Summary
Este protocolo descreve as etapas para a utilização da plataforma automatizada Lustro para realizar a caracterização de alto rendimento de sistemas optogenéticos em leveduras.
Abstract
A optogenética oferece controle preciso sobre o comportamento celular utilizando proteínas sensíveis à luz codificadas geneticamente. No entanto, a otimização desses sistemas para alcançar a funcionalidade desejada geralmente requer vários ciclos de projeto-construção-teste, que podem ser demorados e trabalhosos. Para enfrentar esse desafio, desenvolvemos o Lustro, uma plataforma que combina estimulação luminosa com automação laboratorial, permitindo triagem e caracterização eficientes de sistemas optogenéticos de alto rendimento.
A Lustro utiliza uma estação de trabalho de automação equipada com um dispositivo de iluminação, um dispositivo de agitação e um leitor de placas. Ao empregar um braço robótico, o Lustro automatiza o movimento de uma placa de micropoço entre esses dispositivos, permitindo a estimulação de cepas optogenéticas e a medição de sua resposta. Este protocolo fornece um guia passo-a-passo sobre o uso de Lustro para caracterizar sistemas optogenéticos para controle da expressão gênica em levedura brotante Saccharomyces cerevisiae. O protocolo abrange a configuração dos componentes do Lustro, incluindo a integração do dispositivo de iluminação com a estação de trabalho de automação. Ele também fornece instruções detalhadas para a programação do dispositivo de iluminação, leitor de placas e robô, garantindo uma operação suave e aquisição de dados durante todo o processo experimental.
Introduction
A optogenética é uma técnica poderosa que utiliza proteínas sensíveis à luz para controlar o comportamento das células com alta precisão 1,2,3. No entanto, a prototipagem de construtos optogenéticos e a identificação de condições ótimas de iluminação podem ser demoradas, dificultando a otimização de sistemas optogenéticos 4,5. Métodos de alto rendimento para selecionar e caracterizar rapidamente a atividade de sistemas optogenéticos podem acelerar o ciclo de projeto-construção-teste para prototipar construções e explorar sua função.
A plataforma Lustro foi desenvolvida como uma técnica de automação laboratorial projetada para triagem e caracterização de sistemas optogenéticos de alto rendimento. Ele integra um leitor de microplacas, dispositivo de iluminação e dispositivo de agitação com uma estação de trabalho de automação6. O Lustro combina cultura automatizada e estimulação luminosa de células em placas de micropoços (Figura 1 e Figura Suplementar 1), possibilitando a rápida triagem e comparação de diferentes sistemas optogenéticos. A plataforma Lustro é altamente adaptável e pode ser generalizada para trabalhar com outros robôs de automação laboratorial, dispositivos de iluminação, leitores de placas, tipos de células e sistemas optogenéticos, incluindo aqueles responsivos a diferentes comprimentos de onda de luz.
Este protocolo demonstra a configuração e o uso do Lustro para a caracterização de um sistema optogenético. O controle optogenético de fatores de transcrição divididos em leveduras é usado como um sistema de exemplo para ilustrar a função e utilidade da plataforma, investigando a relação entre entradas de luz e a expressão de um gene repórter fluorescente, mScarlet-I7. Ao seguir esse protocolo, os pesquisadores podem agilizar a otimização de sistemas optogenéticos e acelerar a descoberta de novas estratégias para o controle dinâmico de sistemas biológicos.
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Protocol
As linhagens de leveduras utilizadas neste estudo estão documentadas na Tabela de Materiais. Essas linhagens apresentam crescimento robusto dentro da faixa de temperatura de 22 °C a 30 °C e podem ser cultivadas em vários meios de levedura padrão.
1. Configurando a estação de trabalho de automação
- Equipe a estação de trabalho automatizada com um braço robótico de garra (RGA, ver Tabela de Materiais) capaz de mover placas de micropoços (Figura 1).
- Instale um agitador de aquecedor de microplacas (consulte Tabela de Materiais) na estação de trabalho automatizada (Figura 1(1)) com um mecanismo automático de bloqueio de placas que fornece acesso RGA.
- Posicione um leitor de microplacas adjacente à estação de trabalho automatizada (Figura 1(2)), garantindo a acessibilidade da RGA.
- Incorpore um dispositivo de iluminação de microplacas (Figura 1(3)) que permite acesso conveniente ao RGA. Exemplos incluem o optoPlate8 (como usado neste estudo) ou o LITOS9 (consulte a Tabela de Materiais).
2. Preparação do dispositivo de iluminação
- Construir e calibrar a optoPlate (ou dispositivo alternativo de iluminação) seguindo métodos estabelecidos 8,10,11.
- Utilize um adaptador no dispositivo de iluminação para permitir o acesso RGA.
- Programe o optoPlate usando uma entrada de planilha10 ou uma interface gráfica12. Siga o passo 3 para executar os programas de estimulação luminosa.
3. Projetando um programa de estimulação de luz
- Determinar as condições de luz desejadas para o experimento.
- Insira as condições de luz desejadas, incluindo intensidade da luz, hora de início da luz, comprimento do pulso, número de pulso e duração do interpulso, em uma planilha.
NOTA: Atualize essas informações no optoPlate usando as instruções fornecidas no repositório do GitHub: github.com/mccleanlab/Optoplate-96. Lembre-se de que a placa de amostra não será iluminada enquanto estiver no leitor de microplacas ou no agitador do aquecedor. A duração e a frequência desses eventos podem exigir otimização com base em requisitos experimentais específicos. - Inclua condições escuras para cada cepa para permitir medições de fundo adequadas.
- Para experimentos iniciais de caracterização para avaliar a funcionalidade do transformante, use uma alta intensidade de luz.
OBS: A intensidade luminosa deve ser otimizada para experimentos mais sensíveis, pois o excesso de luz pode ser fototóxico para leveduras13.
4. Preparação do leitor de microplacas
- Configure o leitor de microplacas para medir a quantidade desejada de interesse antes de realizar experimentos.
Observação : neste exemplo, o leitor de microplaca foi configurado para medir a fluorescência de um repórter expresso pela cepa de interesse. Outras saídas, como luminescência ou densidade óptica, podem ser usadas dependendo dos requisitos experimentais. - Cultivar a cepa de interesse (juntamente com um controle não fluorescente) em meio sintético completo (SC)14 (ou outro meio de baixa fluorescência) (ver Tabela de Materiais) para a maior densidade celular a ser medida. Transfira as culturas para uma placa de micropoço com fundo de vidro de parede preta (consulte Tabela de Materiais) e meça-as para determinar as configurações ideais do leitor de microplacas.
NOTA: Garanta leituras precisas inserindo corretamente as dimensões da placa e medindo a placa por baixo. - Consulte um banco de dados de proteínas fluorescentes (por exemplo, fpbase.org) para obter espectros aproximados de absorção e emissão para a proteína fluorescente alvo15.
- Determine o valor z (distância entre a placa e o leitor) realizando uma varredura z em poços contendo as cepas fluorescentes e não fluorescentes. Selecione o valor z que produz a maior relação sinal-ruído.
- Otimize os espectros de absorção e emissão realizando varreduras de absorção e emissão nas cepas fluorescentes e não fluorescentes para determinar a relação sinal-ruído ideal.
- Meça a deformação fluorescente com o ganho ajustado para o nível ideal, determinando o maior ganho óptico que pode ser usado sem resultar em um erro de medição de transbordamento.
NOTA: Esse ganho óptico deve ser definido manualmente de forma consistente em experimentos envolvendo a mesma deformação para garantir a consistência dos resultados. - Prepare um script de medição (consulte a Figura 2) no software leitor de microplacas. Este script configura o instrumento para medir a densidade óptica das culturas e os espectros de fluorescência de quaisquer proteínas fluorescentes a serem medidas.
NOTA: Medir a densidade óptica das estirpes a 600 nm, a menos que expressem proteínas fluorescentes vermelhas. Para cepas que expressam proteínas fluorescentes vermelhas, medir a densidade óptica a 700 nm para evitar viés16. - Defina o script de medição para manter uma temperatura de incubação interna de 30 °C durante as medições.
- Configure o script de medição para exportar os dados para uma planilha ou arquivos ASCII, de acordo com a preferência.
5. Programando o robô
- Configure a definição da mesa de trabalho no software da estação de trabalho automatizada com base no layout físico dos transportadores (por exemplo, agitadores de aquecedor, plataformas de ninho, dispositivos de iluminação) e do material de laboratório (ou seja, a placa de 96 poços) (consulte a Tabela de Materiais). Crie um script no software da estação de trabalho de automação para executar indução de luz e medições (Figura 3), seguindo as etapas abaixo.
- Desative quaisquer fontes de iluminação internas para impedir a ativação em segundo plano de sistemas optogenéticos.
- Ajuste o agitador do aquecedor para manter uma temperatura de 30 °C. Quando a placa não estiver no agitador do aquecedor, ela estará à temperatura ambiente (22 °C).
- Utilize loops, um temporizador e uma variável de contagem de loops para repetir as etapas de indução e medição das células em intervalos regulares.
- Antes de registrar as medições, agite a placa de amostra para garantir a suspensão adequada de todas as células. Uma agitação de 60 s a 1.000 rpm com um orbital de 2 mm é geralmente suficiente para ressuspender as células S288C S. cerevisiae e evitar o viés de medição.
- Mova a placa de amostra para o leitor de microplacas usando o braço do robô e remova a tampa (se aplicável) para evitar viés na medição da densidade óptica. O software de controle removerá e substituirá automaticamente a tampa para a posição designada se a definição do suporte do leitor de microplacas estiver definida para não permitir tampas.
- Execute o script de medição do leitor de microplacas conforme descrito na etapa 4.
- Substitua a tampa da placa de amostra e mova a placa para o dispositivo de iluminação usando o braço do robô.
- Defina o script para aguardar até que o temporizador atinja o intervalo de tempo especificado (por exemplo, 30 min multiplicado pela variável de contagem de loop) e, em seguida, repita o loop inteiro para o número desejado de iterações (por exemplo, 48 vezes para um experimento de 24 horas).
- Solucione possíveis erros e garanta o funcionamento adequado das definições de transportador e laboratório, bem como a capacidade do RGA de pegar e colocar a placa com precisão executando uma placa vazia através do loop de script várias vezes.
- Configure alertas de usuário para notificar o usuário sobre quaisquer alterações ou erros de estado do instrumento que possam ocorrer durante a execução do protocolo.
6. Configuração da placa de amostra
- Cultivar cepas de levedura em placas de mídia rica, como o ágar YPD17 (consulte a Tabela de Materiais). Inclua um controle não fluorescente (negativo).
- Selecionar colônias das placas e inoculá-las em 3 mL de meio SC14 (ou outro meio de baixa fluorescência, como LFM18) em tubos de cultura de vidro. Incubar as culturas durante a noite a 30 °C em um tambor de rolo, mantendo-as no escuro ou sob condições de luz não responsiva (por exemplo, luz vermelha para sistemas responsivos à luz azul).
- Medir a densidade óptica das culturas noturnas diluindo 200 μL de cada cultura em 1 mL de meio SC e registrando a densidade óptica a 600 nm (OD600) usando um espectrofotômetro ou leitor de microplacas.
- Diluir cada cultura durante a noite para um OD600 de 0,1 em tubos de cultura de vidro. Para testes de deformação de maior rendimento, execute diluições automatizadas em placas de micropoço.
- Pipetar as culturas diluídas para a placa de 96 poços. Inclua poços triplicados para cada condição (ou seja, três poços idênticos com a mesma deformação e condição de luz) para levar em conta a variação técnica. Inclua poços com meios em branco e células não fluorescentes como controles negativos para medir a fluorescência de fundo e a densidade óptica.
- Incubar a placa a 30 °C com agitação durante 5 h antes de iniciar a experiência de indução luminosa. Ajustar as quantidades de diluição e os tempos de incubação conforme necessário para otimizar para cepas específicas e condições experimentais.
7. Realização do experimento
- Coloque a placa de amostra no agitador do aquecedor e inicie o script de automação conforme descrito na etapa 5.
- Iniciar o programa de estimulação luminosa conforme descrito na etapa 3, uma vez registrada a medição inicial no leitor de placas.
- Se a estação de trabalho de automação não estiver em uma sala escura, cubra-a com uma cortina blackout para evitar a iluminação de fundo.
8. Análise dos dados
- Crie um mapa de planilha para o experimento, refletindo o layout 8 x 12 da placa de 96 poços. Certifique-se de que o mapa inclua os nomes das deformações que estão sendo medidas em uma grade e descrições das condições de luz usadas em outra grade.
- Utilize um script Python ou outra linguagem de programação preferida para analisar os dados exportados. Importe a planilha de mapa para uma matriz, associando os nomes de tensão e nomes de condição com cada poço da placa.
NOTA: O código de exemplo para análise pode ser encontrado em: https://github.com/mccleanlab/Lustro. Alternativamente, pode-se empregar um aplicativo para analisar dados de vários leitores de placas19. - Leia os dados da planilha de experimento exportada em outra matriz.
- Gere gráficos dos valores de densidade óptica e fluorescência para cada deformação e condição ao longo do tempo, conforme ilustrado na Figura 4.
- Examinar os gráficos de densidade óptica para determinar os estágios de crescimento exponencial ou saturação nas culturas. Essas informações ajudarão a selecionar os momentos apropriados para comparar as medições de fluorescência entre deformações ou condições, conforme ilustrado na Figura 5.
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Representative Results
A Figura 4A mostra os valores de fluorescência ao longo do tempo para uma cepa optogenética que expressa um repórter fluorescente controlado por um fator de transcrição dividido induzível por luz. As diferentes condições de luz utilizadas no experimento são refletidas por variações no ciclo de trabalho, que representa a porcentagem de tempo em que a luz está acesa. Observa-se que o nível de fluorescência global é proporcional ao ciclo de trabalho da estimulação luminosa. A Figura 4B exibe os valores OD700 correspondentes para o mesmo experimento. A consistência das leituras de densidade óptica em diferentes condições de luz sugere que a técnica experimental não afeta significativamente a taxa de crescimento das linhagens sob diferentes condições de luz.
Ao medir a fluorescência e a densidade óptica ao longo do tempo, uma compreensão mais profunda de como os sistemas optogenéticos respondem a diferentes programas de estimulação luminosa pode ser obtida em comparação com técnicas que capturam apenas a saída em um único ponto de tempo. Esses dados de curso de tempo são valiosos para selecionar pontos de tempo específicos para comparar diferentes cepas e condições. A Figura 5 ilustra um único ponto de tempo (medido em 10 h após a indução da luz) para duas cepas optogenéticas distintas induzidas por diferentes programas de estimulação luminosa. Ambas as cepas empregam um fator de transcrição dividido induzível à luz para conduzir a expressão de um repórter fluorescente. Variações na intensidade do pulso de luz, período e ciclo de trabalho provocam respostas diferentes nessas tensões.
Figura 1: Layout da mesa de trabalho e fluxo de trabalho experimental. Captura de tela de um layout de mesa de trabalho de amostra, denotando o movimento da placa de amostra no Lustro. A placa é movida pelo braço robótico de um agitador aquecedor (1) para o leitor de microplacas (2) e, em seguida, para o dispositivo de iluminação (3). As fotografias são fornecidas na Figura Suplementar 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Script de medição do leitor de placas. Captura de tela de amostra de um script de leitor de placas configurando o leitor de microplacas para incubar a 30 °C e registrar medições de fluorescência e densidade óptica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Script de estação de trabalho automatizado. Captura de tela de exemplo de um script de estação de trabalho automatizado para o Lustro. O script inicia um temporizador, garante que a luz interior seja desligada, define uma variável de contagem de loop para um valor inicial de 0 e define o agitador do aquecedor para incubar a 30 °C. Dentro de cada loop, a placa é travada, agitada por 1 min, movida para o leitor de placas, medida e, em seguida, movida para o dispositivo de iluminação, e o robô é configurado para esperar o restante do intervalo de loop de 30 min. No final desse tempo, a variável do contador de loop é aumentada em um, e o loop é repetido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Tempo de curso de indução. Amostra de dados do curso do tempo de indução de luz de uma deformação do fator de transcrição dividido Gal4BD-eMagA/eMagB-Gal4AD com um repórter pGAL1-mScarlet-I (yMM17346). A fluorescência do mScarlet-I7 é medida em excitação de 563 nm e emissão de 606 nm com um ganho óptico de 130. A intensidade da luz é de 125 μW/cm2 e as barras de erro representam o erro padrão das amostras em triplicata. A linha pontilhada vermelha vertical mostra quando as culturas atingem a saturação. (A) Valores de fluorescência da deformação ao longo do tempo. Os padrões de luz (conforme indicado) foram repetidos durante toda a duração do experimento mostrado. Inset mostra que os tempos de pulso de luz são intercalados com tempos de interpulso escuros, repetidos ao longo da investigação. (B) Valores de densidade óptica (medida a 700 nm) para o experimento mostrado em (A). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Comparação de diferentes sistemas optogenéticos. Comparação de diferentes programas de indução de luz entre as linhagens de fator de transcrição split CRY2(535)/CIB1 e eMagA/eMagBM com repórteres pGAL1-mScarlet-I (yMM1763 e yMM17656, respectivamente). A fluorescência do mScarlet-I7 é medida em excitação de 563 nm e emissão de 606 nm com um ganho óptico de 130. A intensidade luminosa utilizada é de 125 μW/cm2, salvo indicação em contrário. As barras de erro representam o erro padrão das amostras em triplicata (indicadas como pontos). Os valores de fluorescência mostrados foram registrados 10 h após a indução. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Imagens representativas dos dispositivos utilizados no Lustro. Imagem da configuração do Lustro e imagens ampliadas dos dispositivos utilizados. O braço robótico move a placa de amostra do agitador do aquecedor para o leitor de placas e, em seguida, para o dispositivo de iluminação em um ciclo durante todo o experimento. Os componentes são numerados com uma legenda na lateral. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
O protocolo Lustro aqui apresentado automatiza os processos de cultivo, iluminação e medição, permitindo a triagem e caracterização de sistemas optogenéticos de alto rendimento6. Isso é conseguido integrando um dispositivo de iluminação, leitor de microplacas e dispositivo de agitação em uma estação de trabalho de automação. Este protocolo demonstra especificamente a utilidade de Lustro para a triagem de diferentes construtos optogenéticos integrados à levedura S. cerevisiae e comparação de programas de indução de luz.
Vários passos cruciais enfatizados neste protocolo são essenciais para a utilização eficaz do Lustro. É necessário um projeto cuidadoso de programas de luz personalizados que se alinhem com a cinética do construto optogenético sob investigação. Além disso, a calibração precisa do leitor de placas é crucial para a obtenção de medições confiáveis. Execuções secas completas dos experimentos no robô, incluindo ajustes necessários para garantir a sincronização adequada com os programas de luz, são fundamentais para garantir que o script funcione sem problemas.
O protocolo de amostra fornecido aqui descreve a comparação de um fator de transcrição dividido induzível por luz que conduz a expressão de um repórter fluorescente a um controle não fluorescente sob várias condições de estimulação luminosa. As medições de fluorescência são tomadas de cada poço na placa em intervalos de 30 minutos, precedidas por 1 minuto de agitação no agitador do aquecedor antes da medição. Como demonstrado neste protocolo, o Lustro é adequado para uso com sistemas optogenéticos responsivos à luz azul integrados em tipos celulares não aderentes, incluindo bactérias e outras leveduras. No entanto, com pequenas modificações, o protocolo pode ser facilmente estendido para diferentes tipos celulares, sistemas optogenéticos e planejamentos experimentais. Ajustes nas configurações do leitor de placas permitiriam a medição de outras saídas além da fluorescência, como a bioluminescência. Para aplicações que exigem resolução temporal mais fina, as medições podem ser feitas com mais frequência. A incubação no agitador do aquecedor pode ser repetida com mais frequência quando crítica para tipos de células específicas que exigem agitação e controle de temperatura. A incorporação de gás e o controle ambiental, como por meio de um hotel incubado, possibilitariam a inclusão de linhagens celulares de mamíferos. Enquanto a iteração do Lustro descrita aqui usa instrumentação específica, a plataforma Lustro pode ser facilmente adaptada para trabalhar com outros robôs de automação laboratorial ou leitores de microplacas. Dispositivos de iluminação, como o LPA20 ou o LITOS9, poderiam substituir o optoPlate para estimular diferentes sistemas optogenéticos. Uma modificação futura da plataforma Lustro poderia envolver a incorporação de manuseio de líquidos para facilitar diluições automatizadas para aplicações de cultura contínua. Isso também permitiria que o Lustro fosse adaptado para o controle de feedback cibergenético, onde medições em tempo real informam mudanças nas condições de luz ou cultura para alcançar ou manter uma resposta desejada 5,21,22.
Técnicas de alto rendimento são cruciais para otimizar e aproveitar a natureza dinâmica dos sistemas optogenéticos. O Lustro supera muitas limitações dos protocolos existentes. Por exemplo, enquanto as técnicas optogenéticas baseadas em biorreatores permitem condições constantes de leitura e cultura, elas sofrem baixo rendimento23,24,25,26. O dispositivo optoPlateReader27 é promissor para experimentos de optogenética em tempo real em placas de micropoços, mas atualmente tem baixo rendimento devido à necessidade de um alto número de réplicas para obter resultados confiáveis e não fornece acesso a cultivo contínuo. O Lustro, por outro lado, permite a triagem de alto rendimento de sistemas optogenéticos para caracterizar sua atividade dinâmica. No entanto, existem algumas limitações ao protocolo de Luxo. O tremor intermitente em Lustro causa um pequeno atraso de crescimento para as células de levedura6, mas isso poderia ser resolvido adaptando-se um dispositivo de iluminação para incorporar o tremor. Outra limitação do sistema Lustro é que a placa de amostra não é incubada enquanto estiver no dispositivo de iluminação e é mantida à temperatura ambiente (22 °C). Embora o pequeno volume de cada amostra permita telas de alto rendimento, a otimização adicional das etapas de iluminação pode ser necessária ao escalar para volumes de reação maiores para bioprodução ou outras aplicações28,29.
No geral, o Lustro facilita o rápido desenvolvimento e teste de sistemas optogenéticos por meio de triagem de alto rendimento e controle preciso da luz. Esta abordagem automatizada permite a caracterização e comparação eficientes de diferentes construções optogenéticas sob várias condições de indução, levando a uma iteração e refinamento mais rápidos desses sistemas. Com sua adaptabilidade a diferentes tipos celulares, ferramentas optogenéticas e configurações de automação, o Lustro abre caminho para avanços no campo da optogenética, facilitando a exploração do controle dinâmico da expressão gênica e ampliando as possibilidades de estudo de redes biológicas e engenharia do comportamento celular.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health grant R35GM128873 e pelo National Science Foundation grant 2045493 (concedido ao M.N.M.). Megan Nicole McClean, Ph.D. tem um Prêmio de Carreira na Interface Científica do Burroughs Wellcome Fund. Z.P.H. foi apoiado por uma bolsa de treinamento do NHGRI para o Programa de Treinamento em Ciências Genômicas 5T32HG002760. Reconhecemos discussões frutíferas com os membros do laboratório McClean e, em particular, somos gratos a Kieran Sweeney por fornecer comentários sobre o manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well glass bottom plate with #1.5 cover glass | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| BioShake 3000-T elm (heater shaker) | QINSTRUMENTS | ||
| Fluent Automation Workstation | Tecan | ||
| LITOS (alternative illumination device) | Hohener, et al. Scientific Reports. 2022 | ||
| optoPlate-96 (illumination device) | Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019 | ||
| Robotic Gripper Arm | Tecan | ||
| Spark (plate reader) | Tecan | ||
| Synthetic Complete media | SigmaAldrich | Y1250 | |
| Tecan Connect (user alert app) | Tecan | ||
| yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| YPD Agar | SigmaAldrich | Y1500 |
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