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Bioengineering

स्वचालित प्लेटफ़ॉर्म लस्ट्रो का उपयोग करके खमीर में उच्च-थ्रूपुट ऑप्टोजेनेटिक्स प्रयोग

Published: August 4, 2023 doi: 10.3791/65686
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 2University of Wisconsin Carbone Cancer Center, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health

Summary

यह प्रोटोकॉल खमीर में ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम के उच्च-थ्रूपुट लक्षण वर्णन करने के लिए स्वचालित प्लेटफ़ॉर्म लस्ट्रो का उपयोग करने के लिए चरणों को रेखांकित करता है।

Abstract

ऑप्टोजेनेटिक्स आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड प्रकाश-संवेदनशील प्रोटीन का उपयोग करके सेलुलर व्यवहार पर सटीक नियंत्रण प्रदान करता है। हालांकि, वांछित कार्यक्षमता प्राप्त करने के लिए इन प्रणालियों को अनुकूलित करने के लिए अक्सर कई डिजाइन-बिल्ड-टेस्ट चक्रों की आवश्यकता होती है, जो समय लेने वाली और श्रम-गहन हो सकती हैं। इस चुनौती का समाधान करने के लिए, हमने लस्ट्रो विकसित किया है, एक मंच जो प्रयोगशाला स्वचालन के साथ प्रकाश उत्तेजना को जोड़ता है, जिससे ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम के कुशल उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग और लक्षण वर्णन को सक्षम किया जा सकता है।

लस्ट्रो एक रोशनी उपकरण, एक हिलाने वाले उपकरण और एक प्लेट रीडर से लैस एक स्वचालन वर्कस्टेशन का उपयोग करता है। एक रोबोट हाथ को नियोजित करके, लस्ट्रो इन उपकरणों के बीच एक माइक्रोवेल प्लेट की गति को स्वचालित करता है, जिससे ऑप्टोजेनेटिक उपभेदों की उत्तेजना और उनकी प्रतिक्रिया के माप की अनुमति मिलती है। यह प्रोटोकॉल नवोदित खमीर सैकरोमाइसेस सेरेविसिया में जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण के लिए ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम को चिह्नित करने के लिए लस्ट्रो का उपयोग करने पर एक चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका प्रदान करता है। प्रोटोकॉल में स्वचालन वर्कस्टेशन के साथ रोशनी डिवाइस के एकीकरण सहित लस्ट्रो के घटकों का सेटअप शामिल है। यह रोशनी डिवाइस, प्लेट रीडर और रोबोट की प्रोग्रामिंग के लिए विस्तृत निर्देश भी प्रदान करता है, जो प्रयोगात्मक प्रक्रिया के दौरान सुचारू संचालन और डेटा अधिग्रहण सुनिश्चित करता है।

Introduction

ऑप्टोजेनेटिक्स एक शक्तिशाली तकनीक है जो उच्च परिशुद्धता 1,2,3 के साथ कोशिकाओं के व्यवहार को नियंत्रित करने के लिए प्रकाश-संवेदनशील प्रोटीन का उपयोग करती है। हालांकि, प्रोटोटाइप ऑप्टोजेनेटिक संरचनाओं और इष्टतम रोशनी की स्थिति की पहचान करना समय लेने वाला हो सकता है, जिससे ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम 4,5 को अनुकूलित करना मुश्किल हो जाता है। ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम की गतिविधि को तेजी से स्क्रीन और चिह्नित करने के लिए उच्च-थ्रूपुट विधियां प्रोटोटाइप संरचनाओं के लिए डिजाइन-बिल्ड-टेस्ट चक्र में तेजी ला सकती हैं और उनके कार्य की खोज कर सकती हैं।

लस्ट्रो प्लेटफॉर्म को एक प्रयोगशाला स्वचालन तकनीक के रूप में विकसित किया गया था जिसे ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम के उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग और लक्षण वर्णन के लिए डिज़ाइन किया गया था। यह एक स्वचालन वर्कस्टेशन6 के साथ एक माइक्रोप्लेट रीडर, रोशनी डिवाइस और हिलाने वाले डिवाइस को एकीकृत करता है। लस्ट्रो माइक्रोवेल प्लेटों (चित्रा 1 और पूरक चित्रा 1) में कोशिकाओं के स्वचालित संवर्धन और प्रकाश उत्तेजना को जोड़ती है, जिससे विभिन्न ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम की तेजी से स्क्रीनिंग और तुलना संभव होती है। लस्ट्रो प्लेटफॉर्म अत्यधिक अनुकूलनीय है और इसे अन्य प्रयोगशाला स्वचालन रोबोट, रोशनी उपकरणों, प्लेट रीडर, सेल प्रकार और ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम के साथ काम करने के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है, जिसमें प्रकाश के विभिन्न तरंग दैर्ध्य के लिए उत्तरदायी शामिल हैं।

यह प्रोटोकॉल एक ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम को चिह्नित करने के लिए लस्ट्रो के सेटअप और उपयोग को दर्शाता है। खमीर में विभाजित प्रतिलेखन कारकों के ऑप्टोजेनेटिक नियंत्रण का उपयोग प्रकाश इनपुट और फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन, एमस्कारलेट-आई7 की अभिव्यक्ति के बीच संबंधों की जांच करके मंच के कार्य और उपयोगिता को चित्रित करने के लिए एक उदाहरण प्रणाली के रूप में किया जाता है। इस प्रोटोकॉल का पालन करके, शोधकर्ता ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम के अनुकूलन को सुव्यवस्थित कर सकते हैं और जैविक प्रणालियों के गतिशील नियंत्रण के लिए नई रणनीतियों की खोज में तेजी ला सकते हैं।

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Protocol

इस अध्ययन में उपयोग किए गए खमीर उपभेदों को सामग्री की तालिका में प्रलेखित किया गया है। ये उपभेद 22 डिग्री सेल्सियस से 30 डिग्री सेल्सियस की तापमान सीमा के भीतर मजबूत विकास प्रदर्शित करते हैं और विभिन्न मानक खमीर मीडिया में खेती की जा सकती है।

1. स्वचालन वर्कस्टेशन स्थापित करना

  1. स्वचालित वर्कस्टेशन को रोबोटिक ग्रिपर आर्म (आरजीए, सामग्री की तालिका देखें) के साथ लैस करें जो माइक्रोवेल प्लेटों को स्थानांतरित करने में सक्षम है (चित्रा 1)।
  2. स्वचालित प्लेट लॉकिंग तंत्र के साथ स्वचालित वर्कस्टेशन (चित्रा 1 (1)) में एक माइक्रोप्लेट हीटर शेकर (सामग्री की तालिका देखें) स्थापित करें जो आरजीए पहुंच प्रदान करता है।
  3. स्वचालित वर्कस्टेशन (चित्रा 1 (2)) से सटे एक माइक्रोप्लेट रीडर को रखें, जिससे आरजीए पहुंच सुनिश्चित हो।
  4. एक माइक्रोप्लेट रोशनी डिवाइस (चित्रा 1 (3)) को शामिल करें जो सुविधाजनक आरजीए पहुंच की अनुमति देता है। उदाहरणों में ऑप्टोप्लेट8 (जैसा कि इस अध्ययन में उपयोग किया गया है) या लिटोस9 (सामग्री की तालिका देखें) शामिल हैं।

2. रोशनी उपकरण की तैयारी

  1. स्थापित विधियों 8,10,11 का पालन करते हुए ऑप्टोप्लेट (या वैकल्पिक रोशनी डिवाइस) का निर्माण और कैलिब्रेट करें।
  2. आरजीए पहुंच को सक्षम करने के लिए रोशनी डिवाइस पर एक एडाप्टर का उपयोग करें।
  3. स्प्रेडशीट इनपुट10 या ग्राफिकल इंटरफ़ेस12 का उपयोग करके ऑप्टोप्लेट प्रोग्राम करें। प्रकाश उत्तेजना कार्यक्रमों को निष्पादित करने के लिए चरण 3 का पालन करें।

3. एक प्रकाश उत्तेजना कार्यक्रम डिजाइन करना

  1. प्रयोग के लिए वांछित प्रकाश स्थितियों का निर्धारण करें।
  2. स्प्रेडशीट में प्रकाश तीव्रता, प्रकाश प्रारंभ समय, पल्स लंबाई, पल्स संख्या और इंटरपल्स अवधि सहित वांछित प्रकाश स्थितियां दर्ज करें।
    नोट: GitHub रिपॉजिटरी में दिए गए निर्देशों का उपयोग करके ऑप्टोप्लेट पर इस जानकारी को फ़्लैश करें: github.com/mccleanlab/Optoplate-96। याद रखें कि माइक्रोप्लेट रीडर में या हीटर शेकर पर नमूना प्लेट रोशन नहीं होगी। इन घटनाओं की अवधि और आवृत्ति को विशिष्ट प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के आधार पर अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।
  3. उचित पृष्ठभूमि माप को सक्षम करने के लिए प्रत्येक तनाव के लिए अंधेरे की स्थिति शामिल करें।
  4. ट्रांसफॉर्मेंट कार्यक्षमता का आकलन करने के लिए प्रारंभिक लक्षण वर्णन प्रयोगों के लिए, उच्च प्रकाश तीव्रता का उपयोग करें।
    नोट: प्रकाश की तीव्रता को अधिक संवेदनशील प्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, क्योंकि अत्यधिक प्रकाश खमीर13 के लिए फोटोटॉक्सिक हो सकता है।

4. माइक्रोप्लेट रीडर की तैयारी

  1. प्रयोगों का संचालन करने से पहले रुचि की वांछित मात्रा को मापने के लिए माइक्रोप्लेट रीडर को कॉन्फ़िगर करें।
    नोट: इस उदाहरण में, माइक्रोप्लेट रीडर को रुचि के तनाव द्वारा व्यक्त एक रिपोर्टर से प्रतिदीप्ति को मापने के लिए कॉन्फ़िगर किया गया था। अन्य आउटपुट, जैसे ल्यूमिनेसेंस या ऑप्टिकल घनत्व, प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. सिंथेटिक पूर्ण (एससी) मीडिया14 (या एक अन्य कम फ्लोरेसेंस मीडिया) ( सामग्री की तालिका देखें) में रुचि के तनाव (एक गैर-फ्लोरोसेंट नियंत्रण के साथ) को मापने के लिए उच्चतम सेल घनत्व की खेती करें। संस्कृतियों को ग्लास-बॉटम ब्लैक-वॉल्ड माइक्रोवेल प्लेट ( सामग्री की तालिका देखें) में स्थानांतरित करें और इष्टतम माइक्रोप्लेट रीडर सेटिंग्स निर्धारित करने के लिए उन्हें मापें।
    नोट: प्लेट आयामों को सही ढंग से दर्ज करके और नीचे से प्लेट को मापकर सटीक रीडिंग सुनिश्चित करें।
  3. लक्ष्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन15 के लिए अनुमानित अवशोषण और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन डेटाबेस (उदाहरण के लिए, fpbase.org) देखें।
  4. फ्लोरोसेंट और नॉनफ्लोरोसेंट उपभेदों वाले कुओं पर जेड-स्कैन करके जेड-वैल्यू (प्लेट और रीडर के बीच की दूरी) निर्धारित करें। उस z-मान का चयन करें जो उच्चतम सिग्नल-टू-शोर अनुपात उत्पन्न करता है।
  5. इष्टतम सिग्नल-टू-शोर अनुपात निर्धारित करने के लिए फ्लोरोसेंट और नॉनफ्लोरोसेंट उपभेदों पर अवशोषण और उत्सर्जन स्कैन का संचालन करके अवशोषण और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा का अनुकूलन करें।
  6. इष्टतम स्तर पर सेट किए गए लाभ के साथ फ्लोरोसेंट तनाव को मापें, उच्चतम ऑप्टिकल लाभ का निर्धारण करें जिसका उपयोग अतिप्रवाह माप त्रुटि के परिणामस्वरूप किया जा सकता है।
    नोट: परिणामों की स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए इस ऑप्टिकल लाभ को एक ही तनाव से जुड़े प्रयोगों में मैन्युअल रूप से लगातार सेट किया जाना चाहिए।
  7. माइक्रोप्लेट रीडर सॉफ्टवेयर में एक माप स्क्रिप्ट ( चित्रा 2 देखें) तैयार करें। यह स्क्रिप्ट उपकरणों को संस्कृतियों के ऑप्टिकल घनत्व और किसी भी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा को मापने के लिए कॉन्फ़िगर करती है।
    नोट: 600 एनएम पर उपभेदों के ऑप्टिकल घनत्व को मापें जब तक कि वे लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त न करें। लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने वाले उपभेदों के लिए, पूर्वाग्रहसे बचने के लिए 700 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व को मापें।
  8. माप के दौरान 30 डिग्री सेल्सियस के आंतरिक इनक्यूबेशन तापमान को बनाए रखने के लिए माप स्क्रिप्ट सेट करें।
  9. वरीयता के अनुसार, डेटा को स्प्रेडशीट या ASCII फ़ाइलों में निर्यात करने के लिए माप स्क्रिप्ट कॉन्फ़िगर करें।

5. रोबोट प्रोग्रामिंग

  1. वाहक (जैसे, हीटर शेकर्स, नेस्ट प्लेटफॉर्म, रोशनी उपकरण) और लैबवेयर (यानी, 96-वेल प्लेट) के भौतिक लेआउट के आधार पर स्वचालित वर्कस्टेशन सॉफ़्टवेयर में वर्कटेबल परिभाषा कॉन्फ़िगर करें ( सामग्री की तालिका देखें)। नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए प्रकाश प्रेरण और माप (चित्रा 3) को निष्पादित करने के लिए स्वचालन वर्कस्टेशन सॉफ़्टवेयर में एक स्क्रिप्ट बनाएं।
  2. ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम की पृष्ठभूमि सक्रियण को रोकने के लिए किसी भी आंतरिक रोशनी स्रोतों को अक्षम करें।
  3. 30 डिग्री सेल्सियस के तापमान को बनाए रखने के लिए हीटर शेकर सेट करें। जब प्लेट हीटर शेकर पर नहीं होती है, तो यह परिवेश के तापमान (22 डिग्री सेल्सियस) पर होगी।
  4. नियमित अंतराल पर कोशिकाओं को प्रेरित करने और मापने के चरणों को दोहराने के लिए लूप, एक टाइमर और एक लूप काउंटिंग चर का उपयोग करें।
  5. माप रिकॉर्ड करने से पहले, सभी कोशिकाओं के उचित निलंबन को सुनिश्चित करने के लिए नमूना प्लेट को हिलाएं। 2 मिमी कक्षीय के साथ 1,000 आरपीएम पर एक 60 एस शेक आम तौर पर एस 288 सी एस सेरेविसिया कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने और माप पूर्वाग्रह से बचने के लिए पर्याप्त है।
  6. रोबोट आर्म का उपयोग करके नमूना प्लेट को माइक्रोप्लेट रीडर पर ले जाएं और ऑप्टिकल घनत्व माप में पूर्वाग्रह को रोकने के लिए ढक्कन (यदि लागू हो) को हटा दें। यदि माइक्रोप्लेट रीडर वाहक परिभाषा ढक्कन की अनुमति नहीं देने के लिए सेट की गई है तो नियंत्रण सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से ढक्कन को हटा देगा और निर्दिष्ट स्थिति में बदल देगा।
  7. चरण 4 में वर्णित माइक्रोप्लेट रीडर माप स्क्रिप्ट निष्पादित करें।
  8. नमूना प्लेट पर ढक्कन बदलें और रोबोट हाथ का उपयोग करके प्लेट को रोशनी डिवाइस पर ले जाएं।
  9. स्क्रिप्ट को तब तक प्रतीक्षा करने के लिए सेट करें जब तक कि टाइमर निर्दिष्ट समय अंतराल तक नहीं पहुंच जाता (उदाहरण के लिए, लूप गिनती चर से 30 मिनट गुणा) और फिर पुनरावृत्तियों की वांछित संख्या के लिए पूरे लूप को दोहराएं (उदाहरण के लिए, 24 घंटे के प्रयोग के लिए 48 बार)।
  10. संभावित त्रुटियों का निवारण करें और वाहक और लैबवेयर परिभाषाओं के उचित कामकाज को सुनिश्चित करें, साथ ही स्क्रिप्ट लूप के माध्यम से कई बार खाली प्लेट चलाकर प्लेट को सही ढंग से उठाने और रखने की आरजीए की क्षमता।
  11. प्रोटोकॉल के निष्पादन के दौरान होने वाले किसी भी उपकरण स्थिति परिवर्तनों या त्रुटियों के उपयोगकर्ता को सूचित करने के लिए उपयोगकर्ता चेतावनियाँ कॉन्फ़िगर करें।

6. नमूना प्लेट सेट करना

  1. समृद्ध मीडिया प्लेटों पर खमीर उपभेदों को विकसित करें, जैसे कि वाईपीडी एगर17 ( सामग्री की तालिका देखें)। एक नॉनफ्लोरोसेंट (नकारात्मक) नियंत्रण शामिल करें।
  2. प्लेटों से कॉलोनियों का चयन करें और उन्हें ग्लास कल्चर ट्यूबों में एससी मीडिया14 (या एक और कम फ्लोरेसेंस मीडिया, जैसे एलएफएम18) के 3 एमएल में टीका लगाएं। संस्कृतियों को अंधेरे में या गैर-उत्तरदायी प्रकाश स्थितियों (जैसे, नीली प्रकाश-उत्तरदायी प्रणालियों के लिए लाल प्रकाश) के तहत रखते हुए रोलर ड्रम पर 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  3. प्रत्येक संस्कृति के 200 μL को SC मीडिया के 1 mL में पतला करके और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर या माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके 600 nm (OD600) पर ऑप्टिकल घनत्व रिकॉर्ड करके रातोंरात संस्कृतियों के ऑप्टिकल घनत्व को मापें।
  4. ग्लास कल्चर ट्यूबों में प्रत्येक रातोंरात संस्कृति को 0.1 के ओडी600 तक पतला करें। उच्च थ्रूपुट तनाव परीक्षण के लिए, माइक्रोवेल प्लेटों में स्वचालित कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें।
  5. पतला संस्कृतियों को 96-वेल प्लेट में पिपेट करें। तकनीकी भिन्नता को ध्यान में रखते हुए प्रत्येक स्थिति (यानी, एक ही तनाव और प्रकाश की स्थिति वाले तीन समान कुएं) के लिए तीन प्रतियों वाले कुओं को शामिल करें। पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति और ऑप्टिकल घनत्व को मापने के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में रिक्त मीडिया और नॉनफ्लोरोसेंट कोशिकाओं वाले कुओं को शामिल करें।
  6. प्रकाश प्रेरण प्रयोग शुरू करने से पहले प्लेट को 5 घंटे के लिए हिलाने के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। विशिष्ट उपभेदों और प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए अनुकूलित करने के लिए आवश्यक रूप से कमजोर पड़ने की मात्रा और इनक्यूबेशन समय समायोजित करें।

7. प्रयोग करना

  1. हीटर शेकर पर नमूना प्लेट रखें और चरण 5 में उल्लिखित स्वचालन स्क्रिप्ट शुरू करें।
  2. प्लेट रीडर पर प्रारंभिक माप दर्ज होने के बाद चरण 3 में वर्णित प्रकाश उत्तेजना कार्यक्रम शुरू करें।
  3. यदि स्वचालन वर्कस्टेशन एक अंधेरे कमरे में नहीं है, तो पृष्ठभूमि रोशनी से बचने के लिए इसे ब्लैकआउट पर्दे के साथ कवर करें।

8. डेटा विश्लेषण

  1. प्रयोग के लिए एक स्प्रेडशीट मानचित्र बनाएं, जो 96-वेल प्लेट के 8 x 12 लेआउट को दर्शाता है। सुनिश्चित करें कि मानचित्र में एक ग्रिड में मापा जा रहा उपभेदों के नाम और दूसरे ग्रिड में उपयोग की जाने वाली प्रकाश स्थितियों का विवरण शामिल है।
  2. निर्यात किए गए डेटा का विश्लेषण करने के लिए पायथन स्क्रिप्ट या किसी अन्य पसंदीदा प्रोग्रामिंग भाषा का उपयोग करें। प्लेट के प्रत्येक कुएं के साथ तनाव नामों और स्थिति नामों को जोड़ते हुए, मानचित्र स्प्रेडशीट को एक सरणी में आयात करें।
    नोट: विश्लेषण के लिए नमूना कोड पाया जा सकता है: https://github.com/mccleanlab/Lustro. वैकल्पिक रूप से, कोई विभिन्न प्लेट रीडर19 से डेटा पार्स करने के लिए एक एप्लिकेशन को नियोजित कर सकता है।
  3. निर्यात किए गए प्रयोग स्प्रेडशीट से डेटा को किसी अन्य सरणी में पढ़ें।
  4. समय के साथ प्रत्येक तनाव और स्थिति के लिए ऑप्टिकल घनत्व मूल्यों और प्रतिदीप्ति मूल्यों के भूखंड उत्पन्न करें, जैसा कि चित्र 4 में दिखाया गया है।
  5. संस्कृतियों में घातीय वृद्धि या संतृप्ति के चरणों को निर्धारित करने के लिए ऑप्टिकल घनत्व भूखंडों की जांच करें। यह जानकारी उपभेदों या स्थितियों के बीच प्रतिदीप्ति माप की तुलना करने के लिए उपयुक्त समय बिंदुओं का चयन करने में सहायता करेगी, जैसा कि चित्र 5 में दर्शाया गया है।

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Representative Results

चित्रा 4 ए एक ऑप्टोजेनेटिक तनाव के लिए समय के साथ प्रतिदीप्ति मूल्यों को दर्शाता है जो एक प्रकाश-इंड्यूसेबल स्प्लिट ट्रांसक्रिप्शन कारक द्वारा नियंत्रित फ्लोरोसेंट रिपोर्टर को व्यक्त करता है। प्रयोग में उपयोग की जाने वाली विभिन्न प्रकाश स्थितियां ड्यूटी चक्र में भिन्नताओं से परिलक्षित होती हैं, जो प्रकाश के समय के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करती है। समग्र प्रतिदीप्ति स्तर प्रकाश उत्तेजना के कर्तव्य चक्र के समानुपाती देखा जाता है। चित्रा 4 बी एक ही प्रयोग के लिए संबंधित ओडी700 मान प्रदर्शित करता है। विभिन्न प्रकाश स्थितियों में ऑप्टिकल घनत्व रीडिंग की स्थिरता से पता चलता है कि प्रयोगात्मक तकनीक अलग-अलग प्रकाश स्थितियों के तहत उपभेदों की वृद्धि दर को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं करती है।

समय के साथ प्रतिदीप्ति और ऑप्टिकल घनत्व को मापने से, ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम विभिन्न प्रकाश उत्तेजना कार्यक्रमों का जवाब कैसे देते हैं, इसकी गहरी समझ उन तकनीकों की तुलना में प्राप्त की जा सकती है जो केवल एक ही समय बिंदु पर आउटपुट को कैप्चर करते हैं। यह समय-पाठ्यक्रम डेटा विभिन्न उपभेदों और स्थितियों की तुलना करने के लिए विशिष्ट समय बिंदुओं का चयन करने के लिए मूल्यवान है। चित्रा 5 विभिन्न प्रकाश उत्तेजना कार्यक्रमों द्वारा प्रेरित दो अलग-अलग ऑप्टोजेनेटिक उपभेदों के लिए एक एकल समय बिंदु (प्रकाश प्रेरण में 10 घंटे पर मापा जाता है) को दर्शाता है। दोनों उपभेद फ्लोरोसेंट रिपोर्टर की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए एक प्रकाश-इंड्यूसेबल स्प्लिट ट्रांसक्रिप्शन कारक को नियोजित करते हैं। प्रकाश नाड़ी तीव्रता, अवधि और ड्यूटी चक्र में भिन्नता इन उपभेदों में अलग-अलग प्रतिक्रियाएं प्राप्त करती है।

Figure 1
चित्र 1: कार्यतालिका लेआउट और प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो. एक नमूना वर्कटेबल लेआउट का स्क्रीनशॉट, जो लस्ट्रो में नमूना प्लेट के आंदोलन को दर्शाता है। प्लेट को रोबोटिक आर्म द्वारा हीटर शेकर (1) से माइक्रोप्लेट रीडर (2) और फिर रोशनी डिवाइस (3) में ले जाया जाता है। तस्वीरें पूरक चित्र 1 में प्रदान की गई हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: प्लेट रीडर माप स्क्रिप्ट। प्लेट रीडर स्क्रिप्ट का नमूना स्क्रीनशॉट माइक्रोप्लेट रीडर को 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करने और प्रतिदीप्ति और ऑप्टिकल घनत्व माप रिकॉर्ड करने के लिए सेट करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: स्वचालित वर्कस्टेशन स्क्रिप्ट। लस्ट्रो के लिए एक स्वचालित वर्कस्टेशन स्क्रिप्ट का नमूना स्क्रीनशॉट। स्क्रिप्ट एक टाइमर शुरू करती है, सुनिश्चित करती है कि आंतरिक प्रकाश बंद है, लूप काउंटिंग चर को 0 के प्रारंभिक मान पर सेट करता है, और हीटर शेकर को 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करने के लिए सेट करता है। प्रत्येक लूप के भीतर, प्लेट को लॉक किया जाता है, 1 मिनट के लिए हिलाया जाता है, प्लेट रीडर में ले जाया जाता है, मापा जाता है, फिर रोशनी डिवाइस पर ले जाया जाता है, और रोबोट को 30 मिनट के लूप अंतराल के शेष के लिए इंतजार करने के लिए सेट किया जाता है। इस समय के अंत में, लूप काउंटर चर को एक से बढ़ाया जाता है, और लूप दोहराया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: प्रेरण समय पाठ्यक्रम। गैल4बीडी-ईएमएजीए/ईमैगबी-गैल4एडी से नमूना प्रकाश प्रेरण समय पाठ्यक्रम डेटा ने पीजीएएल 1-एमस्कारलेट-आई रिपोर्टर (वाईएमएम 17346) के साथ प्रतिलेखन कारक तनाव को विभाजित किया। एमस्कारलेट-आई7 की प्रतिदीप्ति को 130 के ऑप्टिकल लाभ के साथ 563 एनएम उत्तेजना और 606 एनएम उत्सर्जन पर मापा जाता है। प्रकाश की तीव्रता 125 μW / सेमी2 है और त्रुटि पट्टियाँ तीन प्रतियों के नमूने की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं। ऊर्ध्वाधर लाल बिंदीदार रेखा दिखाती है कि संस्कृतियां संतृप्ति तक कब पहुंचती हैं। (ए) समय के साथ तनाव से प्रतिदीप्ति मान। दिखाए गए प्रयोग की पूरी अवधि के लिए प्रकाश पैटर्न (जैसा कि संकेत दिया गया है) दोहराया गया था। इनसेट से पता चलता है कि हल्की नाड़ी के समय को अंधेरे इंटरपल्स समय के साथ जोड़ा जाता है, जिसे पूरी जांच में दोहराया जाता है। (बी) (ए) में दिखाए गए प्रयोग के लिए ऑप्टिकल घनत्व (700 एनएम पर मापा गया) मान। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: विभिन्न ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम की तुलना। CRY2 (535)/CIB1 और eMagA/eMagBM के बीच विभिन्न प्रकाश प्रेरण कार्यक्रमों की तुलना pGAL1-mScarlet-I संवाददाताओं (YMM1763 और yMM17656, क्रमशः) के साथ प्रतिलेखन कारक उपभेदों को विभाजित करती है। एमस्कारलेट-आई7 की प्रतिदीप्ति को 130 के ऑप्टिकल लाभ के साथ 563 एनएम उत्तेजना और 606 एनएम उत्सर्जन पर मापा जाता है। उपयोग की जाने वाली प्रकाश तीव्रता 125 μW / सेमी2 है, सिवाय इसके कि अन्यथा नोट किया गया है। त्रुटि पट्टियाँ तीन प्रतियों के नमूने (डॉट्स के रूप में इंगित) की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं। दिखाए गए प्रतिदीप्ति मान प्रेरण में 10 घंटे दर्ज किए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 1: लस्ट्रो में उपयोग किए जाने वाले उपकरणों की प्रतिनिधि छवियां। लस्ट्रो सेटअप की तस्वीर और उपयोग किए गए उपकरणों की ज़ूम-इन छवियां। रोबोटिक आर्म नमूना प्लेट को हीटर शेकर से प्लेट रीडर तक और फिर पूरे प्रयोग में एक चक्र में रोशनी डिवाइस में ले जाता है। घटकों को किनारे पर एक किंवदंती के साथ गिना जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां प्रस्तुत लस्ट्रो प्रोटोकॉल संवर्धन, रोशनी और माप प्रक्रियाओं को स्वचालित करता है, जिससे ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम6 के उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग और लक्षण वर्णन को सक्षम किया जा सकता है। यह एक रोशनी डिवाइस, माइक्रोप्लेट रीडर और शेकिंग डिवाइस को स्वचालन वर्कस्टेशन में एकीकृत करके प्राप्त किया जाता है। यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से खमीर एस सेरेविसिया में एकीकृत विभिन्न ऑप्टोजेनेटिक संरचनाओं की स्क्रीनिंग और प्रकाश प्रेरण कार्यक्रमों की तुलना करने के लिए लस्ट्रो की उपयोगिता को प्रदर्शित करता है।

इस प्रोटोकॉल में जोर दिए गए कई महत्वपूर्ण कदम लस्ट्रो के प्रभावी उपयोग के लिए आवश्यक हैं। जांच के तहत ऑप्टोजेनेटिक निर्माण के कैनेटीक्स के साथ संरेखित अनुकूलित प्रकाश कार्यक्रमों का सावधानीपूर्वक डिजाइन आवश्यक है। इसके अतिरिक्त, विश्वसनीय माप प्राप्त करने के लिए प्लेट रीडर का सटीक अंशांकन महत्वपूर्ण है। रोबोट पर प्रयोगों के पूरी तरह से ड्राई रन, जिसमें प्रकाश कार्यक्रमों के साथ उचित सिंक्रनाइज़ेशन सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक समायोजन शामिल हैं, यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं कि स्क्रिप्ट सुचारू रूप से चलती है।

यहां प्रदान किया गया नमूना प्रोटोकॉल विभिन्न प्रकाश उत्तेजना स्थितियों के तहत एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर की अभिव्यक्ति को नॉनफ्लोरोसेंट नियंत्रण में चलाने वाले प्रकाश-इंड्यूसेबल स्प्लिट ट्रांसक्रिप्शन कारक की तुलना का वर्णन करता है। प्रतिदीप्ति माप 30 मिनट के अंतराल पर प्लेट में प्रत्येक कुएं से लिया जाता है, माप से पहले हीटर शेकर पर 1 मिनट झटकों से पहले। जैसा कि इस प्रोटोकॉल में दिखाया गया है, लस्ट्रो बैक्टीरिया और अन्य खमीर सहित गैर-अनुयायी सेल प्रकारों में एकीकृत ब्लू लाइट-रिस्पॉन्सिव ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम के साथ उपयोग के लिए उपयुक्त है। हालांकि, मामूली संशोधनों के साथ, प्रोटोकॉल को आसानी से विभिन्न सेल प्रकारों, ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम और प्रयोगात्मक डिजाइनों तक बढ़ाया जा सकता है। प्लेट रीडर सेटिंग्स में समायोजन प्रतिदीप्ति के अलावा अन्य आउटपुट के माप की अनुमति देगा, जैसे कि बायोलुमिनेसेंस। बेहतर अस्थायी संकल्प की आवश्यकता वाले अनुप्रयोगों के लिए, माप अधिक बार लिया जा सकता है। हीटर शेकर पर इनक्यूबेशन को अधिक बार दोहराया जा सकता है जब विशिष्ट सेल प्रकारों के लिए झटकों और तापमान नियंत्रण की आवश्यकता होती है। गैस और पर्यावरण नियंत्रण का समावेश, जैसे कि एक इनक्यूबेटेड होटल के माध्यम से, स्तनधारी सेल लाइनों को शामिल करने में सक्षम होगा। जबकि यहां वर्णित लस्ट्रो का पुनरावृत्ति विशिष्ट इंस्ट्रूमेंटेशन का उपयोग करता है, लस्ट्रो प्लेटफॉर्म को अन्य प्रयोगशाला स्वचालन रोबोट या माइक्रोप्लेट रीडर के साथ काम करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। रोशनी उपकरण, जैसे एलपीए20 या एलआईटीओएस9, विभिन्न ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम को उत्तेजित करने के लिए ऑप्टोप्लेट को प्रतिस्थापित कर सकते हैं। लस्ट्रो प्लेटफॉर्म के भविष्य के संशोधन में निरंतर संस्कृति अनुप्रयोगों के लिए स्वचालित कमजोर पड़ने की सुविधा के लिए तरल हैंडलिंग को शामिल करना शामिल हो सकता है। यह लस्ट्रो को साइबरजेनेटिक फीडबैक नियंत्रण के लिए अनुकूलित करने में भी सक्षम करेगा, जहां वास्तविक समय मापवांछित प्रतिक्रिया 5,21,22 को प्राप्त करने या बनाए रखने के लिए प्रकाश या संस्कृति की स्थिति में परिवर्तन को सूचित करते हैं।

ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम की गतिशील प्रकृति को अनुकूलित करने और दोहन करने के लिए उच्च-थ्रूपुट तकनीक महत्वपूर्ण हैं। लस्ट्रो मौजूदा प्रोटोकॉल की कई सीमाओं को पार करता है। उदाहरण के लिए, जबकि बायोरिएक्टर-आधारित ऑप्टोजेनेटिक्स तकनीक निरंतर रीडआउट और संवर्धन स्थितियों को सक्षम करती है, वे कम थ्रूपुट 23,24,25,26 से पीड़ित हैं। ऑप्टोप्लेटरीडर27 डिवाइस माइक्रोवेल प्लेटों में वास्तविक समय ऑप्टोजेनेटिक्स प्रयोगों के लिए वादा करता है, लेकिन वर्तमान में विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए अधिक संख्या में प्रतिकृति की आवश्यकता के कारण कम थ्रूपुट है और निरंतर संवर्धन तक पहुंच प्रदान नहीं करता है। दूसरी ओर, लस्ट्रो, ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग को उनकी गतिशील गतिविधि को चिह्नित करने में सक्षम बनाता है। बहरहाल, लस्ट्रो प्रोटोकॉल की कुछ सीमाएं हैं। लस्ट्रो में आंतरायिक झटके खमीर कोशिकाओंके लिए एक छोटे से विकास अंतराल का कारण बनते हैं6, लेकिन इसे झटकों को शामिल करने के लिए एक रोशनी उपकरण को अनुकूलित करके संबोधित किया जा सकता है। लस्ट्रो प्रणाली की एक और सीमा यह है कि रोशनी डिवाइस पर नमूना प्लेट को इनक्यूबेट नहीं किया जाता है और परिवेश के तापमान (22 डिग्री सेल्सियस) पर बनाए रखा जाता है। यद्यपि प्रत्येक नमूने की छोटी मात्रा उच्च-थ्रूपुट स्क्रीन की अनुमति देती है, लेकिन जैव उत्पादन या अन्य अनुप्रयोगों28,29 के लिए बड़ी प्रतिक्रिया मात्रा में स्केलिंग करते समय रोशनी चरणों का अतिरिक्त अनुकूलन आवश्यक हो सकता है।

कुल मिलाकर, लस्ट्रो उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग और सटीक प्रकाश नियंत्रण के माध्यम से ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम के तेजी से विकास और परीक्षण की सुविधा प्रदान करता है। यह स्वचालित दृष्टिकोण विभिन्न प्रेरण स्थितियों के तहत विभिन्न ऑप्टोजेनेटिक संरचनाओं के कुशल लक्षण वर्णन और तुलना को सक्षम बनाता है, जिससे इन प्रणालियों का तेजी से पुनरावृत्ति और शोधन होता है। विभिन्न सेल प्रकारों, ऑप्टोजेनेटिक टूल और स्वचालन सेटअप के लिए अपनी अनुकूलनशीलता के साथ, लस्ट्रो ऑप्टोजेनेटिक्स के क्षेत्र में प्रगति का मार्ग प्रशस्त करता है, गतिशील जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण की खोज की सुविधा प्रदान करता है और जैविक नेटवर्क और इंजीनियरिंग सेलुलर व्यवहार का अध्ययन करने के लिए संभावनाओं का विस्तार करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान R35GM128873 संस्थान और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान 2045493 (एमएनएम को सम्मानित) द्वारा समर्थित किया गया था। मेगन निकोल मैकक्लीन, पीएचडी बरोज़ वेलकम फंड से वैज्ञानिक इंटरफ़ेस में एक कैरियर पुरस्कार रखती है। जेडपीएच को जीनोमिक साइंसेज ट्रेनिंग प्रोग्राम 5टी32एचजी002760 के लिए एनएचजीआरआई प्रशिक्षण अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। हम मैकक्लीन लैब के सदस्यों के साथ उपयोगी चर्चा को स्वीकार करते हैं, और विशेष रूप से, हम पांडुलिपि पर टिप्पणी प्रदान करने के लिए कीरन स्वीनी के आभारी हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well glass bottom plate with  #1.5 cover glass Cellvis P96-1.5H-N
BioShake 3000-T elm (heater shaker) QINSTRUMENTS
Fluent Automation Workstation Tecan
LITOS (alternative illumination device) Hohener, et al. Scientific Reports. 2022
optoPlate-96 (illumination device) Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019
Robotic Gripper Arm Tecan
Spark (plate reader) Tecan
Synthetic Complete media SigmaAldrich Y1250
Tecan Connect (user alert app) Tecan
yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
YPD Agar SigmaAldrich Y1500

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References

  1. Pérez, A. L. A., et al. Optogenetic strategies for the control of gene expression in yeasts. Biotechnology Advances. 54, 107839 (2022).
  2. Lan, T. -H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering. Trends in Genetics. 38 (12), 1253-1270 (2022).
  3. Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature Chemical Biology. 10, 502-511 (2014).
  4. Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo Activities of Light Inducible Dimers: a Cellular Optogenetics Guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
  5. Scott, T. D., Sweeney, K., McClean, M. N. Biological signal generators: integrating synthetic biology tools and in silico control. Current Opinion in Systems Biology. 14, 58-65 (2019).
  6. Harmer, Z. P., McClean, M. N. Lustro: High-throughput optogenetic experiments enabled by automation and a yeast optogenetic toolkit. ACS Synthetic Biology. 12 (7), 1943-1951 (2023).
  7. Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
  8. Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
  9. Höhener, T. C., Landolt, A. E., Dessauges, C., Hinderling, L., Gagliardi, P. A., Pertz, O. LITOS: a versatile LED illumination tool for optogenetic stimulation. Scientific Reports. 12 (1), 13139 (2022).
  10. Grødem, E. O., Sweeney, K., McClean, M. N. Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments. BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).
  11. Dunlop, M. J. A supplemental guide to building the optoPlate-96. , https://www.protocols.io/view/a-supplemental-guide-to-building-the-optoplate-96-b2vwqe7e (2021).
  12. Thomas, O. S., Hörner, M., Weber, W. A graphical user interface to design high-throughput optogenetic experiments with the optoPlate-96. Nature Protocols. 15 (9), 2785-2787 (2020).
  13. Robertson, J. B., Davis, C. R., Johnson, C. H. Visible light alters yeast metabolic rhythms by inhibiting respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21130-21135 (2013).
  14. Synthetic Complete (SC) Medium. 2016 (11), Cold Spring Harbor Protocols. (2016).
  15. Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
  16. Hecht, A., Endy, D., Salit, M., Munson, M. S. When wavelengths collide: bias in cell abundance measurements due to expressed fluorescent proteins. ACS Synthetic Biology. 5 (9), 1024-1027 (2016).
  17. YPD media. 2010 (9), Cold Spring Harbor Protocols. (2010).
  18. Low-Fluorescence Yeast Nitrogen Base without Riboflavin and Folic Acid Medium (LFM). 2016 (11), Cold Spring Harbor. (2016).
  19. Csibra, E., Stan, G. -B. Parsley: a web app for parsing data from plate readers. Zenodo. , (2023).
  20. Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6 (1), 35363 (2016).
  21. Gutiérrez Mena, J., Kumar, S., Khammash, M. Dynamic cybergenetic control of bacterial co-culture composition via optogenetic feedback. Nature Communications. 13, 4808 (2022).
  22. Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
  23. Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546 (2016).
  24. Bertaux, F., et al. Enhancing bioreactor arrays for automated measurements and reactive control with ReacSight. Nature Communications. 13 (1), 3363 (2022).
  25. Benisch, M., Benzinger, D., Kumar, S., Hu, H., Khammash, M. Optogenetic closed-loop feedback control of the unfolded protein response optimizes protein production. Metabolic Engineering. 77, 32-40 (2023).
  26. Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative Biology. 6 (3), 366-372 (2014).
  27. Datta, S., et al. High-throughput feedback-enabled optogenetic stimulation and spectroscopy in microwell plates. bioRxiv. , (2022).
  28. Pouzet, S., et al. Optogenetic control of beta-carotene bioproduction in yeast across multiple lab-scales. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 11, 1085268 (2023).
  29. Pouzet, S., Banderas, A., Le Bec, M., Lautier, T., Truan, G., Hersen, P. The promise of optogenetics for bioproduction: dynamic control strategies and scale-up instruments. Bioengineering. 7 (4), 151 (2020).

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Harmer, Z. P., McClean, M. N. High-Throughput Optogenetics Experiments in Yeast Using the Automated Platform Lustro. J. Vis. Exp. (198), e65686, doi:10.3791/65686 (2023).

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