Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zur Verwendung der automatisierten Plattform Lustro zur Durchführung einer Hochdurchsatz-Charakterisierung optogenetischer Systeme in Hefe.
Abstract
Die Optogenetik bietet eine präzise Kontrolle des zellulären Verhaltens durch die Verwendung genetisch kodierter lichtempfindlicher Proteine. Die Optimierung dieser Systeme, um die gewünschte Funktionalität zu erreichen, erfordert jedoch oft mehrere Design-Build-Test-Zyklen, die zeitaufwändig und arbeitsintensiv sein können. Um dieser Herausforderung zu begegnen, haben wir Lustro entwickelt, eine Plattform, die Lichtstimulation mit Laborautomatisierung kombiniert und so ein effizientes Hochdurchsatz-Screening und die Charakterisierung optogenetischer Systeme ermöglicht.
Lustro verfügt über einen Automationsarbeitsplatz, der mit einer Beleuchtungsvorrichtung, einer Schüttelvorrichtung und einem Plattenleser ausgestattet ist. Durch den Einsatz eines Roboterarms automatisiert Lustro die Bewegung einer Mikrotiterplatte zwischen diesen Geräten und ermöglicht so die Stimulation optogenetischer Stämme und die Messung ihrer Reaktion. Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Verwendung von Lustro zur Charakterisierung optogenetischer Systeme zur Genexpressionskontrolle in der knospenden Hefe Saccharomyces cerevisiae. Das Protokoll umfasst die Einrichtung der Lustro-Komponenten, einschließlich der Integration des Beleuchtungsgeräts in die Automatisierungsstation. Es enthält auch detaillierte Anweisungen für die Programmierung des Beleuchtungsgeräts, des Plattenlesers und des Roboters, um einen reibungslosen Betrieb und eine reibungslose Datenerfassung während des gesamten Versuchsprozesses zu gewährleisten.
Introduction
Die Optogenetik ist eine leistungsfähige Technik, die lichtempfindliche Proteine nutzt, um das Verhalten von Zellen mit hoher Präzision zu steuern 1,2,3. Das Prototyping optogenetischer Konstrukte und die Identifizierung optimaler Beleuchtungsbedingungen können jedoch zeitaufwändig sein, was die Optimierung optogenetischer Systeme erschwert 4,5. Hochdurchsatzmethoden zum schnellen Screening und zur Charakterisierung der Aktivität optogenetischer Systeme können den Design-Build-Test-Zyklus für das Prototyping von Konstrukten und die Erforschung ihrer Funktion beschleunigen.
Die Lustro-Plattform wurde als Laborautomatisierungstechnik für das Hochdurchsatz-Screening und die Charakterisierung optogenetischer Systeme entwickelt. Es integriert einen Mikroplatten-Reader, eine Beleuchtungsvorrichtung und eine Schüttelvorrichtung mit einer Automatisierungs-Workstation6. Lustro kombiniert die automatisierte Kultivierung und Lichtstimulation von Zellen in Mikrotiterplatten (Abbildung 1 und ergänzende Abbildung 1) und ermöglicht so das schnelle Screening und den Vergleich verschiedener optogenetischer Systeme. Die Lustro-Plattform ist hochgradig anpassungsfähig und kann verallgemeinert werden, um mit anderen Laborautomatisierungsrobotern, Beleuchtungsgeräten, Plattenlesegeräten, Zelltypen und optogenetischen Systemen zu arbeiten, einschließlich solcher, die auf verschiedene Wellenlängen des Lichts reagieren.
Dieses Protokoll demonstriert den Aufbau und die Verwendung von Lustro zur Charakterisierung eines optogenetischen Systems. Die optogenetische Kontrolle von gespaltenen Transkriptionsfaktoren in Hefe wird als Beispielsystem verwendet, um die Funktion und den Nutzen der Plattform zu veranschaulichen, indem die Beziehung zwischen Lichteinträgen und der Expression eines fluoreszierenden Reportergens, mScarlet-I7, untersucht wird. Durch die Befolgung dieses Protokolls können Forscher die Optimierung optogenetischer Systeme rationalisieren und die Entdeckung neuer Strategien für die dynamische Steuerung biologischer Systeme beschleunigen.
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Protocol
Die in dieser Studie verwendeten Hefestämme sind in der Materialtabelle dokumentiert. Diese Stämme weisen ein robustes Wachstum im Temperaturbereich von 22 °C bis 30 °C auf und können in verschiedenen Standardhefemedien kultiviert werden.
1. Einrichten des Automationsarbeitsplatzes
- Statten Sie die automatisierte Workstation mit einem Roboter-Greifarm (RGA, siehe Materialtabelle) aus, der in der Lage ist, Mikrotiterplatten zu bewegen (Abbildung 1).
- Installieren Sie einen Mikroplatten-Heizschüttler (siehe Materialtabelle) in der automatisierten Workstation (Abbildung 1(1)) mit einem automatischen Plattenverriegelungsmechanismus, der RGA-Zugriff ermöglicht.
- Positionieren Sie einen Mikroplatten-Reader neben der automatisierten Workstation (Abbildung 1(2)) und stellen Sie sicher, dass der RGA zugänglich ist.
- Integrieren Sie ein Mikroplatten-Beleuchtungsgerät (Abbildung 1(3)), das einen bequemen RGA-Zugriff ermöglicht. Beispiele hierfür sind die optoPlate8 (wie sie in dieser Studie verwendet wird) oder LITOS9 (siehe Materialtabelle).
2. Vorbereitung des Beleuchtungsgerätes
- Konstruieren und kalibrieren Sie die OptoPlate (oder ein alternatives Beleuchtungsgerät) nach den etablierten Methoden 8,10,11.
- Verwenden Sie einen Adapter am Beleuchtungsgerät, um den RGA-Zugriff zu ermöglichen.
- Programmieren Sie die optoPlate mit Hilfe einer Tabellenkalkulationseingabe10 oder einer grafischen Oberfläche12. Befolgen Sie Schritt 3, um die Lichtstimulationsprogramme auszuführen.
3. Entwerfen eines Lichtstimulationsprogramms
- Bestimmen Sie die gewünschten Lichtverhältnisse für das Experiment.
- Geben Sie die gewünschten Lichtbedingungen, einschließlich Lichtintensität, Lichtstartzeit, Impulslänge, Impulszahl und Interpulsdauer, in eine Tabelle ein.
HINWEIS: Flashen Sie diese Informationen auf die optoPlate, indem Sie die Anweisungen im GitHub-Repository befolgen: github.com/mccleanlab/Optoplate-96. Denken Sie daran, dass die Probenplatte nicht beleuchtet wird, während sie sich im Mikroplatten-Lesegerät oder auf dem Heizschüttler befindet. Die Dauer und Häufigkeit dieser Ereignisse kann eine Optimierung auf der Grundlage spezifischer experimenteller Anforderungen erfordern. - Beziehen Sie dunkle Bedingungen für jede Sorte mit ein, um korrekte Hintergrundmessungen zu ermöglichen.
- Verwenden Sie für erste Charakterisierungsexperimente zur Beurteilung der Transformantenfunktionalität eine hohe Lichtintensität.
HINWEIS: Die Lichtintensität sollte für empfindlichere Experimente optimiert werden, da übermäßiges Licht für Hefe13 phototoxisch sein kann.
4. Vorbereitung des Mikroplatten-Readers
- Konfigurieren Sie den Mikroplatten-Reader so, dass er die gewünschte gewünschte Menge von Interesse misst, bevor Sie Experimente durchführen.
HINWEIS: In diesem Beispiel wurde der Mikroplatten-Reader so konfiguriert, dass er die Fluoreszenz eines Reporters misst, die durch den interessierenden Stamm ausgedrückt wird. Andere Leistungen, wie Lumineszenz oder optische Dichte, können je nach experimentellen Anforderungen verwendet werden. - Kultivieren Sie den interessierenden Stamm (zusammen mit einer nichtfluoreszierenden Kontrolle) in synthetischen vollständigen (SC) Medien14 (oder einem anderen Medium mit niedriger Fluoreszenz) (siehe Materialtabelle) bis zur höchsten zu messenden Zelldichte. Übertragen Sie die Kulturen in eine schwarzwandige Mikrotiterplatte mit Glasboden (siehe Materialtabelle) und messen Sie sie, um die optimalen Einstellungen für den Mikroplatten-Reader zu bestimmen.
HINWEIS: Stellen Sie genaue Messwerte sicher, indem Sie die Plattenabmessungen korrekt eingeben und die Platte von unten messen. - Beziehen Sie sich auf eine fluoreszierende Proteindatenbank (z. B. fpbase.org), um ungefähre Absorptions- und Emissionsspektren für das fluoreszierende Zielprotein15 zu erhalten.
- Bestimmen Sie den z-Wert (Abstand zwischen der Platte und dem Lesegerät), indem Sie einen z-Scan an Wells durchführen, die die fluoreszierenden und nicht fluoreszierenden Stämme enthalten. Wählen Sie den Z-Wert aus, der das höchste Signal-Rausch-Verhältnis ergibt.
- Optimieren Sie die Absorptions- und Emissionsspektren, indem Sie Absorptions- und Emissionsscans an den fluoreszierenden und nicht fluoreszierenden Stämmen durchführen, um das optimale Signal-Rausch-Verhältnis zu bestimmen.
- Messen Sie die fluoreszierende Dehnung mit der optimalen Verstärkung, um die höchste optische Verstärkung zu bestimmen, die verwendet werden kann, ohne dass es zu einem Überlaufmessfehler kommt.
HINWEIS: Diese optische Verstärkung sollte bei Experimenten mit demselben Stamm manuell einheitlich eingestellt werden, um die Konsistenz der Ergebnisse zu gewährleisten. - Bereiten Sie ein Messskript (siehe Abbildung 2) in der Mikroplatten-Reader-Software vor. Mit diesem Skript wird das Gerät so konfiguriert, dass es die optische Dichte der Kulturen und die Fluoreszenzspektren aller zu messenden fluoreszierenden Proteine misst.
HINWEIS: Messen Sie die optische Dichte von Stämmen bei 600 nm, es sei denn, sie exprimieren rot fluoreszierende Proteine. Bei Stämmen, die rot fluoreszierende Proteine exprimieren, ist die optische Dichte bei 700 nm zu messen, um Verzerrungenzu vermeiden 16. - Stellen Sie das Messskript so ein, dass während der Messungen eine interne Inkubationstemperatur von 30 °C eingehalten wird.
- Konfigurieren Sie das Messskript so, dass die Daten je nach Präferenz in eine Tabellenkalkulation oder in ASCII-Dateien exportiert werden.
5. Programmierung des Roboters
- Konfigurieren Sie die Arbeitstischdefinition in der automatisierten Workstation-Software basierend auf dem physischen Layout der Träger (z. B. Heizgeräte, Verschachtelungsplattformen, Beleuchtungsgeräte) und der Laborgeräte (z. B. der 96-Well-Platte) (siehe Materialtabelle). Erstellen Sie ein Skript in der Software der Automatisierungs-Workstation, um Lichtinduktion und Messungen durchzuführen (Abbildung 3), indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Deaktivieren Sie alle internen Beleuchtungsquellen, um die Hintergrundaktivierung optogenetischer Systeme zu verhindern.
- Stellen Sie den Heizrüttler auf eine Temperatur von 30 °C ein. Wenn sich die Platte nicht auf dem Heizrüttler befindet, hat sie Umgebungstemperatur (22 °C).
- Verwenden Sie Schleifen, einen Timer und eine Schleifenzählvariable, um die Schritte zum Induzieren und Messen der Zellen in regelmäßigen Abständen zu wiederholen.
- Schütteln Sie vor dem Aufzeichnen der Messungen die Probenplatte, um eine ordnungsgemäße Aufhängung aller Zellen sicherzustellen. Ein 60-s-Shake bei 1.000 U/min mit einem 2-mm-Orbital ist in der Regel ausreichend, um S288C S. cerevisiae-Zellen zu resuspendieren und Messverzerrungen zu vermeiden.
- Bewegen Sie die Probenplatte mit dem Roboterarm zum Mikroplatten-Reader und entfernen Sie den Deckel (falls zutreffend), um Verzerrungen bei der optischen Dichtemessung zu vermeiden. Die Steuerungssoftware entfernt den Deckel automatisch und setzt ihn wieder an die gewünschte Position, wenn die Definition des Mikroplatten-Reader-Trägers so eingestellt ist, dass keine Deckel zugelassen werden.
- Führen Sie das Messskript für den Mikroplatten-Reader aus, wie in Schritt 4 beschrieben.
- Setzen Sie den Deckel auf der Probenplatte wieder auf und bewegen Sie die Platte mit dem Roboterarm zum Beleuchtungsgerät.
- Stellen Sie das Skript so ein, dass es wartet, bis der Timer das angegebene Zeitintervall erreicht (z. B. 30 Minuten multipliziert mit der Schleifenzählvariablen) und dann die gesamte Schleife für die gewünschte Anzahl von Iterationen wiederholt (z. B. 48 Mal für ein 24-Stunden-Experiment).
- Beheben Sie potenzielle Fehler und stellen Sie sicher, dass die Träger- und Laborgerätedefinitionen ordnungsgemäß funktionieren, sowie die Fähigkeit des RGA, die Platte genau aufzunehmen und zu platzieren, indem eine leere Platte mehrmals durch die Skriptschleife geführt wird.
- Konfigurieren Sie Benutzerwarnungen, um den Benutzer über Änderungen des Gerätezustands oder Fehler zu informieren, die während der Ausführung des Protokolls auftreten können.
6. Einrichten der Probenplatte
- Züchten Sie Hefestämme auf Rich-Media-Platten, wie z. B. YPD-Agar17 (siehe Materialtabelle). Fügen Sie eine nicht fluoreszierende (negative) Kontrolle hinzu.
- Wählen Sie Kolonien aus den Platten aus und inokulieren Sie sie in 3 ml SC-Medium14 (oder ein anderes Medium mit geringer Fluoreszenz, wie z. B. LFM18) in Glaskulturröhrchen. Inkubieren Sie die Kulturen über Nacht bei 30 °C auf einer Walzentrommel und halten Sie sie dabei im Dunkeln oder unter nicht ansprechenden Lichtbedingungen (z. B. rotes Licht für blaulichtempfindliche Systeme).
- Messen Sie die optische Dichte der Übernachtkulturen, indem Sie 200 μl jeder Kultur in 1 ml SC-Medien verdünnen und die optische Dichte bei 600 nm (OD600) mit einem Spektralphotometer oder Mikroplatten-Lesegerät aufzeichnen.
- Jede Kultur über Nacht wird in Glaskulturröhrchen auf einen OD600 von 0,1 verdünnt. Für Dehnungstests mit höherem Durchsatz führen Sie automatische Verdünnungen in Mikrotiterplatten durch.
- Pipettieren Sie die verdünnten Kulturen in die 96-Well-Platte. Fügen Sie für jede Bedingung dreifache Vertiefungen hinzu (d. h. drei identische Vertiefungen mit der gleichen Sorte und den gleichen Lichtverhältnissen), um technische Unterschiede zu berücksichtigen. Schließen Sie Vertiefungen mit leeren Medien und nicht fluoreszierenden Zellen als Negativkontrollen ein, um die Hintergrundfluoreszenz und die optische Dichte zu messen.
- Inkubieren Sie die Platte bei 30 °C unter Schütteln für 5 Stunden, bevor Sie mit dem Lichtinduktionsexperiment beginnen. Passen Sie die Verdünnungsmengen und Inkubationszeiten nach Bedarf an, um sie für bestimmte Stämme und Versuchsbedingungen zu optimieren.
7. Durchführung des Experiments
- Legen Sie die Probenplatte auf den Heizschüttler und starten Sie das Automatisierungsskript wie in Schritt 5 beschrieben.
- Starten Sie das Lichtstimulationsprogramm wie in Schritt 3 beschrieben, sobald die erste Messung auf dem Plattenleser aufgezeichnet wurde.
- Wenn sich der Automationsarbeitsplatz nicht in einem dunklen Raum befindet, decken Sie ihn mit einem Verdunkelungsvorhang ab, um eine Hintergrundbeleuchtung zu vermeiden.
8. Datenanalyse
- Erstellen Sie eine Tabellenkalkulation für das Experiment, die das 8 x 12-Layout der 96-Well-Platte widerspiegelt. Stellen Sie sicher, dass die Karte die Namen der in einem Raster gemessenen Dehnungen und Beschreibungen der Lichtverhältnisse enthält, die in einem anderen Raster verwendet werden.
- Verwenden Sie ein Python-Skript oder eine andere bevorzugte Programmiersprache, um die exportierten Daten zu analysieren. Importieren Sie die Map-Tabelle in ein Array und ordnen Sie die Stammnamen und Bedingungsnamen den einzelnen Vertiefungen der Platte zu.
HINWEIS: Beispielcode für die Analyse finden Sie unter: https://github.com/mccleanlab/Lustro. Alternativ kann man eine Anwendung verwenden, um Daten von verschiedenen Plattenlesegeräten19 zu analysieren. - Lesen Sie die Daten aus der exportierten Testtabelle in ein anderes Array.
- Generieren Sie Diagramme der optischen Dichtewerte und Fluoreszenzwerte für jede Dehnung und jeden Zustand im Laufe der Zeit, wie in Abbildung 4 dargestellt.
- Untersuchen Sie die optischen Dichtediagramme, um die Stadien des exponentiellen Wachstums oder der Sättigung in den Kulturen zu bestimmen. Diese Informationen helfen bei der Auswahl geeigneter Zeitpunkte für den Vergleich von Fluoreszenzmessungen zwischen Stämmen oder Bedingungen, wie in Abbildung 5 dargestellt.
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Representative Results
Abbildung 4A zeigt die Fluoreszenzwerte über die Zeit für einen optogenetischen Stamm, der einen fluoreszierenden Reporter exprimiert, der durch einen lichtinduzierbaren Split-Transkriptionsfaktor gesteuert wird. Die unterschiedlichen Lichtverhältnisse, die im Experiment verwendet werden, spiegeln sich in Schwankungen des Tastverhältnisses wider, das den Prozentsatz der Zeit darstellt, in der das Licht eingeschaltet ist. Es wird beobachtet, dass das Gesamtfluoreszenzniveau proportional zum Tastverhältnis der Lichtstimulation ist. Abbildung 4B zeigt die entsprechenden OD700-Werte für dasselbe Experiment. Die Konsistenz der optischen Dichtemessungen bei verschiedenen Lichtverhältnissen deutet darauf hin, dass die experimentelle Technik die Wachstumsrate der Stämme bei unterschiedlichen Lichtverhältnissen nicht signifikant beeinflusst.
Durch die Messung von Fluoreszenz und optischer Dichte im Laufe der Zeit kann ein tieferes Verständnis dafür gewonnen werden, wie optogenetische Systeme auf verschiedene Lichtstimulationsprogramme reagieren, verglichen mit Techniken, die die Ausgabe nur zu einem einzigen Zeitpunkt erfassen. Diese Zeitverlaufsdaten sind wertvoll für die Auswahl bestimmter Zeitpunkte, um verschiedene Belastungen und Bedingungen zu vergleichen. Abbildung 5 zeigt einen einzigen Zeitpunkt (gemessen bei 10 Stunden nach Beginn der Lichtinduktion) für zwei unterschiedliche optogenetische Stämme, die durch verschiedene Lichtstimulationsprogramme induziert werden. Beide Stämme verwenden einen lichtinduzierbaren Split-Transkriptionsfaktor, um die Expression eines fluoreszierenden Reporters zu steuern. Variationen in der Intensität der Lichtimpulse, der Periode und des Tastverhältnisses rufen bei diesen Stämmen unterschiedliche Reaktionen hervor.
Abbildung 1: Arbeitstischlayout und experimenteller Arbeitsablauf. Screenshot eines Beispiel-Arbeitstischlayouts, das die Bewegung der Musterplatte in Lustro anzeigt. Die Platte wird durch den Roboterarm von einem Heizschüttler (1) zum Mikroplatten-Reader (2) und dann zur Beleuchtungsvorrichtung (3) bewegt. Fotos sind in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Messskript für den Plattenleser. Beispiel-Screenshot eines Platten-Reader-Skripts, das den Mikroplatten-Reader so einstellt, dass er bei 30 °C inkubiert und Fluoreszenz- und optische Dichtemessungen aufzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Automatisiertes Workstation-Skript. Beispiel-Screenshot eines automatisierten Workstation-Skripts für Lustro. Das Skript startet einen Timer, stellt sicher, dass die Innenbeleuchtung ausgeschaltet ist, setzt eine Schleifenzählvariable auf einen Anfangswert von 0 und stellt den Heizrüttler so ein, dass er bei 30 °C inkubiert. Innerhalb jeder Schleife wird die Platte verriegelt, 1 Minute lang geschüttelt, zum Plattenleser bewegt, gemessen, dann zum Beleuchtungsgerät bewegt, und der Roboter wird so eingestellt, dass er für den Rest des 30-minütigen Schleifenintervalls wartet. Am Ende dieser Zeit wird die Schleifenzählervariable um eins erhöht, und die Schleife wird wiederholt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Verlauf der Einarbeitungszeit. Beispieldaten des Lichtinduktionszeitverlaufs eines Gal4BD-eMagA/eMagB-Gal4AD-Stammes mit gespaltenem Transkriptionsfaktor mit einem pGAL1-mScarlet-I-Reporter (yMM17346). Die Fluoreszenz von mScarlet-I7 wird bei 563 nm Anregung und 606 nm Emission mit einem optischen Gewinn von 130 gemessen. Die Lichtintensität beträgt 125 μW/cm2 und die Fehlerbalken stellen den Standardfehler von dreifachen Proben dar. Die vertikale rote gestrichelte Linie zeigt an, wann Kulturen die Sättigung erreicht haben. (A) Fluoreszenzwerte der Dehnung über die Zeit. Die Lichtmuster (wie angegeben) wurden für die gesamte Dauer des gezeigten Experiments wiederholt. Der Einschub zeigt, dass sich die hellen Pulszeiten mit den dunklen Impulszeiten abwechseln, die sich während der gesamten Untersuchung wiederholen. (B) Optische Dichtewerte (gemessen bei 700 nm) für das in (A) gezeigte Experiment. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Vergleich verschiedener optogenetischer Systeme. Vergleich verschiedener Lichtinduktionsprogramme zwischen CRY2(535)/CIB1- und eMagA/eMagBM-Split-Transkriptionsfaktor-Stämmen mit pGAL1-mScarlet-I-Reportern (yMM1763 bzw. yMM17656). Die Fluoreszenz von mScarlet-I7 wird bei 563 nm Anregung und 606 nm Emission mit einem optischen Gewinn von 130 gemessen. Die verwendete Lichtintensität beträgt 125 μW/cm2, sofern nicht anders angegeben. Fehlerbalken stellen den Standardfehler von dreifachen Stichproben dar (gekennzeichnet als Punkte). Die gezeigten Fluoreszenzwerte wurden 10 Stunden nach Beginn der Induktion aufgezeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Repräsentative Bilder der in Lustro verwendeten Geräte. Bild des Lustro-Setups und vergrößerte Bilder der verwendeten Geräte. Der Roboterarm bewegt die Probenplatte während des gesamten Experiments in einem Zyklus vom Heizschüttler zum Plattenleser und dann zum Beleuchtungsgerät. Die Komponenten sind mit einer Legende an der Seite nummeriert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Das hier vorgestellte Lustro-Protokoll automatisiert die Kultivierungs-, Beleuchtungs- und Messprozesse und ermöglicht so das Hochdurchsatz-Screening und die Charakterisierung optogenetischer Systeme6. Dies wird durch die Integration eines Beleuchtungsgeräts, eines Mikroplatten-Readers und eines Schüttelgeräts in einen Automatisierungsarbeitsplatz erreicht. Dieses Protokoll demonstriert insbesondere die Nützlichkeit von Lustro für das Screening verschiedener optogenetischer Konstrukte, die in die Hefe S. cerevisiae integriert sind, und für den Vergleich von Lichtinduktionsprogrammen.
Mehrere entscheidende Schritte, die in diesem Protokoll hervorgehoben werden, sind für die effektive Nutzung von Lustro unerlässlich. Ein sorgfältiges Design von maßgeschneiderten Lichtprogrammen, die sich an der Kinetik des untersuchten optogenetischen Konstrukts orientieren, ist notwendig. Darüber hinaus ist eine präzise Kalibrierung des Plattenlesers entscheidend, um zuverlässige Messungen zu erhalten. Gründliche Probeläufe der Experimente am Roboter, einschließlich der notwendigen Anpassungen, um eine ordnungsgemäße Synchronisierung mit den Lichtprogrammen zu gewährleisten, sind entscheidend für einen reibungslosen Ablauf des Skripts.
Das hier bereitgestellte Beispielprotokoll beschreibt den Vergleich eines lichtinduzierbaren gespaltenen Transkriptionsfaktors, der die Expression eines fluoreszierenden Reporters antreibt, mit einer nicht-fluoreszierenden Kontrolle unter verschiedenen Lichtstimulationsbedingungen. Fluoreszenzmessungen werden aus jeder Vertiefung in der Platte in 30-Minuten-Intervallen durchgeführt, wobei vor der Messung 1 Minute lang am Heizschüttler geschüttelt wird. Wie in diesem Protokoll gezeigt, eignet sich Lustro für die Verwendung mit auf blaues Licht reagierenden optogenetischen Systemen, die in nicht-adhärente Zelltypen, einschließlich Bakterien und andere Hefen, integriert sind. Mit geringfügigen Modifikationen kann das Protokoll jedoch problemlos auf verschiedene Zelltypen, optogenetische Systeme und Versuchspläne ausgeweitet werden. Anpassungen an den Einstellungen des Plattenlesers würden die Messung anderer Ausgänge als der Fluoreszenz, wie z. B. Biolumineszenz, ermöglichen. Für Anwendungen, die eine feinere zeitliche Auflösung erfordern, können Messungen häufiger durchgeführt werden. Die Inkubation auf dem Heater Shaker kann bei bestimmten Zelltypen, die geschüttelt und temperiert werden müssen, häufiger wiederholt werden. Die Einbeziehung von Gas und Umweltkontrolle, z. B. durch ein inkubiertes Hotel, würde den Einschluss von Säugetierzelllinien ermöglichen. Während die hier beschriebene Iteration von Lustro spezifische Instrumente verwendet, kann die Lustro-Plattform leicht an die Arbeit mit anderen Laborautomatisierungsrobotern oder Mikroplatten-Readern angepasst werden. Beleuchtungsgeräte wie der LPA20 oder LITOS9 könnten die OptoPlate ersetzen, um verschiedene optogenetische Systeme zu stimulieren. Eine zukünftige Modifikation der Lustro-Plattform könnte die Integration von Liquid Handling beinhalten, um automatisierte Verdünnungen für kontinuierliche Kulturanwendungen zu ermöglichen. Dies würde es auch ermöglichen, Lustro für die cybergenetische Feedback-Kontrolle anzupassen, bei der Echtzeitmessungen über Änderungen der Licht- oder Kulturbedingungen informieren, um eine gewünschte Reaktion zu erreichen oder aufrechtzuerhalten 5,21,22.
Hochdurchsatztechniken sind entscheidend, um die dynamische Natur optogenetischer Systeme zu optimieren und nutzbar zu machen. Lustro überwindet viele Einschränkungen bestehender Protokolle. Zum Beispiel ermöglichen bioreaktorbasierte Optogenetik-Techniken zwar konstante Auslese- und Kultivierungsbedingungen, leiden aber unter einem geringen Durchsatz23,24,25,26. Der optoPlateReader27 ist vielversprechend für optogenetische Echtzeit-Experimente in Mikrotiterplatten, hat aber derzeit einen geringen Durchsatz, da eine hohe Anzahl von Replikaten erforderlich ist, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten, und bietet keinen Zugang zu einer kontinuierlichen Kultivierung. Lustro hingegen ermöglicht das Hochdurchsatz-Screening optogenetischer Systeme, um deren dynamische Aktivität zu charakterisieren. Nichtsdestotrotz gibt es einige Einschränkungen für das Lustro-Protokoll. Intermittierendes Schütteln in Lustro verursacht eine kleine Wachstumsverzögerung für Hefezellen6, aber dies könnte durch die Anpassung einer Beleuchtungsvorrichtung behoben werden, um das Schütteln zu integrieren. Eine weitere Einschränkung des Lustro-Systems besteht darin, dass die Probenplatte nicht inkubiert wird, während sie sich auf dem Beleuchtungsgerät befindet, und auf Umgebungstemperatur (22 °C) gehalten wird. Obwohl das kleine Volumen jeder Probe Hochdurchsatz-Screenings ermöglicht, kann eine zusätzliche Optimierung der Beleuchtungsschritte erforderlich sein, wenn auf größere Reaktionsvolumina für die Bioproduktion oder andere Anwendungen skaliert wird28,29.
Insgesamt ermöglicht Lustro die schnelle Entwicklung und Erprobung optogenetischer Systeme durch Hochdurchsatz-Screening und präzise Lichtsteuerung. Dieser automatisierte Ansatz ermöglicht die effiziente Charakterisierung und den Vergleich verschiedener optogenetischer Konstrukte unter verschiedenen Induktionsbedingungen, was zu einer schnelleren Iteration und Verfeinerung dieser Systeme führt. Mit seiner Anpassungsfähigkeit an verschiedene Zelltypen, optogenetischen Werkzeugen und Automatisierungskonfigurationen ebnet Lustro den Weg für Fortschritte auf dem Gebiet der Optogenetik, erleichtert die Erforschung der dynamischen Genexpressionskontrolle und erweitert die Möglichkeiten zur Untersuchung biologischer Netzwerke und zur Entwicklung zellulären Verhaltens.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch das National Institutes of Health Grant R35GM128873 und das National Science Foundation Grant 2045493 (vergeben an M.N.M.) unterstützt. Megan Nicole McClean, Ph.D., ist Trägerin des Career Award am Scientific Interface des Burroughs Wellcome Fund. Z.P.H. wurde durch ein NHGRI-Schulungsstipendium für das Genomic Sciences Training Program 5T32HG002760 unterstützt. Wir danken den fruchtbaren Gesprächen mit den Mitgliedern des McClean-Labors und insbesondere Kieran Sweeney für die Bereitstellung von Kommentaren zum Manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well glass bottom plate with #1.5 cover glass | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| BioShake 3000-T elm (heater shaker) | QINSTRUMENTS | ||
| Fluent Automation Workstation | Tecan | ||
| LITOS (alternative illumination device) | Hohener, et al. Scientific Reports. 2022 | ||
| optoPlate-96 (illumination device) | Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019 | ||
| Robotic Gripper Arm | Tecan | ||
| Spark (plate reader) | Tecan | ||
| Synthetic Complete media | SigmaAldrich | Y1250 | |
| Tecan Connect (user alert app) | Tecan | ||
| yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| YPD Agar | SigmaAldrich | Y1500 |
References
- Pérez, A. L. A., et al. Optogenetic strategies for the control of gene expression in yeasts. Biotechnology Advances. 54, 107839 (2022).
- Lan, T. -H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering. Trends in Genetics. 38 (12), 1253-1270 (2022).
- Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature Chemical Biology. 10, 502-511 (2014).
- Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo Activities of Light Inducible Dimers: a Cellular Optogenetics Guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
- Scott, T. D., Sweeney, K., McClean, M. N. Biological signal generators: integrating synthetic biology tools and in silico control. Current Opinion in Systems Biology. 14, 58-65 (2019).
- Harmer, Z. P., McClean, M. N. Lustro: High-throughput optogenetic experiments enabled by automation and a yeast optogenetic toolkit. ACS Synthetic Biology. 12 (7), 1943-1951 (2023).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
- Höhener, T. C., Landolt, A. E., Dessauges, C., Hinderling, L., Gagliardi, P. A., Pertz, O. LITOS: a versatile LED illumination tool for optogenetic stimulation. Scientific Reports. 12 (1), 13139 (2022).
- Grødem, E. O., Sweeney, K., McClean, M. N. Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments. BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).
- Dunlop, M. J. A supplemental guide to building the optoPlate-96. , https://www.protocols.io/view/a-supplemental-guide-to-building-the-optoplate-96-b2vwqe7e (2021).
- Thomas, O. S., Hörner, M., Weber, W. A graphical user interface to design high-throughput optogenetic experiments with the optoPlate-96. Nature Protocols. 15 (9), 2785-2787 (2020).
- Robertson, J. B., Davis, C. R., Johnson, C. H. Visible light alters yeast metabolic rhythms by inhibiting respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21130-21135 (2013).
- Synthetic Complete (SC) Medium. 2016 (11), Cold Spring Harbor Protocols. (2016).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
- Hecht, A., Endy, D., Salit, M., Munson, M. S. When wavelengths collide: bias in cell abundance measurements due to expressed fluorescent proteins. ACS Synthetic Biology. 5 (9), 1024-1027 (2016).
- YPD media. 2010 (9), Cold Spring Harbor Protocols. (2010).
- Low-Fluorescence Yeast Nitrogen Base without Riboflavin and Folic Acid Medium (LFM). 2016 (11), Cold Spring Harbor. (2016).
- Csibra, E., Stan, G. -B. Parsley: a web app for parsing data from plate readers. Zenodo. , (2023).
- Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6 (1), 35363 (2016).
- Gutiérrez Mena, J., Kumar, S., Khammash, M. Dynamic cybergenetic control of bacterial co-culture composition via optogenetic feedback. Nature Communications. 13, 4808 (2022).
- Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
- Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546 (2016).
- Bertaux, F., et al. Enhancing bioreactor arrays for automated measurements and reactive control with ReacSight. Nature Communications. 13 (1), 3363 (2022).
- Benisch, M., Benzinger, D., Kumar, S., Hu, H., Khammash, M. Optogenetic closed-loop feedback control of the unfolded protein response optimizes protein production. Metabolic Engineering. 77, 32-40 (2023).
- Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative Biology. 6 (3), 366-372 (2014).
- Datta, S., et al. High-throughput feedback-enabled optogenetic stimulation and spectroscopy in microwell plates. bioRxiv. , (2022).
- Pouzet, S., et al. Optogenetic control of beta-carotene bioproduction in yeast across multiple lab-scales. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 11, 1085268 (2023).
- Pouzet, S., Banderas, A., Le Bec, M., Lautier, T., Truan, G., Hersen, P. The promise of optogenetics for bioproduction: dynamic control strategies and scale-up instruments. Bioengineering. 7 (4), 151 (2020).
