Summary
פרוטוקול זה מתאר את השלבים לשימוש בפלטפורמה האוטומטית Lustro לביצוע אפיון תפוקה גבוהה של מערכות אופטוגנטיות בשמרים.
Abstract
אופטוגנטיקה מציעה שליטה מדויקת על התנהגות התא על ידי שימוש בחלבונים רגישים לאור המקודדים גנטית. עם זאת, אופטימיזציה של מערכות אלה כדי להשיג את הפונקציונליות הרצויה דורשת לעתים קרובות מחזורי תכנון-בנייה-בדיקה מרובים, שיכולים לגזול זמן רב ולעבוד הרבה. כדי להתמודד עם אתגר זה, פיתחנו את Lustro, פלטפורמה המשלבת גירוי אור עם אוטומציה במעבדה, ומאפשרת סינון יעיל בתפוקה גבוהה ואפיון של מערכות אופטוגנטיות.
Lustro משתמשת בתחנת עבודה אוטומטית המצוידת במכשיר תאורה, מכשיר טלטול וקורא לוחות. על ידי שימוש בזרוע רובוטית, Lustro הופכת את התנועה של צלחת מיקרו-באר בין התקנים אלה לאוטומטית, ומאפשרת גירוי של זנים אופטוגנטיים ומדידת התגובה שלהם. פרוטוקול זה מספק מדריך שלב אחר שלב לשימוש ב- Lustro לאפיון מערכות אופטוגנטיות לבקרת ביטוי גנים בשמרים הניצנים Saccharomyces cerevisiae. הפרוטוקול מכסה את ההתקנה של רכיבי Lustro, כולל שילוב של התקן התאורה עם תחנת העבודה אוטומציה. הוא גם מספק הוראות מפורטות לתכנות מכשיר התאורה, קורא הלוחות והרובוט, ומבטיח פעולה חלקה ורכישת נתונים לאורך כל תהליך הניסוי.
Introduction
אופטוגנטיקה היא טכניקה רבת עוצמה המשתמשת בחלבונים רגישים לאור כדי לשלוט בהתנהגות התאים בדיוקגבוה 1,2,3. עם זאת, אב טיפוס של מבנים אופטוגנטיים וזיהוי תנאי תאורה אופטימליים יכולים לגזול זמן, מה שמקשה על אופטימיזציה של מערכות אופטוגנטיות 4,5. שיטות בעלות תפוקה גבוהה לסינון ואפיון מהיר של פעילות מערכות אופטוגנטיות יכולות להאיץ את מחזור התכנון-בנייה-בדיקה של מבני אב טיפוס וחקירת תפקודם.
פלטפורמת Lustro פותחה כטכניקת אוטומציה מעבדתית המיועדת לסינון ואפיון מערכות אופטוגנטיות בתפוקה גבוהה. הוא משלב קורא microplate, התקן תאורה ומכשיר רעידות עם תחנת עבודה אוטומציה6. Lustro משלבת תרבית אוטומטית וגירוי אור של תאים בלוחות מיקרו-בארות (איור 1 ואיור משלים 1), ומאפשרת סינון מהיר והשוואה של מערכות אופטוגנטיות שונות. פלטפורמת Lustro ניתנת להתאמה גבוהה וניתן להכליל אותה לעבודה עם רובוטים אחרים לאוטומציה במעבדה, התקני תאורה, קוראי לוחות, סוגי תאים ומערכות אופטוגנטיות, כולל אלה המגיבים לאורכי גל שונים של אור.
פרוטוקול זה מדגים את ההגדרה והשימוש בלוסטרו לאפיון מערכת אופטוגנטית. בקרה אופטוגנטית של גורמי שעתוק מפוצלים בשמרים משמשת כמערכת לדוגמה כדי להמחיש את הפונקציה והתועלת של הפלטפורמה על ידי חקירת הקשר בין קלט אור לבין ביטוי של גן כתב פלואורסצנטי, mScarlet-I7. על ידי ביצוע פרוטוקול זה, חוקרים יכולים לייעל את האופטימיזציה של מערכות אופטוגנטיות ולהאיץ את הגילוי של אסטרטגיות חדשות לבקרה דינמית של מערכות ביולוגיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
זני השמרים בהם נעשה שימוש במחקר זה מתועדים בטבלת החומרים. זנים אלה מציגים צמיחה חזקה בטווח הטמפרטורות של 22 °C (75 °F) עד 30 °C (75 °F) וניתן לגדל אותם במצעי שמרים סטנדרטיים שונים.
1. הגדרת תחנת העבודה לאוטומציה
- ציידו את תחנת העבודה האוטומטית בזרוע אחיזה רובוטית (RGA, ראו טבלת חומרים) המסוגלת להזיז לוחות מיקרו-באר (איור 1).
- התקינו שייקר מחמם מיקרו-פלטות (ראו טבלת חומרים) בתחנת העבודה האוטומטית (איור 1(1)) עם מנגנון נעילת לוחות אוטומטי המספק גישת RGA.
- מקם קורא מיקרו-לוחות בסמוך לתחנת העבודה האוטומטית (איור 1(2)), כדי להבטיח נגישות RGA.
- שלבו התקן תאורת מיקרו-פלטה (איור 1(3)) המאפשר גישה נוחה ל-RGA. דוגמאות לכך כוללות את optoPlate8 (כפי שנעשה בו שימוש במחקר זה) או LITOS9 (ראו טבלת חומרים).
2. הכנת מכשיר התאורה
- בנה וכייל את optoPlate (או התקן תאורה חלופי) בהתאם לשיטות מבוססות 8,10,11.
- השתמש במתאם בהתקן התאורה כדי לאפשר גישת RGA.
- תכנת את optoPlate באמצעות קלט גיליון אלקטרוני10 או ממשק גרפי12. בצע את שלב 3 כדי להפעיל את התוכניות לגירוי אור.
3. תכנון תוכנית לגירוי אור
- קבע את תנאי האור הרצויים לניסוי.
- הזן את תנאי האור הרצויים, כולל עוצמת האור, זמן התחלת האור, אורך הפולס, מספר הפולס ומשך האינטרפולס, לתוך גיליון אלקטרוני.
הערה: מהבהב מידע זה אל optoPlate באמצעות ההוראות המופיעות במאגר GitHub: github.com/mccleanlab/Optoplate-96. זכור כי צלחת הדגימה לא תהיה מוארת כאשר הוא נמצא בקורא microplate או על שייקר התנור. משך ותדירות האירועים הללו עשויים לדרוש אופטימיזציה בהתבסס על דרישות ניסוי ספציפיות. - כלול תנאים כהים עבור כל זן כדי לאפשר מדידות רקע נאותות.
- עבור ניסויי אפיון ראשוניים להערכת פונקציונליות טרנספורמנטית, השתמש בעוצמת אור גבוהה.
הערה: עוצמת האור צריכה להיות אופטימלית לניסויים רגישים יותר, מכיוון שעודף אור יכול להיות פוטוטוקסי לשמרים13.
4. הכנת קורא microplate
- הגדר את קורא המיקרו-צלחות כדי למדוד את כמות העניין הרצויה לפני ביצוע ניסויים.
הערה: בדוגמה זו, קורא המיקרו-צלחות הוגדר למדוד פלואורסצנטיות של כתב המובע על-ידי זן העניין. ניתן להשתמש ביציאות אחרות, כגון עוצמת אור או צפיפות אופטית, בהתאם לדרישות הניסוי. - טפח את הזן המעניין (יחד עם בקרה לא פלואורסצנטית) במדיה סינתטית שלמה (SC)14 (או מדיה פלואורסצנטית נמוכה אחרת) (ראה טבלת חומרים) לצפיפות התא הגבוהה ביותר שיש למדוד. העבירו את התרביות לצלחת מיקרווול בעלת תחתית זכוכית שחורה (ראו טבלת חומרים) ומדדו אותן כדי לקבוע את הגדרות קורא המיקרו-צלחות האופטימליות.
הערה: ודא קריאות מדויקות על-ידי הזנה נכונה של מידות הלוח ומדידת הלוח מלמטה. - עיין במסד נתונים של חלבונים פלואורסצנטיים (לדוגמה, fpbase.org) כדי לקבל ספקטרום בליעה ופליטה משוער עבור חלבון היעד הפלואורסצנטי15.
- קבע את ערך z (המרחק בין הלוח לקורא) על ידי ביצוע סריקת z על בארות המכילות את הזנים הפלואורסצנטיים והלא פלואורסצנטיים. בחר בערך z שמפיק את יחס האות לרעש הגבוה ביותר.
- מטב את ספקטרום הספיגה והפליטה על ידי ביצוע סריקות בליעה ופליטה על הזנים הפלואורסצנטיים והלא פלואורסצנטיים כדי לקבוע את יחס האות לרעש האופטימלי.
- מדוד את המאמץ הפלואורסצנטי עם הגדרת הרווח לרמה האופטימלית, וקבע את הרווח האופטי הגבוה ביותר שניתן להשתמש בו מבלי לגרום לשגיאת מדידת גלישה.
הערה: יש להגדיר רווח אופטי זה באופן ידני באופן עקבי בניסויים הכוללים את אותו זן כדי להבטיח עקביות של התוצאות. - הכינו סקריפט מדידה (ראו איור 2) בתוכנת קורא המיקרו-לוחות. סקריפט זה מגדיר את המכשיר למדידת הצפיפות האופטית של התרביות ואת ספקטרום הפלואורסצנטיות של כל החלבונים הפלואורסצנטיים שיש למדוד.
הערה: מדוד את הצפיפות האופטית של זנים ב- 600 ננומטר, אלא אם כן הם מבטאים חלבונים פלואורסצנטיים אדומים. עבור זנים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים אדומים, מדדו את הצפיפות האופטית ב-700 ננומטר כדי למנוע הטיה16. - הגדר את סקריפט המדידה כדי לשמור על טמפרטורת דגירה פנימית של 30 ° C במהלך המדידות.
- הגדר את סקריפט המדידה לייצוא הנתונים לגיליון אלקטרוני או לקובצי ASCII, בהתאם להעדפה.
5. תכנות הרובוט
- הגדר את הגדרת שולחן העבודה בתוכנת תחנת העבודה האוטומטית בהתבסס על הפריסה הפיזית של המנשאים (לדוגמה, מטלטלי חימום, פלטפורמות קן, התקני תאורה) וכלי המעבדה (כלומר, צלחת 96 הקידוחים) (ראה טבלת חומרים). צור סקריפט בתוכנת תחנת העבודה לאוטומציה כדי לבצע אינדוקציה ומדידות של אור (איור 3), לפי השלבים הבאים.
- השבת מקורות תאורה פנימיים כדי למנוע הפעלת רקע של מערכות אופטוגנטיות.
- כוונו את שייקר החימום כך שישמור על טמפרטורה של 30°C. כאשר הצלחת אינה על שייקר החימום, היא תהיה בטמפרטורת הסביבה (22 מעלות צלזיוס).
- השתמש בלולאות, טיימר ומשתנה ספירת לולאה כדי לחזור על השלבים של השראת התאים ומדידתם במרווחי זמן קבועים.
- לפני הקלטת המדידות, נערו את צלחת הדגימה כדי להבטיח השעיה נאותה של כל התאים. רעידה של 60 שניות ב-1,000 סל"ד עם אורביטל של 2 מ"מ מספיקה בדרך כלל כדי להשהות מחדש את תאי S288C S. cerevisiae ולמנוע הטיית מדידה.
- העבר את לוחית הדגימה לקורא המיקרו-לוחות באמצעות זרוע הרובוט והסר את המכסה (אם רלוונטי) כדי למנוע הטיה במדידת צפיפות אופטית. תוכנת הבקרה תסיר ותחליף באופן אוטומטי את המכסה למיקום המיועד אם הגדרת הנשא של קורא המיקרו-לוחות מוגדרת כלא לאפשר מכסים.
- הפעל את סקריפט המדידה של קורא לוחות המיקרו כמתואר בשלב 4.
- החלף את המכסה בלוח הדגימה והזז את הצלחת להתקן התאורה באמצעות זרוע הרובוט.
- הגדר את הסקריפט להמתין עד שהטיימר יגיע למרווח הזמן שצוין (לדוגמה, 30 דקות כפול משתנה ספירת הלולאה) ולאחר מכן חזור על הלולאה כולה עבור מספר האיטרציות הרצוי (לדוגמה, 48 פעמים עבור ניסוי של 24 שעות).
- פתור בעיות של שגיאות פוטנציאליות וודא את התפקוד התקין של הגדרות המוביל וכלי המעבדה, כמו גם את היכולת של ה- RGB להרים ולמקם את הצלחת במדויק על ידי הפעלת צלחת ריקה דרך לולאת הסקריפט מספר פעמים.
- הגדר התראות משתמש כדי להודיע למשתמש על כל שינוי במצב המכשיר או שגיאות שעלולות להתרחש במהלך ביצוע הפרוטוקול.
6. הגדרת צלחת הדגימה
- גדלו זני שמרים על צלחות מדיה עשירות, כגון אגר YPD17 (ראו טבלת חומרים). כלול פקד שאינו פלואורסצנטי (שלילי).
- בחרו מושבות מהלוחות וחסנו אותן ל-3 מ"ל של מדיה SC14 (או מדיה פלואורסצנטית נמוכה אחרת, כגון LFM18) בצינורות תרבית זכוכית. יש לדגור על התרביות למשך הלילה בטמפרטורה של 30°C על תוף רולר תוך שמירה עליהן בחושך או בתנאי תאורה שאינם מגיבים (למשל, אור אדום עבור מערכות המגיבות לאור כחול).
- מדוד את הצפיפות האופטית של תרביות הלילה על-ידי דילול 200 μL מכל תרבית ל-1 מ"ל של מדיית SC והקלטת הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר (OD600) באמצעות ספקטרופוטומטר או קורא מיקרו-לוחות.
- יש לדלל כל תרבית לילה ל-OD600 של 0.1 בצינורות תרבית זכוכית. לבדיקת מאמץ בתפוקה גבוהה יותר, בצעו דילולים אוטומטיים בלוחות מיקרו-באר.
- פיפטה את התרבויות המדוללות לתוך צלחת 96 בארות. כלול בארות משולשות עבור כל מצב (כלומר, שלוש בארות זהות עם אותו זן ומצב קל) כדי לקחת בחשבון את השונות הטכנית. כלול בארות עם מדיה ריקה ותאים שאינם פלואורסצנטיים כבקרות שליליות למדידת פלואורסצנטיות רקע וצפיפות אופטית.
- יש לדגור על הצלחת בטמפרטורה של 30°C תוך טלטול במשך 5 שעות לפני תחילת ניסוי השראת האור. התאימו את כמויות הדילול וזמני הדגירה לפי הצורך כדי למטב זנים ספציפיים ותנאי ניסוי.
7. ביצוע הניסוי
- הניחו את צלחת הדגימה על שייקר החימום והפעילו את סקריפט האוטומציה כמתואר בשלב 5.
- התחל את תוכנית גירוי האור כמתואר בשלב 3 לאחר הקלטת המדידה הראשונית בקורא הלוחות.
- אם תחנת העבודה לאוטומציה אינה נמצאת בחדר חשוך, כסו אותה בווילון האפלה כדי למנוע תאורת רקע.
8. ניתוח נתונים
- צור מפת גיליון אלקטרוני עבור הניסוי, המשקפת את הפריסה של 8 x 12 של לוח 96 בארות. ודא שהמפה כוללת את שמות הזנים הנמדדים ברשת אחת ותיאורים של תנאי האור המשמשים ברשת אחרת.
- השתמש בסקריפט Python או בשפת תכנות מועדפת אחרת כדי לנתח את הנתונים המיוצאים. יבא את הגיליון האלקטרוני של המפה למערך, תוך שיוך שמות הזנים ושמות התנאים לכל באר של הלוח.
הערה: ניתן למצוא קוד לדוגמה לניתוח בכתובת: https://github.com/mccleanlab/Lustro. לחילופין, ניתן להשתמש באפליקציה לניתוח נתונים מקוראי לוחות שונים19. - קרא את הנתונים מהגיליון האלקטרוני של הניסוי המיוצא למערך אחר.
- צור חלקות של ערכי הצפיפות האופטית וערכי הפלואורסצנטיות עבור כל זן ומצב לאורך זמן, כפי שמודגם באיור 4.
- בחן את תרשימי הצפיפות האופטית כדי לקבוע את שלבי הצמיחה או הרוויה המעריכית בתרבויות. מידע זה יסייע בבחירת נקודות זמן מתאימות להשוואת מדידות פלואורסצנטיות בין זנים או תנאים, כפי שמתואר באיור 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 4A מראה את הערכים הפלואורסצנטיים לאורך זמן עבור זן אופטוגנטי המבטא כתב פלואורסצנטי הנשלט על-ידי גורם שעתוק מפוצל הניתן להשראת אור. תנאי האור השונים המשמשים בניסוי משתקפים על ידי שינויים במחזור העבודה, המייצג את אחוז הזמן שבו האור דולק. רמת הפלואורסצנטיות הכוללת נצפתה פרופורציונלית למחזור העבודה של גירוי האור. איור 4B מציג את ערכי OD700 המתאימים עבור אותו ניסוי. העקביות של קריאות הצפיפות האופטית על פני תנאי אור שונים מצביעה על כך שטכניקת הניסוי אינה משפיעה באופן משמעותי על קצב הגידול של הזנים בתנאי אור משתנים.
על ידי מדידת פלואורסצנטיות וצפיפות אופטית לאורך זמן, ניתן להשיג הבנה עמוקה יותר של האופן שבו מערכות אופטוגנטיות מגיבות לתוכניות גירוי אור שונות בהשוואה לטכניקות שלוכדות פלט רק בנקודת זמן אחת. נתוני מסלול זמן אלה הם בעלי ערך לבחירת נקודות זמן ספציפיות להשוואה בין זנים ותנאים שונים. איור 5 מדגים נקודת זמן אחת (שנמדדה ב-10 שעות לתוך השראת אור) עבור שני זנים אופטוגנטיים נפרדים המושרים על-ידי תוכניות שונות לגירוי אור. שני הזנים משתמשים בגורם שעתוק מפוצל המושרה לאור כדי להניע את הביטוי של כתב פלורסנט. שינויים בעוצמת פעימות האור, בתקופה ובמחזור העבודה מעוררים תגובות שונות בזנים אלה.
איור 1: פריסת שולחן עבודה וזרימת עבודה ניסיונית. צילום מסך של פריסת שולחן עבודה לדוגמה, המציין את תנועת לוח הדגימה ב- Lustro. הצלחת מועברת על ידי הזרוע הרובוטית משייקר חימום (1) לקורא המיקרו-צלחות (2), ולאחר מכן למכשיר התאורה (3). הצילומים מופיעים באיור משלים 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: סקריפט מדידה של קורא לוחות. צילום מסך לדוגמה של סקריפט קורא לוחות המגדיר את קורא המיקרו-לוחות לדגור ב- 30°C ולתעד מדידות פלואורסצנטיות וצפיפות אופטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: סקריפט אוטומטי של תחנת עבודה. צילום מסך לדוגמה של סקריפט אוטומטי של תחנת עבודה עבור Lustro. הסקריפט מפעיל טיימר, מוודא שהאור הפנימי כבוי, מגדיר משתנה ספירת לולאה לערך התחלתי של 0, ומגדיר את שייקר החימום לדגירת 30 מעלות צלזיוס. בתוך כל לולאה, הצלחת ננעלת, מזועזעת למשך דקה, מועברת לקורא הצלחות, נמדדת, ואז מועברת למכשיר התאורה, והרובוט מוגדר להמתין לשארית מרווח הלולאה של 30 דקות. בסוף זמן זה, משתנה מונה הלולאה גדל באחד, והלולאה חוזרת על עצמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: קורס זמן אינדוקציה. דגימת נתוני מסלול זמן השראת אור מזן גורם שעתוק מפוצל Gal4BD-eMagA/eMagB-Gal4AD עם כתב pGAL1-mScarlet-I (yMM17346). פלואורסצנטיות של mScarlet-I7 נמדדת בעירור של 563 ננומטר ופליטה של 606 ננומטר עם רווח אופטי של 130. עוצמת האור היא 125 μW/cm2 וקווי שגיאה מייצגים את שגיאת התקן של דגימות משולשות. הקו המקווקו האדום האנכי מראה מתי תרבויות מגיעות לרוויה. (A) ערכי פלואורסצנטיות מהזן לאורך זמן. דפוסי האור (כפי שצוין) חזרו על עצמם במשך כל הניסוי המוצג. הכניסה מראה כי זמני פעימות האור משולבים עם זמני פעימות כהות, החוזרים על עצמם לאורך כל החקירה. (B) ערכי צפיפות אופטית (נמדדת ב-700 ננומטר) עבור הניסוי המוצג ב-(A). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: השוואה בין מערכות אופטוגנטיות שונות. השוואה בין תוכניות שונות להשראת אור בין זני גורמי שעתוק מפוצלים מסוג CRY2(535)/CIB1 ו-eMagA/eMagBM עם כתבי pGAL1-mScarlet-I (yMM1763 ו-yMM17656, בהתאמה). פלואורסצנטיות של mScarlet-I7 נמדדת בעירור של 563 ננומטר ופליטה של 606 ננומטר עם רווח אופטי של 130. עוצמת האור בשימוש היא 125 μW/cm2, אלא אם צוין אחרת. קווי שגיאה מייצגים את שגיאת התקן של דגימות משולשות (מסומנות כנקודות). ערכי הפלואורסצנטיות המוצגים נרשמו 10 שעות לאחר האינדוקציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1: תמונות מייצגות של המכשירים המשמשים ב-Lustro. תמונה של הגדרת Lustro ותמונות מוגדלות של המכשירים שבהם נעשה שימוש. הזרוע הרובוטית מעבירה את צלחת הדגימה משייקר החימום לקורא הצלחות ולאחר מכן למכשיר התאורה במחזור לאורך כל הניסוי. הרכיבים ממוספרים עם מקרא בצד. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול Lustro המוצג כאן הופך את תהליכי הגידול, ההארה והמדידה לאוטומטיים, ומאפשר סינון ואפיון של מערכות אופטוגנטיותבתפוקה גבוהה 6. זה מושג על ידי שילוב התקן תאורה, קורא microplate, ומכשיר טלטול לתוך תחנת עבודה אוטומציה. פרוטוקול זה מדגים באופן ספציפי את התועלת של Lustro לסינון מבנים אופטוגנטיים שונים המשולבים בשמרים S. cerevisiae ולהשוואת תוכניות השראת אור.
מספר צעדים מכריעים המודגשים בפרוטוקול זה חיוניים לניצול יעיל של Lustro. יש צורך בתכנון זהיר של תוכניות אור מותאמות אישית התואמות את הקינטיקה של המבנה האופטוגנטי הנחקר. בנוסף, כיול מדויק של קורא הלוחות חיוני לקבלת מדידות אמינות. ריצות יבשות ויסודיות של הניסויים ברובוט, כולל התאמות הכרחיות כדי להבטיח סנכרון נכון עם תוכניות התאורה, הן קריטיות כדי להבטיח שהתסריט יפעל בצורה חלקה.
פרוטוקול הדגימה המובא כאן מתאר השוואה של גורם שעתוק מפוצל המושרה לאור המניע את הביטוי של כתב פלואורסצנטי לבקרה שאינה פלואורסצנטית בתנאי גירוי אור שונים. מדידות פלואורסצנטיות נלקחות מכל באר בצלחת במרווחים של 30 דקות, ולפניה דקה אחת של ניעור על שייקר החימום לפני המדידה. כפי שהוכח בפרוטוקול זה, Lustro מתאים לשימוש עם מערכות אופטוגנטיות המגיבות לאור כחול המשולבות בסוגי תאים שאינם דבקים, כולל חיידקים ושמרים אחרים. עם זאת, עם שינויים קלים, ניתן להרחיב את הפרוטוקול בקלות לסוגי תאים שונים, מערכות אופטוגנטיות ותכנונים ניסיוניים. התאמות להגדרות קורא הלוחות יאפשרו מדידה של פלטים שאינם פלואורסצנטיים, כגון ביולומינסנציה. עבור יישומים הדורשים רזולוציה זמנית עדינה יותר, ניתן לבצע מדידות בתדירות גבוהה יותר. ניתן לחזור על הדגירה על שייקר החימום לעתים קרובות יותר כאשר הדבר קריטי עבור סוגי תאים ספציפיים הדורשים ניעור ובקרת טמפרטורה. שילוב של גז ובקרה סביבתית, למשל באמצעות מלון מודגר, יאפשר הכללת קווי תאים של יונקים. בעוד האיטרציה של Lustro המתוארת כאן משתמשת במכשור ספציפי, פלטפורמת Lustro יכולה להיות מותאמת בקלות לעבודה עם רובוטים אוטומציה מעבדה אחרים או קוראי microplate. מכשירי תאורה, כגון LPA20 או LITOS9, יכולים להחליף את optoPlate כדי לעורר מערכות אופטוגנטיות שונות. שינוי עתידי של פלטפורמת Lustro עשוי לכלול שילוב טיפול בנוזלים כדי להקל על דילולים אוטומטיים עבור יישומי תרבית רציפה. זה גם יאפשר להתאים את Lustro לבקרת משוב סייברגנטי, שבה מדידות בזמן אמת מודיעות על שינויים בתנאי אור או תרבית כדי להשיג או לשמור על התגובה הרצויה 5,21,22.
טכניקות בעלות תפוקה גבוהה חיוניות לאופטימיזציה ולרתימה של האופי הדינמי של מערכות אופטוגנטיות. Lustro מתגברת על מגבלות רבות של פרוטוקולים קיימים. לדוגמה, בעוד שטכניקות אופטוגנטיקה מבוססות ביוריאקטור מאפשרות קריאה מתמדת ותנאי תרבית, הם סובלים מתפוקות נמוכות 23,24,25,26. מכשיר optoPlateReader27 טומן בחובו הבטחה לניסויים באופטוגנטיקה בזמן אמת בצלחות מיקרו-באר, אך כיום יש לו תפוקה נמוכה בשל הצורך במספר גבוה של עותקים משוכפלים כדי להשיג תוצאות אמינות ואינו מספק גישה לתרבית רציפה. לוסטרו, לעומת זאת, מאפשרת סריקה בתפוקה גבוהה של מערכות אופטוגנטיות כדי לאפיין את פעילותן הדינמית. עם זאת, ישנן כמה מגבלות לפרוטוקול Lustro. טלטול לסירוגין בלוסטרו גורם לפיגור גדילה קטן עבור תאי שמרים6, אך ניתן לטפל בכך על ידי התאמת מכשיר תאורה כך שישלב רעידות. מגבלה נוספת של מערכת Lustro היא שלוח הדגימה אינו מודגר בזמן שהוא נמצא במכשיר התאורה ונשמר בטמפרטורת הסביבה (22 מעלות צלזיוס). למרות שהנפח הקטן של כל דגימה מאפשר מסכים בעלי תפוקה גבוהה, ייתכן שיהיה צורך באופטימיזציה נוספת של שלבי התאורה בעת שינוי קנה מידה לנפחי תגובה גדולים יותר עבור ייצור ביולוגי או יישומים אחרים28,29.
בסך הכל, Lustro מאפשרת פיתוח ובדיקה מהירים של מערכות אופטוגנטיות באמצעות סינון בתפוקה גבוהה ובקרת אור מדויקת. גישה אוטומטית זו מאפשרת אפיון והשוואה יעילים של מבנים אופטוגנטיים שונים בתנאי אינדוקציה שונים, מה שמוביל לאיטרציה ושכלול מהירים יותר של מערכות אלו. עם יכולת ההסתגלות שלה לסוגי תאים שונים, כלים אופטוגנטיים ומערכי אוטומציה, Lustro סוללת את הדרך להתקדמות בתחום האופטוגנטיקה, מקלה על חקר בקרת ביטוי גנים דינמית ומרחיבה את האפשרויות לחקר רשתות ביולוגיות והנדסת התנהגות תאית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי R35GM128873 המענקים של המכונים הלאומיים לבריאות והקרן הלאומית למדע 2045493 (שהוענקה ל-M.N.M). מייגן ניקול מקלין, Ph.D. מחזיקה בפרס קריירה בממשק המדעי מקרן Burroughs Wellcome. Z.P.H. נתמך על ידי מענק הכשרה של NHGRI לתוכנית ההכשרה למדעים גנומיים 5T32HG002760. אנו מודים על דיונים פוריים עם חברי מעבדת McClean, ובמיוחד, אנו אסירי תודה לקירן סוויני על מתן הערות על כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well glass bottom plate with #1.5 cover glass | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| BioShake 3000-T elm (heater shaker) | QINSTRUMENTS | ||
| Fluent Automation Workstation | Tecan | ||
| LITOS (alternative illumination device) | Hohener, et al. Scientific Reports. 2022 | ||
| optoPlate-96 (illumination device) | Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019 | ||
| Robotic Gripper Arm | Tecan | ||
| Spark (plate reader) | Tecan | ||
| Synthetic Complete media | SigmaAldrich | Y1250 | |
| Tecan Connect (user alert app) | Tecan | ||
| yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| YPD Agar | SigmaAldrich | Y1500 |
References
- Pérez, A. L. A., et al. Optogenetic strategies for the control of gene expression in yeasts. Biotechnology Advances. 54, 107839 (2022).
- Lan, T. -H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering. Trends in Genetics. 38 (12), 1253-1270 (2022).
- Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature Chemical Biology. 10, 502-511 (2014).
- Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo Activities of Light Inducible Dimers: a Cellular Optogenetics Guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
- Scott, T. D., Sweeney, K., McClean, M. N. Biological signal generators: integrating synthetic biology tools and in silico control. Current Opinion in Systems Biology. 14, 58-65 (2019).
- Harmer, Z. P., McClean, M. N. Lustro: High-throughput optogenetic experiments enabled by automation and a yeast optogenetic toolkit. ACS Synthetic Biology. 12 (7), 1943-1951 (2023).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
- Höhener, T. C., Landolt, A. E., Dessauges, C., Hinderling, L., Gagliardi, P. A., Pertz, O. LITOS: a versatile LED illumination tool for optogenetic stimulation. Scientific Reports. 12 (1), 13139 (2022).
- Grødem, E. O., Sweeney, K., McClean, M. N. Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments. BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).
- Dunlop, M. J. A supplemental guide to building the optoPlate-96. , https://www.protocols.io/view/a-supplemental-guide-to-building-the-optoplate-96-b2vwqe7e (2021).
- Thomas, O. S., Hörner, M., Weber, W. A graphical user interface to design high-throughput optogenetic experiments with the optoPlate-96. Nature Protocols. 15 (9), 2785-2787 (2020).
- Robertson, J. B., Davis, C. R., Johnson, C. H. Visible light alters yeast metabolic rhythms by inhibiting respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21130-21135 (2013).
- Synthetic Complete (SC) Medium. 2016 (11), Cold Spring Harbor Protocols. (2016).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
- Hecht, A., Endy, D., Salit, M., Munson, M. S. When wavelengths collide: bias in cell abundance measurements due to expressed fluorescent proteins. ACS Synthetic Biology. 5 (9), 1024-1027 (2016).
- YPD media. 2010 (9), Cold Spring Harbor Protocols. (2010).
- Low-Fluorescence Yeast Nitrogen Base without Riboflavin and Folic Acid Medium (LFM). 2016 (11), Cold Spring Harbor. (2016).
- Csibra, E., Stan, G. -B. Parsley: a web app for parsing data from plate readers. Zenodo. , (2023).
- Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6 (1), 35363 (2016).
- Gutiérrez Mena, J., Kumar, S., Khammash, M. Dynamic cybergenetic control of bacterial co-culture composition via optogenetic feedback. Nature Communications. 13, 4808 (2022).
- Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
- Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546 (2016).
- Bertaux, F., et al. Enhancing bioreactor arrays for automated measurements and reactive control with ReacSight. Nature Communications. 13 (1), 3363 (2022).
- Benisch, M., Benzinger, D., Kumar, S., Hu, H., Khammash, M. Optogenetic closed-loop feedback control of the unfolded protein response optimizes protein production. Metabolic Engineering. 77, 32-40 (2023).
- Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative Biology. 6 (3), 366-372 (2014).
- Datta, S., et al. High-throughput feedback-enabled optogenetic stimulation and spectroscopy in microwell plates. bioRxiv. , (2022).
- Pouzet, S., et al. Optogenetic control of beta-carotene bioproduction in yeast across multiple lab-scales. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 11, 1085268 (2023).
- Pouzet, S., Banderas, A., Le Bec, M., Lautier, T., Truan, G., Hersen, P. The promise of optogenetics for bioproduction: dynamic control strategies and scale-up instruments. Bioengineering. 7 (4), 151 (2020).
