Summary
Denne protokol skitserer trinene til brug af den automatiserede platform Lustro til at udføre karakterisering af høj gennemstrømning af optogenetiske systemer i gær.
Abstract
Optogenetik giver præcis kontrol over cellulær adfærd ved at udnytte genetisk kodede lysfølsomme proteiner. Optimering af disse systemer for at opnå den ønskede funktionalitet kræver dog ofte flere design-build-testcyklusser, hvilket kan være tidskrævende og arbejdskrævende. For at løse denne udfordring har vi udviklet Lustro, en platform, der kombinerer lysstimulering med laboratorieautomatisering, hvilket muliggør effektiv high-throughput screening og karakterisering af optogenetiske systemer.
Lustro bruger en automatiseringsarbejdsstation udstyret med en belysningsenhed, en rysteenhed og en pladelæser. Ved at anvende en robotarm automatiserer Lustro bevægelsen af en mikrobrøndplade mellem disse enheder, hvilket muliggør stimulering af optogenetiske stammer og måling af deres respons. Denne protokol giver en trin-for-trin guide til brug af Lustro til at karakterisere optogenetiske systemer til genekspressionskontrol i den spirende gær Saccharomyces cerevisiae. Protokollen dækker opsætningen af Lustros komponenter, herunder integrationen af belysningsenheden med automatiseringsarbejdsstationen. Det giver også detaljerede instruktioner til programmering af belysningsenheden, pladelæseren og robotten, hvilket sikrer jævn drift og dataindsamling gennem hele eksperimentprocessen.
Introduction
Optogenetik er en kraftfuld teknik, der bruger lysfølsomme proteiner til at kontrollere cellernes adfærd med høj præcision 1,2,3. Imidlertid kan prototyping af optogenetiske konstruktioner og identifikation af optimale belysningsforhold være tidskrævende, hvilket gør det vanskeligt at optimere optogenetiske systemer 4,5. High-throughput metoder til hurtigt at screene og karakterisere aktiviteten af optogenetiske systemer kan fremskynde design-build-testcyklussen for prototyping konstruktioner og udforske deres funktion.
Lustro-platformen blev udviklet som en laboratorieautomatiseringsteknik designet til screening og karakterisering af optogenetiske systemer med høj kapacitet. Den integrerer en mikropladelæser, belysningsenhed og rysteenhed med en automatiseringsarbejdsstation6. Lustro kombinerer automatiseret dyrkning og lysstimulering af celler i mikrobrøndplader (figur 1 og supplerende figur 1), hvilket muliggør hurtig screening og sammenligning af forskellige optogenetiske systemer. Lustro-platformen er meget tilpasningsdygtig og kan generaliseres til at arbejde med andre laboratorieautomatiseringsrobotter, belysningsenheder, pladelæsere, celletyper og optogenetiske systemer, herunder dem, der reagerer på forskellige bølgelængder af lys.
Denne protokol demonstrerer opsætningen og brugen af Lustro til karakterisering af et optogenetisk system. Optogenetisk kontrol af split transkriptionsfaktorer i gær bruges som et eksempelsystem til at illustrere platformens funktion og anvendelighed ved at undersøge forholdet mellem lysinput og ekspressionen af et fluorescerende reportergen, mScarlet-I7. Ved at følge denne protokol kan forskere strømline optimeringen af optogenetiske systemer og fremskynde opdagelsen af nye strategier for dynamisk kontrol af biologiske systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De gærstammer, der anvendes i denne undersøgelse, er dokumenteret i materialetabellen. Disse stammer udviser robust vækst inden for temperaturområdet fra 22 ° C til 30 ° C og kan dyrkes i forskellige standard gærmedier.
1. Opsætning af automatiseringsarbejdsstationen
- Udstyr den automatiserede arbejdsstation med en robotgribearm (RGA, se materialetabel), der er i stand til at flytte mikrobrøndplader (figur 1).
- Installer en mikropladevarmerryster (se materialetabellen) i den automatiserede arbejdsstation (figur 1(1)) med en automatisk pladelåsemekanisme, der giver RGA-adgang.
- Placer en mikropladelæser ved siden af den automatiserede arbejdsstation (figur 1.2)), og sørg for Enhedslistens tilgængelighed.
- Inkorporer en mikropladebelysningsenhed (figur 1 (3)), der giver nem adgang til Enhedslisten. Som eksempler kan nævnes optoPlate8 (som anvendt i denne undersøgelse) eller LITOS9 (se materialetabel).
2. Klargøring af belysningsanordningen
- OptoPladen (eller den alternative belysningsanordning) konstrueres og kalibreres efter etablerede metoder 8,10,11.
- Brug en adapter på belysningsenheden for at aktivere RGA-adgang.
- Programmér optoPlate ved hjælp af et regneark input10 eller en grafisk grænseflade12. Følg trin 3 for at udføre lysstimuleringsprogrammerne.
3. Design af et lysstimuleringsprogram
- Bestem de ønskede lysforhold for eksperimentet.
- Indtast de ønskede lysforhold, herunder lysintensitet, lysstarttid, pulslængde, pulstal og interpulsvarighed, i et regneark.
BEMÆRK: Flash disse oplysninger på optoPlate ved hjælp af instruktionerne i GitHub-lageret: github.com/mccleanlab/Optoplate-96. Husk, at prøvepladen ikke lyser, mens den er i mikropladelæseren eller på varmelegemets ryster. Varigheden og hyppigheden af disse hændelser kan kræve optimering baseret på specifikke eksperimentelle krav. - Inkluder mørke forhold for hver stamme for at muliggøre korrekte baggrundsmålinger.
- Til indledende karakteriseringseksperimenter til vurdering af transformativ funktionalitet skal du bruge en høj lysintensitet.
BEMÆRK: Lysintensiteten bør optimeres til mere følsomme eksperimenter, da overdreven lys kan være fototoksisk for gær13.
4. Klargøring af mikropladelæseren
- Konfigurer mikropladelæseren til at måle den ønskede mængde interesse, før du udfører eksperimenter.
BEMÆRK: I dette eksempel blev mikropladelæseren konfigureret til at måle fluorescens fra en reporter udtrykt ved belastningen af interesse. Andre output, såsom luminescens eller optisk tæthed, kan bruges afhængigt af de eksperimentelle krav. - Dyrk den pågældende stamme (sammen med en ikke-fluorescerende kontrol) i syntetiske komplette (SC) medier14 (eller et andet lavt fluorescensmedie) (se materialetabel) til den højeste celletæthed, der skal måles. Overfør kulturerne til en sortvægget mikrobrøndplade med glasbund (se materialetabel), og mål dem for at bestemme de optimale mikropladelæserindstillinger.
BEMÆRK: Sørg for nøjagtige aflæsninger ved korrekt indtastning af plademålene og måling af pladen nedefra. - Der henvises til en database over fluorescerende proteiner (f.eks. fpbase.org) for at opnå omtrentlige absorptions- og emissionsspektre for målfluorescerende protein15.
- Z-værdien (afstanden mellem pladen og læseren) bestemmes ved at udføre en z-scanning på huller, der indeholder fluorescerende og ikke-fluorescerende stammer. Vælg den z-værdi, der giver det højeste signal-støj-forhold.
- Optimer absorptions- og emissionsspektrene ved at udføre absorptions- og emissionsscanninger på de fluorescerende og ikke-fluorescerende stammer for at bestemme det optimale signal-støj-forhold.
- Mål den fluorescerende stamme med forstærkningen indstillet til det optimale niveau, og bestem den højeste optiske forstærkning, der kan bruges uden at resultere i en overløbsmålefejl.
BEMÆRK: Denne optiske forstærkning skal indstilles manuelt konsekvent på tværs af eksperimenter, der involverer den samme stamme for at sikre konsistens i resultaterne. - Forbered et målescript (se figur 2) i mikropladelæsersoftwaren. Dette script konfigurerer instrumentet til at måle den optiske tæthed af kulturerne og fluorescensspektrene for eventuelle fluorescerende proteiner, der skal måles.
BEMÆRK: Mål den optiske tæthed af stammer ved 600 nm, medmindre de udtrykker røde fluorescerende proteiner. For stammer, der udtrykker røde fluorescerende proteiner, måles den optiske densitet ved 700 nm for at undgå bias16. - Indstil målescriptet til at opretholde en intern inkubationstemperatur på 30 °C under målingerne.
- Konfigurer målescriptet til at eksportere dataene til et regneark eller ASCII-filer efter præference.
5. Programmering af robotten
- Konfigurer arbejdsbordsdefinitionen i softwaren til den automatiserede arbejdsstation baseret på bærernes fysiske layout (f.eks. varmelegemer, redeplatforme, belysningsanordninger) og labware (dvs. 96-brøndspladen) (se materialetabel). Opret et script i automatiseringsarbejdsstationssoftwaren til at udføre lysinduktion og målinger (figur 3) ved at følge nedenstående trin.
- Deaktiver eventuelle interne belysningskilder for at forhindre baggrundsaktivering af optogenetiske systemer.
- Indstil varmeapparatet til at opretholde en temperatur på 30 °C. Når pladen ikke sidder på varmeapparatets rysteapparat, vil den være ved omgivelsestemperatur (22 °C).
- Brug sløjfer, en timer og en looptællingsvariabel til at gentage trinene til at inducere og måle cellerne med jævne mellemrum.
- Før målingerne registreres, rystes prøvepladen for at sikre, at alle celler er korrekt suspenderet. En 60 s rystelse ved 1.000 o / min med en 2 mm orbital er generelt tilstrækkelig til at resuspendere S288C S. cerevisiae celler og undgå målebias.
- Flyt prøvepladen til mikropladelæseren ved hjælp af robotarmen, og fjern låget (hvis relevant) for at forhindre bias i optisk densitetsmåling. Kontrolsoftwaren fjerner og sætter automatisk låget tilbage til den angivne position, hvis mikropladelæserens bærerdefinition er indstillet til ikke at tillade låg.
- Udfør mikropladelæserens målescript som beskrevet i trin 4.
- Sæt låget på prøvepladen på igen, og flyt pladen til belysningsenheden ved hjælp af robotarmen.
- Indstil scriptet til at vente, indtil timeren når det angivne tidsinterval (f.eks. 30 minutter ganget med looptællingsvariablen), og gentag derefter hele sløjfen for det ønskede antal gentagelser (f.eks. 48 gange for et eksperiment på 24 timer).
- Fejlfinding af potentielle fejl og sikring af, at transportør- og labwaredefinitionerne fungerer korrekt, samt enhedslistens evne til nøjagtigt at hente og placere pladen ved at køre en tom plade gennem scriptsløjfen flere gange.
- Konfigurer brugeradvarsler for at underrette brugeren om eventuelle ændringer i instrumenttilstanden eller fejl, der kan opstå under udførelsen af protokollen.
6. Opsætning af prøvepladen
- Dyrk gærstammer på rige medieplader, såsom YPD-agar17 (se materialetabel). Inkluder en ikke-fluorescerende (negativ) kontrol.
- Vælg kolonier fra pladerne og pod dem i 3 ml SC-medier14 (eller et andet lavt fluorescensmedie, såsom LFM18) i glaskulturrør. Kulturerne inkuberes natten over ved 30 °C på en tromle, mens de opbevares i mørke eller under ikke-responsive lysforhold (f.eks. rødt lys til systemer med blåt lys).
- Den optiske tæthed af natkulturerne måles ved at fortynde 200 μL af hver kultur til 1 ml SC-medier og registrere den optiske densitet ved 600 nm (OD600) ved hjælp af et spektrofotometer eller en mikropladelæser.
- Hver natkultur fortyndes til OD600 på 0,1 i glaskulturrør. For test af højere gennemstrømningsbelastning skal du udføre automatiserede fortyndinger i mikrobrøndplader.
- De fortyndede kulturer pipetteres ind i 96-brøndpladen. Medtag tredobbelte brønde for hver tilstand (dvs. tre identiske brønde med samme belastning og lystilstand) for at tage højde for teknisk variation. Medtag brønde med tomme medier og ikke-fluorescerende celler som negative kontroller til måling af baggrundsfluorescens og optisk densitet.
- Pladen rystes ved 30 °C i 5 timer, inden lysinduktionsforsøget påbegyndes. Juster fortyndingsmængderne og inkubationstiderne efter behov for at optimere til specifikke stammer og eksperimentelle forhold.
7. Udførelse af eksperimentet
- Placer prøvepladen på varmeapparatets ryster, og start automatiseringsscriptet som beskrevet i trin 5.
- Start lysstimuleringsprogrammet som beskrevet i trin 3, når den indledende måling på pladelæseren er blevet registreret.
- Hvis automatiseringsarbejdsstationen ikke er i et mørkt rum, skal du dække den med et mørklægningsgardin for at undgå baggrundsbelysning.
8. Analyse af data
- Opret et regnearkskort til eksperimentet, der afspejler 8 x 12-layoutet på 96-brøndspladen. Sørg for, at kortet indeholder navnene på de stammer, der måles i ét gitter, og beskrivelser af de lysforhold, der anvendes i et andet gitter.
- Brug et Python-script eller et andet foretrukket programmeringssprog til at analysere de eksporterede data. Importer kortregnearket til et array, der knytter stammenavnene og tilstandsnavnene til hvert hul på pladen.
BEMÆRK: Eksempelkode til analyse kan findes på: https://github.com/mccleanlab/Lustro. Alternativt kan man anvende et program til at analysere data fra forskellige pladelæsere19. - Læs dataene fra det eksporterede eksperimentregneark i et andet system.
- Der afbildes optiske densitetsværdier og fluorescensværdier for hver stamme og tilstand over tid, som illustreret i figur 4.
- Undersøg de optiske tæthedsplots for at bestemme stadierne af eksponentiel vækst eller mætning i kulturerne. Disse oplysninger vil hjælpe med at vælge passende tidspunkter til sammenligning af fluorescensmålinger mellem stammer eller betingelser, som vist i figur 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 4A viser fluorescensværdierne over tid for en optogenetisk stamme, der udtrykker en fluorescerende reporter kontrolleret af en lysinducerbar splittranskriptionsfaktor. De forskellige lysforhold, der anvendes i eksperimentet, afspejles af variationer i driftscyklussen, som repræsenterer den procentdel af tiden, lyset er tændt. Det samlede fluorescensniveau observeres at være proportionalt med lysstimuleringens driftscyklus. Figur 4B viser de tilsvarende OD700-værdier for det samme eksperiment. Konsistensen af de optiske densitetsaflæsninger på tværs af forskellige lysforhold tyder på, at den eksperimentelle teknik ikke signifikant påvirker stammernes væksthastighed under varierende lysforhold.
Ved at måle fluorescens og optisk tæthed over tid kan der opnås en dybere forståelse af, hvordan optogenetiske systemer reagerer på forskellige lysstimuleringsprogrammer sammenlignet med teknikker, der kun fanger output på et enkelt tidspunkt. Disse tidsforløbsdata er værdifulde til valg af specifikke tidspunkter for at sammenligne forskellige stammer og forhold. Figur 5 illustrerer et enkelt tidspunkt (målt ved 10 timer i lysinduktion) for to forskellige optogenetiske stammer induceret af forskellige lysstimuleringsprogrammer. Begge stammer anvender en lysinducerbar splittranskriptionsfaktor til at drive ekspressionen af en fluorescerende reporter. Variationer i lyspulsintensitet, periode og arbejdscyklus fremkalder forskellige reaktioner i disse stammer.
Figur 1: Arbejdstabellayout og eksperimentel arbejdsgang. Skærmbillede af et eksempel på et arbejdsbordlayout, der angiver prøvepladens bevægelse i Lustro. Pladen flyttes af robotarmen fra en varmelegemeryster (1) til mikropladelæseren (2) og derefter til belysningsanordningen (3). Fotografier findes i supplerende figur 1. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Manuskript til måling af pladelæser. Eksempel på skærmbillede af et pladelæserscript, der indstiller mikropladelæseren til at inkubere ved 30 °C og registrere målinger af fluorescens og optisk densitet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Automatiseret arbejdsstationsscript. Eksempel på skærmbillede af et automatiseret arbejdsstationsscript til Lustro. Scriptet starter en timer, sikrer, at det indvendige lys er slukket, indstiller en looptællingsvariabel til en startværdi på 0 og indstiller varmelegemets ryster til at inkubere ved 30 ° C. Inden for hver løkke låses pladen, rystes i 1 min, flyttes til pladelæseren, måles og flyttes derefter til belysningsenheden, og robotten indstilles til at vente på resten af 30 minutters loop-intervallet. I slutningen af denne tid øges looptællervariablen med en, og sløjfen gentages. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Induktionstidsforløb. Prøve lysinduktionstidskursusdata fra en Gal4BD-eMagA/eMagB-Gal4AD delt transkriptionsfaktorstamme med en pGAL1-mScarlet-I-reporter (yMM17346). Fluorescens af mScarlet-I7 måles ved 563 nm excitation og 606 nm emission med en optisk forstærkning på 130. Lysintensiteten er 125 μW/cm2 , og fejlbjælker repræsenterer standardfejlen i tredobbelte prøver. Den lodrette røde stiplede linje viser, hvornår kulturer når mætning. (A) Fluorescensværdier fra stammen over tid. Lysmønstre (som angivet) blev gentaget i hele det viste eksperiments varighed. Indsat viser, at lyspulstider er afbrudt af mørke interpulstider, gentaget gennem hele undersøgelsen. B) Værdier for optisk densitet (målt ved 700 nm) for det i punkt A viste forsøg. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Sammenligning af forskellige optogenetiske systemer. Sammenligning af forskellige lysinduktionsprogrammer mellem CRY2(535)/CIB1 og eMagA/eMagBM split transkriptionsfaktorstammer med pGAL1-mScarlet-I reportere (henholdsvis yMM1763 og yMM17656). Fluorescens af mScarlet-I7 måles ved 563 nm excitation og 606 nm emission med en optisk forstærkning på 130. Den anvendte lysintensitet er 125 μW/cm2, medmindre andet er angivet. Fejlbjælker repræsenterer standardfejlen i tredobbelte prøver (angivet som prikker). De viste fluorescensværdier blev registreret 10 timer i induktion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Repræsentative billeder af de enheder, der anvendes i Lustro. Billede af Lustro-opsætningen og zoomede billeder af de anvendte enheder. Robotarmen flytter prøvepladen fra varmelegemets ryster til pladelæseren og derefter til belysningsanordningen i en cyklus under hele eksperimentet. Komponenter er nummereret med en legende på siden. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lustro-protokollen, der præsenteres her, automatiserer dyrknings-, belysnings- og måleprocesserne, hvilket muliggør screening og karakterisering af optogenetiske systemer med høj kapacitet6. Dette opnås ved at integrere en belysningsenhed, mikropladelæser og rysteenhed i en automatiseringsarbejdsstation. Denne protokol demonstrerer specifikt Lustros anvendelighed til screening af forskellige optogenetiske konstruktioner integreret i gæren S. cerevisiae og sammenligning af lysinduktionsprogrammer.
Flere afgørende trin, der understreges i denne protokol, er afgørende for en effektiv udnyttelse af Lustro. Omhyggeligt design af tilpassede lysprogrammer, der stemmer overens med kinetikken i den optogenetiske konstruktion, der undersøges, er nødvendig. Derudover er præcis kalibrering af pladelæseren afgørende for at opnå pålidelige målinger. Grundige tørkørsler af eksperimenterne på robotten, herunder nødvendige justeringer for at sikre korrekt synkronisering med lysprogrammerne, er afgørende for at sikre, at scriptet kører problemfrit.
Prøveprotokollen, der er angivet her, beskriver sammenligningen af en lysinducerbar splittranskriptionsfaktor, der driver ekspressionen af en fluorescerende reporter til en ikke-fluorescerende kontrol under forskellige lysstimuleringsbetingelser. Fluorescensmålinger foretages fra hvert hul i pladen med 30 minutters mellemrum, efterfulgt af 1 minuts omrystning på varmelegemets ryster inden måling. Som demonstreret i denne protokol, Lustro er egnet til brug med blåt lys-responsive optogenetiske systemer integreret i ikke-klæbende celletyper, herunder bakterier og andre gær. Men med mindre ændringer kan protokollen let udvides til forskellige celletyper, optogenetiske systemer og eksperimentelle designs. Justeringer af pladelæserindstillingerne vil gøre det muligt at måle andre output end fluorescens, såsom bioluminescens. For applikationer, der kræver finere tidsmæssig opløsning, kan målinger foretages hyppigere. Inkubation på varmelegemet kan gentages oftere, når det er kritisk for specifikke celletyper, der kræver omrystning og temperaturregulering. Inkorporering af gas- og miljøkontrol, f.eks. gennem et inkuberet hotel, ville gøre det muligt at inddrage pattedyrs cellelinjer. Mens iterationen af Lustro, der er beskrevet her, bruger specifik instrumentering, kan Lustro-platformen let tilpasses til at arbejde med andre laboratorieautomatiseringsrobotter eller mikropladelæsere. LPA20 eller LITOS9, kan erstatte optopladen for at stimulere forskellige optogenetiske systemer. En fremtidig ændring af Lustro-platformen kunne indebære inkorporering af væskehåndtering for at lette automatiserede fortyndinger til kontinuerlige kulturapplikationer. Dette ville også gøre det muligt at tilpasse Lustro til cybergenetisk feedbackkontrol, hvor realtidsmålinger informerer ændringer i lys- eller kulturforhold for at opnå eller opretholde et ønsket respons 5,21,22.
High-throughput teknikker er afgørende for at optimere og udnytte den dynamiske karakter af optogenetiske systemer. Lustro overvinder mange begrænsninger i eksisterende protokoller. For eksempel, mens bioreaktorbaserede optogenetiske teknikker muliggør konstant aflæsning og dyrkningsbetingelser, lider de af lav gennemstrømning23,24,25,26. OptoPlateReader27-enheden lover godt for optogenetiske eksperimenter i realtid i mikrobrøndplader, men har i øjeblikket lav gennemstrømning på grund af behovet for et stort antal replikater for at opnå pålidelige resultater og giver ikke adgang til kontinuerlig dyrkning. Lustro muliggør på den anden side screening med høj kapacitet af optogenetiske systemer for at karakterisere deres dynamiske aktivitet. Ikke desto mindre er der nogle begrænsninger for Lustro-protokollen. Intermitterende rystelser i Lustro forårsager en lille vækstforsinkelse for gærceller6, men dette kan løses ved at tilpasse en belysningsenhed til at inkorporere rystelser. En anden begrænsning ved Lustro-systemet er, at prøvepladen ikke inkuberes, mens den er på belysningsanordningen, og holdes ved omgivelsestemperatur (22 °C). Selvom det lille volumen af hver prøve giver mulighed for skærme med høj kapacitet, kan yderligere optimering af belysningstrinnene være nødvendig ved skalering til større reaktionsvolumener til bioproduktion eller andre applikationer28,29.
Samlet set letter Lustro den hurtige udvikling og test af optogenetiske systemer gennem screening med høj kapacitet og præcis lyskontrol. Denne automatiserede tilgang muliggør effektiv karakterisering og sammenligning af forskellige optogenetiske konstruktioner under forskellige induktionsbetingelser, hvilket fører til hurtigere iteration og forfining af disse systemer. Med sin tilpasningsevne til forskellige celletyper, optogenetiske værktøjer og automatiseringsopsætninger baner Lustro vejen for fremskridt inden for optogenetik, hvilket letter udforskningen af dynamisk genekspressionskontrol og udvider mulighederne for at studere biologiske netværk og konstruere cellulær adfærd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health grant R35GM128873 og National Science Foundation grant 2045493 (tildelt M.N.M.). Megan Nicole McClean, Ph.D. har en karrierepris ved Scientific Interface fra Burroughs Wellcome Fund. Z.P.H. blev støttet af et NHGRI træningsstipendium til Genomic Sciences Training Program 5T32HG002760. Vi anerkender frugtbare diskussioner med McClean-laboratoriemedlemmer, og især er vi taknemmelige for Kieran Sweeney for at give kommentarer til manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well glass bottom plate with #1.5 cover glass | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| BioShake 3000-T elm (heater shaker) | QINSTRUMENTS | ||
| Fluent Automation Workstation | Tecan | ||
| LITOS (alternative illumination device) | Hohener, et al. Scientific Reports. 2022 | ||
| optoPlate-96 (illumination device) | Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019 | ||
| Robotic Gripper Arm | Tecan | ||
| Spark (plate reader) | Tecan | ||
| Synthetic Complete media | SigmaAldrich | Y1250 | |
| Tecan Connect (user alert app) | Tecan | ||
| yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| YPD Agar | SigmaAldrich | Y1500 |
References
- Pérez, A. L. A., et al. Optogenetic strategies for the control of gene expression in yeasts. Biotechnology Advances. 54, 107839 (2022).
- Lan, T. -H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering. Trends in Genetics. 38 (12), 1253-1270 (2022).
- Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature Chemical Biology. 10, 502-511 (2014).
- Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo Activities of Light Inducible Dimers: a Cellular Optogenetics Guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
- Scott, T. D., Sweeney, K., McClean, M. N. Biological signal generators: integrating synthetic biology tools and in silico control. Current Opinion in Systems Biology. 14, 58-65 (2019).
- Harmer, Z. P., McClean, M. N. Lustro: High-throughput optogenetic experiments enabled by automation and a yeast optogenetic toolkit. ACS Synthetic Biology. 12 (7), 1943-1951 (2023).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
- Höhener, T. C., Landolt, A. E., Dessauges, C., Hinderling, L., Gagliardi, P. A., Pertz, O. LITOS: a versatile LED illumination tool for optogenetic stimulation. Scientific Reports. 12 (1), 13139 (2022).
- Grødem, E. O., Sweeney, K., McClean, M. N. Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments. BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).
- Dunlop, M. J. A supplemental guide to building the optoPlate-96. , https://www.protocols.io/view/a-supplemental-guide-to-building-the-optoplate-96-b2vwqe7e (2021).
- Thomas, O. S., Hörner, M., Weber, W. A graphical user interface to design high-throughput optogenetic experiments with the optoPlate-96. Nature Protocols. 15 (9), 2785-2787 (2020).
- Robertson, J. B., Davis, C. R., Johnson, C. H. Visible light alters yeast metabolic rhythms by inhibiting respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21130-21135 (2013).
- Synthetic Complete (SC) Medium. 2016 (11), Cold Spring Harbor Protocols. (2016).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
- Hecht, A., Endy, D., Salit, M., Munson, M. S. When wavelengths collide: bias in cell abundance measurements due to expressed fluorescent proteins. ACS Synthetic Biology. 5 (9), 1024-1027 (2016).
- YPD media. 2010 (9), Cold Spring Harbor Protocols. (2010).
- Low-Fluorescence Yeast Nitrogen Base without Riboflavin and Folic Acid Medium (LFM). 2016 (11), Cold Spring Harbor. (2016).
- Csibra, E., Stan, G. -B. Parsley: a web app for parsing data from plate readers. Zenodo. , (2023).
- Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6 (1), 35363 (2016).
- Gutiérrez Mena, J., Kumar, S., Khammash, M. Dynamic cybergenetic control of bacterial co-culture composition via optogenetic feedback. Nature Communications. 13, 4808 (2022).
- Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
- Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546 (2016).
- Bertaux, F., et al. Enhancing bioreactor arrays for automated measurements and reactive control with ReacSight. Nature Communications. 13 (1), 3363 (2022).
- Benisch, M., Benzinger, D., Kumar, S., Hu, H., Khammash, M. Optogenetic closed-loop feedback control of the unfolded protein response optimizes protein production. Metabolic Engineering. 77, 32-40 (2023).
- Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative Biology. 6 (3), 366-372 (2014).
- Datta, S., et al. High-throughput feedback-enabled optogenetic stimulation and spectroscopy in microwell plates. bioRxiv. , (2022).
- Pouzet, S., et al. Optogenetic control of beta-carotene bioproduction in yeast across multiple lab-scales. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 11, 1085268 (2023).
- Pouzet, S., Banderas, A., Le Bec, M., Lautier, T., Truan, G., Hersen, P. The promise of optogenetics for bioproduction: dynamic control strategies and scale-up instruments. Bioengineering. 7 (4), 151 (2020).
