Summary
Dit protocol schetst de stappen voor het gebruik van het geautomatiseerde platform Lustro om high-throughput karakterisering van optogenetische systemen in gist uit te voeren.
Abstract
Optogenetica biedt nauwkeurige controle over cellulair gedrag door gebruik te maken van genetisch gecodeerde lichtgevoelige eiwitten. Het optimaliseren van deze systemen om de gewenste functionaliteit te bereiken, vereist echter vaak meerdere ontwerp-bouw-testcycli, die tijdrovend en arbeidsintensief kunnen zijn. Om deze uitdaging aan te gaan, hebben we Lustro ontwikkeld, een platform dat lichtstimulatie combineert met laboratoriumautomatisering, waardoor efficiënte high-throughput screening en karakterisering van optogenetische systemen mogelijk wordt.
Lustro maakt gebruik van een automatiseringswerkplek die is uitgerust met een verlichtingsapparaat, een schudapparaat en een plaatlezer. Door gebruik te maken van een robotarm automatiseert Lustro de beweging van een microtiterplaat tussen deze apparaten, waardoor optogenetische stammen kunnen worden gestimuleerd en hun respons kan worden gemeten. Dit protocol biedt een stap-voor-stap handleiding voor het gebruik van Lustro om optogenetische systemen te karakteriseren voor de controle van genexpressie in de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae. Het protocol omvat de installatie van de componenten van Lustro, inclusief de integratie van het verlichtingsapparaat met het automatiseringswerkstation. Het biedt ook gedetailleerde instructies voor het programmeren van het verlichtingsapparaat, de plaatlezer en de robot, waardoor een soepele werking en gegevensverzameling tijdens het experimentele proces wordt gegarandeerd.
Introduction
Optogenetica is een krachtige techniek die gebruik maakt van lichtgevoelige eiwitten om het gedrag van cellen met hoge precisie te controleren 1,2,3. Het maken van prototypes van optogenetische constructies en het identificeren van optimale verlichtingsomstandigheden kan echter tijdrovend zijn, waardoor het moeilijk is om optogenetische systemen te optimaliseren 4,5. High-throughput-methoden om de activiteit van optogenetische systemen snel te screenen en te karakteriseren, kunnen de ontwerp-bouw-testcyclus versnellen voor het maken van prototypes van constructen en het onderzoeken van hun functie.
Het Lustrom-platform is ontwikkeld als een laboratoriumautomatiseringstechniek die is ontworpen voor high-throughput screening en karakterisering van optogenetische systemen. Het integreert een microplaatlezer, verlichtingsapparaat en schudapparaat met een automatiseringswerkstation6. Lustro combineert geautomatiseerde kweek en lichtstimulatie van cellen in microtiterplaten (Figuur 1 en aanvullende Figuur 1), waardoor een snelle screening en vergelijking van verschillende optogenetische systemen mogelijk is. Het Lustro-platform is zeer aanpasbaar en kan worden gegeneraliseerd om te werken met andere laboratoriumautomatiseringsrobots, verlichtingsapparaten, plaatlezers, celtypen en optogenetische systemen, inclusief systemen die reageren op verschillende golflengten van licht.
Dit protocol demonstreert de opzet en het gebruik van Lustro voor het karakteriseren van een optogenetisch systeem. Optogenetische controle van gesplitste transcriptiefactoren in gist wordt gebruikt als een voorbeeldsysteem om de functie en het nut van het platform te illustreren door de relatie tussen lichtinput en de expressie van een fluorescerend reportergen, mScarlet-I7, te onderzoeken. Door dit protocol te volgen, kunnen onderzoekers de optimalisatie van optogenetische systemen stroomlijnen en de ontdekking van nieuwe strategieën voor de dynamische controle van biologische systemen versnellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De giststammen die in dit onderzoek zijn gebruikt, zijn gedocumenteerd in de materiaaltabel. Deze stammen vertonen een robuuste groei binnen het temperatuurbereik van 22 °C tot 30 °C en kunnen worden gekweekt in verschillende standaard gistmedia.
1. Inrichting van de automatiseringswerkplek
- Rust het geautomatiseerde werkstation uit met een robotgrijperarm (RGA, zie Materiaaltabel) die in staat is om microtiterplaten te verplaatsen (Afbeelding 1).
- Installeer een microplaatverwarmerschudder (zie Materiaaltabel) in het geautomatiseerde werkstation (Figuur 1(1)) met een automatisch plaatvergrendelingsmechanisme dat RGA-toegang biedt.
- Plaats een microplaatlezer naast het geautomatiseerde werkstation (Figuur 1(2)), zodat de RGA-toegankelijkheid gewaarborgd is.
- Integreer een microplaatverlichtingsapparaat (Figuur 1(3)) dat gemakkelijke RGA-toegang mogelijk maakt. Voorbeelden hiervan zijn de optoPlate8 (zoals gebruikt in dit onderzoek) of LITOS9 (zie Tabel met materialen).
2. Voorbereiding van de verlichtingsinrichting
- Construeer en kalibreer de optoPlate (of een ander verlichtingsapparaat) volgens de vastgestelde methoden 8,10,11.
- Gebruik een adapter op het verlichtingsapparaat om RGA-toegang mogelijk te maken.
- Programmeer de optoPlate met behulp van een spreadsheetingang10 of een grafische interface12. Volg stap 3 om de lichtstimulatieprogramma's uit te voeren.
3. Ontwerpen van een lichtstimulatieprogramma
- Bepaal de gewenste lichtomstandigheden voor het experiment.
- Voer de gewenste lichtomstandigheden, waaronder lichtintensiteit, starttijd van het licht, pulslengte, pulsnummer en interpulsduur, in een spreadsheet in.
OPMERKING: Flash deze informatie op de optoPlate met behulp van de instructies in de GitHub-opslagplaats: github.com/mccleanlab/Optoplate-96. Houd er rekening mee dat het monsterplaatje niet verlicht zal zijn in de microplaatlezer of op de verwarmingsschudder. De duur en frequentie van deze gebeurtenissen kunnen optimalisatie vereisen op basis van specifieke experimentele vereisten. - Zorg voor donkere omstandigheden voor elke soort om de juiste achtergrondmetingen mogelijk te maken.
- Gebruik een hoge lichtintensiteit voor de eerste karakteriseringsexperimenten om de functionaliteit van de transformator te beoordelen.
OPMERKING: De lichtintensiteit moet worden geoptimaliseerd voor gevoeligere experimenten, omdat overmatig licht fototoxisch kan zijn voor gist13.
4. Voorbereiding van de microplaatlezer
- Configureer de microplaatlezer om de gewenste hoeveelheid interesse te meten voordat u experimenten uitvoert.
OPMERKING: In dit voorbeeld is de microplaatlezer geconfigureerd om de fluorescentie van een reporter te meten, uitgedrukt door de betreffende stam. Andere outputs, zoals luminescentie of optische dichtheid, kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de experimentele vereisten. - Cultiveer de betreffende stam (samen met een niet-fluorescerende controle) in synthetische complete (SC) media14 (of een ander laag fluorescentiemedium) (zie Tabel met materialen) tot de hoogste celdichtheid die moet worden gemeten. Breng de culturen over in een microtiterplaat met zwarte wanden met glazen bodem (zie Materiaaltabel) en meet ze om de optimale instellingen van de microplaatlezer te bepalen.
NOTITIE: Zorg voor nauwkeurige metingen door de afmetingen van de plaat correct in te voeren en de plaat van onderaf te meten. - Raadpleeg een database met fluorescerende eiwitten (bijvoorbeeld fpbase.org) om bij benadering absorptie- en emissiespectra voor het beoogde fluorescerende eiwit15 te verkrijgen.
- Bepaal de z-waarde (afstand tussen de plaat en de lezer) door een z-scan uit te voeren op putjes met de fluorescerende en niet-fluorescerende stammen. Selecteer de z-waarde die de hoogste signaal-ruisverhouding oplevert.
- Optimaliseer de absorptie- en emissiespectra door absorptie- en emissiescans uit te voeren op de fluorescerende en niet-fluorescerende stammen om de optimale signaal-ruisverhouding te bepalen.
- Meet de fluorescerende sterkte met de versterking ingesteld op het optimale niveau, waarbij de hoogste optische versterking wordt bepaald die kan worden gebruikt zonder te resulteren in een overloopmeetfout.
OPMERKING: Deze optische versterking moet handmatig consistent worden ingesteld bij experimenten met dezelfde stam om consistentie van de resultaten te garanderen. - Bereid een meetscript voor (zie afbeelding 2) in de software van de microplaatlezer. Dit script configureert het instrument om de optische dichtheid van de culturen en de fluorescentiespectra van eventueel te meten fluorescerende eiwitten te meten.
OPMERKING: Meet de optische dichtheid van stammen bij 600 nm, tenzij ze rode fluorescerende eiwitten tot expressie brengen. Voor stammen die rode fluorescerende eiwitten tot expressie brengen, meet de optische dichtheid bij 700 nm om bias16 te voorkomen. - Stel het meetscript in om tijdens de metingen een interne incubatietemperatuur van 30 °C aan te houden.
- Configureer het meetscript om de gegevens naar wens te exporteren naar een spreadsheet of ASCII-bestanden.
5. Programmeren van de robot
- Configureer de definitie van de werktafel in de geautomatiseerde werkstationsoftware op basis van de fysieke lay-out van dragers (bijv. verwarmingsschudders, nestplatforms, verlichtingsapparatuur) en het laboratoriumgerei (d.w.z. de plaat met 96 putjes) (zie Materiaaltabel). Maak een script in de automatiseringswerkstationsoftware om lichtinductie en metingen uit te voeren (Afbeelding 3), door de onderstaande stappen te volgen.
- Schakel alle interne verlichtingsbronnen uit om achtergrondactivering van optogenetische systemen te voorkomen.
- Stel de verwarmingsschudder in op een temperatuur van 30 °C. Als de plaat niet op de verwarmingsschudder staat, is deze op kamertemperatuur (22 °C).
- Gebruik lussen, een timer en een lustelvariabele om de stappen van het induceren en meten van de cellen met regelmatige tussenpozen te herhalen.
- Voordat u metingen registreert, schudt u de monsterplaat om ervoor te zorgen dat alle cellen goed worden opgehangen. Een schok van 60 s bij 1.000 tpm met een orbitaal van 2 mm is over het algemeen voldoende om S288C S. cerevisiae-cellen te resuspenderen en meetbias te voorkomen.
- Verplaats de monsterplaat met behulp van de robotarm naar de microplaatlezer en verwijder het deksel (indien van toepassing) om vertekening bij de optische dichtheidsmeting te voorkomen. De besturingssoftware verwijdert en plaatst het deksel automatisch terug in de aangewezen positie als de definitie van de microplaatlezer is ingesteld om geen deksels toe te staan.
- Voer het meetscript van de microplaatlezer uit zoals beschreven in stap 4.
- Plaats het deksel terug op de monsterplaat en verplaats de plaat met behulp van de robotarm naar het verlichtingsapparaat.
- Stel het script zo in dat het wacht tot de timer het opgegeven tijdsinterval bereikt (bijv. 30 minuten vermenigvuldigd met de lustelvariabele) en herhaal vervolgens de hele lus voor het gewenste aantal iteraties (bijv. 48 keer voor een experiment van 24 uur).
- Los mogelijke fouten op en zorg voor de goede werking van de definities van dragers en laboratoriumartikelen, evenals het vermogen van de RGA om de plaat nauwkeurig op te pakken en te plaatsen door een lege plaat meerdere keren door de scriptlus te halen.
- Configureer gebruikerswaarschuwingen om de gebruiker op de hoogte te stellen van wijzigingen in de status van het instrument of fouten die kunnen optreden tijdens de uitvoering van het protocol.
6. Opzetten van de monsterplaat
- Kweek giststammen op platen met rijke media, zoals YPD-agar17 (zie Materiaaltabel). Voeg een niet-fluorescerende (negatieve) controle toe.
- Selecteer kolonies van de platen en inoculeer ze in 3 ml SC-media14 (of een ander medium met lage fluorescentie, zoals LFM18) in glazen kweekbuizen. Incubeer de culturen een nacht bij 30 °C op een roltrommel en bewaar ze in het donker of onder niet-responsieve lichtomstandigheden (bijv. rood licht voor systemen die reageren op blauw licht).
- Meet de optische dichtheid van de nachtculturen door 200 μl van elke cultuur te verdunnen tot 1 ml SC-media en de optische dichtheid bij 600 nm (OD600) te registreren met behulp van een spectrofotometer of microplaatlezer.
- Verdun elke nachtkweek tot een OD600 van 0,1 in glazen kweekbuisjes. Voor het testen van een hogere doorvoer voert u geautomatiseerde verdunningen uit in microtiterplaten.
- Pipetteer de verdunde culturen in de plaat met 96 putjes. Neem drievoudige putten op voor elke aandoening (d.w.z. drie identieke putten met dezelfde stam en lichte toestand) om rekening te houden met technische variatie. Voeg putjes met blanco media en niet-fluorescerende cellen toe als negatieve controles om achtergrondfluorescentie en optische dichtheid te meten.
- Incubeer de plaat bij 30 °C met schudden gedurende 5 uur voordat u met het lichte inductie-experiment begint. Pas de verdunningshoeveelheden en incubatietijden zo nodig aan om te optimaliseren voor specifieke stammen en experimentele omstandigheden.
7. Uitvoeren van het experiment
- Plaats de monsterplaat op de verwarmingsschudder en start het automatiseringsscript zoals beschreven in stap 5.
- Start het lichtstimulatieprogramma zoals beschreven in stap 3 zodra de eerste meting op de plaatlezer is geregistreerd.
- Als het automatiseringswerkstation zich niet in een donkere kamer bevindt, bedek het dan met een verduisteringsgordijn om achtergrondverlichting te voorkomen.
8. Data-analyse
- Maak een spreadsheetkaart voor het experiment, die de lay-out van 8 x 12 van de plaat met 96 putjes weergeeft. Zorg ervoor dat de kaart de namen bevat van de stammen die in het ene raster worden gemeten en beschrijvingen van de lichtomstandigheden die in een ander raster worden gebruikt.
- Gebruik een Python-script of een andere voorkeursprogrammeertaal om de geëxporteerde gegevens te analyseren. Importeer de kaartspreadsheet in een array en koppel de stamnamen en conditienamen aan elk putje van de plaat.
OPMERKING: Voorbeeldcode voor analyse is te vinden op: https://github.com/mccleanlab/Lustro. Als alternatief kan men een applicatie gebruiken om gegevens van verschillende plaatlezers te ontleden19. - Lees de gegevens uit de geëxporteerde experimentspreadsheet in een andere matrix.
- Genereer grafieken van de optische dichtheidswaarden en fluorescentiewaarden voor elke stam en toestand in de loop van de tijd, zoals geïllustreerd in figuur 4.
- Onderzoek de optische dichtheidsplots om de stadia van exponentiële groei of verzadiging in de culturen te bepalen. Deze informatie zal helpen bij het selecteren van geschikte tijdstippen voor het vergelijken van fluorescentiemetingen tussen stammen of omstandigheden, zoals weergegeven in figuur 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 4A toont de fluorescentiewaarden in de loop van de tijd voor een optogenetische stam die een fluorescerende reporter tot expressie brengt die wordt bestuurd door een lichtinduceerbare gesplitste transcriptiefactor. De verschillende lichtomstandigheden die in het experiment worden gebruikt, worden weerspiegeld door variaties in de inschakelduur, die het percentage van de tijd vertegenwoordigt dat het licht brandt. Het totale fluorescentieniveau is evenredig met de inschakelduur van de lichtstimulatie. Figuur 4B toont de overeenkomstige OD700-waarden voor hetzelfde experiment. De consistentie van de optische dichtheidsmetingen onder verschillende lichtomstandigheden suggereert dat de experimentele techniek geen significante invloed heeft op de groeisnelheid van de stammen onder wisselende lichtomstandigheden.
Door fluorescentie en optische dichtheid in de loop van de tijd te meten, kan een beter begrip worden verkregen van hoe optogenetische systemen reageren op verschillende lichtstimulatieprogramma's in vergelijking met technieken die slechts op één tijdstip output vastleggen. Deze tijdverloopgegevens zijn waardevol voor het selecteren van specifieke tijdstippen om verschillende stammen en omstandigheden te vergelijken. Figuur 5 illustreert een enkel tijdstip (gemeten om 10 uur na lichtinductie) voor twee verschillende optogenetische stammen die worden geïnduceerd door verschillende lichtstimulatieprogramma's. Beide stammen maken gebruik van een licht-induceerbare gesplitste transcriptiefactor om de expressie van een fluorescerende reporter te stimuleren. Variaties in lichtpulsintensiteit, periode en inschakelduur lokken verschillende reacties uit bij deze stammen.
Figuur 1: Lay-out van de werktafel en experimentele workflow. Schermafbeelding van een voorbeeldindeling van een werktafel, die de beweging van de monsterplaat in Lustro aangeeft. De plaat wordt door de robotarm verplaatst van een verwarmingsschudder (1) naar de microplaatlezer (2) en vervolgens naar het verlichtingsapparaat (3). Foto's zijn opgenomen in aanvullende figuur 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Meetscript plaatlezer. Voorbeeld van een screenshot van een plaatlezerscript dat de microplaatlezer instelt op incubeer bij 30 °C en fluorescentie- en optische dichtheidsmetingen registreert. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Geautomatiseerd werkstationscript. Voorbeeld van een screenshot van een geautomatiseerd werkstationscript voor Lustro. Het script start een timer, zorgt ervoor dat de binnenverlichting wordt uitgeschakeld, stelt een lustelvariabele in op een beginwaarde van 0 en stelt de verwarmingsschudder in op incuberen bij 30 °C. Binnen elke lus wordt de plaat vergrendeld, gedurende 1 minuut geschud, naar de plaatlezer verplaatst, gemeten en vervolgens naar het verlichtingsapparaat verplaatst en de robot wordt ingesteld om te wachten op de rest van het lusinterval van 30 minuten. Aan het einde van deze tijd wordt de lustellervariabele met één verhoogd en wordt de lus herhaald. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Introductietijd. Voorbeeld van gegevens over het verloop van de lichtinductietijd van een Gal4BD-eMagA/eMagB-Gal4AD gesplitste transcriptiefactorstam met een pGAL1-mScarlet-I-reporter (yMM17346). De fluorescentie van mScarlet-I7 wordt gemeten bij 563 nm excitatie en 606 nm emissie met een optische versterking van 130. De lichtintensiteit is 125 μW/cm2 en de foutbalken geven de standaardfout van drievoudige monsters weer. De verticale rode stippellijn geeft aan wanneer culturen verzadigd zijn. (A) Fluorescentiewaarden van de stam in de loop van de tijd. Lichtpatronen (zoals aangegeven) werden herhaald voor de volledige duur van het getoonde experiment. Inzet laat zien dat lichte pulstijden worden afgewisseld met donkere interpulstijden, die gedurende het hele onderzoek worden herhaald. B) Optische dichtheid (gemeten bij 700 nm) voor het onder A) getoonde experiment. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Vergelijking van verschillende optogenetische systemen. Vergelijking van verschillende lichtinductieprogramma's tussen CRY2(535)/CIB1 en eMagA/eMagBM gesplitste transcriptiefactorstammen met pGAL1-mScarlet-I-reporters (respectievelijk yMM1763 en yMM17656). De fluorescentie van mScarlet-I7 wordt gemeten bij 563 nm excitatie en 606 nm emissie met een optische versterking van 130. De gebruikte lichtintensiteit is 125 μW/cm2, tenzij anders vermeld. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van drievoudige steekproeven (aangegeven als punten). De getoonde fluorescentiewaarden werden 10 uur na inductie geregistreerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende afbeelding 1: Representatieve afbeeldingen van de apparaten die in Lustro worden gebruikt. Foto van de Ludro-opstelling en ingezoomde afbeeldingen van de gebruikte apparaten. De robotarm verplaatst de monsterplaat van de verwarmingsschudder naar de plaatlezer en vervolgens naar het verlichtingsapparaat in een cyclus tijdens het experiment. Onderdelen zijn genummerd met een legenda op de zijkant. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hier gepresenteerde Ludro-protocol automatiseert de kweek-, belichtings- en meetprocessen, waardoor high-throughput screening en karakterisering van optogenetische systemen mogelijk wordt6. Dit wordt bereikt door een verlichtingsapparaat, een microplaatlezer en een schudapparaat te integreren in een automatiseringswerkstation. Dit protocol demonstreert specifiek het nut van Lustro voor het screenen van verschillende optogenetische constructen die zijn geïntegreerd in de gist S. cerevisiae en het vergelijken van lichtinductieprogramma's.
Verschillende cruciale stappen die in dit protocol worden benadrukt, zijn essentieel voor het effectieve gebruik van Lustro. Zorgvuldig ontwerp van op maat gemaakte lichtprogramma's die aansluiten bij de kinetiek van het onderzochte optogenetische construct is noodzakelijk. Bovendien is een nauwkeurige kalibratie van de plaatlezer cruciaal voor het verkrijgen van betrouwbare metingen. Grondige proefuitvoeringen van de experimenten op de robot, inclusief de nodige aanpassingen om een goede synchronisatie met de lichtprogramma's te garanderen, zijn van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat het script soepel verloopt.
Het voorbeeldprotocol dat hier wordt gegeven, beschrijft de vergelijking van een lichtinduceerbare gesplitste transcriptiefactor die de expressie van een fluorescerende reporter aanstuurt met een niet-fluorescerende controle onder verschillende lichtstimulatieomstandigheden. Fluorescentiemetingen worden uitgevoerd van elk putje in de plaat met tussenpozen van 30 minuten, voorafgegaan door 1 minuut schudden op de verwarmingsschudder voorafgaand aan de meting. Zoals in dit protocol wordt aangetoond, is Lustro geschikt voor gebruik met optogenetische systemen die reageren op blauw licht en zijn geïntegreerd in niet-aanhangende celtypen, waaronder bacteriën en andere gisten. Met kleine aanpassingen kan het protocol echter eenvoudig worden uitgebreid naar verschillende celtypen, optogenetische systemen en experimentele ontwerpen. Aanpassingen aan de instellingen van de plaatlezer zouden het mogelijk maken om andere outputs dan fluorescentie, zoals bioluminescentie, te meten. Voor toepassingen die een fijnere temporele resolutie vereisen, kunnen metingen vaker worden uitgevoerd. Incubatie op de verwarmingsschudder kan vaker worden herhaald wanneer dit van cruciaal belang is voor specifieke celtypen die schudden en temperatuurregeling vereisen. Integratie van gas en milieubeheersing, bijvoorbeeld door middel van een geïncubeerd hotel, zou de opname van cellijnen van zoogdieren mogelijk maken. Hoewel de hier beschreven iteratie van Lustro specifieke instrumentatie gebruikt, kan het Lustrom-platform gemakkelijk worden aangepast om te werken met andere laboratoriumautomatiseringsrobots of microplaatlezers. Verlichtingsapparaten, zoals de LPA20 of LITOS9, zouden de optoPlate kunnen vervangen om verschillende optogenetische systemen te stimuleren. Een toekomstige aanpassing van het Lustro-platform zou kunnen bestaan uit het integreren van vloeistofbehandeling om geautomatiseerde verdunningen voor continue kweektoepassingen mogelijk te maken. Dit zou het ook mogelijk maken om Lustro aan te passen voor cybergenetische feedbackcontrole, waarbij real-time metingen veranderingen in licht- of kweekomstandigheden informeren om een gewenste respons te bereiken of te behouden 5,21,22.
High-throughput technieken zijn cruciaal voor het optimaliseren en benutten van de dynamische aard van optogenetische systemen. Lustro overwint veel beperkingen van bestaande protocollen. Hoewel optogeneticatechnieken op basis van bioreactoren bijvoorbeeld constante uitlees- en kweekomstandigheden mogelijk maken, hebben ze last van een lage doorvoer23,24,25,26. Het optoPlateReader27-apparaat is veelbelovend voor real-time optogenetica-experimenten in microtiterplaten, maar heeft momenteel een lage doorvoer vanwege de behoefte aan een groot aantal replicaten om betrouwbare resultaten te verkrijgen en biedt geen toegang tot continue kweek. Lustro, aan de andere kant, maakt high-throughput screening van optogenetische systemen mogelijk om hun dynamische activiteit te karakteriseren. Toch zijn er enkele beperkingen aan het Lustro-protocol. Intermitterend schudden in Lustro veroorzaakt een kleine groeivertraging voor gistcellen6, maar dit kan worden verholpen door een verlichtingsapparaat aan te passen om schudden op te nemen. Een andere beperking van het Ludro-systeem is dat de monsterplaat niet wordt geïncubeerd terwijl deze zich op het verlichtingsapparaat bevindt en op kamertemperatuur (22 °C) wordt gehouden. Hoewel het kleine volume van elk monster schermen met een hoge doorvoer mogelijk maakt, kan aanvullende optimalisatie van de verlichtingsstappen nodig zijn bij het opschalen naar grotere reactievolumes voor bioproductie of andere toepassingen28,29.
Over het algemeen faciliteert Lustro de snelle ontwikkeling en het testen van optogenetische systemen door middel van high-throughput screening en nauwkeurige lichtregeling. Deze geautomatiseerde aanpak maakt een efficiënte karakterisering en vergelijking van verschillende optogenetische constructen onder verschillende inductieomstandigheden mogelijk, wat leidt tot snellere iteratie en verfijning van deze systemen. Met zijn aanpassingsvermogen aan verschillende celtypen, optogenetische hulpmiddelen en automatiseringsopstellingen, maakt Lustro de weg vrij voor vooruitgang op het gebied van optogenetica, waardoor de verkenning van dynamische genexpressiecontrole wordt vergemakkelijkt en de mogelijkheden voor het bestuderen van biologische netwerken en het manipuleren van cellulair gedrag worden uitgebreid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health-subsidie R35GM128873 en de National Science Foundation-subsidie 2045493 (toegekend aan M.N.M.). Megan Nicole McClean, Ph.D. heeft een Career Award bij de Scientific Interface van het Burroughs Wellcome Fund. Z.P.H. werd ondersteund door een NHGRI-trainingssubsidie voor het Genomic Sciences Training Program 5T32HG002760. We erkennen vruchtbare discussies met McClean-lableden, en in het bijzonder zijn we Kieran Sweeney dankbaar voor het leveren van commentaar op het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well glass bottom plate with #1.5 cover glass | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| BioShake 3000-T elm (heater shaker) | QINSTRUMENTS | ||
| Fluent Automation Workstation | Tecan | ||
| LITOS (alternative illumination device) | Hohener, et al. Scientific Reports. 2022 | ||
| optoPlate-96 (illumination device) | Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019 | ||
| Robotic Gripper Arm | Tecan | ||
| Spark (plate reader) | Tecan | ||
| Synthetic Complete media | SigmaAldrich | Y1250 | |
| Tecan Connect (user alert app) | Tecan | ||
| yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| YPD Agar | SigmaAldrich | Y1500 |
References
- Pérez, A. L. A., et al. Optogenetic strategies for the control of gene expression in yeasts. Biotechnology Advances. 54, 107839 (2022).
- Lan, T. -H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering. Trends in Genetics. 38 (12), 1253-1270 (2022).
- Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature Chemical Biology. 10, 502-511 (2014).
- Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo Activities of Light Inducible Dimers: a Cellular Optogenetics Guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
- Scott, T. D., Sweeney, K., McClean, M. N. Biological signal generators: integrating synthetic biology tools and in silico control. Current Opinion in Systems Biology. 14, 58-65 (2019).
- Harmer, Z. P., McClean, M. N. Lustro: High-throughput optogenetic experiments enabled by automation and a yeast optogenetic toolkit. ACS Synthetic Biology. 12 (7), 1943-1951 (2023).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
- Höhener, T. C., Landolt, A. E., Dessauges, C., Hinderling, L., Gagliardi, P. A., Pertz, O. LITOS: a versatile LED illumination tool for optogenetic stimulation. Scientific Reports. 12 (1), 13139 (2022).
- Grødem, E. O., Sweeney, K., McClean, M. N. Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments. BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).
- Dunlop, M. J. A supplemental guide to building the optoPlate-96. , https://www.protocols.io/view/a-supplemental-guide-to-building-the-optoplate-96-b2vwqe7e (2021).
- Thomas, O. S., Hörner, M., Weber, W. A graphical user interface to design high-throughput optogenetic experiments with the optoPlate-96. Nature Protocols. 15 (9), 2785-2787 (2020).
- Robertson, J. B., Davis, C. R., Johnson, C. H. Visible light alters yeast metabolic rhythms by inhibiting respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21130-21135 (2013).
- Synthetic Complete (SC) Medium. 2016 (11), Cold Spring Harbor Protocols. (2016).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
- Hecht, A., Endy, D., Salit, M., Munson, M. S. When wavelengths collide: bias in cell abundance measurements due to expressed fluorescent proteins. ACS Synthetic Biology. 5 (9), 1024-1027 (2016).
- YPD media. 2010 (9), Cold Spring Harbor Protocols. (2010).
- Low-Fluorescence Yeast Nitrogen Base without Riboflavin and Folic Acid Medium (LFM). 2016 (11), Cold Spring Harbor. (2016).
- Csibra, E., Stan, G. -B. Parsley: a web app for parsing data from plate readers. Zenodo. , (2023).
- Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6 (1), 35363 (2016).
- Gutiérrez Mena, J., Kumar, S., Khammash, M. Dynamic cybergenetic control of bacterial co-culture composition via optogenetic feedback. Nature Communications. 13, 4808 (2022).
- Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
- Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546 (2016).
- Bertaux, F., et al. Enhancing bioreactor arrays for automated measurements and reactive control with ReacSight. Nature Communications. 13 (1), 3363 (2022).
- Benisch, M., Benzinger, D., Kumar, S., Hu, H., Khammash, M. Optogenetic closed-loop feedback control of the unfolded protein response optimizes protein production. Metabolic Engineering. 77, 32-40 (2023).
- Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative Biology. 6 (3), 366-372 (2014).
- Datta, S., et al. High-throughput feedback-enabled optogenetic stimulation and spectroscopy in microwell plates. bioRxiv. , (2022).
- Pouzet, S., et al. Optogenetic control of beta-carotene bioproduction in yeast across multiple lab-scales. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 11, 1085268 (2023).
- Pouzet, S., Banderas, A., Le Bec, M., Lautier, T., Truan, G., Hersen, P. The promise of optogenetics for bioproduction: dynamic control strategies and scale-up instruments. Bioengineering. 7 (4), 151 (2020).
