Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Высокопроизводительные оптогенетические эксперименты на дрожжах с использованием автоматизированной платформы Lustro

Published: August 4, 2023 doi: 10.3791/65686
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 2University of Wisconsin Carbone Cancer Center, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health

Summary

В этом протоколе описаны шаги по использованию автоматизированной платформы Lustro для выполнения высокопроизводительной характеристики оптогенетических систем в дрожжах.

Abstract

Оптогенетика обеспечивает точный контроль над поведением клеток, используя генетически закодированные светочувствительные белки. Однако оптимизация этих систем для достижения желаемой функциональности часто требует нескольких циклов проектирования-сборки-тестирования, что может быть трудоемким и трудоемким. Чтобы решить эту проблему, мы разработали Lustro, платформу, которая сочетает в себе световую стимуляцию с лабораторной автоматизацией, обеспечивая эффективный высокопроизводительный скрининг и определение характеристик оптогенетических систем.

Lustro использует автоматизированное рабочее место, оснащенное устройством освещения, встряхивающим устройством и считывателем номерных знаков. Используя роботизированную руку, Lustro автоматизирует перемещение микролунки между этими устройствами, позволяя стимулировать оптогенетические штаммы и измерять их реакцию. Этот протокол представляет собой пошаговое руководство по использованию Lustro для характеристики оптогенетических систем для контроля экспрессии генов у почковавшихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Протокол охватывает настройку компонентов Lustro, включая интеграцию осветительного устройства с автоматизированным рабочим местом. Он также содержит подробные инструкции по программированию осветительного устройства, считывателя пластин и робота, обеспечивая бесперебойную работу и сбор данных на протяжении всего экспериментального процесса.

Introduction

Оптогенетика является мощным методом, который использует светочувствительные белки для управления поведением клеток с высокой точностью 1,2,3. Однако прототипирование оптогенетических конструкций и определение оптимальных условий освещения может занимать много времени, что затрудняет оптимизацию оптогенетических систем 4,5. Высокопроизводительные методы быстрого скрининга и определения характеристик активности оптогенетических систем могут ускорить цикл «проектирование-строительство-тестирование» для прототипирования конструкций и изучения их функций.

Платформа Lustro была разработана как метод автоматизации лаборатории, предназначенный для высокопроизводительного скрининга и характеризации оптогенетических систем. Он объединяет считыватель микропланшетов, устройство освещения и устройство встряхивания с автоматизированной рабочей станцией6. Lustro сочетает в себе автоматизированное культивирование и световую стимуляцию клеток в микролуночных планшетах (рис. 1 и дополнительный рис. 1), что позволяет проводить быстрый скрининг и сравнение различных оптогенетических систем. Платформа Lustro обладает широкими возможностями адаптации и может быть универсализирована для работы с другими роботами автоматизации лабораторий, устройствами освещения, считывателями пластин, типами клеток и оптогенетическими системами, в том числе реагирующими на различные длины волн света.

Этот протокол демонстрирует настройку и использование Lustro для характеристики оптогенетической системы. Оптогенетический контроль расщепленных транскрипционных факторов у дрожжей используется в качестве примера системы, чтобы проиллюстрировать функцию и полезность платформы путем исследования взаимосвязи между световыми входами и экспрессией флуоресцентного репортерного гена mScarlet-I7. Следуя этому протоколу, исследователи могут оптимизировать оптогенетические системы и ускорить открытие новых стратегий динамического управления биологическими системами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Штаммы дрожжей, использованные в этом исследовании, описаны в таблице материалов. Эти штаммы демонстрируют устойчивый рост в диапазоне температур от 22 °C до 30 °C и могут культивироваться в различных стандартных дрожжевых средах.

1. Настройка автоматизированного рабочего места

  1. Оснастите автоматизированную рабочую станцию роботизированным захватом (RGA, см. таблицу материалов), способным перемещать планшеты с микролунками (рис. 1).
  2. Установите встряхиватель микропластинчатого нагревателя (см. Таблицу материалов) в автоматизированное рабочее место (Рисунок 1(1)) с механизмом автоматической блокировки пластины, обеспечивающим доступ RGA.
  3. Расположите считыватель микропланшетов рядом с автоматизированной рабочей станцией (рис. 1(2)), обеспечив доступ RGA.
  4. Установите устройство подсветки на микропластинах (рис. 1(3)), обеспечивающее удобный доступ к RGA. В качестве примера можно привести optoPlate8 (используемый в данном исследовании) или LITOS9 (см. таблицу материалов).

2. Подготовка осветительного прибора

  1. Сконструировать и откалибровать оптопластину (или альтернативное осветительное устройство) в соответствии с установленными методами 8,10,11.
  2. Используйте адаптер на устройстве освещения, чтобы разрешить доступ RGA.
  3. Запрограммируйте optoPlate с помощью ввода электронной таблицы10 или графического интерфейса12. Выполните шаг 3, чтобы выполнить программы световой стимуляции.

3. Разработка программы световой стимуляции

  1. Определите желаемые условия освещения для эксперимента.
  2. Введите в электронную таблицу желаемые условия освещения, включая интенсивность света, время начала света, длину импульса, количество импульсов и длительность между импульсами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прошейте эту информацию на optoPlate, следуя инструкциям, приведенным в репозитории GitHub: github.com/mccleanlab/Optoplate-96. Помните, что планшет с образцом не будет подсвечиваться, пока он находится в считывателе микропланшетов или на шейкере нагревателя. Продолжительность и частота этих событий могут потребовать оптимизации в соответствии с конкретными экспериментальными требованиями.
  3. Учитывайте темные условия для каждого штамма, чтобы обеспечить надлежащие фоновые измерения.
  4. Для первоначальных экспериментов по определению характеристик для оценки функциональности трансформатора используйте высокую интенсивность света.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность света должна быть оптимизирована для более чувствительных экспериментов, так как чрезмерный свет может быть фототоксичным для дрожжей13.

4. Подготовка считывателя микропланшетов

  1. Настройте считыватель микропланшетов для измерения желаемого количества интересующего вас количества перед проведением экспериментов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом примере считыватель микропланшетов был сконфигурирован для измерения флуоресценции от репортера, выраженной интересующей деформацией. Другие выходы, такие как люминесценция или оптическая плотность, могут быть использованы в зависимости от требований эксперимента.
  2. Культивировать интересующий штамм (наряду с нефлуоресцентным контролем) в синтетической полной (SC) среде14 (или другой среде с низкой флуоресценцией) (см. таблицу материалов) до максимальной плотности клеток, подлежащей измерению. Перенесите культуры в микролунку со стеклянным дном и черными стенками (см. Таблицу материалов) и измерьте их, чтобы определить оптимальные настройки считывателя микропланшетов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте точные показания, правильно введя размеры пластины и измерив пластину снизу.
  3. Обратитесь к базе данных флуоресцентных белков (например, fpbase.org), чтобы получить приблизительные спектры поглощения и излучения целевого флуоресцентного белка15.
  4. Определите z-значение (расстояние между планшетом и считывателем), выполнив z-сканирование лунок, содержащих флуоресцентные и нефлуоресцентные деформации. Выберите z-значение, которое дает наибольшее отношение сигнал/шум.
  5. Оптимизируйте спектры поглощения и излучения, проводя сканирование поглощения и излучения флуоресцентных и нефлуоресцентных штаммов для определения оптимального соотношения сигнал/шум.
  6. Измерьте флуоресцентную деформацию при оптимальном уровне усиления, определив максимальное оптическое усиление, которое можно использовать без ошибки измерения переполнения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это оптическое усиление должно быть установлено вручную в экспериментах с одной и той же деформацией, чтобы обеспечить согласованность результатов.
  7. Подготовьте сценарий измерения (см. рис. 2) в программном обеспечении считывателя микропланшетов. Этот скрипт настраивает прибор для измерения оптической плотности культур и спектров флуоресценции любых флуоресцентных белков, подлежащих измерению.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Измеряйте оптическую плотность штаммов на длине волны 600 нм, если они не экспрессируют красные флуоресцентные белки. Для штаммов, экспрессирующих красные флуоресцентные белки, измеряют оптическую плотность при длине волны 700 нм, чтобы избежать смещения16.
  8. Настройте сценарий измерения на поддержание внутренней температуры инкубации 30 °C во время измерений.
  9. Настройте сценарий измерения для экспорта данных в электронную таблицу или файлы ASCII в соответствии с предпочтениями.

5. Программирование робота

  1. Настройте определение рабочего стола в программном обеспечении автоматизированной рабочей станции на основе физического расположения носителей (например, нагревательных шейкеров, платформ для гнездования, осветительных приборов) и лабораторного оборудования (например, 96-луночной пластины) (см. Таблицу материалов). Создайте сценарий в программном обеспечении автоматизированной рабочей станции для выполнения световой индукции и измерений (рис. 3), выполнив следующие действия.
  2. Отключите все внутренние источники освещения, чтобы предотвратить фоновую активацию оптогенетических систем.
  3. Установите шейкер нагревателя на поддержание температуры 30 °C. Когда пластина не находится на шейкере нагревателя, она будет иметь температуру окружающей среды (22 °C).
  4. Используйте циклы, таймер и переменную подсчета циклов, чтобы повторять шаги индуцирования и измерения клеток через равные промежутки времени.
  5. Перед записью измерений встряхните планшет с образцом, чтобы обеспечить надлежащую подвеску всех клеток. Встряхивания в течение 60 с при 1000 об/мин с орбиталью 2 мм, как правило, достаточно для ресуспендирования клеток S288C S. cerevisiae и избежания систематической ошибки измерения.
  6. Переместите планшет для образца в считыватель микропланшетов с помощью манипулятора робота и снимите крышку (если применимо), чтобы предотвратить смещение при измерении оптической плотности. Управляющее программное обеспечение автоматически снимет и установит крышку в указанное положение, если определение держателя считывателя микропланшетов установлено таким образом, чтобы крышки не допускались.
  7. Выполните сценарий измерения считывателя микропланшетов, как описано в шаге 4.
  8. Установите крышку на планшет для образца и переместите планшет к устройству освещения с помощью манипулятора робота.
  9. Настройте скрипт так, чтобы он ждал, пока таймер не достигнет указанного интервала времени (например, 30 минут, умноженных на переменную подсчета циклов), а затем повторите весь цикл для желаемого количества итераций (например, 48 раз для 24-часового эксперимента).
  10. Устраняйте потенциальные ошибки и обеспечьте надлежащее функционирование определений носителя и лабораторного оборудования, а также способность RGA точно поднимать и размещать пластину, многократно пропуская пустую пластину через цикл сценария.
  11. Настройте пользовательские оповещения, чтобы уведомлять пользователя о любых изменениях состояния прибора или ошибках, которые могут возникнуть во время выполнения протокола.

6. Настройка планшета для образцов

  1. Выращивайте штаммы дрожжей на пластинах с насыщенной средой, например, на агаре YPD17 (см. Таблицу материалов). Включите нефлуоресцентный (отрицательный) контроль.
  2. Выберите колонии из планшетов и засейте их в 3 мл среды SC14 (или другой среды с низкой флуоресценцией, например, LFM18) в стеклянные пробирки для культивирования. Инкубируйте культуры в течение ночи при температуре 30 °C на роликовом барабане, держа их в темноте или в условиях невосприимчивого освещения (например, красный свет для систем, реагирующих на синий свет).
  3. Измеряют оптическую плотность ночных культур, разбавляя 200 мкл каждой культуры в 1 мл среды SC и регистрируя оптическую плотность при длине волны 600 нм (OD600) с помощью спектрофотометра или микропланшетного ридера.
  4. Разбавляйте каждую ночную культуру до наружного диаметра600 0,1 в стеклянных пробирках для культивирования. Для более высокой производительности испытания деформации выполняйте автоматические разбавления в планшетах с микролунками.
  5. Пипетку разбавляют разведенными культурами в 96-луночный планшет. Включите три скважины для каждого условия (т. е. три одинаковые скважины с одинаковой деформацией и состоянием освещенности), чтобы учесть технические различия. Включите лунки с пустыми средами и нефлуоресцентными ячейками в качестве негативного контроля для измерения фоновой флуоресценции и оптической плотности.
  6. Перед началом эксперимента по индукции света инкубируйте планшет при температуре 30 °C при встряхивании в течение 5 часов. При необходимости отрегулируйте количество разведения и время инкубации для оптимизации для конкретных штаммов и условий эксперимента.

7. Проведение эксперимента

  1. Поместите пластину с образцом на шейкер нагревателя и запустите сценарий автоматизации, как описано в шаге 5.
  2. Запустите программу световой стимуляции, как описано в шаге 3, после того, как будет записано первоначальное измерение на считывателе пластин.
  3. Если рабочее место автоматики находится не в темном помещении, накройте его плотной шторой, чтобы избежать фонового освещения.

8. Анализ данных

  1. Создайте карту электронной таблицы для эксперимента, отражающую компоновку 96-луночного планшета размером 8 x 12. Убедитесь, что карта содержит названия штаммов, измеряемых в одной сетке, и описания условий освещения, используемых в другой сетке.
  2. Используйте скрипт Python или другой предпочтительный язык программирования для анализа экспортируемых данных. Импортируйте электронную таблицу карты в массив, связав названия деформаций и состояний с каждой лункой планшета.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пример кода для анализа можно найти по адресу: https://github.com/mccleanlab/Lustro. В качестве альтернативы можно использовать приложение для анализа данных с различных считывателей пластин19.
  3. Считывание данных из экспортированной таблицы эксперимента в другой массив.
  4. Постройте графики значений оптической плотности и флуоресценции для каждого штамма и состояния с течением времени, как показано на рисунке 4.
  5. Изучите графики оптической плотности, чтобы определить стадии экспоненциального роста или насыщения культур. Эта информация поможет выбрать подходящие моменты времени для сравнения измерений флуоресценции между штаммами или условиями, как показано на рисунке 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 4А показаны значения флуоресценции с течением времени для оптогенетического штамма, экспрессирующего флуоресцентный репортер, контролируемый светоиндуцируемым расщепленным транскрипционным фактором. Различные условия освещения, используемые в эксперименте, отражаются изменениями в рабочем цикле, который представляет собой процент времени, в течение которого свет включен. Общий уровень флуоресценции пропорционален скважности световой стимуляции. На рисунке 4B показаны соответствующие значения OD700 для того же эксперимента. Постоянство показаний оптической плотности при различных условиях освещения позволяет предположить, что экспериментальная методика не оказывает существенного влияния на скорость роста штаммов при различных условиях освещения.

Измеряя флуоресценцию и оптическую плотность с течением времени, можно получить более глубокое понимание того, как оптогенетические системы реагируют на различные программы световой стимуляции по сравнению с методами, которые регистрируют выходные данные только в один момент времени. Эти данные о временном цикле полезны для выбора конкретных моментов времени для сравнения различных штаммов и условий. На рисунке 5 показана одна временная точка (измеренная через 10 часов после начала световой индукции) для двух различных оптогенетических штаммов, индуцированных различными программами световой стимуляции. Оба штамма используют светоиндуцируемый расщепленный транскрипционный фактор для управления экспрессией флуоресцентного репортера. Изменения интенсивности светового импульса, периодичности и скважности вызывают различную реакцию на эти деформации.

Figure 1
Рисунок 1: Макет рабочей таблицы и экспериментальный рабочий процесс. Снимок экрана образца макета рабочего стола, обозначающий перемещение образца пластины в Lustro. Пластина перемещается роботизированной рукой от шейкера нагревателя (1) к считывателю микропластин (2), а затем к устройству освещения (3). Фотографии представлены на дополнительном рисунке 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Сценарий измерения считывателя пластин. Пример скриншота скрипта считывателя пластин, настраивающего считыватель микропланшетов на инкубацию при 30 °C и записывающий измерения флуоресценции и оптической плотности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Сценарий автоматизированной рабочей станции. Пример скриншота скрипта автоматизированной рабочей станции для Lustro. Сценарий запускает таймер, следит за тем, чтобы внутреннее освещение было выключено, устанавливает переменную подсчета циклов в начальное значение 0 и настраивает шейкер нагревателя на инкубацию при 30 °C. Внутри каждой петли пластина блокируется, встряхивается в течение 1 минуты, перемещается к считывателю пластин, измеряется, затем перемещается к устройству освещения, и робот настраивается на ожидание оставшейся части 30-минутного интервала петли. По истечении этого времени переменная счетчика цикла увеличивается на единицу, и цикл повторяется. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Время индукции. Выборка данных о времени индукции света из штамма расщепленного транскрипционного фактора Gal4BD-eMagA/eMagB-Gal4AD с репортером pGAL1-mScarlet-I (yMM17346). Флуоресценция mScarlet-I7 измеряется при возбуждении 563 нм и излучении 606 нм с оптическим коэффициентом усиления 130. Интенсивность света составляет 125 мкВт/см2 , а столбцы погрешности представляют собой стандартную ошибку тройных образцов. Вертикальная красная пунктирная линия показывает, когда культуры достигают насыщения. (A) Значения флуоресценции штамма с течением времени. Световые паттерны (как указано) повторялись в течение всего показанного эксперимента. На врезке показано, что время светового импульса перемежается с темным межимпульсным временем, повторяющимся на протяжении всего исследования. (B) Значения оптической плотности (измеренные при длине волны 700 нм) для эксперимента, показанного на рисунке (A). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Сравнение различных оптогенетических систем. Сравнение различных программ световой индукции между штаммами транскрипционного фактора расщепления CRY2(535)/CIB1 и eMagA/eMagBM с репортерами pGAL1-mScarlet-I (yMM1763 и yMM17656 соответственно). Флуоресценция mScarlet-I7 измеряется при возбуждении 563 нм и излучении 606 нм с оптическим коэффициентом усиления 130. Используемая интенсивность света составляет 125 мкВт/см2, если не указано иное. Столбцы погрешности представляют собой стандартную ошибку трех образцов (обозначаются точками). Показанные значения флуоресценции были зарегистрированы через 10 ч после индукции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Репрезентативные изображения устройств, используемых в Lustro. Изображение установки Lustro и увеличенные изображения используемых устройств. Роботизированная рука перемещает планшет с образцом от шейкера нагревателя к считывателю, а затем к устройству освещения в цикле на протяжении всего эксперимента. Компоненты пронумерованы с помощью условных обозначений сбоку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Протокол Lustro, представленный здесь, автоматизирует процессы культивирования, освещения и измерения, обеспечивая высокопроизводительный скрининг и определение характеристик оптогенетических систем6. Это достигается за счет интеграции осветительного устройства, считывателя микропланшетов и встряхивающего устройства в автоматизированную рабочую станцию. Этот протокол, в частности, демонстрирует полезность Lustro для скрининга различных оптогенетических конструкций, интегрированных в дрожжи S. cerevisiae, и сравнения программ световой индукции.

Несколько важных шагов, подчеркнутых в этом протоколе, имеют важное значение для эффективного использования Lustro. Необходима тщательная разработка индивидуальных световых программ, которые согласуются с кинетикой исследуемой оптогенетической конструкции. Кроме того, точная калибровка считывателя пластин имеет решающее значение для получения надежных измерений. Тщательные пробные запуски экспериментов на роботе, включая необходимые корректировки для обеспечения надлежащей синхронизации со световыми программами, имеют решающее значение для обеспечения бесперебойной работы скрипта.

Приведенный здесь пример протокола описывает сравнение светоиндуцируемого расщепленного транскрипционного фактора, управляющего экспрессией флуоресцентного репортера, с нефлуоресцентным контролем при различных условиях световой стимуляции. Измерения флуоресценции проводятся из каждой лунки в планшете с интервалом в 30 минут, которым предшествует 1 минута встряхивания на нагревателе перед измерением. Как показано в этом протоколе, Lustro подходит для использования с оптогенетическими системами, реагирующими на синий свет, интегрированными в неадгезивные типы клеток, включая бактерии и другие дрожжи. Тем не менее, с незначительными изменениями протокол может быть легко расширен на различные типы клеток, оптогенетические системы и экспериментальные дизайны. Корректировка настроек планшетного считывателя позволит измерять выходы, отличные от флуоресценции, такие как биолюминесценция. Для приложений, требующих более высокого временного разрешения, измерения можно проводить чаще. Инкубацию на нагревательном шейкере можно повторять чаще, когда это критично для определенных типов клеток, требующих встряхивания и контроля температуры. Включение газового и экологического контроля, например, через инкубационный отель, позволило бы включить клеточные линии млекопитающих. В то время как описанная здесь итерация Lustro использует специальные приборы, платформа Lustro может быть легко адаптирована для работы с другими роботами для автоматизации лабораторий или считывателями микропланшетов. Осветительные приборы, такие как LPA20 или LITOS9, могут заменить optoPlate для стимуляции различных оптогенетических систем. Будущая модификация платформы Lustro может включать в себя интеграцию работы с жидкостями для облегчения автоматизированного разбавления для непрерывного культивирования. Это также позволило бы адаптировать Lustro для управления кибергенетической обратной связью, где измерения в режиме реального времени информируют об изменениях в условиях освещения или культуры для достижения или поддержания желаемого отклика 5,21,22.

Высокопроизводительные методы имеют решающее значение для оптимизации и использования динамической природы оптогенетических систем. Lustro преодолевает многие ограничения существующих протоколов. Например, несмотря на то, что оптогенетические методы на основе биореакторов обеспечивают постоянное считывание и культивирование, они страдают от низкой пропускной способности23,24,25,26. Устройство optoPlateReader27 перспективно для оптогенетических экспериментов в реальном времени на микролуночных планшетах, но в настоящее время имеет низкую пропускную способность из-за необходимости большого количества репликаций для получения достоверных результатов и не обеспечивает доступ к непрерывному культивированию. Lustro, с другой стороны, позволяет проводить высокопроизводительный скрининг оптогенетических систем для характеристики их динамической активности. Тем не менее, у протокола Lustro есть некоторые ограничения. Прерывистое встряхивание в Lustro вызывает небольшую задержку роста дрожжевых клеток6, но эту проблему можно устранить, приспособив осветительное устройство для включения встряхивания. Еще одним ограничением системы Lustro является то, что планшет для образцов не инкубируется на осветительном устройстве и поддерживается при температуре окружающей среды (22 °C). Несмотря на то, что небольшой объем каждого образца позволяет использовать высокопроизводительные экраны, при масштабировании до больших объемов реакции для биопроизводства или других применений может потребоваться дополнительная оптимизация этапов освещения28,29.

В целом, Lustro способствует быстрой разработке и тестированию оптогенетических систем с помощью высокопроизводительного скрининга и точного управления светом. Этот автоматизированный подход позволяет эффективно характеризовать и сравнивать различные оптогенетические конструкции в различных условиях индукции, что приводит к более быстрой итерации и уточнению этих систем. Благодаря своей адаптивности к различным типам клеток, оптогенетическим инструментам и автоматизированным установкам, Lustro прокладывает путь к достижениям в области оптогенетики, облегчая исследование динамического контроля экспрессии генов и расширяя возможности для изучения биологических сетей и инженерии клеточного поведения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантом Национального института здравоохранения R35GM128873 и грантом Национального научного фонда 2045493 (присужден M.N.M.). Меган Николь Макклин, доктор философии, имеет награду за карьеру в Scientific Interface от Burroughs Wellcome Fund. Z.P.H. был поддержан грантом NHGRI на обучение в рамках учебной программы геномных наук 5T32HG002760. Мы признательны за плодотворные дискуссии с сотрудниками лаборатории McClean, и, в частности, благодарны Кирану Суини (Kieran Sweeney) за комментарии к рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well glass bottom plate with  #1.5 cover glass Cellvis P96-1.5H-N
BioShake 3000-T elm (heater shaker) QINSTRUMENTS
Fluent Automation Workstation Tecan
LITOS (alternative illumination device) Hohener, et al. Scientific Reports. 2022
optoPlate-96 (illumination device) Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019
Robotic Gripper Arm Tecan
Spark (plate reader) Tecan
Synthetic Complete media SigmaAldrich Y1250
Tecan Connect (user alert app) Tecan
yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
YPD Agar SigmaAldrich Y1500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pérez, A. L. A., et al. Optogenetic strategies for the control of gene expression in yeasts. Biotechnology Advances. 54, 107839 (2022).
  2. Lan, T. -H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering. Trends in Genetics. 38 (12), 1253-1270 (2022).
  3. Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature Chemical Biology. 10, 502-511 (2014).
  4. Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo Activities of Light Inducible Dimers: a Cellular Optogenetics Guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
  5. Scott, T. D., Sweeney, K., McClean, M. N. Biological signal generators: integrating synthetic biology tools and in silico control. Current Opinion in Systems Biology. 14, 58-65 (2019).
  6. Harmer, Z. P., McClean, M. N. Lustro: High-throughput optogenetic experiments enabled by automation and a yeast optogenetic toolkit. ACS Synthetic Biology. 12 (7), 1943-1951 (2023).
  7. Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
  8. Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
  9. Höhener, T. C., Landolt, A. E., Dessauges, C., Hinderling, L., Gagliardi, P. A., Pertz, O. LITOS: a versatile LED illumination tool for optogenetic stimulation. Scientific Reports. 12 (1), 13139 (2022).
  10. Grødem, E. O., Sweeney, K., McClean, M. N. Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments. BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).
  11. Dunlop, M. J. A supplemental guide to building the optoPlate-96. , https://www.protocols.io/view/a-supplemental-guide-to-building-the-optoplate-96-b2vwqe7e (2021).
  12. Thomas, O. S., Hörner, M., Weber, W. A graphical user interface to design high-throughput optogenetic experiments with the optoPlate-96. Nature Protocols. 15 (9), 2785-2787 (2020).
  13. Robertson, J. B., Davis, C. R., Johnson, C. H. Visible light alters yeast metabolic rhythms by inhibiting respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21130-21135 (2013).
  14. Synthetic Complete (SC) Medium. 2016 (11), Cold Spring Harbor Protocols. (2016).
  15. Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
  16. Hecht, A., Endy, D., Salit, M., Munson, M. S. When wavelengths collide: bias in cell abundance measurements due to expressed fluorescent proteins. ACS Synthetic Biology. 5 (9), 1024-1027 (2016).
  17. YPD media. 2010 (9), Cold Spring Harbor Protocols. (2010).
  18. Low-Fluorescence Yeast Nitrogen Base without Riboflavin and Folic Acid Medium (LFM). 2016 (11), Cold Spring Harbor. (2016).
  19. Csibra, E., Stan, G. -B. Parsley: a web app for parsing data from plate readers. Zenodo. , (2023).
  20. Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6 (1), 35363 (2016).
  21. Gutiérrez Mena, J., Kumar, S., Khammash, M. Dynamic cybergenetic control of bacterial co-culture composition via optogenetic feedback. Nature Communications. 13, 4808 (2022).
  22. Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
  23. Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546 (2016).
  24. Bertaux, F., et al. Enhancing bioreactor arrays for automated measurements and reactive control with ReacSight. Nature Communications. 13 (1), 3363 (2022).
  25. Benisch, M., Benzinger, D., Kumar, S., Hu, H., Khammash, M. Optogenetic closed-loop feedback control of the unfolded protein response optimizes protein production. Metabolic Engineering. 77, 32-40 (2023).
  26. Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative Biology. 6 (3), 366-372 (2014).
  27. Datta, S., et al. High-throughput feedback-enabled optogenetic stimulation and spectroscopy in microwell plates. bioRxiv. , (2022).
  28. Pouzet, S., et al. Optogenetic control of beta-carotene bioproduction in yeast across multiple lab-scales. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 11, 1085268 (2023).
  29. Pouzet, S., Banderas, A., Le Bec, M., Lautier, T., Truan, G., Hersen, P. The promise of optogenetics for bioproduction: dynamic control strategies and scale-up instruments. Bioengineering. 7 (4), 151 (2020).

Tags

Высокопроизводительные оптогенетические эксперименты Автоматизированная платформа LustroOptogenetics Генетически кодируемые светочувствительные белки Оптимизация Циклы проектирования-сборки-тестирования Трудоемкий трудоемкий Платформа Lustro Световая стимуляция Автоматизация лаборатории Высокопроизводительный скрининг Определение характеристик Автоматизированная рабочая станция Устройство освещения Устройство для встряхивания Считыватель пластин Роботизированная рука Движение планшета в микролунках Стимуляция оптогенетических штаммов Измерение ответа Экспрессия генов Контроль Почкование дрожжей Saccharomyces Cerevisiae Настройка протокола Интеграция Осветительного Устройства С Автоматизированной Рабочей Станцией Программирование Осветительного Устройства Считыватель Пластин И Робот
Высокопроизводительные оптогенетические эксперименты на дрожжах с использованием автоматизированной платформы Lustro
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Harmer, Z. P., McClean, M. N.… More

Harmer, Z. P., McClean, M. N. High-Throughput Optogenetics Experiments in Yeast Using the Automated Platform Lustro. J. Vis. Exp. (198), e65686, doi:10.3791/65686 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter