Summary
Denne protokollen skisserer trinnene for bruk av den automatiserte plattformen Lustro for å utføre høy gjennomstrømningskarakterisering av optogenetiske systemer i gjær.
Abstract
Optogenetikk gir presis kontroll over cellulær oppførsel ved å benytte genetisk kodede lysfølsomme proteiner. Optimalisering av disse systemene for å oppnå ønsket funksjonalitet krever imidlertid ofte flere design-build-test-sykluser, noe som kan være tidkrevende og arbeidskrevende. For å møte denne utfordringen har vi utviklet Lustro, en plattform som kombinerer lysstimulering med laboratorieautomatisering, noe som muliggjør effektiv screening og karakterisering av optogenetiske systemer med høy gjennomstrømning.
Lustro benytter en automatiseringsarbeidsstasjon utstyrt med en belysningsenhet, en risteanordning og en plateleser. Ved å bruke en robotarm automatiserer Lustro bevegelsen av en mikrobrønnplate mellom disse enhetene, noe som muliggjør stimulering av optogenetiske stammer og måling av deres respons. Denne protokollen gir en trinnvis veiledning om bruk av Lustro for å karakterisere optogenetiske systemer for genuttrykkskontroll i den spirende gjæren Saccharomyces cerevisiae. Protokollen dekker oppsettet av Lustros komponenter, inkludert integrering av belysningsenheten med automatiseringsarbeidsstasjonen. Den gir også detaljerte instruksjoner for programmering av belysningsenheten, plateleseren og roboten, noe som sikrer jevn drift og datainnsamling gjennom hele eksperimentprosessen.
Introduction
Optogenetikk er en kraftig teknikk som benytter lysfølsomme proteiner for å kontrollere oppførselen til celler med høy presisjon 1,2,3. Imidlertid kan prototyping av optogenetiske konstruksjoner og identifisering av optimale belysningsforhold være tidkrevende, noe som gjør det vanskelig å optimalisere optogenetiske systemer 4,5. Høykapasitetsmetoder for raskt å skjerme og karakterisere aktiviteten til optogenetiske systemer kan akselerere design-build-test-syklusen for prototyping av konstruksjoner og utforsking av deres funksjon.
Lustro-plattformen ble utviklet som en laboratorieautomatiseringsteknikk designet for høy gjennomstrømningsscreening og karakterisering av optogenetiske systemer. Den integrerer en mikroplateleser, belysningsenhet og risteenhet med en automatiseringsarbeidsstasjon6. Lustro kombinerer automatisert dyrking og lysstimulering av celler i mikrobrønnplater (figur 1 og tilleggsfigur 1), noe som muliggjør rask screening og sammenligning av forskjellige optogenetiske systemer. Lustro-plattformen er svært tilpasningsdyktig og kan generaliseres til å fungere med andre laboratorieautomatiseringsroboter, belysningsenheter, platelesere, celletyper og optogenetiske systemer, inkludert de som reagerer på forskjellige bølgelengder av lys.
Denne protokollen demonstrerer oppsettet og bruken av Lustro for å karakterisere et optogenetisk system. Optogenetisk kontroll av delte transkripsjonsfaktorer i gjær brukes som et eksempelsystem for å illustrere funksjonen og nytten av plattformen ved å undersøke forholdet mellom lysinnganger og uttrykket av et fluorescerende reportergen, mScarlet-I7. Ved å følge denne protokollen kan forskere strømlinjeforme optimaliseringen av optogenetiske systemer og akselerere oppdagelsen av nye strategier for dynamisk kontroll av biologiske systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Gjærstammene som ble brukt i denne studien er dokumentert i materialfortegnelsen. Disse stammene viser robust vekst innenfor temperaturområdet 22 ° C til 30 ° C og kan dyrkes i ulike standard gjærmedier.
1. Sette opp automatiseringsarbeidsstasjonen
- Utstyr den automatiserte arbeidsstasjonen med en robotgriperarm (RGA, se materialfortegnelse) som er i stand til å flytte mikrobrønnplater (figur 1).
- Installer en mikroplatevarmer (se materialfortegnelse) i den automatiserte arbeidsstasjonen (figur 1 (1)) med en automatisk platelåsemekanisme som gir RGA-tilgang.
- Plasser en mikroplateleser ved siden av den automatiserte arbeidsstasjonen (figur 1(2)), for å sikre RGA-tilgjengelighet.
- Innlemme en mikroplate belysning enhet (figur 1 (3)) som gir praktisk RGA-tilgang. Eksempler er optoPlate8 (som brukt i denne studien) eller LITOS9 (se Materialfortegnelse).
2. Klargjøring av belysningsanordningen
- Konstruer og kalibrer optoPlate (eller alternativ belysningsenhet) etter etablerte metoder 8,10,11.
- Bruk en adapter på belysningsenheten for å aktivere RGA-tilgang.
- Programmer optoPlate ved hjelp av et regnearkinngang10 eller et grafisk grensesnitt12. Følg trinn 3 for å utføre lysstimuleringsprogrammene.
3. Designe et lysstimuleringsprogram
- Bestem de ønskede lysforholdene for eksperimentet.
- Skriv inn de ønskede lysforholdene, inkludert lysintensitet, lysstarttid, pulslengde, pulstall og interpulsvarighet, i et regneark.
MERK: Flash denne informasjonen på optoPlate ved hjelp av instruksjonene i GitHub-depotet: github.com/mccleanlab/Optoplate-96. Husk at prøveplaten ikke vil bli opplyst mens den er i mikroplateleseren eller på ovnsristeren. Varigheten og hyppigheten av disse hendelsene kan kreve optimalisering basert på spesifikke eksperimentelle krav. - Inkluder mørke forhold for hver belastning for å muliggjøre riktige bakgrunnsmålinger.
- For innledende karakteriseringseksperimenter for å vurdere transformantfunksjonalitet, bruk en høy lysintensitet.
MERK: Lysintensiteten bør optimaliseres for mer følsomme eksperimenter, da overdreven lys kan være fototoksisk for gjær13.
4. Klargjøring av mikroplateleseren
- Konfigurer mikroplateleseren til å måle ønsket mengde interesse før du utfører eksperimenter.
MERK: I dette eksemplet ble mikroplateleseren konfigurert til å måle fluorescens fra en reporter uttrykt av belastningen av interesse. Andre utganger, som luminescens eller optisk tetthet, kan brukes avhengig av eksperimentelle krav. - Dyrk belastningen av interesse (sammen med en ikke-fluorescerende kontroll) i syntetiske komplette (SC) medier14 (eller et annet medium med lav fluorescens) (se materialtabell) til den høyeste celletettheten som skal måles. Overfør kulturene til en svartvegget mikrobrønnplate med glassbunn (se Materialliste) og mål dem for å bestemme de optimale mikroplateleserinnstillingene.
MERK: Sørg for nøyaktige avlesninger ved å skrive inn platedimensjonene riktig og måle platen nedenfra. - Se en fluorescerende proteindatabase (for eksempel fpbase.org) for å oppnå omtrentlig absorpsjon og utslippsspektra for målfluorescerende protein15.
- Bestem z-verdien (avstanden mellom platen og leseren) ved å utføre en z-skanning på brønner som inneholder fluorescerende og ikke-fluorescerende stammer. Velg z-verdien som gir det høyeste signal-støy-forholdet.
- Optimaliser absorpsjons- og utslippsspektrene ved å utføre absorpsjons- og utslippsskanninger på fluorescerende og ikke-fluorescerende stammer for å bestemme det optimale signal-støy-forholdet.
- Mål den fluorescerende belastningen med forsterkningen satt til det optimale nivået, og bestem den høyeste optiske forsterkningen som kan brukes uten å resultere i en overløpsmålingsfeil.
MERK: Denne optiske forsterkningen bør settes manuelt konsekvent på tvers av eksperimenter som involverer samme belastning for å sikre konsistens i resultatene. - Forbered et måleskript (se figur 2) i programvaren for mikroplateleseren. Dette skriptet konfigurerer instrumentet til å måle den optiske tettheten til kulturene og fluorescensspektrene til fluorescerende proteiner som skal måles.
MERK: Mål den optiske tettheten av stammer ved 600 nm med mindre de uttrykker røde fluorescerende proteiner. For stammer som uttrykker røde fluorescerende proteiner, måler den optiske tettheten ved 700 nm for å unngå skjevhet16. - Still inn måleskriptet til å opprettholde en intern inkubasjonstemperatur på 30 °C under målingene.
- Konfigurer måleskriptet til å eksportere dataene til et regneark eller ASCII-filer, i henhold til preferanse.
5. Programmering av roboten
- Konfigurer arbeidstabelldefinisjonen i den automatiserte arbeidsstasjonsprogramvaren basert på den fysiske utformingen av bærere (f.eks. varmeristere, nestplattformer, belysningsenheter) og labware (dvs. 96-brønnsplaten) (se materialfortegnelse). Opprett et skript i automatiseringsarbeidsstasjonsprogramvaren for å utføre lysinduksjon og målinger (figur 3), ved å følge trinnene nedenfor.
- Deaktiver eventuelle interne belysningskilder for å forhindre bakgrunnsaktivering av optogenetiske systemer.
- Still inn ovnshakeren til å opprettholde en temperatur på 30 °C. Når platen ikke er på ovnsristeren, vil den være ved omgivelsestemperatur (22 °C).
- Bruk løkker, en tidtaker og en løkketellingsvariabel for å gjenta trinnene for å indusere og måle cellene med jevne mellomrom.
- Før du registrerer målinger, rist prøveplaten for å sikre riktig suspensjon av alle celler. En 60 s risting ved 1000 o / min med en 2 mm orbital er vanligvis tilstrekkelig til å resuspendere S288C S. cerevisiae-celler og unngå måleskjevhet.
- Flytt prøveplaten til mikroplateleseren ved hjelp av robotarmen, og fjern lokket (hvis aktuelt) for å forhindre skjevhet ved måling av optisk tetthet. Kontrollprogramvaren vil automatisk fjerne og sette lokket tilbake til den angitte posisjonen hvis mikroplateleserens bærerdefinisjon er satt til ikke å tillate lokk.
- Utfør måleskriptet for mikroplateleseren som beskrevet i trinn 4.
- Sett lokket på prøveplaten igjen, og flytt platen til belysningsenheten ved hjelp av robotarmen.
- Still inn skriptet til å vente til timeren når det angitte tidsintervallet (f.eks. 30 minutter multiplisert med løkketellingsvariabelen) og gjenta deretter hele sløyfen for ønsket antall iterasjoner (f.eks. 48 ganger for et 24-timers eksperiment).
- Feilsøk potensielle feil og sikre at bærer- og labwaredefinisjonene fungerer som de skal, samt RGAs evne til nøyaktig å plukke opp og plassere platen ved å kjøre en tom plate gjennom skriptsløyfen flere ganger.
- Konfigurer brukervarsler for å varsle brukeren om eventuelle instrumenttilstandsendringer eller feil som kan oppstå under kjøring av protokollen.
6. Sette opp prøveplaten
- Dyrk gjærstammer på rike medieplater, for eksempel YPD-agar17 (se Materialfortegnelse). Inkluder en ikke-fluorescerende (negativ) kontroll.
- Velg kolonier fra platene og inokuler dem i 3 ml SC-medier14 (eller et annet lavfluorescensmedium, slik som LFM18) i glasskulturrør. Inkuber kulturene over natten ved 30 °C på en rulletrommel mens du holder dem i mørket eller under ikke-responsive lysforhold (f.eks. rødt lys for blått lysresponsive systemer).
- Mål den optiske tettheten til nattens kulturer ved å fortynne 200 μL av hver kultur til 1 ml SC-medier og registrere den optiske tettheten ved 600 nm (OD600) ved hjelp av et spektrofotometer eller mikroplateleser.
- Fortynn hver kultur over natten til en OD600 på 0,1 i glasskulturrør. For testing av høyere gjennomstrømningsbelastning, utfør automatiserte fortynninger i mikrobrønnplater.
- Pipett de fortynnede kulturene inn i 96-brønnplaten. Inkluder triplikate brønner for hver tilstand (dvs. tre identiske brønner med samme belastning og lette tilstand) for å ta hensyn til teknisk variasjon. Inkluder brønner med tomme medier og ikke-fluorescerende celler som negative kontroller for å måle bakgrunnsfluorescens og optisk tetthet.
- Inkuber platen ved 30 °C med risting i 5 timer før lysinduksjonseksperimentet starter. Juster fortynningsmengder og inkubasjonstider etter behov for å optimalisere for spesifikke stammer og eksperimentelle forhold.
7. Utføre eksperimentet
- Plasser prøveplaten på ovnsristeren og start automatiseringsskriptet som beskrevet i trinn 5.
- Start lysstimuleringsprogrammet som beskrevet i trinn 3 når den første målingen på plateleseren er registrert.
- Hvis automatiseringsarbeidsstasjonen ikke er i et mørkt rom, må du dekke den med et blendingsgardin for å unngå bakgrunnsbelysning.
8. Dataanalyse
- Lag et regnearkkart for eksperimentet, som gjenspeiler 8 x 12-oppsettet på 96-brønnsplaten. Sørg for at kartet inneholder navnene på stammene som måles i ett rutenett og beskrivelser av lysforholdene som brukes i et annet rutenett.
- Bruk et Python-skript eller et annet foretrukket programmeringsspråk for å analysere de eksporterte dataene. Importer kartregnearket til en matrise, og knytt stammenavnene og tilstandsnavnene til hver brønn på platen.
MERK: Eksempelkode for analyse finner du på: https://github.com/mccleanlab/Lustro. Alternativt kan man bruke en applikasjon for å analysere data fra ulike platelesere19. - Les dataene fra regnearket for eksporterte eksperimenter til en annen matrise.
- Generer plott av de optiske tetthetsverdiene og fluorescensverdiene for hver stamme og tilstand over tid, som illustrert i figur 4.
- Undersøk de optiske tetthetsplottene for å bestemme stadiene av eksponentiell vekst eller metning i kulturene. Denne informasjonen vil hjelpe til med å velge passende tidspunkter for å sammenligne fluorescensmålinger mellom stammer eller forhold, som vist i figur 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 4A viser fluorescensverdiene over tid for en optogenetisk stamme som uttrykker en fluorescerende reporter styrt av en lysinduserbar delt transkripsjonsfaktor. De forskjellige lysforholdene som brukes i forsøket reflekteres av variasjoner i driftssyklusen, som representerer prosentandelen av tiden lyset er på. Det totale fluorescensnivået observeres å være proporsjonalt med lysstimuleringens driftssyklus. Figur 4B viser de tilsvarende OD700-verdiene for det samme eksperimentet. Konsistensen av de optiske tetthetsavlesningene over forskjellige lysforhold antyder at den eksperimentelle teknikken ikke signifikant påvirker veksthastigheten til stammene under varierende lysforhold.
Ved å måle fluorescens og optisk tetthet over tid, kan man oppnå en dypere forståelse av hvordan optogenetiske systemer reagerer på forskjellige lysstimuleringsprogrammer sammenlignet med teknikker som bare fanger opp output på et enkelt tidspunkt. Disse tidskursdataene er verdifulle for å velge bestemte tidspunkter for å sammenligne forskjellige stammer og forhold. Figur 5 illustrerer et enkelt tidspunkt (målt ved 10 timer i lysinduksjon) for to forskjellige optogenetiske stammer indusert av forskjellige lysstimuleringsprogrammer. Begge stammene bruker en lysinduserbar delt transkripsjonsfaktor for å drive uttrykket til en fluorescerende reporter. Variasjoner i lyspulsintensitet, periode og driftssyklus fremkaller forskjellige responser i disse belastningene.
Figur 1: Worktable-oppsett og eksperimentell arbeidsflyt. Skjermbilde av et arbeidstabelloppsett som angir bevegelsen av prøveplaten i Lustro. Platen beveges av robotarmen fra en varmeapparatrister (1) til mikroplateleseren (2), og deretter til belysningsenheten (3). Fotografier er gitt i tilleggsfigur 1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Måleskript for plateleser. Eksempel på skjermbilde av et plateleserskript som stiller inn mikroplateleseren til å inkubere ved 30 °C og registrere fluorescens- og optiske tetthetsmålinger. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Automatisert arbeidsstasjonsskript. Eksempel på skjermbilde av et automatisert arbeidsstasjonsskript for Lustro. Skriptet starter en tidtaker, sørger for at det innvendige lyset er slått av, setter en sløyfetellingsvariabel til en startverdi på 0, og stiller inn ovnsristeren til å inkubere ved 30 °C. Innenfor hver sløyfe låses platen, ristes i 1 min, flyttes til plateleseren, måles og flyttes deretter til belysningsenheten, og roboten er satt til å vente på resten av 30 minutters sløyfeintervall. På slutten av denne tiden økes sløyfetellervariabelen med en, og løkken gjentas. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Induksjonstidsforløp. Eksempel på lysinduksjonstidskursdata fra en Gal4BD-eMagA / eMagB-Gal4AD delt transkripsjonsfaktorstamme med en pGAL1-mScarlet-I reporter (yMM17346). Fluorescens av mScarlet-I7 måles ved 563 nm eksitasjon og 606 nm utslipp med en optisk forsterkning på 130. Lysintensiteten er 125 μW/cm2 og feilfeltene representerer standardfeilen i triplikate prøver. Den vertikale røde stiplede linjen viser når kulturer når metning. (A) Fluorescensverdier fra stammen over tid. Lysmønstre (som angitt) ble gjentatt i hele varigheten av eksperimentet vist. Innfelt viser at lyspulstider er ispedd mørke interpulstider, gjentatt gjennom hele undersøkelsen. (B) Optisk tetthet (målt ved 700 nm) verdier for eksperimentet vist i (A). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Sammenligning av ulike optogenetiske systemer. Sammenligning av forskjellige lysinduksjonsprogrammer mellom CRY2 (535) / CIB1 og eMagA / eMagBM delte transkripsjonsfaktorstammer med pGAL1-mScarlet-I reportere (yMM1763 og yMM17656, henholdsvis). Fluorescens av mScarlet-I7 måles ved 563 nm eksitasjon og 606 nm utslipp med en optisk forsterkning på 130. Lysintensiteten som brukes er 125 μW/cm2, unntatt der annet er angitt. Feilfelt representerer standardfeilen i triplikate prøver (angitt som prikker). Fluorescensverdier vist ble registrert 10 timer ved induksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 1: Representative bilder av enhetene som brukes i Lustro. Bilde av Lustro-oppsettet og zoomede bilder av enhetene som brukes. Robotarmen beveger prøveplaten fra varmeristeren til plateleseren og deretter til belysningsenheten i en syklus gjennom hele eksperimentet. Komponentene er nummerert med en forklaring på siden. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lustro-protokollen som presenteres her automatiserer dyrkings-, belysnings- og måleprosessene, noe som muliggjør høy gjennomstrømningsscreening og karakterisering av optogenetiske systemer6. Dette oppnås ved å integrere en belysningsenhet, mikroplateleser og risteenhet i en automatiseringsarbeidsstasjon. Denne protokollen demonstrerer spesifikt Lustros nytte for screening av forskjellige optogenetiske konstruksjoner integrert i gjæren S. cerevisiae og sammenligning av lysinduksjonsprogrammer.
Flere viktige skritt understreket i denne protokollen er avgjørende for effektiv utnyttelse av Lustro. Nøye utforming av tilpassede lysprogrammer som samsvarer med kinetikken til den optogenetiske konstruksjonen som undersøkes, er nødvendig. I tillegg er nøyaktig kalibrering av plateleseren avgjørende for å oppnå pålitelige målinger. Grundige tørrkjøringer av eksperimentene på roboten, inkludert nødvendige justeringer for å sikre riktig synkronisering med lysprogrammene, er avgjørende for å sikre at skriptet går jevnt.
Prøveprotokollen gitt her beskriver sammenligningen av en lysinduserbar delt transkripsjonsfaktor som driver uttrykket av en fluorescerende reporter til en ikke-fluorescerende kontroll under forskjellige lysstimuleringsforhold. Fluorescensmålinger tas fra hver brønn i platen med 30 minutters intervaller, etterfulgt av 1 min risting på varmeristeren før måling. Som demonstrert i denne protokollen, er Lustro egnet for bruk med optogenetiske systemer med blått lys integrert i ikke-adherente celletyper, inkludert bakterier og andre gjærsopper. Imidlertid, med mindre modifikasjoner, kan protokollen enkelt utvides til forskjellige celletyper, optogenetiske systemer og eksperimentelle design. Justeringer av plateleserinnstillingene vil tillate måling av andre utganger enn fluorescens, for eksempel bioluminescens. For applikasjoner som krever finere tidsoppløsning, kan målinger tas oftere. Inkubasjon på varmeristeren kan gjentas oftere når det er kritisk for spesifikke celletyper som krever risting og temperaturkontroll. Inkorporering av gass og miljøkontroll, for eksempel gjennom et inkubert hotell, vil muliggjøre inkludering av pattedyrcellelinjer. Mens iterasjonen av Lustro beskrevet her bruker spesifikk instrumentering, kan Lustro-plattformen lett tilpasses for å fungere med andre laboratorieautomatiseringsroboter eller mikroplatelesere. Belysningsenheter, som LPA20 eller LITOS9, kan erstatte optoPlate for å stimulere forskjellige optogenetiske systemer. En fremtidig modifikasjon av Lustro-plattformen kan innebære å innlemme væskehåndtering for å muliggjøre automatiserte fortynninger for kontinuerlige kulturapplikasjoner. Dette vil også gjøre det mulig å tilpasse Lustro for cybergenetisk tilbakemeldingskontroll, der sanntidsmålinger informerer om endringer i lys- eller kulturforhold for å oppnå eller opprettholde en ønsket respons 5,21,22.
Høy gjennomstrømningsteknikker er avgjørende for å optimalisere og utnytte den dynamiske naturen til optogenetiske systemer. Lustro overvinner mange begrensninger av eksisterende protokoller. For eksempel, mens bioreaktorbaserte optogenetikkteknikker muliggjør konstant avlesning og dyrkingsforhold, lider de av lav gjennomstrømning23,24,25,26. OptoPlateReader27-enheten holder løfte om sanntids optogenetikkeksperimenter i mikrobrønnplater, men har for tiden lav gjennomstrømning på grunn av behovet for et høyt antall replikater for å oppnå pålitelige resultater og gir ikke tilgang til kontinuerlig dyrking. Lustro, derimot, muliggjør høy gjennomstrømningsscreening av optogenetiske systemer for å karakterisere deres dynamiske aktivitet. Likevel er det noen begrensninger i Lustro-protokollen. Intermitterende risting i Lustro forårsaker et lite vekstetterslep for gjærceller6, men dette kan løses ved å tilpasse en belysningsenhet for å innlemme risting. En annen begrensning ved Lustro-systemet er at prøveplaten ikke inkuberes mens den er på belysningsenheten og holdes ved omgivelsestemperatur (22 °C). Selv om det lille volumet av hver prøve tillater skjermer med høy gjennomstrømning, kan det være nødvendig med ytterligere optimalisering av belysningstrinnene ved skalering til større reaksjonsvolumer for bioproduksjon eller andre applikasjoner28,29.
Samlet sett legger Lustro til rette for rask utvikling og testing av optogenetiske systemer gjennom høy gjennomstrømningsscreening og presis lyskontroll. Denne automatiserte tilnærmingen muliggjør effektiv karakterisering og sammenligning av forskjellige optogenetiske konstruksjoner under forskjellige induksjonsbetingelser, noe som fører til raskere iterasjon og forfining av disse systemene. Med sin tilpasningsevne til forskjellige celletyper, optogenetiske verktøy og automatiseringsoppsett, baner Lustro vei for fremskritt innen optogenetikk, noe som letter utforskningen av dynamisk genuttrykkskontroll og utvider mulighetene for å studere biologiske nettverk og engineering cellulær oppførsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health grant R35GM128873 og National Science Foundation grant 2045493 (tildelt MNM). Megan Nicole McClean, Ph.D. har en Career Award på Scientific Interface fra Burroughs Wellcome Fund. Z.P.H. ble støttet av et NHGRI treningsstipend til Genomic Sciences Training Program 5T32HG002760. Vi anerkjenner fruktbare diskusjoner med McClean lab-medlemmer, og spesielt er vi takknemlige for Kieran Sweeney for å gi kommentarer til manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well glass bottom plate with #1.5 cover glass | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| BioShake 3000-T elm (heater shaker) | QINSTRUMENTS | ||
| Fluent Automation Workstation | Tecan | ||
| LITOS (alternative illumination device) | Hohener, et al. Scientific Reports. 2022 | ||
| optoPlate-96 (illumination device) | Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019 | ||
| Robotic Gripper Arm | Tecan | ||
| Spark (plate reader) | Tecan | ||
| Synthetic Complete media | SigmaAldrich | Y1250 | |
| Tecan Connect (user alert app) | Tecan | ||
| yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| YPD Agar | SigmaAldrich | Y1500 |
References
- Pérez, A. L. A., et al. Optogenetic strategies for the control of gene expression in yeasts. Biotechnology Advances. 54, 107839 (2022).
- Lan, T. -H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering. Trends in Genetics. 38 (12), 1253-1270 (2022).
- Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature Chemical Biology. 10, 502-511 (2014).
- Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo Activities of Light Inducible Dimers: a Cellular Optogenetics Guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
- Scott, T. D., Sweeney, K., McClean, M. N. Biological signal generators: integrating synthetic biology tools and in silico control. Current Opinion in Systems Biology. 14, 58-65 (2019).
- Harmer, Z. P., McClean, M. N. Lustro: High-throughput optogenetic experiments enabled by automation and a yeast optogenetic toolkit. ACS Synthetic Biology. 12 (7), 1943-1951 (2023).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
- Höhener, T. C., Landolt, A. E., Dessauges, C., Hinderling, L., Gagliardi, P. A., Pertz, O. LITOS: a versatile LED illumination tool for optogenetic stimulation. Scientific Reports. 12 (1), 13139 (2022).
- Grødem, E. O., Sweeney, K., McClean, M. N. Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments. BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).
- Dunlop, M. J. A supplemental guide to building the optoPlate-96. , https://www.protocols.io/view/a-supplemental-guide-to-building-the-optoplate-96-b2vwqe7e (2021).
- Thomas, O. S., Hörner, M., Weber, W. A graphical user interface to design high-throughput optogenetic experiments with the optoPlate-96. Nature Protocols. 15 (9), 2785-2787 (2020).
- Robertson, J. B., Davis, C. R., Johnson, C. H. Visible light alters yeast metabolic rhythms by inhibiting respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21130-21135 (2013).
- Synthetic Complete (SC) Medium. 2016 (11), Cold Spring Harbor Protocols. (2016).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
- Hecht, A., Endy, D., Salit, M., Munson, M. S. When wavelengths collide: bias in cell abundance measurements due to expressed fluorescent proteins. ACS Synthetic Biology. 5 (9), 1024-1027 (2016).
- YPD media. 2010 (9), Cold Spring Harbor Protocols. (2010).
- Low-Fluorescence Yeast Nitrogen Base without Riboflavin and Folic Acid Medium (LFM). 2016 (11), Cold Spring Harbor. (2016).
- Csibra, E., Stan, G. -B. Parsley: a web app for parsing data from plate readers. Zenodo. , (2023).
- Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6 (1), 35363 (2016).
- Gutiérrez Mena, J., Kumar, S., Khammash, M. Dynamic cybergenetic control of bacterial co-culture composition via optogenetic feedback. Nature Communications. 13, 4808 (2022).
- Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
- Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546 (2016).
- Bertaux, F., et al. Enhancing bioreactor arrays for automated measurements and reactive control with ReacSight. Nature Communications. 13 (1), 3363 (2022).
- Benisch, M., Benzinger, D., Kumar, S., Hu, H., Khammash, M. Optogenetic closed-loop feedback control of the unfolded protein response optimizes protein production. Metabolic Engineering. 77, 32-40 (2023).
- Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative Biology. 6 (3), 366-372 (2014).
- Datta, S., et al. High-throughput feedback-enabled optogenetic stimulation and spectroscopy in microwell plates. bioRxiv. , (2022).
- Pouzet, S., et al. Optogenetic control of beta-carotene bioproduction in yeast across multiple lab-scales. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 11, 1085268 (2023).
- Pouzet, S., Banderas, A., Le Bec, M., Lautier, T., Truan, G., Hersen, P. The promise of optogenetics for bioproduction: dynamic control strategies and scale-up instruments. Bioengineering. 7 (4), 151 (2020).
