Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Genetisk profilering og genomskala frafallsscreening for å identifisere terapeutiske mål i musemodeller av ondartet perifer nerveskjede tumor

Published: August 25, 2023 doi: 10.3791/65430
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1,2
1Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 3Department of Computational Medicine and Bioinformatics, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Vi har utviklet en komparativ onkogenomisk tilnærming på tvers av arter som bruker genomiske analyser og funksjonelle genomiske skjermer for å identifisere og sammenligne terapeutiske mål i svulster som oppstår i genetisk konstruerte musemodeller og den tilsvarende humane tumortypen.

Abstract

Ondartede perifere nerveskjede svulster (MPNST) er avledet fra Schwann-celler eller deres forløpere. Hos pasienter med tumorfølsomhetssyndromet nevrofibromatose type 1 (NF1) er MPNST den vanligste maligniteten og den viktigste dødsårsaken. Disse sjeldne og aggressive bløtvevsarkomene tilbyr en sterk fremtid, med 5-års sykdomsfri overlevelse på 34-60%. Behandlingsmuligheter for personer med MPNST er skuffende begrenset, med skjemmende kirurgi som det fremste behandlingsalternativet. Mange en gang lovende terapier som tipifarnib, en hemmer av Ras-signalering, har mislyktes klinisk. På samme måte har fase II kliniske studier med erlotinib, som retter seg mot epidermal vekstfaktor (EFGR), og sorafenib, som retter seg mot vaskulær endotelial vekstfaktorreseptor (VEGF), blodplateavledet vekstfaktorreseptor (PDGF) og Raf, i kombinasjon med standard kjemoterapi, heller ikke gitt respons hos pasienter.

I de senere år har funksjonelle genomiske screeningsmetoder kombinert med genetisk profilering av kreftcellelinjer vist seg nyttige for å identifisere viktige cytoplasmatiske signalveier og utvikling av målspesifikke terapier. Når det gjelder sjeldne tumortyper, brukes en variasjon av denne tilnærmingen kjent som komparativ onkogenomikk på tvers av arter i økende grad for å identifisere nye terapeutiske mål. I komparativ onkogenomikk på tvers av arter utføres genetisk profilering og funksjonell genomikk i genetisk utviklede musmodeller (GEM), og resultatene blir deretter validert i de sjeldne humane prøvene og cellelinjene som er tilgjengelige.

Denne artikkelen beskriver hvordan man identifiserer kandidatdrivergenmutasjoner i MPNST-celler fra mennesker og mus ved bruk av hele eksomsekvensering (WES). Vi beskriver deretter hvordan man utfører genomskala shRNA-skjermer for å identifisere og sammenligne kritiske signalveier i mus og humane MPNST-celler og identifisere medisinerbare mål i disse veiene. Disse metodene gir en effektiv tilnærming til å identifisere nye terapeutiske mål i en rekke humane krefttyper.

Introduction

Ondartede perifere nerveskjede svulster (MPNST) er svært aggressive spindelcellesvulster som oppstår i forbindelse med tumorfølsomhetssyndromet nevrofibromatose type 1 (NF1), sporadisk i den generelle befolkningen og på steder av tidligere strålebehandling 1,2,3. NF1-pasienter er født med en villtypekopi av NF1-tumorsuppressorgenet og et andre NF1-allel med en funksjonstapsmutasjon. Denne tilstanden av haploinsuffisiens gjør NF1-pasienter utsatt for en andre tap av funksjonsmutasjon i deres villtype NF1-gen, noe som utløser tumorigenese. Når denne "andre hit" NF1-mutasjonen forekommer i en celle i Schwann-cellelinjen, er den resulterende svulsten enten et dermalt nevrofibrom som oppstår i huden eller et plexiform nevrofibrom som utvikler seg i store nerver eller nerveplexuser. Selv om patologien til dermale og pleksiforme nevrofibromer er identiske, er deres biologiske oppførsel ganske annerledes, selv om både dermal og plexiform nevrofibromer er godartede, kan bare pleksiforme nevrofibromer gjennomgå transformasjon og gi opphav til MPNST. I tillegg til tap av nevrofibromin, Ras GTPase-aktiverende protein kodet av NF1-genet, bærer MPNST mutasjoner av flere andre tumorsuppressorgener, inkludert TP53 4,5,6,7, CDKN2A 8,9 og PTEN 10, mutasjoner av gener som koder for komponenter av polycomb repressivt kompleks 2 11,12 (PRC2 ; SUZ12- og EED-gener) og avvikende ekspresjon av reseptortyrosinkinaser 1,2. Mutasjoner av NF1 og de andre genene nevnt ovenfor er også tilstede i sporadiske og strålingsinduserte MPNST 11,12.

Selv om disse fremskrittene i vår forståelse av genomiske abnormiteter i MPNST har vært uvurderlige for å forstå deres patogenese, har de ennå ikke resultert i utvikling av effektive nye terapier for MPNST. En stor barriere som hindrer utviklingen av nye behandlinger er det faktum at MPNST er sjeldne kreftformer. På grunn av dette er det vanskelig å få tak i det store antallet pasientprøver som kreves for globale analyser som definerer viktige drivermutasjoner som de som utføres av The Cancer Genome Atlas (TCGA). Vår erfaring er at det kan ta flere år å samle selv et beskjedent antall humane MPNST-prøver. For å overvinne slike begrensninger har mange etterforskere som studerer andre sjeldne krefttyper, vendt seg til bruk av komparativ onkogenomikk på tvers av arter for å identifisere essensielle drivergenmutasjoner, definere de essensielle cytoplasmatiske signalveiene i deres svulst av interesse og identifisere nye terapeutiske mål. Siden signalveiene som er essensielle for tumorigenese er svært konservert mellom mennesker og andre virveldyrarter, kan bruk av funksjonelle genomikktilnærminger som genomskala shRNA-skjermer være et effektivt middel til å identifisere disse nye drivermutasjonene, signalveiene og terapeutiske mål 13,14,15,16,17,18,19, spesielt når man studerer sjeldne humane tumortyper som er tilgjengelige i begrensende antall20.

I metodene som presenteres her, beskriver vi denne tilnærmingen til å utføre genomisk profilering i humane MPNST-cellelinjer og tidlig passasje MPNST-kulturer avledet fra P 0-GGFβ3-mus, en genetisk konstruert musemodell (GEM) der Schwann-cellespesifikk overekspresjon av vekstfaktoren neuregulin-1 (NRG1) fremmer patogenesen av pleksiforme nevrofibromer og deres påfølgende progresjon til MPNST21, 22,23. Det første trinnet i denne tilnærmingen er å identifisere kandidatdrivergener i P 0-GGFβ3 MPNST, humane MPNST-cellelinjer og kirurgisk resekterte humane MPNSTer. For å funksjonelt validere signalveiene som er berørt av disse mutasjonene, bruker vi deretter genomskala shRNA-skjermer for å identifisere genene som kreves for spredning og overlevelse i humane og mus MPNST-cellelinjer. Etter å ha identifisert genene som kreves for spredning og overlevelse, identifiserer vi deretter de medisinerbare genproduktene i samlingen av "treff" ved hjelp av Drug Gene Interaction Database. Vi sammenligner også "treffene" i MPNST-celler fra mennesker og mus for å avgjøre om GEM-modellen og humane MPNST viser lignende avhengighet av de samme genene og signalveiene. Identifisering av overlapping i gener som kreves for spredning og overlevelse og de berørte signalveiene tjener som et middel til å validere P 0-GGFβ3 musemodellen på molekylært nivå. Denne tilnærmingen understreker også effektiviteten av å kombinere menneskelige og museskjermer for å identifisere nye terapeutiske mål, der musemodellen kan tjene som et supplement til de menneskelige skjermene. Verdien av denne kryssartede tilnærmingen er spesielt tydelig når man ser etter terapeutiske mål i sjeldne svulster, hvor humane svulster og cellelinjer er vanskelige å oppnå.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Før oppstart av studiene, har dyreprosedyrer og protokoller for håndtering av virale vektorer gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og Institutional Biosafety Committee (IBC). Prosedyrene beskrevet her ble godkjent av Medical University of South Carolina IACUC og IBC Boards og ble utført av riktig opplært personell i samsvar med NIH Guide for Care and Use of Laboratory Animals og MUSCs institusjonelle dyrepleieretningslinjer.

1. WES-Seq-analyser og identifisering av patogene varianter

  1. Isoler genomisk DNA fra en tumorprøve eller subkonfluent (70%) MPNST-celler dyrket på en 60 mm tallerken, ved hjelp av standard kommersielt tilgjengelige adsorpsjonssilikagelbaserte metoder (se produsentens protokoll for detaljerte trinn). Den generelle arbeidsflyten er diagrammet i figur 1.
  2. Send minst 10 μL genomisk DNA ved 50 ng / μL til sekvenseringskjernen, med mindre forskjellige mengder eller konsentrasjoner av genomisk DNA er spesifisert.
    1. Kjerneanlegget fragmenterer det genomiske DNA ved sonikering og renser det deretter ved hjelp av den foretrukne metoden. Eksomfangst og bibliotekkonstruksjon utføres ved hjelp av det foretrukne eksomsekvenseringssettet, og indekskoder legges til det forsterkede fangede eksomet.
    2. Send prøver til sekvenseringskjernen for å få utført hele eksomparet sekvensering (WES; 100 bp sekvensert fra hver ende).
    3. FASTQ-filer generert av kjernen leveres til etterforskeren. Bruk bare FASTQ-filer som består kvalitetsberegninger for analyse.
  3. Juster og analyser FASTQ-filene ved hjelp av kommersielt tilgjengelige programmer (f.eks. DNAStar19,20, Partek21 eller Varsome). Juster FASTQ-filene til musereferansegenomet GRCm38/mm10 ved hjelp av standardinnstillingene.
    MERK: Ved å bruke DNAStar og en MPNST-prøve fra mus som et eksempel, er den generelle arbeidsflyten diagrammet i Figur 1 og kort forklart nedenfor.
    1. Åpne DNAStar programvare og velg SeqMan NGen arbeidsflyt.
    2. Velg Arbeidsflyt ved å velge Variantanalyse/Resekvensering og typen sekvenseringsanalyse NGS-basert forsterker, genpanel eller eksom. Klikk på Neste.
    3. Velg den foretrukne referansesekvensen ved å velge Last ned genompakke og riktig referansegenom (dvs. Mus_musculus-GRCm38-dbSNP146.zip eller Homo sapien-GRCh37.p13.zip). Hvis kjernefasiliteten ga en sengefil, last opp denne tilleggsfilen. Klikk på Neste.
    4. Velg Inndatasekvenser ved å velge riktig sequencerteknologi, Illumina, og angi at sekvensavlesningene er paret. Velg deretter eksperimentoppsettet, flereksemplet og last opp sekvenserings-FASTQ-filene ved å velge Legg til. Hvis du kjører flere prøver, angir du hvert sammenkoblede sett med et unikt eksperiment eller prøvenavn Tumor, Cell line eller A18, A202 ... Klikk på Neste.
    5. Angi kontrolldatasettet hvis det finnes et. Klikk Neste, og klikk Neste på nytt under Sammenstillingsalternativer. Under Analysealternativer klikker du den aktuelle variantdeteksjonsmodusen som Diploid, og deretter klikker du Neste. Under Assembly Output, navngi og angi filsparingsstedet for prosjektet; klikk på Neste. Kjør samlingen på den lokale datamaskinen eller skyen.
      MERK: De resulterende justeringsfilene kan åpnes i ArrayStar-arbeidsflyten for variantmerknad av oppdagede single nucleotide polymorphisms (SNPs). Denne arbeidsflyten oppdager SNP-er, ikke gevinster eller tap av genkopinummer. En egen analyse kalt SNP-array med høy tetthet oppdager kopinummerendringer; Hele eksomsekvensering oppdager ikke pålitelig kopinummerendringer. Se programmets brukerhåndbok for de spesifikke trinnene som skal utføres med justeringsprogrammet.
    6. Bruk brukerdefinerte filtre på variantmerknaden for oppdagede SNP-er for å inkludere eller ekskludere bestemte data. For å få en komprimert liste over sannsynlige funksjonelt relevante varianter, bruk følgende filtre på variantdatasettene i dette hierarkiet: ikke i kontroll (hvis en normal kontrollprøve er tilgjengelig), populasjonsfrekvens (gnomAD, ExAC, 1000 genomfrekvenser), allelfrekvens (inkluderer ≤0,001 eller 0,1%), dekningsdybde (unntatt <10 dybde), patogenisitet eller ClinVar-klasse (inkluderer: patogen, sannsynlig patogen; ekskluderer: usikker, sannsynlig godartet, godartet), og om ønskelig SNP-type og kodingspåvirkning (inkluderer: ikke-synonymt, missense, tull, frameshift, in-frame, spleising).
      MERK: En kjent relevant kreftgenliste kan også brukes på den endelige listen for å trekke bare spesifikke sykdomsrelevante gener, se trinn 1.3.7. Disse filtrene kan redusere variantgenlisten ned til mindre enn 20 gener.
      1. Bruk variantallelfrekvensen til å filtrere ut SNPer for sekvenseringsfeil. Homozygote og heterozygote varianter vil være representert omtrent 100 % og 50 % for en ren, ikke-forurensende cellepopulasjon (en etablert tumoravledet cellelinje bør representere en enkelt populasjon av isogene tumorceller). I dette tilfellet, bruk 100-90% og 50-40% allelfrekvenser for varianter som et filter, og fjern dermed eventuelle varianter under det. Hvis SNP-matrisedata med høy tetthet også er tilgjengelige for det samme datasettet, kan du bruke kopinummergevinst eller -tap på SNP-er med variantallelfrekvenser mindre enn homozygote eller heterozygote forhold (dvs. kopinummerforsterkning som resulterer i 2 kopier av allel A og 1 kopi av allel B vil gi passende variantallelfrekvenser på 75 %, 25 % henholdsvis).
    7. Etter å ha identifisert patogene varianter med ArrayStar, eksporter og lagre variantgenlisten som en csv-, txt- eller xls-fil og sammenlign genene som inneholder disse mutasjonene med de i kohorten av P 0-GGFβ3-genererte svulster for å bestemme overlappende og unike muterte genlister. Sammenlign de muterte genene med kjente muterte gener assosiert med deres menneskelige kolleger (dvs. Bushman Lab Cancer Gene list eller en brukerkuratert liste).
      1. Før du bruker brukerdefinerte filtre (1.3.6), eksporterer og lagrer du den kommenterte filen som en VCF-fil.
        MERK: Denne VCF-filen kan lastes opp til annen variant effektor prediktor programvare Varsome eller VEP for sammenligning som en sekundær analyse. Biologisk og baneanalyse kan også utføres på de filtrerte variantgenlistene.
    8. Utføre funksjonell klassifisering av variantgenliste via en brukerforetrukket database for å oppnå proteinklasse, vei, veikomponent og genfamilie og ontologiinformasjon.
      MERK: PANTHER (pantherdp.org) er brukt som eksempel her.
      1. Last opp filtrert genliste med gen-ID.
      2. Velg organismen (Mus musculus).
      3. Velg analyse (Funksjonell klassifisering vist i genliste) og klikk på Send inn biologisk og veianalyse på filtrerte variantgenlister.

2. Genomskala shRNA-skjermer

MERK: Flere shRNA- og CRISPR-biblioteker er tilgjengelige som kan brukes til funksjonelle skjermer i genomskala med svulstkulturer med lav passasje. Her beskriver vi bruken av CELLECTA DECIPHER shRNA-biblioteker som et eksempel. CELLECTA DECIPHER lentiviral shRNA biblioteker er optimalisert for RNAi genetiske skjermer i samlet format. Hvert transkripsjon er målrettet av minst 5-6 unike shRNAer, og hver lentiviral shRNA-vektor inneholder en unik genetisk strekkode flankert av PCR-primersteder. Disse bibliotekene dekker de fleste sykdomsrelevante gener for mennesker og mus, men dekker ikke alle gener i genomet. Cellecta humanbibliotek plasmid DNA-bassenger er tilgjengelige i tre moduler (Human Module I, II, III; mål 15,377 gener) mens musebibliotekets plasmidbassenger er tilgjengelige i to moduler (Mouse Modules I og II; mål 9,145 gener). Disse bibliotekene brukes til å utføre "drop out" -analyser der målrettede gener som kreves for spredning og / eller overlevelse uttrykkes differensielt på forskjellige tidspunkter etter viral transduksjon.

  1. Lentiviral emballasje
    1. Dag 0: Tallerken 10 retter med 10 millioner 293T-celler/15 cm tallerken i 30 ml/oppvask antibiotikafri DMEM inneholdende 10% føtal bovint serum (FBS).
    2. Dag 1: Bekreft at cellene er ~ 80% sammenflytende neste dag og klar til å transfektere. I et 50 ml konisk rør, bland følgende i denne rekkefølgen: 600 mikrol emballasjeplasmidblanding (0,5 μg / μL), 60 mikrol plasmid strekkodebibliotek, 12 ml DMEM (ingen serum eller antibiotika) og 600 mikrol transfeksjonsreagens. Inkuber ved romtemperatur i 15 minutter.
    3. Plasser 900 μL transfeksjonsreagens og 12 ml DMEM i et separat 15 ml konisk rør og bland ved virvel. Tilsett 12,9 ml av transfeksjonsreagenset/DMEM-blandingen til DNA-blandingen og flikk for å blande. Inkuber ved romtemperatur i 15 minutter uten ytterligere blanding. Tilsett 2,5 ml av denne blandingen, dråpemessig, til hver 15 cm tallerken med 293T-celler og inkuber over natten i en vevskulturinkubator.
    4. Dag 2: Erstatt media neste dag med vanlige vekstmedier som inneholder antibiotika.
    5. Dag 3: Høst viruset ved å samle media og føre det gjennom en 0,2 μm filtreringsenhet og aliquoting i 15 ml koniske rør; Forbered også fem 1 ml alikoter av filtrert virus i kryovialer for bruk i viral titering (betraktet som 48 H-virus); Oppbevar viruset i fryser ved -80 °C. Bytt ut medier med 30 ml vekstmedier på platene, ett om gangen for å unngå uttørking av celler.
    6. Dag 4: Høst virus ved å samle media og sende det gjennom en 0,2 μm filtreringsenhet. Aliquot virus i 15 ml koniske rør. Dette regnes som 72 h virus; Oppbevar viruset i fryser ved -80 °C.
  2. Titer Lentiviral bassenger
    1. Tilsett 65 μL kationisk polymer (10 mg / ml) til 65 ml tumorcellevekstmedier. Pipette 1 ml / brønn av det polymerholdige mediet i elleve 6-brønns vevskulturplater. Trypsinisere tidlig passasje tumorceller og telle celler ved hjelp av den foretrukne metoden slik at hver brønn mottar 50.000 celler / ml / brønn. Tine 1 ml alikoter med 48 timer lentivirus fra fryseren i et vannbad på 37 °C.
    2. For hver virusmodul, klargjør infeksjonen som vist i tabell 1.
    3. Plasser alle 6-brønnplatene i en vevskulturinkubator. Neste dag, fjern virale medier og fyll på med friske vekstmedier. Ved 48 timer, tilsett puromycinholdige medier til alle brønner som mottar valg. Før kontrollceller er konfluente, utfør celletellinger av overlevende kloner ved hjelp av den foretrukne metoden.
      MERK: Konsentrasjonen av puromycin som kreves for å drepe ikke-transducerte celler må forhåndsbestemmes empirisk ved å teste en rekke konsentrasjoner i en "kill" -kurve. Bruk den laveste konsentrasjonen som jevnt induserer død av ikke-transducerte kulturer.
  3. Lentiviral infeksjon av målceller
    1. Trypsinize MPNST celler og telle. Tallerken 2,5 millioner celler per 15 cm tallerken for totalt tjue 15 cm retter per modul. Tine viruset og transdusere cellene med viruset ved en MOI på 0,5 i nærvær av 5 μg / ml kationisk polymer (figur 2A).
    2. Fjern virusholdige medier neste morgen og erstatt med friske vekstmedier. Kultur celler i ytterligere 2 dager for å tillate ekspresjon av utvalgsmarkøren og deretter legge puromycin til kulturer for å eliminere ikke-transducerte celler.
    3. Tre dager etter tilsetning av puromycin, trypsiniserer cellene og sentrifugerer halvparten av cellepopulasjonen ved 200 × g i 5 minutter i en bordplatesentrifuge. Oppbevar de pelleterte cellene i -80 ° C fryseren for fremtidig genomisk DNA-forberedelse; Dette er referansetidspunktet, eller tidspunktet 1 (T1).
    4. Replate den andre halvdelen av cellepopulasjonen og dyrk den i ca. 7 populasjonsdoblinger før høsting og sentrifugering som ovenfor. Denne cellepelleten vil fungere som det endelige tidspunktet (tidspunkt 2, T2) og lagres ved -80 °C for fremtidig genomisk DNA-isolasjon (figur 2).
  4. Isolering av genomisk DNA fra celler transducert med virusbassenger
    1. Tine cellepelleten fra -80 °C fryseren og resuspender pelleten i 10 ml resuspensjonsbuffer med tilsatt RNAse, og del umiddelbart i to 15 ml polymetylpentenrør (figur 2B).
    2. Tilsett 500 μL 10% SDS per 5 ml, bland og inkuber ved romtemperatur i 5 minutter. Deretter plasserer du rør i en DNA-skjæringsanordning for å sonikere DNA i 25 sykluser på 30 s på / 30 s av, og sørg for å holde temperaturen på 4 ° C.
    3. Tilsett 5 ml fenol/kloroform, pH 8,0 (lagret ved 4 °C), og bland fenol/kloroformen godt før bruk. Etter tilsetning av fenol / kloroform, bland godt ved å virve kraftig på maksimal innstilling i 45-60 s. Sentrifuge i 60 min, -20 °C ved 7 200 × g.
      MERK: Et skummende/melkeaktig utseende etter virvel vil signalisere fullstendig resuspensjon.
    4. Overfør 3 ml av den klare øvre fasen til et nytt 15 ml rør og tilsett 0,5 ml 3 M natriumacetat og 4 ml isopropanol og bland godt (figur 2C). Sentrifuge i 30 minutter ved 20 °C ved 7 200 × g.
    5. Etter sentrifugering kastes supernatanten og pipetterer forsiktig av den gjenværende væsken. Tilsett 0,5 ml 70 % etanol og løsne pelleten ved å pipettere opp og ned. Overfør den resuspenderte pelleten til et 1,5 ml sentrifugerør og kombiner begge pellets fra samme prøve til et enkelt 1,5 ml sentrifugerør. Sentrifuge ved maksimal hastighet i en stasjonær sentrifuge i 5 min.
    6. Kast supernatanten og bruk en laboratorieserviett til å absorbere eventuelle gjenværende 70 % etanol. Oppfyll pelleten igjen i 0,5 ml destillert vann, pass på at pelleten ikke tørker ut, da dette vil gjøre resuspendering vanskelig. Oppbevar prøver ved 4 °C før DNA-konsentrasjonen måles.
  5. Nestet PCR for å forsterke shRNA-strekkoder
    MERK: Hent DNA fra lagring og legg på is. Hvis DNA-konsentrasjonen er lavere enn 100 ng / μL, må du vakuumtørke DNA og resuspendere i et passende volum destillert vann. Vi anbefaler at du bare behandler én modul om gangen (tidspunkt 1 (T1) eller tidspunkt 2 (T2)). Utfør to preps av hvert tidspunkt som skal slås sammen på slutten; Derfor er det viktig å ikke behandle replikere tidspunkter på samme dag. Følgende protokoll er for ett tidspunkt for genomisk DNA.
    1. Sett opp 7 rør og merk dem som beskrevet: Negativ kontroll, positiv kontroll, 4 rør for genomisk DNA og ett for en masterblanding (figur 3A). Den negative kontrollen er destillert vann; den positive kontrollen er plasmid-DNA som brukes i 293T-transfeksjonen for å generere lentivirus.
    2. Tilsett vann til hvert rør først som angitt i tabell 2.
    3. Klargjør en Master Mix (MM) som vist i tabell 3.
    4. Tilsett 18 μL MM til hvert rør som inneholder vann. Deretter legger du til 25 μL genomisk DNA til hvert av de 4 malrørene. Deretter legger du til 1 μL positiv kontroll (10 ng / μL) til det positive kontrollrøret, og vær forsiktig så du ikke forurenser andre rør med positivt kontroll-DNA. Til slutt, tilsett 2 μL polymerase til hvert rør, tilsett de 4 prøverørene først og det positive kontrollrøret sist; bland og spinn ned PCR-tubene (figur 3).
    5. Utfør PCR-reaksjon under betingelsene angitt i tabell 4.
    6. Mens den første PCR kjører, klargjør du rør for 2. PCR som angitt i tabell 5. Sett opp syv rør: Negativ kontroll, positiv kontroll, 4 rør for genomisk DNA og ett for MM (figur 3B).
    7. Tilsett 22 μL MM til hvert rør som inneholder vann og vent til den første runden med PCR er ferdig før du tilsetter DNA og polymerase.
      1. Når den første runden med PCR er fullført, kombiner 4 prøverør i ett mikrosentrifugerør og bland.
      2. Tilsett 25 μL til hvert prøverør som inneholder vann.
      3. Deretter legger du til 2 μL av den første PCR-negative kontrollen og 2 μL av den første PCR-positive kontrollen til passende merkede rør.
      4. Tilsett 2 μL polymerase til hvert rør, legg til de 4 prøverørene først og den negative kontrollen sist.
    8. Utfør PCR-reaksjon som angitt i tabell 6.
      MERK: Ved analyse av resultater fra den første PCR-reaksjonen ved elektroforese på en 3,5% agarosegel, hvis en overflod av produkt oppnås, kan antall sykluser reduseres til 9-10 for neste gjentakelse av denne prosedyren; På samme måte, hvis produktutbyttet er lavt, kan sykluser økes til 14.
    9. Når den andre PCR-reaksjonen er fullført, kombiner 4 prøver i ett mikrosentrifugerør pluss 80 μL 6x lastestoff. For positive og negative kontroller, bruk 20 μL av prøven.
      1. Tilbered en 3,5% agarosegel i Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer (figur 4A). For å imøtekomme det store prøvevolumet, opprett en stor brønn i gelkammen ved å tape flere brønner sammen (hvis en kam for å passe volumet ikke er tilgjengelig), og sørg for å la to brønner være tilgjengelige for de positive og negative kontrollene. Kjør gelen på 90 V i 1 time.
    10. Visualiser gelen og bekreft et bånd ved ca. 250 basepar (bp).
  6. Første rensing: Gelekstraksjon
    1. Bruk en ren skalpell eller barberblad til å stikke av 250 bp-båndet, og skjær av så mye gel som mulig. Seksjon det store båndet i 4 stykker og overfør hvert stykke til et rent mikrosentrifugerør. Mål og registrer vekten til hver gelskive.
      MERK: Hvert stykke skal være ca 200 mg eller mindre per rør.
    2. Tilsett 6 volumer oppløselighetsbuffer (f.eks. hvis gelstykket veier 200 mg, tilsett 1,2 ml buffer). Plasser tubene i et vannbad på 50 °C og roter hvert 10-15 minutt til gelskivene er oppløst. Deretter tilsettes 1 volum isopropanol til hvert rør (f.eks. 0,2 ml isopropanol hvis gelstykket veier 200 mg).
    3. Bruk to spinnkolonner for rensing, last prøvene fra alle 4 rørene inn i kolonnene. Utfør flere spinn for å behandle alt prøvevolumet, da kolonnene bare holder 750 μL. Spinn kolonnene på 17 900 × g i 1 min i en konvensjonell stasjonær mikrosentrifuge og kast gjennomstrømningen hver gang.
    4. Vask kolonnene med 750 μL vaskebuffer og sentrifuge ved 17 900 × g i 1 min. Etter vasken kastes gjennomstrømningen og tørker sentrifugeringen ved å sentrifugere ved 17 900 × g i 3 minutter. Elute DNA med 50 μL destillert vann per kolonne og sentrifuge som tidligere i 1 min og kombiner begge rørene for et totalt volum på 100 μL av prøven.
  7. Andre rensing
    1. Dette neste rensetrinnet vil bruke bindingsbuffer 2 (fra PCR-rensesettet), som ikke eliminerer små fragmenter. Legg til 400 μL buffer til 100 μL DNA, og last den på en spinnkolonne (figur 4B). Sentrifuger prøven ved 17 900 × g i 1 min.
    2. Deretter vaskes membranen med 650 μL vaskebuffer og spinn som tidligere utført. Tørk sentrifugeringen med ytterligere sentrifugering som ovenfor i 3 min.
    3. Elute DNA-et med 30 μL destillert vann og spinn med maks hastighet i 1 min. Etter eluering, kontroller konsentrasjonen på et spektrofotometer; sørg for at konsentrasjonen ikke er lavere enn 10 ng / μL eller høyere enn 70-80 ng / μL. Oppbevar DNA i en -20 ° C fryser.
  8. Sekvensering av forsterkede strekkoder
    1. For sekvensering, fortynn rensede strekkoder til 0,75 ng / μL ved bruk av elueringsbuffer (EB). For å legge til sekvensdiversitet er forsterkere gruppert ved 17 pM, inkludert 30% (v / v) PhiX. Utfør single-end (SE) klynger på et automatisert klyngegenereringssystem i henhold til produsentens protokoll.
    2. Få sekvenseringskjernen til å utføre totalt 36 sykluser med single-end sekvensering på en NextGen sequencer (figur 4C). Legg til tilpasset primer GexSeqS til Illumina-sekvenseringsprimerne ved 0,5 μM.
    3. Bruk den refererte analyseprogramvaren til å generere Fastq-filer og behandle dem ved hjelp av programvare for å trimme leselengder til 18 nukleotider.
    4. Bruk strekkodeanalysator og Deconvoluter-programvare for å deconvolute trimmede leser. Beregn folddeplesjonspoeng for hvert shRNA som forholdet mellom lesetellingene ved referansetidspunktet (T1) versus det endelige tidspunktet (T2).
  9. Analyse av shRNA-skjermresultater og identifisering av kandidatterapeutiske mål
    MERK: I Cellecta shRNA-biblioteket er de fleste gener målrettet av enten 5 (67%) eller 6 forskjellige shRNA (32%). Imidlertid er flere housekeeping-gener, som skal treffes i de fleste celler, målrettet av et stort antall shRNA og tjener som kontroller som definerer rekkevidden av score for negative.
    1. For å forhindre skjevhet mot gener rettet mot større antall shRNAer, logg transformere uttømmingspoengene. Utfør en kvantitilestimering ved å beregne 80-prosentilen for hvert gen fra den empiriske fordelingen.
    2. For å generere en nullfordeling av loggfold-deplesjonsscore, antar du at >95% av genene ikke vil bli utarmet, og at deres log-quantile score vil ha en normal fordeling. Bruk medianen til den empiriske fordelingen til å estimere gjennomsnittet av nullfordelingen. Ved hjelp av denne nullfordelingen klassifiserer du alle gener med log-fold depletion score som er større enn 95th percentilen av nullfordelingen som 'treff'.
      MERK: Alle treff skal ha minst to shRNA med uttømmingsscore over skjæringspunktet (figur 5).
    3. For å vurdere kvaliteten på RNAi-frafallsskjermdataene og gyldigheten av kuttpunktet, bruk et sett med gener som er definert som "kjerneessensielle" av COLT Cancer RNAi screening initiative24,25 for sammenligning. Fjern CEGs fra listen over treff for å produsere den første listen over potensielle terapeutiske mål.
      MERK: Gener i COLT-settet scoret som en hit i >50% av de 72 kreftcellelinjene som ble screenet av COLT. Den essensielle kjernegenlisten inneholder 640 gener.
    4. For å identifisere potensielle terapeutiske mål som vanligvis eller ensartet kreves av flere MPNST-cellelinjer, konstruer Venn-diagrammer av ikke-CEG-treffene identifisert i skjermer med forskjellige MPNST-cellelinjer eller tidlige passasjekulturer (figur 6A). Prioriter ikke-CEG-treff som kreves i alle eller de fleste MPNST-linjer eller -kulturer.
      1. Alternativt kan du utføre baneanalyser på ikke-CEG-trefflisten fra hver cellelinje eller tidlig passasjekultur for å identifisere gener hvis produkter koder for komponenter i signalveier som kreves for tumorcelleproliferasjon og / eller overlevelse. Sammenlign deretter signalveiene som er identifisert i baneanalysen av ikke-CEGer med signalveiene som ble identifisert som påvirket av mutasjoner identifisert med WES.
        MERK: Vi finner det spesielt nyttig å identifisere signalveier som konsekvent påvirkes av mutasjoner identifisert i WES og sammenligne dem med signalveiene identifisert som kritiske i shRNA-skjermer.
    5. For å identifisere medisinerbare mål som terapeutiske midler allerede er tilgjengelige for, screene listen over treff som gjenstår etter fjerning av de essensielle kjernegenene ved hjelp av Drug Gene Interaction Database (dgidb.org).
      MERK: Denne databasen tillater en liste over gener som skal legges inn og screenes samtidig, og gir veiledning om legemidler som for øyeblikket er tilgjengelige for å målrette mot disse genene.
    6. Valider de identifiserte legemiddelbare høyinteressemålene først ved å slå ned genuttrykket deres med shRNA som er forskjellig fra de som ble brukt i den første bibliotekskjermen i et enkelt batchformat (ikke et bibliotek-batchformat som nettopp er beskrevet). For å slå ned genuttrykk, bruk to til tre forskjellige lentivirale shRNAer. Tre til fire dager etter infeksjon, bestem effekten som dette har på tumorcelleproliferasjon og overlevelse som beskrevet nedenfor.

3. Utføre cytometeranalyser av celletall og levedyktighet i MPNST-celler utfordret med kandidatterapeutiske midler

  1. Utvikle MPNST-celler i DMEM til 80 % konfluens. Skyll celler med romtemperatur Hanks balansert saltløsning (HBSS).
    MERK: Ikke voks celler til samløp, da veksten av disse cellene vil henge etter replating.
  2. Løsne celler fra substratet ved å dekke celler i 30 s til 1 min med en ikke-enzymatisk celledissosiasjonsløsning. Tilsett 5 ml DMEM per 1 ml av dissosiasjonsløsningen og rør celler forsiktig opp og ned for å løsne fra underlaget.
  3. Telle celler ved hjelp av et hemocytometer. Plateceller med en tetthet på 1,200 celler per brønn i svartveggede 96-brønnsplater; Plate minst tre brønner for hver legemiddelfortynning som skal testes og utføre tre biologiske replikater av disse forsøkene.
  4. For å bestemme de første konsentrasjonene av stoffet som vil bli testet, gjennomgå litteraturen for å vurdere hvilke konsentrasjoner som har vært effektive mot andre kreftcelletyper. I innledende eksperimenter, test en rekkevidde av to størrelsesordener over og to størrelsesordener under legemiddelkonsentrasjonen som brukes med andre krefttyper.
  5. Forbered fortynninger av stoffet som skal testes, og tilsett hver fortynning eller kjøretøy til minst tre replikerende brønner.
  6. Vurder direkte celle nummer 1, 3, 5 og 7 dager etter tilsetning av legemidler. Tilsett Hoechst 33342 til en endelig konsentrasjon på 5 μg/ml og inkuber platene i 30 minutter ved 37 °C. Les plater på et cytometer med høy gjennomstrømning ved hjelp av alternativet direkte celleantall for totalt cellenummer med eksponeringstider på 100 000 ms.
  7. Analyser lesingene ved hjelp av programvaren og eksporter dem til et regneark og bruk passende programvare for statistiske analyser.
  8. Hvis statistisk signifikante reduksjoner i antall celler observeres i legemiddelbehandlede brønner, utfør en "Live/Dead"-analyse for å avgjøre om denne reduksjonen delvis skyldes induksjon av celledød.
    1. Plateceller i sortveggede 96 brønnplater som beskrevet i trinn 3.3.
    2. Forbered og legg til legemidler som beskrevet i trinn 3.5.
    3. Vurder cellens levedyktighet og død 1, 3, 5 og 7 dager etter tilsetning av legemidlet. Tilsett kalcein AM til en endelig konsentrasjon på 1 μM og propidiumjodid til en endelig konsentrasjon på 1 μM i hver brønn. Inkuber celler i 15 minutter ved 37 °C.
    4. Bildeceller på et bildecytometer ved hjelp av programvarealternativet Live+Dead . Analyser lesingene ved hjelp av programvaren og eksporter dem til et regneark og bruk passende programvare for statistiske analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 5-plott viser uttømmingspoeng av essensielle kjernegener (CEG) merket som SANN sammenlignet med ikke-CEG (merket som FALSE) i hver menneskelig cellelinje som ble screenet. Poeng representerer log2 av foldeuttømmingspoeng for individuelle gener, som er plottet over en boksplottrepresentasjon av den samlede poengfordelingen. Studentens t-test ble brukt til å teste for en signifikant forskjell i gjennomsnittet av uttømmingsscore mellom de to gruppene i hver cellelinje. De resulterende p-verdiene er angitt i hvert panel. Merk at gjennomsnittlig folduttømmingsscore er betydelig høyere for CEGene enn ikke-CEGs. Dette forventes ettersom essensielle kjernegener per definisjon konsekvent kreves for spredning og/eller overlevelse i de fleste celletyper.

Figur 6A viser et Venn-diagram over "treffene" for tre humane MPNST-cellelinjer. Vi finner vanligvis at et stort antall gener deles mellom flere linjer; Disse treffene er høyt prioritert, da de representerer gener som koder for proteiner som sannsynligvis vil være avgjørende for spredning og / eller overlevelse av en stor delmengde av MPNST. Merk også at det er en rekke gener som er treff i bare en cellelinje. Vi møter dette ofte, og det bør ikke tas som en indikasjon på at skjermene er av dårlig kvalitet. Genene som er vanlige treff mellom flere linjer, blir deretter vurdert ved hjelp av Drug Gene Interaction Database for å identifisere gener i denne undergruppen som koder for proteiner som er medisinerbare med eksisterende midler. Vi velger deretter flere av disse og utfører en innledende validering ved å slå ned uttrykket av det tilsvarende mRNA med shRNAer. Siden noen shRNA vil ha off-target effekter, tester vi alltid flere shRNAer rettet mot samme transkripsjon. Figur 6B viser et representativt resultat der vi har transdusert MPNST-celler med en ikke-målrettende kontroll og flere shRNA rettet mot BCL6. Celletall ble deretter bestemt på varierende tidspunkt etter transduksjon. Merk at flere av BCL6 shRNAene markant reduserte celletall; som vist i den medfølgende immunoblot, korrelerer graden av reduksjon i celletall med graden av BCL6 knockdown. Figur 6C viser en representativ vekstkurve for en tidlig passasje P 0-GGFβ3 MPNST-kultur.

Figure 1
Figur 1: Arbeidsflyt for å utføre hele eksomsekvensering av MPNST-vev eller MPNST-celler med tidlig passasje. Skjematisk illustrerer den generelle arbeidsflyten for variantdeteksjon som er tilstede i tumoravledede tidlige passasjekulturer. Isoler DNA fra tidlige passasjekulturer (1) og send kvalitets-DNA til sekvenseringskjernen i henhold til deres innsendingsprotokoller (2). Sekvenseringskjernen vil kontrollere kvaliteten på det innsendte DNA-et og utføre alle nødvendige prøve- og genombibliotekpreparater. Kjernefasiliteten vil gi brukerne FASTQ-sekvenseringsfiler med kvalitetskontrollberegninger (3). Brukere vil laste opp FASTQ-filene til et genomjusterings- og variantanropsprogram etter eget valg. (4) Annoterte varianter filtreres etter brukerdefinerte kriterier for å fjerne ikke-relevante varianter. Representative data vist sammenligne resektert human MPNST-tumorprøve vs. en cellelinje avledet fra svulsten26. (5) Utføre funksjonell klassifiseringsanalyse med PANTHER. Forkortelse: MPNST = Ondartet perifer nervekappe svulst. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Arbeidsflyt for å utføre viral transduksjon av shRNA-bibliotekene til MPNST-celler og isolere genomisk DNA fra cellene ved tidspunkt 1 og tidspunkt 2. (A) Målceller infiseres ved lav MOI på 0,3 med strekkodede lentivirale partikler og selekteres i 72 timer. Cellene passeres for 5-7 populasjonsdoblinger (ca. 7 dager). Cellepellets på dag 0 og dag 7 lagres ved -80 °C for genomisk DNA-isolering. Dag 0 refereres til som Tidspunkt 1 (T1) og Dag 7 refereres til som Tidspunkt 2 (T2). (B) Genomisk DNA-isolering begynner med resuspendering av cellepellets i resuspensjonsbuffer som deretter deles i to 15 ml rør. For å lette cellelysen tilsettes 10% SDS til hvert rør og sonikeres i 25 sykluser på 30 s på / 30 s av. Etter sonikering tilsettes fenol / kloroform til hvert rør og virveles kraftig i 45-60 s. Rørene sentrifugeres deretter. (C) En klar øvre fase pipetteres av og tilsettes et rent rør med tilsetning av natriumacetat/isopropanol og blandes godt. Rørene sentrifugeres igjen. Denne gangen kasseres supernatanten, og pelleten løsnes med tilsetning av 70% etanol. Kombiner de resuspenderte pellets i ett rør og spinn med maksimal hastighet i en stasjonær sentrifuge. Kast supernatanten og resuspender pelleten i destillert vann. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Arbeidsflyt for forsterkning av strekkodesekvenser fra lentivirale shRNA-vektorer som forberedelse til kvantifisering av strekkoder med neste generasjons sekvensering. (A) Representasjon av hvordan man setter opp rør for den første nestede PCR-reaksjonen (7 rør: en for negativ kontroll, en for positiv kontroll, og de resterende 4 rørene for genomisk DNA. Det siste røret vil fungere som masterblandingsrøret). Etter den første PCR-reaksjonen, kombiner de genomiske DNA-rørene i ett rør og bland. (B) Produktene fra den første nestede PCR-reaksjonen vil fungere som maler for den andre nestede PCR-reaksjonen. Etter den andre PCR, kombiner genomiske DNA-rør i ett rør og bland. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Arbeidsflyt for rensing av de forsterkede shRNA-strekkodene og sekvensering av strekkoder for å kvantifisere deres representasjon ved tidspunkt 1 og tidspunkt 2 . (A) Hell en 3,5% agarosegel. Fordi volumet av det samlede DNA overskrider grensen for en brønn, tape 4-6 tenner av en gelkam sammen for å produsere en stor brønn. Forbered PCR-produkter med 6x lastfargestoff og last den positive kontrollen, negativ kontroll og samlet DNA i gelen. Etter elektroforese skal et stort bånd på ca. 250 basepar vises i den samlede DNA-banen. Bruk en ren skalpell, punkter hele båndet, og kutt deretter i 4 gelskiver. Oppløselig gelbitene og kombiner dem deretter i to spinnkolonner for å eluere DNA. Kombiner det eluerte DNA i ett rør. (B) DNA renses gjennom et andre renselsestrinn. Legg bindingsbuffer 2 til røret med samlet DNA, og deretter pipette på en spinnkolonne. Vask membranen og eluer deretter DNA i destillert vann. (C) Send det rensede DNA til sekvenseringskjernen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Representative eksempler på fordelingen av essensielle kjernegener etter analyse som beskrevet i protokollen. I dette eksemplet ble tre humane MPNST-cellelinjer (S462, T265 og 2XSB) celler screenet med Cellecta DECIPHER shRNA-biblioteker. For hver human MPNST-cellelinje ble det opprettet en boksplott for å sammenligne uttømmingspoeng på gennivå for gener i listen over kjerneessensielle gener (CEG; True box plot)25 til det av gener som ikke finnes i listen over CEGer (False box plot). Individuelle datapunkter legges lagvis på toppen av hver bokstegning. P-verdier er fra en standard t-test som sammenligner gennivå depletion score av CEG til ikke-CEGs. Forkortelser: CEG = essensielt kjernegen; MPNST = ondartet perifer nervekappe svulst. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Validering av skjermresultater . (A) Representativt Venn-diagram over overlappende treff i tre humane MPNST-cellelinjer. (B) S462 humane MPNST-celler transdusert med en ikke-målrettende (NT) lentiviral vektor og lentivirus som uttrykker fire forskjellige BCL6 shRNA (shRNA1, shRNA2, shRNA3 og shRNA4). Cellene ble transdusert med lentivirus og deretter behandlet med et seleksjonsmiddel (puromycin) i 3 dager. Celletallene ble deretter vurdert i løpet av de neste syv dagene. (C) Western blot-analyse som viser proteinnivåer av BCL6 etter transduksjon med NT, shRNA1, shRNA2, shRNA3 og shRNA4 lentivirus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Plateoppsett for lentiving. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Første oppsett av første PCR-reaksjoner. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 3: Tilberedning av masterblanding ved første PCR-reaksjon. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 4: Cellectas første PCR-parametere. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 5: Første oppsett av andre PCR-reaksjon. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 6: Cellecta andre PCR-parametere. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De detaljerte metodene som presenteres her ble utviklet for å studere perifer nervesystemneoplasi og MPNST-patogenese. Selv om vi har funnet at disse metodene er effektive, bør det erkjennes at det er noen potensielle begrensninger for metodene vi beskriver her. Nedenfor diskuterer vi noen av disse begrensningene og potensielle strategier for å overvinne dem i andre modellsystemer.

Vi har funnet ut at hele eksomsekvensering effektivt identifiserer mutasjoner av interesse i P 0-GGFβ3 mus. Det bør imidlertid erkjennes at hele eksomsekvensering i seg selv har begrensninger. For det første er ikke heleksomsekvensering en effektiv tilnærming til å identifisere fusjonsgenprodukter. Dette skyldes at flertallet av kromosomale brudd og påfølgende fusjon hovedsakelig involverer intergeniske regioner og introner, da disse regionene representerer flertallet av genomet. Vi har i stedet funnet at RNA-Seq med parede avlesninger mye mer effektivt identifiserer fusjonsgener. Det er også spørsmålet om hvor effektivt hele eksomsekvensering identifiserer relativt store regioner av kromosomalt tap.

Selv om flere algoritmer er utviklet for å identifisere slike tap, er begrepet "hel eksomsekvensering" i seg selv misvisende fordi fangsten av eksomet selv i gode løp ofte savner opptil 5-10% av eksoniske regioner. På grunn av dette kompletterer vi rutinemessig hele eksomsekvensering med andre tilnærminger som array comparative genomic hybridization (aCGH). Etter å ha identifisert gevinster og tap, undersøker vi genene innenfor disse intervallene og sammenligner dem med de kjente drivermutasjonene som er forbundet med deres menneskelige kolleger. Musegenomet er imidlertid mer stabilt enn det menneskelige genom27. Følgelig viser musetumorer vanligvis ikke kromothripsis analogt med det som ses i humane neoplasmer. Mønsteret i musetumorer er i stedet mye enklere, tenderer mot hele kromosom- eller kromosomgevinster eller tap med relativt få fokale delesjoner som har en tendens til å forekomme under sterkt selektivt trykk22,23.

Det er noen potensielle fallgruver som vi har støtt på når vi utfører genomskala shRNA-skjermer. Et av de vanligste problemene vi støter på er den relativt dårlige transduksjonen av lentivirale vektorer i målcellene. Vi finner oftest at problemet oppsto ved feil titrering av de pakkede lentivirale bassengene. Fordi tidlig passasje mustumorkulturer er en begrensende ressurs, vil mange etterforskere i stedet forsøke å titre deres lentivirus ved hjelp av en annen etablert cellelinje som er lettere tilgjengelig. Problemet med denne tilnærmingen er imidlertid at effektiviteten av lentiviral transduksjon kan variere betydelig fra celletype til celletype. Det er av denne grunn at vi anbefaler titering av lentivirus på de faktiske cellene som skal brukes i forsøket. Vi har også støtt på problemer med relativt lave virale titere. Dette problemet gjenspeiler oftest dårlig transfeksjon av 293T-celler når man produserer det pakkede viruset.

Det er mulig å oppnå falske positive treff når du utfører genomskala shRNA-skjermer. På grunn av dette, når vi har identifisert de potensielt medisinerbare målene som er mest interessante for oss, validerer vi alltid resultatene av våre shRNA-skjermer. Vanligvis vil vi bruke to forskjellige tilnærminger for å validere høyrentemål. Først slår vi ned genuttrykk ved hjelp av to eller flere shRNAer som er forskjellige fra de som brukes i startskjermbildet og bestemmer effekten dette har på tumorcelleproliferasjon og overlevelse. For det andre får vi stoffet (e) identifisert i Drug Gene Interaction Database og bestemmer effekten dette har på tumorcelleproliferasjon og overlevelse. Vi bruker begge tilnærmingene i tandem fordi vi har møtt omstendigheter der shRNAene virker og stoffet ikke gjør det. I minst noen av disse tilfellene har undersøkelse av hele eksomsekvensdatasettet vist at det målrettede proteinet produseres av et gen som har en mutasjon som potensielt påvirker legemiddelproteininteraksjoner.

Tilnærmingene som er skissert ovenfor, vil gi etterforskeren et aktuelt middel for å identifisere potensielle drivermutasjoner som forekommer i sjeldne neoplasmer, funksjonelt identifisere signalveiene som kreves for spredning og overlevelse, og prioritere mål for terapeutisk utvikling. Vi håper at andre etterforskere vil finne disse tilnærmingene nyttige for å identifisere viktige terapeutiske mål i andre menneskelige kreftformer. Leseren bør imidlertid være klar over at det finnes andre funksjonelle genomiske tilnærminger som kan brukes til å identifisere gener involvert i tumorpatogenese og gener som koder for potensielle terapeutiske mål. Som et eksempel er CRISPR-biblioteker tilgjengelige som kan brukes på en måte som er analog med den vi beskriver for shRNA-biblioteker. Funksjonelle skjermer kan også utføres in vivo for å identifisere gener som fremmer tumorigenese. Som et eksempel på dette har Tornerose-transposonbasert somatisk mutagenesesystem tidligere blitt brukt til å målrette Schwann-celler og deres forløpere, noe som resulterer i identifisering av flere hundre gener involvert i MPNST-patogenese28. Da disse systemene nærmer seg funksjonell genomikk på forskjellige måter, anbefaler vi at etterforskeren nøye vurderer målene for deres planlagte eksperimenter og baserer sitt valg av en funksjonell genomikkmetodikk på disse målene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353 og R01 NS109655 til SLC; R01 NS109655-03S1 til D.P.J.), National Cancer Institute (R01 CA122804 til SLC) og Forsvarsdepartementet (X81XWH-09-1-0086 og W81XWH-12-1-0164 til SLC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bioruptor Sonication System Diagenode  UCD-600
CASAVA 1.8.2
Cbot Illumina, San Diego, CA N/A
Celigo Image Cytometer Nexcelom N/A
Cellecta Barcode Analyzer and Deconvoluter software
Citrisolve Hybrid Decon Laboratories 5989-27-5
Corning 96-well Black Microplate Millipore Sigma CLS3603
Diagenode Bioruptor 15ml conical tubes Diagenode  C30010009
dNTP mix Clontech 639210
Eosin Y Thermo Scientific 7111
Elution buffer Qiagen  19086
Ethanol (200 Proof) Decon Laboratories 2716
Excel  Microsoft 
FWDGEX 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3’
FWDHTS 5’-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3’
GexSeqS (5’ AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3’ HPLC purified
GraphPad Prism Dotmatics
Harris Hematoxylin Fisherbrand 245-677
Illumina HiScanSQ Illumina, San Diego, CA N/A
Paraformaldehyde (4%) Thermo Scientific J19943-K2
PLUS Transfection Reagent Thermo Scientific 11514015
Polybrene Transfection Reagent Millipore Sigma TR1003G
PureLink Quick PCR Purification Kit Invitrogen K310001
Qiagen Buffer P1 Qiagen  19051
Qiagen Gel Extraction Kit Qiagen 28704
RevGEX 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’
RevHTS1 5’-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3’
Titanium Taq polymerase Clontech 639210
Trimmomatic software www.usadellab.org

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carroll, S. L. Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms. Acta Neuropathol. 123 (3), 321-348 (2012).
  2. Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L. Recent Advances in the Diagnosis and Pathogenesis of Neurofibromatosis Type 1 (NF1)-associated Peripheral Nervous System Neoplasms. Adv Anat Pathol. 25 (5), 353-368 (2018).
  3. Longo, J. F., Carroll, S. L. The RASopathies: Biology, genetics and therapeutic options. Adv Cancer Res. 153, 305-341 (2022).
  4. Birindelli, S., et al. Rb and TP53 pathway alterations in sporadic and NF1-related malignant peripheral nerve sheath tumors. Lab Invest. 81 (6), 833-844 (2001).
  5. Legius, E., et al. TP53 mutations are frequent in malignant NF1 tumors. Genes Chromosomes Cancer. 10 (4), 250-255 (1994).
  6. Menon, A. G., et al. Chromosome 17p deletions and p53 gene mutations associated with the formation of malignant neurofibrosarcomas in von Recklinghausen neurofibromatosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (14), 5435-5439 (1990).
  7. Upadhyaya, M., et al. Germline and somatic NF1 gene mutation spectrum in NF1-associated malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs). Hum Mutat. 29 (1), 74-82 (2008).
  8. Kourea, H. P., Orlow, I., Scheithauer, B. W., Cordon-Cardo, C., Woodruff, J. M. Deletions of the INK4A gene occur in malignant peripheral nerve sheath tumors but not in neurofibromas. Am J Pathol. 155 (6), 1855-1860 (1999).
  9. Nielsen, G. P., et al. Malignant transformation of neurofibromas in neurofibromatosis 1 is associated with CDKN2A/p16 inactivation. Am J Pathol. 155 (6), 1879-1884 (1999).
  10. Gregorian, C., et al. PTEN dosage is essential for neurofibroma development and malignant transformation. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (46), 19479-19484 (2009).
  11. Lee, W., et al. PRC2 is recurrently inactivated through EED or SUZ12 loss in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nat Genet. 46 (11), 1227-1232 (2014).
  12. Zhang, M., et al. Somatic mutations of SUZ12 in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nat Genet. 46 (11), 1170-1172 (2014).
  13. Varela, I., et al. Somatic structural rearrangements in genetically engineered mouse mammary tumors. Genome Biol. 11 (10), 100 (2010).
  14. Johnson, R. A., et al. Cross-species genomics matches driver mutations and cell compartments to model ependymoma. Nature. 466 (7306), 632-636 (2010).
  15. Kim, M., et al. Comparative oncogenomics identifies NEDD9 as a melanoma metastasis gene. Cell. 125 (7), 1269-1281 (2006).
  16. Zender, L., et al. Identification and validation of oncogenes in liver cancer using an integrative oncogenomic approach. Cell. 125 (7), 1253-1267 (2006).
  17. Uren, A. G., et al. Large-scale mutagenesis in p19(ARF)- and p53-deficient mice identifies cancer genes and their collaborative networks. Cell. 133 (4), 727-741 (2008).
  18. Starr, T. K., et al. A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer. Science. 323 (5922), 1747-1750 (2009).
  19. Dupuy, A. J., et al. A modified sleeping beauty transposon system that can be used to model a wide variety of human cancers in mice. Cancer Res. 69 (20), 8150-8156 (2009).
  20. Carroll, S. L. The Challenge of Cancer Genomics in Rare Nervous System Neoplasms: Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors as a Paradigm for Cross-Species Comparative Oncogenomics. Am J Pathol. 186 (3), 464-477 (2016).
  21. Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. J Neurosci. 23 (19), 7269-7280 (2003).
  22. Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. Am J Pathol. 182 (3), 646-667 (2013).
  23. Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropathol. 127 (4), 573-591 (2014).
  24. Hart, T., Brown, K. R., Sircoulomb, F., Rottapel, R., Moffat, J. Measuring error rates in genomic perturbation screens: gold standards for human functional genomics. Mol Syst Biol. 10 (7), 733 (2014).
  25. Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knockout Screens. G3. 7 (8), Bethesda. 2719-2727 (2017).
  26. Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Sci Rep. 11 (1), 5690 (2021).
  27. Maser, R. S., et al. Chromosomally unstable mouse tumours have genomic alterations similar to diverse human cancers. Nature. 447 (7147), 966-971 (2007).
  28. Rahrmann, E. P., et al. Forward genetic screen for malignant peripheral nerve sheath tumor formation identifies new genes and pathways driving tumorigenesis. Nat Genet. 45 (7), 756-766 (2013).

Tags

genetisk profilering screening av frafall på genomskala terapeutiske mål musemodeller ondartet perifer nerveskjedetumor schwannceller nevrofibromatose type 1 (NF1) bløtvevssarkom sykdomsfri overlevelse behandlingsalternativer skjemmende kirurgi tipifarnib ras-signalhemmer erlotinib hemmer av epidermal vekstfaktor (EGFR) sorafenib hemmer av vaskulær endotelial vekstfaktorreseptor (VEGF) hemmer av blodplateavledet vekstfaktorreseptor (PDGF) Raf-hemmer Funksjonell genomisk screening kreftcellelinjer cytoplasmatiske signalveier målspesifikke terapier
Genetisk profilering og genomskala frafallsscreening for å identifisere terapeutiske mål i musemodeller av ondartet perifer nerveskjede tumor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Turner-Ivey, B., Longo, J. F.,… More

Turner-Ivey, B., Longo, J. F., Jenkins, D. P., Guest, S. T., Carroll, S. L. Genetic Profiling and Genome-Scale Dropout Screening to Identify Therapeutic Targets in Mouse Models of Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor. J. Vis. Exp. (198), e65430, doi:10.3791/65430 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter