se materialtabell) bör användas vid hantering av flytande kväve. - Kryosektion av de frysta OCT-proverna vid -22 °C och fäst 10 μm tjocka skivor på positivt laddade glasobjektglas. Förbered tre objektglas med minst 3-5 kryosektioner per objektglas för varje 3D-hydrogelprov.
OBS: Objektglasen kan förvaras vid denna punkt vid -80 °C om det behövs som stopppunkt. - Fixera kryosektionerna i iskall aceton i 15 minuter för att hjälpa kryosektionerna att fästa vid objektglasen. Skölj försiktigt kryosektionerna med RT-vatten för att ta bort eventuell kvarvarande OCT. Låt dessa prover torka och skissera kryosektionerna med en hydrofob penna (se materialförteckning).
- Permeabilisera proverna vid rumstemperatur med 0,2 % v/v Triton X-100 i PBS i 10 min och blockera sedan sektionerna med 5 % BSA w/v i PBS i 1 h vid RT.
- Tillsätt den primära antikroppen mot human alfa-glatt muskulaturaktin (αSMA) (1:250 spädning) (se materialförteckning) till IF-lösningen. Förvara dessa snittade prover med den primära antikroppen över natten vid 4 °C. Skölj proverna 3 gånger med IF-lösning.
- Inkubera sektionerna i IF-lösning som innehåller den sekundära getanti-musantikroppen Alexa Fluor 555 (1:250 spädning) och två droppar ActinGreen 488 ReadyProbe (se materialtabell) per ml IF-lösning. Täck proverna för alla efterföljande steg med aluminiumfolie för att skydda dem från ljus och låt den sekundära antikroppslösningen stanna på proverna i 1 timme vid RT.
- Skölj sektionerna 3 gånger med IF-lösning. Inkubera dem i 300 nM 4',6-diamidino-2-phylindol (DAPI) i DI-vatten i 15 minuter vid RT. Utför en sista sköljning av sektionerna 3x med DI-vatten.
- Använd 10 μl av ett kommersiellt tillgängligt antifade-reagens (se materialtabell) och täck sektionerna med standardmetoder.
OBS: De monterade objektglasen kan förvaras skyddade från ljus i en frys på -80 °C tills de behövs för bildbehandling. - Avbilda kryosektionerna med ett fluorescensmikroskop (Figur 3C och Figur 5B). Bild tre slumpmässiga sektioner per bild med ett 10x mål.
OBS: Bilder bör tas i DAPI-, FITC- och TRITC-kanalerna. - Ladda upp bilderna till ImageJ (NIH). Kvantifiera procentandelen αSMA-positiva celler som ett mått på fibroblastaktivering (figur 5A) genom att dividera det totala antalet αSMA-positiva celler med det totala antalet cellkärnor för varje synfält.
Figur 5: Fibroblastaktivering i 3D-bioprintade modeller av pulmonell arteriell adventiti . (A) Fibrotisk aktivering i mjuka och stela 3D-hydrogeler mätt med αSMA-uttryck. HPAAF i förstyvade konstrukt var signifikant mer positiva för αSMA än celler i mjuka konstrukt. Kolumnerna representerar medelvärdet ± SEM, n = 3. *, p < 0,05, Mann-Whitney U-test. (B) Representativa konfokalbilder av immunfärgning för αSMA, aktin och DAPI i mjuka och stelnade 3D-hydrogeler. HPAAF i stelnade konstrukt uppvisade vanligare αSMA-immunofluorescens än celler i mjuka konstrukt. Skalstapel = 250 μm. (C) Fibroblastproliferation i mjuka och stela 3D-bioprintade konstrukt mätt med EdU-positivitet. HPAAF i förstyvade konstrukt var signifikant mer positiva för EdU än celler i mjuka konstrukt. Kolumnerna representerar medelvärdet ± SEM, n = 3. *, p < 0,05, Mann-Whitney U-test. (D) Representativa konfokalbilder av immunfärgning för EdU- och Hoechst-färgämnen i mjuka och stelnade 3D-hydrogeler. HPAAF i stelnade konstrukt uppvisade vanligare EdU-immunofluorescens än celler i mjuka konstrukt. Skalstapel = 300 μm. Återges med tillstånd från Davis-Hall et al.5. Klicka här för att se en större version av denna figur.
10. Bedömning av fibroblastproliferation
- Tjugofyra timmar före en önskad proliferationstidpunkt, avlägsna cellodlingssubstrat från varje brunn och ersätt med lågserumsubstrat kompletterat med 10 μM EdU-lösning från det kommersiellt tillgängliga cellproliferationssatsen (se materialförteckning). Lägg tillbaka proverna i inkubatorn för inkubation över natten.
- Vid den önskade spridningstidpunkten, fixera proverna som inkuberats med EdU med 4 % PFA vid 37 °C i 30 minuter på en vippa. Ersätt 4 % PFA-lösningen med 100 mM glycin i PBS och inkubera proverna vid 37 °C i minst 15 minuter. Tillsätt Hoechst i lämplig koncentration i 30 minuter och skölj sedan konstruktet 2 gånger med PBS.
OBS: Proverna kan förvaras skyddade från ljus vid 4 °C fram till avbildning. - Ta en bild av alla fasta och lagrade EdU-prover med hjälp av ett fluorescensmikroskop och tillverkarens föreslagna inställningar och filter för cellproliferationssatser (figur 3C och figur 5D). Skaffa tre olika z-stackavbildningar på 100 μm per prov och skapa maximala projektioner från var och en av dessa z-stackar. Mät HPAAF-proliferation genom att räkna antalet EdU-positiva celler och dividera med det totala antalet celler som identifierats av Hoechst-motfärgning inom de maximala projektionsbilderna (figur 5C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll beskriver hur man 3D-bioprintar fotoavstämbara hydrogeler i ett stödbad för att skapa konstruktioner som kan dynamisk och tidsmässig förstyvning för att studera fibroblastaktivering i geometrier som efterliknar mänskliga vävnader. Först förklarade protokollet hur man syntetiserar PEGαMA, ryggraden i detta fotojusterbara polymersystem. Spektroskopimätningar med kärnmagnetisk resonans (NMR) visade framgångsrik PEGαMA-funktionalisering vid 96,5 % (figur 1). Funktionaliseringsvärden på 90 % eller högre är acceptabla för den här proceduren. Därefter presenteras detaljer om hur man skapar en 3D CAD-modell av en ihålig cylinder för att efterlikna lungkärl. En nedladdningsbar 3D CAD-modell finns i tilläggsfil 1, medan den tillhörande G-koden för denna design finns i tilläggsfil 2. Denna CAD-modell producerade konstruktioner med följande mått: 4 mm höjd, 4 mm innerdiameter och 300 μm väggtjocklek.
Instruktioner för hur du ställer in bioprintern finns (figur 2). Att sätta ihop skrivhuvudet ordentligt och fästa det så att glassprutan och nålen extruderar biobläcket direkt i en brunn som innehåller stödbadet nedan är ett kritiskt steg (Figur 2 och Figur 3A). Tabell 1 innehåller den information som krävs för att bereda stamkoncentrationerna för biobläckets beståndsdelar och de korrekta volymer som ska kombineras för att uppnå den biobläcksammansättning som använts i dessa studier som representativa resultat. Den slutliga biobläckformuleringen var 17,5 viktprocent PEGαMA med 0,375 molförhållande (αMA:tioler) av 70:30 DTT:MMP2-nedbrytbara tvärbindare, 2 mM CGRGDS och 2,5 viktprocent PEO. Denna reaktion binder kovalent CGRGDS-peptiden i hydrogelnätverket genom en reaktion mellan en fri tiol på cystinet och en αMA-del. pH-värdet för biobläck och stödslurrylösningar justerades till värden på 6,2 respektive 9. Denna kombination av ett surt biobläck och basisk stödbadslurry underlättade polymerisationen av de 3D-bioprintade konstruktionerna och bibehöll de cylindriska strukturerna (Figur 4A-C). På dag 7 var 91 ± 2 % av cellerna levande och vid dag 14 var 85 ± 3 % fortfarande livsdugliga (medelvärde ± SEM, ANOVA, Tukey HSD) och statistiskt signifikanta med p < 0,05 (Figur 4D,E).
Slutligen beskrev detta protokoll hur man styvar upp de 3D-bioprintade konstruktionerna genom fotoinitiering (Figur 3B) av sekundär polymerisationsreaktion med oreagerade αMA-delar. Det ursprungliga manuskriptet av Davis-Hall et al. visade genom parallell plattreologi att de 3D-bioprintade konstruktionerna hade en initial elasticitetsmodul på 4,7 ± 0,09 kPa och ökade efter fotoinitierad förstyvning till 12,8 ± 0,47 kPa5. Fibroblastaktiveringen bedömdes på dag 7 genom att kvantifiera antalet fibroblaster som uttrycker alfa-glatt muskelaktin (αSMA). En större andel av fibroblasterna i förstyvade hydrogelkonstruktioner aktiverades (88 ± 2 %) jämfört med mjuka prover (65 ± 4 %) (medelvärde ± SEM, Mann-Whitney U-test) med statistisk signifikans på p < 0,05 (Figur 5A,B). På samma sätt var 66 ± 6 % av fibroblasterna i de förstyvade konstruktionerna positiva för EdU, en proliferationsmarkör, jämfört med 39 ± 6 % av fibroblasterna i det mjuka tillståndet (medelvärde ± SEM, Mann-Whitney U-test) med en statistisk signifikans på p < 0,05 (Figur 5C,D). Sammantaget stöder dessa resultat att en stelnad mikromiljö signifikant ökade fibrotiska aktiveringsmarkörer i 3D-bioprintade modeller.
Tilläggsfil 1: CAD-fil (Computer-aided design). Filen innehåller en cylindergeometri med 4 mm höjd, 4 mm innerdiameter och 300 μm tjocklek. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 2: G-kodsfil. Filen är associerad med cylindergeometri med 4 mm höjd, 4 mm innerdiameter och 300 μm tjocklek. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tvåstegs polymerisationsreaktioner som svar på kontrollerad ljusexponering kan styva biomaterial med rumslig och tidsmässig kontroll. Flera studier har utnyttjat denna teknik för att utvärdera cell-matrixinteraktioner i olika plattformar 5,8,9,10,11,21,22,23. Mer specifikt kan fotomasker eller tvåfotonexcitationsmetoder användas för att styva upp diskreta sektioner av en 3D-bioprintad konstruktion och undersöka hur celler svarar på dynamisk förstyvning i trånga områden eller gränsskikt som beskrivits i våra tidigare publikationer 5,8. Att välja meningsfulla tidpunkter för att bedöma cellsvar är avgörande. Här förstärktes konstruktionerna efter att ha tillåtit fibroblaster att spridas i den MMP-nedbrytbara fotoavstämbara hydrogelen för att möjliggöra aktiveringsstudier8. Detta protokoll beskriver hur man utvecklar ett fototunable hydrogelbiobläck och skapar 3D-bioprintade konstruktioner med hjälp av biobläck och stödbadskombination som initierade en pH-katalyserad polymerisationsreaktion. Polymerisationen av 3D-bioprintade konstrukt med distinkta geometrier utformade för att efterlikna lungkärl underlättades genom extrudering av surt biobläck till basisk stödbadslam. In vivo vävnadsstelhet är ett kännetecken för fibros och det är allmänt etablerat att mekaniska förändringar i den cellulära mikromiljön är potenta drivkrafter för sjukdomsprogression 10,23,24,25. Därför har detta protokoll och denna plattform en enorm potential när det gäller att ge viktiga detaljer om de mekanokänsliga cellulära mekanismer som är involverade i fibrotisk patogenes. Möjligheten att ändra konstruktionens geometri och egenskaper, bestämma specifika tidpunkter för att initiera förstyvning och bestämma vilken typ av celler som ska ingå i biobläcket är obestridliga fördelar med denna metod. Dessa variabler kan skräddarsys för att studera andra pH-katalyserade biomaterial och effekterna av mikromiljöförstyvning som är relevanta för andra biologiska tillämpningar.
PEGαMA valdes som ryggrad i biobläcket eftersom det är hydrolytiskt stabilt och mer reaktivt än andra vanliga tvåstegspolymerisationssystem såsom poly(etylenglykol) metakrylat (PEGMA)5,8,9. En MMP2-nedbrytbar peptidsekvens inkluderades som en tvärbindare för att tillåta adventiella fibroblaster att producera MMP2-endopeptidaser för att omforma den extracellulära mikromiljön26. Vår grupp och andra har visat att närvaron av cellnedbrytbar tvärbindare förbättrar fibroblastspridningen och är en funktion som är nödvändig för aktivering 5,27. Hög PEGαMA-funktionalisering är avgörande för framgången för detta protokoll, särskilt eftersom de oreagerade αMA-grupperna aktiverar klickkemifunktionen. PEGαMA med funktionalisering över 95 % är bäst, men 90 % funktionaliserad PEGαMA har fungerat med detta protokoll. Om funktionaliseringen av PEGαMA är lägre än önskat kan det resultera i inkonsekvent polymerisation, särskilt när det finns hög celldensitet. För att övervinna denna utmaning rekommenderas att man tar hänsyn till cellpelletens volym och subtraherar denna volym från volymen av cellodlingsmedier och pH-justeringsreagenser som tillsätts i tabell 1. Luftfickor i stödbadet, för tidig polymerisation i sprutan eller felaktiga pH-värden för de olika lösningarna som beskrivs ovan är andra vanliga felmekanismer som har observerats med detta protokoll.
Justeringar av biobläckets och stödbadets pH bör utföras för varje försök individuellt för att ta hänsyn till variation från sats till sats eller förändringar i pH över tiden. Till exempel, när pH 7 TCEP användes för att återsuspendera dessa biobläckkomponenter med vissa PEGαMA-batcher, behövde det totala biobläckets pH justeras närmare 7-7,5 istället för 6,2. Tidigare forskning visar att fibroblaster som exponerats för pH-justerade medier från 6,2-9 kan motstå dessa pH-förändringar och bibehålla viabilitet5. Dessutom har tidigare forskning visat att kontrollerad UV-ljusexponering som används för att polymerisera hydrogeler med celler inbäddade i har minimala effekter på cellviabiliteten och inte förändrar fibroblasttranskriptomet 8,9,10,28. Men om låg cellviabilitet mäts bör pH-justering vara det första steget som tas för att ta itu med detta problem. Det är väl etablerat att pH har en betydande inverkan på cellviabiliteten 5,9,29, så användare bör utföra liknande viabilitetstester med specifika cellinjer som kan vara mer känsliga för pH-justeringar. Dessutom, innan du försöker storskaliga experiment, föreslås det att du testar eventuella avvikelser från detta protokoll med små batchstorlekar.
För närvarande har den interna bioprintern bara ett extruderingsskrivhuvud och kräver betydande tidskrävande användarinmatning för att manuellt orientera nålen och ge utskriftskommandon för varje prov. Kommersiellt tillgängliga bioskrivare30,31,32 tar itu med dessa begränsningar men är betydligt dyrare. Framtida arbete syftar till att skriva ut flerskiktskonstruktioner som innehåller en annan celltyp för att återskapa alla tre distinkta lungkärlsskikt (tunica intima, tunica media och tunica adventitia). Arbete som utförts av andra har redan visat att denna bioprintningsteknik med icke-fototunable material kan producera avancerade och geometriskt komplexa modeller, inklusive klyvning av blodkärlsstrukturer och hela det mänskliga hjärtat 6,7,20,33. Metoderna som tillhandahålls i detta protokoll kan reproduceras med olika bioprinters. Detta kommer att göra det möjligt för forskare att 3D-bioprinta en mängd olika material som genomgår pH-katalyserade polymerisationsreaktioner och konstruera ett antal modeller av vävnadshomeostas, sjukdom och reparation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa. Delar av detta manuskript återges med tillstånd från © IOP Publishing https://doi.org/10.1088/1758-5090/aca8cf. 5 Alla rättigheter förbehållna.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr. Adam Feinberg (Carnegie Mellon University) och de som var värdar för 3D Bioprinting Open-Source Workshop. Dessa personer gjorde det möjligt att lära sig teknikerna för FRESH bioprinting och bygga den 3D-bioprinter som användes för dessa studier. Dessutom vill författarna uppmärksamma Biorender.com, som användes för att producera figurer i detta manuskript. Detta arbete stöddes av flera grupper eller finansieringskällor, inklusive Rose Community Foundation (DDH och CMM), Colorado Pulmonary Vascular Disease Research Award (DDH och CMM), National Science Foundation under Award 1941401 (CMM), Department of the Army under Award W81XWH-20-1-0037 (CMM), National Cancer Institute of the NIH under Award R21 CA252172 (CMM), Ludeman Family Center for Women's Health Research vid University of Colorado Anschutz Medical Campus (DDH och CMM), National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health under utmärkelserna R01 HL080396 (CMM), R01 HL153096 (CMM), F31 HL151122 (DDH) och T32 HL072738 (DDH och AT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AccuMax Radiometer/Photometer Kit | Spectronics Corporation | XPR-3000 | To measure light intensity, used for photostiffening |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | BP2401-500 | Used during PEGaMA synthesis |
| Acetone | Fisher Scientific | A184 | Used with the cryosections |
| ActinGreen 488 ReadyProbes | Fisher Scientific | R37110 | Used for staining |
| Aluminum Foil | Reynolds | F28028 | |
| Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) | Sigma-Aldrich | 401757-1L | Used during PEGaMA synthesis |
| Argon Compressed Gas | Airgas | AR R300 | Used during PEGaMA synthesis |
| 8 Arm Poly(ethylene glycol)-hydroxyl (PEG-OH) | JenKem Technology | 8ARM-PEG-10K | Used during PEGaMA synthesis |
| 365 nm Bandpass Filter | Edmund Optics | 65-191 | Used for photostiffening |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9700-100 | Used during staining process |
| Buchner Funnel | Quark Glass | QFN-8-14 | Used during PEGaMA synthesis |
| Calcein AM | Invitrogen | 65-0853-39 | Used during staining process |
| Celite 545 (Filtration Aid) | EMD Millipore | CX0574-1 | Used during PEGaMA synthesis |
| Charged Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Chloroform-d | Sigma-Aldrich | 151823-10X0.75ML | Used to characterize PEGaMA |
| Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C10637 | Used for staining |
| 50 mL Conical Tubes | CELLTREAT | 667050B | |
| Cryogenic Safety Kit | Cole-Parmer | EW-25000-85 | |
| Cryostat | Leica | CM 1850-3-1 | |
| Dialysis Tubing | Repligen | 132105 | |
| 4’,6-Diamidino-2-Phylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Used for staining |
| Diethyl Ether | Fisher Scientific | E1384 | Used during PEGaMA synthesis |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 10197777001 | Bioink component |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Cytiva | SH30271.FS | |
| Filter Paper | Whatman | 1001-090 | Used during PEGaMA synthesis |
| Freezone 2.5L Freeze Dry System | Labconco | LA-2.5LR | Lyophilizer |
| Fusion 360 | Autodesk | N/A | Software download |
| 2.5 mL Gastight Syringe | Hamilton | 81420 | Used for bioprinting |
| 15 Gauge 1.5" IT Series Tip | Jensen Global | JG15-1.5X | Used for bioprinting |
| 30 Gauge 0.5" HP Series Tip | Jensen Global | JG30-0.5HPX | Used for bioprinting |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 555 Antibody | Fisher Scientific | A21422 | Used for staining |
| Glycine | Fisher Scientific | C2H5NO2 | Used during staining process |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 1461 | |
| Hoechst | Thermo Scientific | 62249 | Used during staining process |
| Human Pulmonary Artery Adventitial Fibroblasts (HPAAFs) | AcceGen | ABC-TC3773 | From a 2-year-old male patient |
| Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-500 | Used to pH adjust solutions |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | N/A | Free software download |
| ImmEdge® Pen | Vector Laboratories | H-4000 | Used during staining process |
| Incubator | VWR | VWR51014991 | |
| LifeSupport Gelatin Microparticle Slurry (Gelatin Slurry) | Advanced Biomatrix | 5244-10GM | Used for bioprinting |
| Light Microscope | Olympus | CKX53 | Inverted light microscope |
| Lithium Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889-5G | Photoinitiator used for photostiffening |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| LulzBot Mini 2 | LulzBot | N/A | Bioprinter adapted |
| Methacryloxyethyl Thiocarbamoyl Rhodamine B | Polysciences Inc. | 669775-30-8 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631-4L | |
| Microman Capillary Pistons CP1000 | VWR | 76178-166 | Positive displacement pipette tips |
| MMP2 Degradable Crosslinker (KCGGPQGIWGQGCK) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
| Mouse Anti-Human αSMA Monoclonal Antibody | Fisher Scientific | MA5-11547 | Used for staining |
| OmniCure Series 2000 | Lumen Dynamics | S2000-XLA | UV light source used for photostiffening |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Used to fix samples |
| pH Meter | Mettler Toledo | FP20 | |
| pH Strips | Cytiva | 10362010 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone Laboratories, Inc. | Cytiva SH30256.FS | |
| Pipette Set | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| 10 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1120-3710 | |
| 20 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1183-1510 | |
| 200 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-0700 | |
| 1000 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-2721 | |
| Poly(Ethylene Glycol)-Alpha Methacrylate (PEGαMA) | N/A | N/A | Refer to manuscript for synthesis steps |
| Poly(Ethylene Oxide) (PEO) | Sigma-Aldrich | 372773-250G | Bioink component |
| Positive Displacement Pipette | Fisher Scientific | FD10004G | 100-1000 µL |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473-500G | Used to pH adjust solutions |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | Used during staining process |
| Pronterface | All3DP | N/A | Software download |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | Used for staining |
| RGD Peptide (CGRGDS) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
| Rocker | VWR | 10127-876 | |
| Rotary Evaporator | Thomas Scientific | 11100V2022 | Used during PEGaMA synthesis |
| Rubber Band | Staples | 808659 | |
| Schlenk Flask | Kemtech America | F902450 | Used during PEGaMA synthesis |
| Slic3r | Slic3r | N/A | Software download |
| Smooth Muscle Cell Growth Medium-2 (SmGM-2) BulletKit | Lonza | CC-3182 | Kit contains CC-3181 and CC-4149 components |
| Sodium Hydride | Sigma-Aldrich | 223441-50G | Used during PEGaMA synthesis |
| Sorvall ST 40R Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-525 | |
| Stir Bar | VWR | 58948-091 | |
| Syringe Filter | VWR | 28145-483 | Used to sterile filter solutions |
| T-75 Tissue-Cultured Treated Flask | VWR | 82050-856 | Used for cell culture work |
| Tissue-Tek Cyromold | Sakura | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound (OCT) | Sakura | 4583 | |
| Tris(2-Carboxyethyl) Phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | C34H622O11 | Used during staining process |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | Used for cell culture work |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-062 | Used for cell culture work |
| Tween 20 | Fisher Bioreagents | C58H114O26 | Used during staining process |
| Upright Microscope | Olympus | BX63F | Fluorescent microscope capabilities |
| Water Bath | PolyScience | WBE20A11B | |
| 24-Well Tissue Culture Plates | Corning | 3527 |
References
- Ahrens, J. H., et al. Programming cellular alignment in engineered cardiac tissue via bioprinting anisotropic organ building blocks. Advanced Materials. 34 (26), e2200217 (2022).
- Lin, N. Y. C., et al. Renal reabsorption in 3D vascularized proximal tubule models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (12), 5399-5404 (2019).
- Grigoryan, B., et al. Multivascular networks and functional intravascular topologies within biocompatible hydrogels. Science. 364 (6439), 458-464 (2019).
- Kang, Y., Datta, P., Shanmughapriya, S., Ozbolat, I. T. 3D bioprinting of tumor models for cancer research. ACS Applied Biomaterials. 3 (9), 5552-5573 (2020).
- Davis-Hall, D., Thomas, E., Pena, B., Magin, C. M. 3D-bioprinted, phototunable hydrogel models for studying adventitial fibroblast activation in pulmonary arterial hypertension. Biofabrication. 15 (1), (2022).
- Mirdamadi, E., Tashman, J. W., Shiwarski, D. J., Palchesko, R. N., Feinberg, A. W. FRESH 3D bioprinting of a full-size model of the human heart. ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (11), 6453-6459 (2020).
- Shiwarski, D. J., Hudson, A. R., Tashman, J. W., Feinberg, A. W. Emergence of FRESH 3D printing as a platform for advanced tissue biofabrication. APL Bioengineering. 5 (1), 010904 (2021).
- Petrou, C. L., et al. Clickable decellularized extracellular matrix as a new tool for building hybrid hydrogels to model chronic fibrotic diseases in vitro. Journal of Materials Chemistry B. 8 (31), 6814-6826 (2020).
- Hewawasam, R. S., Blomberg, R., Serbedzija, P., Magin, C. M. Chemical modification of human decellularized extracellular matrix for incorporation into phototunable hybrid hydrogel models of tissue fibrosis. ACS Applied Materials & Interfaces. 15 (12), 15071-15083 (2023).
- Saleh, K. S., et al. Engineering hybrid hydrogels comprised healthy or diseased decellularized extracellular matrix to study pulmonary fibrosis. Cellular and Molecular Bioengineering. 15 (5), 505-519 (2022).
- Guvendiren, M., Burdick, J. A. Stiffening hydrogels to probe short- and long-term cellular responses to dynamic mechanics. Nature Communications. 3, 792 (2012).
- Rosales, A. M., Vega, S. L., DelRio, F. W., Burdick, J. A., Anseth, K. S. Hydrogels with reversible mechanics to probe dynamic cell microenvironments. Angewandte Chemie International Edition English. 56 (40), 12132-12136 (2017).
- Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nature Medicine. 18 (7), 1028-1040 (2012).
- Huertas, A., Tu, L., Humbert, M., Guignabert, C. Chronic inflammation within the vascular wall in pulmonary arterial hypertension: more than a spectator. Cardiovascular Research. 116 (5), 885-893 (2020).
- Kendall, R. T., Feghali-Bostwick, C. A. Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators. Frontiers in Pharmacology. 5, 123 (2014).
- Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. The Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).
- Habiel, D. M., Hogaboam, C. Heterogeneity in fibroblast proliferation and survival in idiopathic pulmonary fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 5, 2 (2014).
- Hu, C. J., Zhang, H., Laux, A., Pullamsetti, S. S., Stenmark, K. R. Mechanisms contributing to persistently activated cell phenotypes in pulmonary hypertension. The Journal of Physiology. 597 (4), 1103-1119 (2019).
- Li, M., et al. Emergence of fibroblasts with a proinflammatory epigenetically altered phenotype in severe hypoxic pulmonary hypertension. The Journal of Immunology. 187 (5), 2711-2722 (2011).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform-reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).
- Brown, T. E., et al. Secondary photocrosslinking of click hydrogels to probe myoblast mechanotransduction in three dimensions. Journal of the American Chemical Society. 140 (37), 11585-11588 (2018).
- Ondeck, M. G., et al. Dynamically stiffened matrix promotes malignant transformation of mammary epithelial cells via collective mechanical signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3502-3507 (2019).
- Caliari, S. R., et al. Stiffening hydrogels for investigating the dynamics of hepatic stellate cell mechanotransduction during myofibroblast activation. Scientific Reports. 6, 21387 (2016).
- Liu, F., et al. Feedback amplification of fibrosis through matrix stiffening and COX-2 suppression. Journal of Cell Biology. 190 (4), 693-706 (2010).
- Tschumperlin, D. J., Ligresti, G., Hilscher, M. B., Shah, V. H.
- Chelladurai, P., Seeger, W., Pullamsetti, S. S. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in pulmonary hypertension. European Respiratory Journal. 40 (3), 766-782 (2012).
- Caracena, T., et al. Alveolar epithelial cells and microenvironmental stiffness synergistically drive fibroblast activation in three-dimensional hydrogel lung models. Biomaterials Science. 10 (24), 7133-7148 (2022).
- Ruskowitz, E. R., DeForest, C. A. Proteome-wide analysis of cellular response to ultraviolet light for biomaterial synthesis and modification. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (5), 2111-2116 (2019).
- Kruse, C. R., et al. The effect of pH on cell viability, cell migration, cell proliferation, wound closure, and wound reepithelialization: In vitro and in vivo study. Wound Repair and Regeneration. 25 (2), 260-269 (2017).
- Filippi, M., et al. Perfusable biohybrid designs for bioprinted skeletal muscle tissue. Advanced Healthcare Materials. , e1500758 (2023).
- Matthiesen, I., et al. Astrocyte 3D culture and bioprinting using peptide-functionalized hyaluronan hydrogels. Science and Technology of Advanced Materials. 24 (1), 2165871 (2023).
- Xu, L., et al. Bioprinting a skin patch with dual-crosslinked gelatin (GelMA) and silk fibroin (SilMA): An approach to accelerating cutaneous wound healing. Materials Today Bio. 18, 100550 (2023).
- Bliley, J. M., Shiwarski, D. J., Feinberg, A. W. 3D-bioprinted human tissue and the path toward clinical translation. Science Translational Medicine. 14 (666), eabo7047 (2022).
