Summary
この記事では、口腔鼻腔瘻のあるマウスモデルを確立するための段階的な手順を概説します。口腔鼻瘻は、加熱された眼科焼灼を使用して硬口蓋の正中線部分を損傷し、口腔と鼻腔の間に開口部を形成することによって作成されました。
Abstract
この研究は、口腔瘻を調査するための実行可能なモデルを開発するために加熱された眼科焼灼を利用する方法を提示します。C57BL/6マウスを用いて、口腔鼻腔瘻(ONF)モデルを確立した。ONFを作製するために、マウスに麻酔をかけ、固定し、硬口蓋を露出させた。外科的処置中、眼科焼灼を使用して硬口蓋の正中線に2.0 x 1.5mmの全層粘膜損傷が誘発されました。実験を成功させるためには、ONFのサイズを制御し、出血を最小限に抑えることが重要でした。ONFモデルの有効性の検証は、解剖学的評価と機能的評価の両方を含む、術後7日目に実施されました。口腔内に鼻中隔が存在し、口腔内に注射した際の鼻孔からの滅菌水の流出により、ONFモデルの確立に成功しました。このモデルは、死亡率が低く、体重が有意に変化し、ONFサイズの変動が最小限であることを特徴とする、実用的で成功した口腔鼻腔瘻を実証しました。今後の研究では、口蓋創傷治癒のメカニズムを解明し、口腔鼻腔瘻の新しい治療法を探求するために、この方法論の採用を検討する可能性があります。
Introduction
口腔と鼻腔の間の異常な開口部である口腔瘻(ONF)は、臨床的には歯槽突起から口蓋垂までの構造領域の欠損として現れ、口蓋裂修復後の合併症として一般的に発生します1。ONFの患者は、食物逆流、構音障害、および咽頭機能障害を経験し、生活の質に大きな影響を与えます2,3,4。術後ONFの割合は、裂け目の幅、Veauタイプ、および手術方法5,6,7,8などの要因により、2.4%から55%の範囲です。さらに、ONF修復後の再発率は0%から43%の範囲で高くなっています9。
最近、さまざまな材料、薬物、および新しい技術を含む、いくつかの新しい治療法がONFの分野で有望であることが示されています10,11,12,13,14,15,16,17。治療効果の正確な評価は、ONF治療の選択とさらなる開発の基礎となるため、不可欠です。しかし、ONFの特性は患者によって異なるため、手術以外の治療効果について短期的に有効な評価を得ることは困難です。したがって、これらの治療法の有効性を検証するためには、ONF疾患モデルの確立が必要である。
数十年にわたり、研究者は、ラット18,19、子豚20,21、ミニブタ22、イヌ23など、さまざまな動物種で口鼻瘻(ONF)モデルを作成してきました。しかし、マウスはヒトと類似した遺伝子配列と全ゲノムを持っているため、新薬の研究開発のための重要なモデルとなっています24,25,26。さらに、マウスはバッチ間のばらつきがほとんどないため、ONFモデル12,13,27を確立するのに有利な選択肢となります。
ただし、ONFを作成するための詳細な手順は記載されておらず、ONFサイズの安定性は考慮されていませんでした。さらに、ONF形成の検証は観察のみに依存しており、口腔と鼻腔の間の直接的なコミュニケーションは保証されていませんでした28。ONFによる摂食困難によるマウスの体重減少など、他の手段では実証されなかった。さらに、創傷治癒を促進または阻害する薬物または材料の研究に不可欠な創傷サイズの正常な変動は考慮されていませんでした。したがって、安定した検証済みのONFモデルを確立することが強く求められています。
本研究の目的は、上記の課題に対応する実用的なONFモデルの開発であり、このプロトコルが口蓋創傷治癒のメカニズムとONFの新しい治療法に関する将来の研究の基礎となることを期待しています。
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Protocol
この研究のすべての動物手順は、四川大学西中国口腔病学学校の倫理委員会によってレビューおよび承認されました。本研究では、成体C57BL/6マウス(雌)を用いた。
1.手術の準備
- 手術に必要な手術器具を集めます:発芽器、眼科用焼灼、顕微手術用ハサミ、顕微手術用ピンセット、注射器、針(26 g x 0.63インチ)(図1A、B)( 材料表を参照)。
注意: 外科的処置の前に、眼科用焼灼、マイクロサージェリーピンセット、マイクロサージェリーハサミなどの手術器具を102.9 kPa(1.05 kg / cm2)および121°Cで20分間オートクレーブします。 - 手術用ドレープ、ラテックス手袋、滅菌綿、滅菌シート、滅菌金属ホイル、手術用プラットフォームとしての発泡スチロールボード、輪ゴム(医療用ラテックス手袋を引き裂くことで入手できる)、テープ(図1C)( 材料表を参照)など、必要な手術用品を集めます。
注意:手術野用の注射器や滅菌シートなど、マウスごとに個別の消耗品セットを使用してください。 - 手術部位と器具(光源、発泡スチロールボード、温度維持装置、 材料表を参照)をアルコールワイプを使用して清掃します。手順中に必要になる可能性のある器具のノブとハンドルを滅菌金属ホイルで覆います。
- 個々の器具を無菌的に開き、手術領域に慎重に配置します。発芽器( 材料表を参照)と、手順中に使用するライトをアクティブにします。眼科用焼灼を発芽器に入れ、250°Cで20分間加熱します。
2.外科的処置
- マウスの固定を行い、以下の手順で口腔を開きます。
- 体重20〜25g、8〜12週齢のメスのC57BL/6Jマウスを選択します。手順を実行する前に、マウスを7日間保管してください。
- ゾレチル50(80 mg / kg)およびキシラジン(5 mg / kg)の腹腔内注射によりマウスに麻酔をかけます( 材料表を参照)。マウスの目に眼科用軟膏を塗ります。つま先をつまむ反応がなくなるまで待ちます。
メモ: マウスは、単独でひっくり返すことができない場合、手順の準備ができています。 - 滅菌シートで裏打ちされた発泡スチロールボードにマウスを固定します。テープを使用して、マウスを仰臥位で手術台に結び付けます(図2A)。
- マウスの口腔を開きます。2本の針(26 g x 0.63インチ)を眼窩耳面の前に置き、さらに2本の針をその後ろに置きます。針の周りに輪ゴムを置き、切歯を交差させて口を開いたままにします。マイクロサージェリーピンセットを使用して、口角を平らげて開きます(図2B)。
注意: 硬口蓋がはっきりと露出していることを確認してください。舌を輪ゴムの下に固定して、視野の遮蔽やその後の実験中の火傷を防ぎます。
- 硬口蓋に口鼻腔瘻(ONF)を作成します(図3A-F)。
- 250°Cで20分間加熱した眼科用焼灼を取り出します。口蓋の正中線と第一小臼歯の線の交点から1mm離して焼灼の先端を置き、正中線の硬口蓋に全層粘膜損傷を作成します。
注意: マウスの舌をやけどしないでください。 - 数秒後、焼灼先端の粘膜が白くなったら眼科焼灼を抜去します。
- 眼科用焼灼を発芽器に入れ、250°Cで10分間加熱し続けます。前の手順を繰り返して、長さが2.0mm、幅が1.5mmになるまで、端の周りの傷を拡大します。
注意: 各エクステンションは、最後の怪我の端に従う必要があります。ノギスを使用して、怪我の長さと幅を測定します。怪我は口蓋の10%を覆う必要があります。 - マイクロサージェリーハサミを使用して、創傷の周りの余分な変性軟部組織を取り除きます。滅菌綿を使用して、マウスの出血を止め、吸入窒息を防ぎます。創傷を測定して、正中線で2.0 x 1.5 mmの全層硬口蓋粘膜損傷を形成していることを確認します。
- 250°Cで20分間加熱した眼科用焼灼を取り出します。口蓋の正中線と第一小臼歯の線の交点から1mm離して焼灼の先端を置き、正中線の硬口蓋に全層粘膜損傷を作成します。
3. 術後のケア
- 術後覚醒時にメロキシカムをマウスに投与し、5 mg / kg / dの用量で3日間、皮下投与します29。.
- マウスが完全に意識を取り戻すまで、温度維持装置の上にマウスを置きます。
メモ: マウスが呼吸しやすい位置にあることを確認してください。マウスを10〜15分ごとに回転させて、血液が溜まったり、肺葉がつぶれたりするのを防ぎます。マウスが温まったら、ケージに戻します。マウスが消費できるように、ケージの底に滅菌ゼリーと照射された飼料を提供します。
4.口腔鼻腔瘻の生成の検証
注:口腔鼻腔瘻(ONF)の作成の成功は、外科的処置の7日目に評価されます。
- 輪ゴム、テープ、注射器、外科用ドレープ、ラテックス手袋、滅菌シート、滅菌金属ホイル、発泡スチロールボードなど、必要な手術用品を準備します。
- 無菌状態を維持するために、外科用ドレープと滅菌手袋を着用してください。発泡スチロールボード、光源、温度維持装置をアルコールで消毒します。
- ゾレチル50(80 mg / kg)の腹腔内注射による全身麻酔を誘発します。.つま先をつまむ反応がなくなるまで待ちます。ステップ2.1.3および2.1.4で説明したのと同じ方法を使用して、マウスを固定し、硬口蓋を露出させます。
- 解剖学的構造検証は、創傷部位に中隔がまだ見えることを確認し、ONFの作成が成功したことを示します(図4A、B)。
- 機能検証を行う:マウスの口腔を閉じ、滅菌シリンジを使用して口腔内に滅菌水を注入します。ONFの生成が成功したのは、マウスの鼻孔から液体が流れたときです。
- マウスが完全に意識を取り戻すまで、温度維持装置(37°C)の上にマウスを置きます。マウスを10〜15分ごとに回転させて、血液が溜まったり、肺葉がつぶれたりするのを防ぎます。
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Representative Results
この実験法の実現可能性と安定性を評価するために、10匹のマウスで同様の手順を実行し、死亡率、創傷サイズの変化、体重、および組織学的分析に関する観察を行いました。マウスは7日目に安楽死させた。
この手順は低い死亡率を示しました。図1A-Cに示されている眼科焼灼と発芽器は、この実験で使用された主要な器具でした。ONF モデルは、提供されたプロトコルに従って作成されました。手術した10匹のマウスのうち、術後7日目に死亡したのは1匹だけでした。実験全体の死亡率は約10%でした。
その結果、記載された方法を使用して生成されたONFのサイズに顕著なばらつきがあることが明らかになりました。手術当日、すべてのマウスに長さ2.0mm、幅1.5mmの楕円形の創傷が認められました。術後7日目にONFの形成を評価すると、ONFサイズの有意な変動が観察されました(P = 0.0085)(図5A、B)。
ONFの存在は、食物逆流や摂食困難などの合併症を引き起こし、体重の変化につながる可能性があります。したがって、マウスの体重も考慮に入れた。手術当日(1日目)と7日目(7日目)にONF形成を調べたマウスの体重を測定した。1日目と比較して、7日目には体重の有意な減少が観察されました(P < 0.001)(図6A、B)。体重の減少は25.16%でした。
組織学的分析のために、創傷と正常組織の両方を7日目にマウスから採取した。単離された口蓋を組織学切片化のサンプルとして使用しました。それらを組織包埋ボックスに入れ、4%パラホルムアルデヒドおよび10%ギ酸脱灰試薬を用いて固定した。次に、組織をパラフィンに包埋し、冠状面に沿って7 μmのスライスに切片化し、ヘマトキシリンとエオシン(H&E)で染色しました。ONFの組織学的解析により、硬口蓋粘膜の喪失、骨の剥離、およびONFの形成が明らかになりました(図7)。肺の組織診を行い、正常マウスとONFマウスで異常は認められなかった。
図1:手術器具と消耗品 。 (A)眼科焼灼を加熱するために使用される発芽器。(B)手術器具:眼科用焼灼、顕微手術用ハサミ、顕微手術用ピンセット、注射器、針(26 g x 0.63インチ)。(C)手術用品:外科用ドレープ、滅菌手袋、滅菌綿、滅菌シート、滅菌金属箔、発泡板、輪ゴム、テープ。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:マウスの固定と口腔の開口部 。 (A)マウスの前肢をテープで固定した。(B)発泡スチロールボードにシリンジ針を挿入し、針に輪ゴムを巻いた。マウスの口腔は、輪ゴムとマイクロサージェリーピンセットを使用して開かれました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:口腔鼻腔の形成 。 (A)口腔を露出させる。(B)眼科焼灼の先端を硬口蓋の正中線部分に置く。(C)眼科焼灼を取り外す。(D)マイクロサージェリーハサミを使用して創傷周囲の余分な軟部組織を除去します。(E)滅菌綿を使用して止血する。(F)最終的に形成された口蓋創傷。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:術後7日目の口蓋創傷の検査 。 (A)1日目の口蓋創傷。(B)7日目の口蓋創傷。白い矢印は鼻腔瘻(ONF)を示します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:1日目と7日目の口蓋創傷の大きさ 。 (A)1日目と7日目のマウスの平均値。(B)対応のあるサンプルの t検定を使用して検証された有意差。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図6:1日目と7日目のマウスの体重 。 (A)1日目と7日目のマウスの平均値。(B)対応のあるサンプルの t検定を使用して検証された有意差。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図7:組織学的観察。 ONFの組織学的分析では、硬口蓋粘膜の喪失、剥離した骨、およびONF形成が示されています。(A)7日目の口腔鼻腔瘻、倍率:4倍。 (B)7日目の口腔鼻腔瘻、倍率:10倍。 (C)無傷制御、倍率:4倍。 (D)無傷制御、倍率:10倍。黒い矢印はONFの位置を示します。スケールバー: A、C = 200 μm; B,D = 100 μm. この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
研究者は、ONF 10、11、12、13、14、15、16、17を治療するためのさまざまな材料、薬物、および新しい技術を探求してきました。外科的処置の進歩により、ONFの発生率と再発は減少しています。しかし、この疾患のユニークな特性により、診療所のONF患者の数は限られており、潜在的な治療法を研究するための標準化されたモデルが必要です。ONFモデルを作成するためのいくつかの方法が説明されていますが18、19、20、21、22、23、それらはしばしば簡潔であり、実験方法の詳細な議論を欠いていました。ONFの形成は、組織病理学的特徴を説明する顕微鏡的および組織学的研究によって検証されています12,13,27。このプロトコルは、研究を容易にするために、ONFの再現性のあるマウスモデルを確立することを目的としていました。
統一されたONFの作成を実現することは、課題でした。再現性を確保するためには、マウスの口蓋を均一に損傷させることが重要でした。ONFの直径を制御し、創傷治癒を最小限に抑え、効果的に出血を止めることが、ONFを作成する上で重要なステップでした。眼科焼灼を使用した後、創傷周囲の余分な軟部組織を除去するためにマイクロサージェリーハサミが使用され、治癒段階での創傷径の変化が最小限に抑えられました。しかし、マイクロサージェリーハサミを使用して余分な組織を除去すると、マウスの大量出血や死亡のリスクが伴い、他の実験で観察されたより高い死亡率の一因となりました12,13,27。このプロトコルでは、顕微手術用ハサミと止血眼科焼灼の組み合わせを使用して余分な組織を変性および除去し、滅菌綿を使用して出血を制御しました。この方法は、加熱された眼科焼灼の焼灼効果により、出血を大幅に減少させ、または完全な止血を達成しました。
マウスにおいてONFモデルを作成するための代替方法が報告されており、生検パンチの使用を含む13,27。この方法では、パンチのサイズが一定であるため、創傷径をより適切に制御できますが、故障率が高く、必要な力の管理が困難になり、マウスの死につながる可能性があります。この方法でONFの生成の深さと強さを制御することは困難であり、鼻中隔に到達したかどうかを判断することは困難でした。また、出血のコントロールにも問題があり、マウスは実験中に大量に出血して窒息する危険性がありました。
ただし、この実験方法には限界があります。第一に、創傷の大きさは、直径が固定されたサイズの生検パンチと比較して、各マウスの同じ瘻孔サイズでは制御できません。また、各瘻孔のサイズを最大化するために測定ツールを使用する必要があります。創傷の治癒の遅れがONF形成の中心となるため、口蓋創傷の大きさは実験にとって重要です。したがって、口蓋創傷の適切なサイズを決定することが重要です。傷口が小さすぎると、すぐに治り、その後の実験の時間要件を満たさない可能性があります。逆に大きすぎると、手術中の過度な失血でマウスが死亡したり、術後に食事が困難になったりして飢餓に陥ることがあります。したがって、口蓋創傷の最適なサイズを調査することが正当化されます。それにもかかわらず、今回の実験で使用したサイズ(2.0mm×1.5mm)が適切であると考えられました。このプロトコルでは、雌マウスのみを使用しますが、研究計画に従って雌マウスまたは雄マウスを選択できます。
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Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
本研究は、四川大学華西口腔病院研究開発プログラム(RD-02-202107)、四川省科学技術支援プログラム(2022NSFSC0743)、四川省ポスドク科学基金会(TB2022005)のH. Huangへの助成金の支援を受けて行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Germinator | Electron Microscopy Sciences | 66118-20 | Heating and disinfection equipment |
| Latex gloves | Allmed | or similar | |
| Lights | Olympus | A1813 | |
| Meloxicam | MedChemExpress | HY-B0261 | crushed; 5 mg/kg |
| Microsurgical instruments (scissors and tweezers) | Jiangsu Tonghui Medical Devices Co. | M-Y-0087 | Surgical instrument |
| Ophthalmologic cautery | Suqian Wenchong Medical Equipment Co. | 1.00234E+13 | Surgical instrument |
| Sterile cotton, | Yancheng Begu Technology Co. | or similar | |
| Sterile metal foil | Biosharp | or similar | |
| Sterile sheets | 3M | XH003801129 | or similar |
| Surgical drapes | Yancheng Begu Technology Co. | or similar | |
| Syringes | Yancheng Begu Technology Co. | S-015301 | or similar |
| Tape | Bkmamlab | or similar | |
| Temperature maintenance device | Harvard Apparatus | LE-13-2104 | |
| Zoletil50 | Virbac | 80 mg/kg |
References
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