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Cancer Research

घातक परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर के माउस मॉडल में चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए आनुवंशिक प्रोफाइलिंग और जीनोम-स्केल ड्रॉपआउट स्क्रीनिंग

Published: August 25, 2023 doi: 10.3791/65430
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1,2
1Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 3Department of Computational Medicine and Bioinformatics, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

हमने आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल और संबंधित मानव ट्यूमर प्रकार में उत्पन्न होने वाले ट्यूमर में चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान और तुलना करने के लिए जीनोमिक विश्लेषण और कार्यात्मक जीनोमिक स्क्रीन का उपयोग करके एक क्रॉस-प्रजाति तुलनात्मक ऑन्कोजेनोमिक्स दृष्टिकोण विकसित किया है।

Abstract

घातक परिधीय तंत्रिका शीथ ट्यूमर (एमपीएनएसटी) श्वान कोशिकाओं या उनके अग्रदूतों से प्राप्त होते हैं। ट्यूमर संवेदनशीलता सिंड्रोम न्यूरोफिब्रोमैटोसिस टाइप 1 (एनएफ 1) वाले रोगियों में, एमपीएनएसटी सबसे आम दुर्भावना और मृत्यु का प्रमुख कारण है। ये दुर्लभ और आक्रामक नरम-ऊतक सारकोमा 34-60% की 5 साल की रोग मुक्त जीवित रहने की दर के साथ एक कठोर भविष्य प्रदान करते हैं। एमपीएनएसटी वाले व्यक्तियों के लिए उपचार के विकल्प निराशाजनक रूप से सीमित हैं, जिसमें सर्जरी सबसे महत्वपूर्ण उपचार विकल्प है। कई बार आशाजनक उपचार जैसे कि टिपिफार्निब, रास सिग्नलिंग का एक अवरोधक, चिकित्सकीय रूप से विफल रहा है। इसी तरह, एर्लोटिनिब के साथ दूसरे चरण के नैदानिक परीक्षण, जो एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईएफजीआर) को लक्षित करते हैं, और सोराफेनिब, जो संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर (वीईजीएफ), प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक रिसेप्टर (पीडीजीएफ) और आरएएफ को लक्षित करते हैं, मानक कीमोथेरेपी के साथ संयोजन में, रोगियों में प्रतिक्रिया उत्पन्न करने में विफल रहे हैं।

हाल के वर्षों में, कैंसर सेल लाइनों की आनुवंशिक प्रोफाइलिंग के साथ संयुक्त कार्यात्मक जीनोमिक स्क्रीनिंग विधियां आवश्यक साइटोप्लाज्मिक सिग्नलिंग मार्गों की पहचान करने और लक्ष्य-विशिष्ट उपचारों के विकास के लिए उपयोगी साबित हुई हैं। दुर्लभ ट्यूमर प्रकारों के मामले में, इस दृष्टिकोण की एक भिन्नता जिसे क्रॉस-प्रजाति तुलनात्मक ऑन्कोजेनोमिक्स के रूप में जाना जाता है, का उपयोग तेजी से नए चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए किया जा रहा है। क्रॉस-प्रजाति तुलनात्मक ऑन्कोजेनोमिक्स में, आनुवंशिक प्रोफाइलिंग और कार्यात्मक जीनोमिक्स आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस (जीईएम) मॉडल में किए जाते हैं और परिणाम तब उपलब्ध दुर्लभ मानव नमूनों और सेल लाइनों में मान्य होते हैं।

यह पेपर बताता है कि पूरे एक्सोम अनुक्रमण (डब्ल्यूईएस) का उपयोग करके मानव और माउस एमपीएनएसटी कोशिकाओं में उम्मीदवार ड्राइवर जीन उत्परिवर्तन की पहचान कैसे करें। फिर हम वर्णन करते हैं कि माउस और मानव एमपीएनएसटी कोशिकाओं में महत्वपूर्ण सिग्नलिंग मार्गों की पहचान और तुलना करने के लिए जीनोम-स्केल एसएचआरएनए स्क्रीन कैसे करें और इन मार्गों में दवा योग्य लक्ष्यों की पहचान करें। ये पद्धतियां विभिन्न प्रकार के मानव कैंसर प्रकारों में नए चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए एक प्रभावी दृष्टिकोण प्रदान करती हैं।

Introduction

घातक परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर (एमपीएनएसटी) अत्यधिक आक्रामक स्पिंडल सेल नियोप्लाज्म हैं जो ट्यूमर संवेदनशीलता सिंड्रोम न्यूरोफिब्रोमैटोसिस टाइप 1 (एनएफ 1) के साथ मिलकर उत्पन्न होते हैं, जो सामान्य आबादी में छिटपुट रूप से और पिछले रेडियोथेरेपी 1,2,3 की साइटों पर उत्पन्न होते हैं। एनएफ 1 रोगियों का जन्म एनएफ 1 ट्यूमर शमन जीन की एक जंगली प्रकार की प्रतिलिपि और एक दूसरे एनएफ 1 एलील के साथ होता है, जिसमें हानि-ऑफ-फ़ंक्शन उत्परिवर्तन होता है। हैप्लोअपर्याप्तता की यह स्थिति एनएफ 1 रोगियों को उनके जंगली-प्रकार एनएफ 1 जीन में दूसरे नुकसान-ऑफ-फ़ंक्शन उत्परिवर्तन के लिए अतिसंवेदनशील बनाती है, जो ट्यूमरजेनिसिस को ट्रिगर करती है। जब यह "दूसरा हिट" एनएफ 1 उत्परिवर्तन श्वान सेल वंश में एक कोशिका में होता है, तो परिणामस्वरूप ट्यूमर या तो त्वचा में उत्पन्न होने वाला एक त्वचीय न्यूरोफिब्रोमा होता है या एक प्लेक्सीफॉर्म न्यूरोफिब्रोमा होता है जो बड़ी नसों या तंत्रिका जाल में विकसित होता है। यद्यपि त्वचीय और प्लेक्सीफॉर्म न्यूरोफिब्रोमास की विकृति समान है, उनका जैविक व्यवहार काफी अलग है-हालांकि त्वचीय और प्लेक्सीफॉर्म न्यूरोफिब्रोमास दोनों सौम्य हैं, केवल प्लेक्सीफॉर्म न्यूरोफिब्रोमस परिवर्तन से गुजर सकते हैं और एमपीएनएसटी को जन्म दे सकते हैं। न्यूरोफिब्रोमिन के नुकसान के अलावा, एनएफ 1 जीन द्वारा एन्कोड किए गए रास जीटीपेस-सक्रिय प्रोटीन, एमपीएनएसटी कई अन्य ट्यूमर शमन जीन ों के उत्परिवर्तन करते हैं, जिनमें टीपी 53 4,5,6,7, सीडीकेएन 2 ए8,9, और पीटीएन 10, पॉलीकॉम्ब दमनकारी कॉम्प्लेक्स 2 11,12 (पीआरसी 2) के जीन एन्कोडिंग घटकों के उत्परिवर्तन शामिल हैं। एसयूजेड 12 और ईईडी जीन) और रिसेप्टर टायरोसिन किनेसेस 1,2 की असामान्य अभिव्यक्ति। एनएफ 1 और ऊपर उल्लिखित अन्य जीनों के उत्परिवर्तन छिटपुट और विकिरण-प्रेरित एमपीएनएसटी11,12 में भी मौजूद हैं।

जबकि एमपीएनएसटी में जीनोमिक असामान्यताओं की हमारी समझ में ये प्रगति उनके रोगजनन को समझने के लिए अमूल्य रही है, लेकिन उनके परिणामस्वरूप अभी तक एमपीएनएसटी के लिए प्रभावी नए उपचारों का विकास नहीं हुआ है। नए उपचारों के विकास में बाधा डालने वाली एक बड़ी बाधा यह तथ्य है कि एमपीएनएसटी दुर्लभ कैंसर हैं। इस वजह से, कैंसर जीनोम एटलस (टीसीजीए) द्वारा किए गए प्रमुख ड्राइवर म्यूटेशन को परिभाषित करने वाले वैश्विक विश्लेषण ों के लिए आवश्यक बड़ी संख्या में रोगी के नमूने प्राप्त करना मुश्किल है। हमारे अनुभव में, मानव एमपीएनएसटी नमूनों की एक मामूली संख्या जमा करने में भी वर्षों लग सकते हैं। ऐसी सीमाओं को दूर करने के लिए, अन्य दुर्लभ कैंसर प्रकारों का अध्ययन करने वाले कई जांचकर्ताओं ने आवश्यक चालक जीन उत्परिवर्तन की पहचान करने, उनके ट्यूमर में आवश्यक साइटोप्लाज्मिक सिग्नलिंग मार्गों को परिभाषित करने और नए चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए क्रॉस-प्रजाति तुलनात्मक ऑन्कोजेनोमिक्स के उपयोग की ओर रुख किया है। चूंकि ट्यूमरजेनिसिस के लिए आवश्यक सिग्नलिंग मार्ग मनुष्यों और अन्य कशेरुक प्रजातियों के बीच अत्यधिक संरक्षित हैं, इसलिए जीनोम-स्केल एसएचआरएनए स्क्रीन जैसे कार्यात्मक जीनोमिक्स दृष्टिकोण को लागू करना इन नए ड्राइवर उत्परिवर्तन, सिग्नलिंग मार्गों और चिकित्सीय लक्ष्यों 13,14,15,16,17,18,19 की पहचान करने का एक प्रभावी साधन हो सकता है।, विशेष रूप से दुर्लभ मानव ट्यूमर प्रकारों का अध्ययन करते समय जो सीमित संख्या20 में उपलब्ध हैं।

यहां प्रस्तुत पद्धतियों में, हम मानव एमपीएनएसटी सेल लाइनों और पी 0-जीजीएफ 3 चूहों से प्राप्त प्रारंभिक मार्ग एमपीएनएसटी संस्कृतियों में जीनोमिक प्रोफाइलिंग करने के लिए इस दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं, एक आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल (जीईएम) जिसमें विकास कारक न्यूरेगुलिन -1 (एनआरजी 1) के श्वान सेल-विशिष्ट अतिवृद्धि प्लेक्सीफॉर्म न्यूरोफिब्रोमास के रोगजनन को बढ़ावा देती है और एमपीएनएसटी21 में उनकी बाद की प्रगति को बढ़ावा देती है। 22,23. इस दृष्टिकोण में पहला कदम पी 0-जीजीएफ 3 एमपीएनएसटी, मानव एमपीएनएसटी सेल लाइनों और शल्य चिकित्सा द्वारा निकाले गए मानव एमपीएनएसटी में उम्मीदवार ड्राइवर जीन की पहचान करना है। इन उत्परिवर्तनों से प्रभावित सिग्नलिंग मार्गों को कार्यात्मक रूप से मान्य करने के लिए, हम मानव और माउस एमपीएनएसटी सेल लाइनों में प्रसार और अस्तित्व के लिए आवश्यक जीन की पहचान करने के लिए जीनोम-स्केल एसएचआरएनए स्क्रीन का उपयोग करते हैं। प्रसार और अस्तित्व के लिए आवश्यक जीन की पहचान करने के बाद, हम ड्रग जीन इंटरैक्शन डेटाबेस का उपयोग करके "हिट्स" के संग्रह के भीतर दवा योग्य जीन उत्पादों की पहचान करते हैं। हम मानव और माउस एमपीएनएसटी कोशिकाओं में "हिट्स" की तुलना भी करते हैं, यह निर्धारित करने के लिए कि जीईएम मॉडल और मानव एमपीएनएसटी एक ही जीन और सिग्नलिंग मार्गों पर समान निर्भरता प्रदर्शित करते हैं या नहीं। प्रसार और अस्तित्व के लिए आवश्यक जीन और प्रभावित सिग्नलिंग मार्गों में ओवरलैप की पहचान करना आणविक स्तर पर पी 0-जीजीएफ 3 माउस मॉडल को मान्य करने के साधन के रूप में कार्य करता है। यह दृष्टिकोण उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए मानव और माउस स्क्रीन के संयोजन की प्रभावशीलता पर भी जोर देता है, जहां माउस मॉडल मानव स्क्रीन के पूरक के रूप में काम कर सकता है। दुर्लभ ट्यूमर में चिकित्सीय लक्ष्यों की तलाश करते समय इस क्रॉस-प्रजाति दृष्टिकोण का मूल्य विशेष रूप से स्पष्ट है, जहां मानव ट्यूमर और सेल लाइनों को प्राप्त करना मुश्किल है।

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Protocol

अध्ययन शुरू करने से पहले, वायरल वैक्टर से निपटने के लिए पशु प्रक्रियाओं और प्रोटोकॉल की समीक्षा की जाती है और संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) और संस्थागत जैव सुरक्षा समिति (आईबीसी) द्वारा अनुमोदित किया जाता है। यहां वर्णित प्रक्रियाओं को दक्षिण कैरोलिना के मेडिकल यूनिवर्सिटी के आईएसीयूसी और आईबीसी बोर्डों द्वारा अनुमोदित किया गया था और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए एनआईएच गाइड और एमयूएससी के संस्थागत पशु देखभाल दिशानिर्देशों के अनुसार ठीक से प्रशिक्षित कर्मियों द्वारा किया गया था।

1. डब्ल्यूईएस-सेक विश्लेषण और रोगजनक वेरिएंट की पहचान

  1. मानक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सोखना सिलिका-जेल-आधारित विधियों (विस्तृत चरणों के लिए निर्माताओं के प्रोटोकॉल से परामर्श) का उपयोग करते हुए, 60 मिमी डिश पर उगाए गए ट्यूमर के नमूने या उप-कंफ्लुएंट (70%) एमपीएनएसटी कोशिकाओं से जीनोमिक डीएनए को अलग करें। सामान्य वर्कफ़्लो चित्र 1 में आरेखित किया गया है.
  2. अनुक्रमण कोर में 50 ng / μL पर जीनोमिक डीएनए के कम से कम 10 μL सबमिट करें जब तक कि जीनोमिक डीएनए की विभिन्न मात्रा या सांद्रता निर्दिष्ट न हो।
    1. कोर सुविधा सोनिकेशन द्वारा जीनोमिक डीएनए को विभाजित करती है और फिर पसंदीदा विधि का उपयोग करके इसे शुद्ध करती है। एक्सोम कैप्चर और लाइब्रेरी निर्माण पसंदीदा एक्सोम अनुक्रमण किट का उपयोग करके किया जाता है और इंडेक्स टैग को प्रवर्धित कैप्चर किए गए एक्सोम में जोड़ा जाता है।
    2. पूरे एक्सोम युग्मित-अंत अनुक्रमण (डब्ल्यूईएस; प्रत्येक छोर से 100 बीपी अनुक्रमित) करने के लिए अनुक्रमण कोर में नमूने जमा करें।
    3. कोर द्वारा उत्पन्न FASTQ फाइलें अन्वेषक को प्रदान की जाती हैं। विश्लेषण के लिए केवल FASTQ फ़ाइलों का उपयोग करें जो गुणवत्ता मीट्रिक पास करते हैं।
  3. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर प्रोग्रामों (जैसे, DNAStar19,20, Partek21, या Varsome) का उपयोग करके FASTQ फ़ाइलों को संरेखित और विश्लेषण करें। FASTQ फ़ाइलों को डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स का उपयोग करके माउस संदर्भ जीनोम GRCm38/mm10 से संरेखित करें।
    नोट: एक उदाहरण के रूप में DNAStar और एक माउस MPNST नमूना का उपयोग करते हुए, सामान्य वर्कफ़्लो में आरेखित किया गया है। चित्र 1 और संक्षेप में नीचे समझाया गया है।
    1. DNAStar सॉफ़्टवेयर खोलें और SeqMan NGen वर्कफ़्लो चुनें।
    2. वेरिएंट विश्लेषण/रीसीक्वेंसिंग और अनुक्रमण विश्लेषण एनजीएस-आधारित एम्प्लिकॉन, जीन पैनल, या एक्सोम के प्रकार का चयन करके वर्कफ़्लो चुनें. अगला क्लिक करें.
    3. डाउनलोड जीनोम पैकेज और उपयुक्त संदर्भ जीनोम (यानी Mus_musculus-GRCm38-dbSNP146.zip या होमो सेपियन-GRCh37.p13.zip) का चयन करके पसंदीदा संदर्भ अनुक्रम चुनें। यदि कोर सुविधा ने एक बिस्तर फ़ाइल प्रदान की है, तो इस सहायक फ़ाइल को अपलोड करें। अगला क्लिक करें.
    4. उपयुक्त अनुक्रमक तकनीक, इलुमिना का चयन करके इनपुट अनुक्रम चुनें, और निर्दिष्ट करें कि अनुक्रमण पढ़ने वाले युग्मित-अंत हैं। फिर, प्रयोग सेटअप, बहु नमूना का चयन करें, और जोड़ें का चयन करके अनुक्रमण FASTQ फ़ाइलें अपलोड करें। यदि कई नमूने चल रहे हैं, तो प्रत्येक युग्मित-अंत सेट को एक अद्वितीय प्रयोग या नमूना नाम ट्यूमर, सेल लाइन या ए 18, ए 202 के साथ नामित करें ... अगला क्लिक करें.
    5. यदि कोई है तो नियंत्रण डेटासेट सेट करें। अगला क्लिक करें और असेंबली विकल्प के अंतर्गत फिर से अगला क्लिक करें. विश्लेषण विकल्प के अंतर्गत, उपयुक्त संस्करण पहचान मोड को द्विगुणित के रूप में क्लिक करें, फिर अगला क्लिक करें. असेंबली आउटपुट के तहत, प्रोजेक्ट के फ़ाइल सेविंग स्थान को नाम और नामित करें; अगला क्लिक करें. असेंबली को स्थानीय कंप्यूटर या क्लाउड पर चलाएँ।
      नोट: परिणामी संरेखण फ़ाइलों को पता लगाए गए एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपताओं (एसएनपी) के संस्करण एनोटेशन के लिए एरेस्टार वर्कफ़्लो में खोला जा सकता है। यह वर्कफ़्लो एसएनपी का पता लगाता है, न कि जीन कॉपी संख्या लाभ या हानि। उच्च घनत्व एसएनपी सरणी नामक एक अलग विश्लेषण कॉपी संख्या परिवर्तनों का पता लगाता है; संपूर्ण एक्सोम अनुक्रमण विश्वसनीय रूप से कॉपी संख्या परिवर्तनों का पता नहीं लगाता है। संरेखण प्रोग्राम के साथ किए जाने वाले विशिष्ट चरणों के लिए प्रोग्राम उपयोगकर्ता मार्गदर्शिका से परामर्श करें।
    6. कुछ डेटा को शामिल करने या बाहर करने के लिए पता लगाए गए एसएनपी के संस्करण एनोटेशन पर उपयोगकर्ता-परिभाषित फ़िल्टर लागू करें। संभावित कार्यात्मक रूप से प्रासंगिक वेरिएंट की एक संघनित सूची प्राप्त करने के लिए, इस पदानुक्रम में वेरिएंट डेटासेट पर निम्न फ़िल्टर लागू करें: नियंत्रण में नहीं (यदि एक सामान्य नियंत्रण नमूना उपलब्ध है), जनसंख्या आवृत्ति (gnomAD, ExAC, 1,000 जीनोम आवृत्तियों), एलील आवृत्ति (≤0.001 या 0.1%), कवरेज गहराई (<10 गहराई को छोड़कर), रोगजनकता या ClinVar वर्ग । (शामिल हैं: रोगजनक, संभावित रोगजनक; बाहर: अनिश्चित, संभावित सौम्य, सौम्य), और यदि वांछित एसएनपी प्रकार और कोडिंग प्रभाव (शामिल हैं: गैर-पर्यायवाची, गलत समझ, बकवास, फ्रेमशिफ्ट, इन-फ्रेम, स्प्लिसिंग)।
      नोट: एक ज्ञात प्रासंगिक कैंसर जीन सूची को केवल विशिष्ट रोग-प्रासंगिक जीन खींचने के लिए अंतिम सूची पर भी लागू किया जा सकता है, चरण 1.3.7 देखें। ये फिल्टर वेरिएंट जीन सूची को 20 से कम जीन तक कम कर सकते हैं।
      1. होमोजीगस और विषमयुग्मी वेरिएंट को शुद्ध गैर-दूषित सेल आबादी के लिए क्रमशः लगभग 100% और 50% पर दर्शाया जाएगा (एक स्थापित ट्यूमर-व्युत्पन्न सेल लाइन को इसोजेनिक ट्यूमर कोशिकाओं की एकल आबादी का प्रतिनिधित्व करना चाहिए)। इस मामले में, एक फिल्टर के रूप में वेरिएंट के लिए 100-90% और 50-40% एलील आवृत्तियों को लागू करें, जिससे उससे नीचे के किसी भी वेरिएंट को हटा दिया जाए। यदि उच्च घनत्व वाले एसएनपी सरणी डेटा भी उसी डेटासेट के लिए उपलब्ध हैं, तो होमोजीगस या विषम अनुपात से कम वेरिएंट एलील आवृत्तियों वाले एसएनपी पर कॉपी नंबर लाभ या हानि लागू करें (यानी, कॉपी नंबर गेन के परिणामस्वरूप एलील ए की 2 प्रतियां और एलील बी की 1 प्रति 75%, 25% की उपयुक्त वेरिएंट एलील आवृत्तियों को बनाएगी। क्रमशः)।
    7. ऐरेस्टार के साथ रोगजनक वेरिएंट की पहचान करने के बाद, वेरिएंट जीन सूची को सीएसवी, टीएक्सटी, या एक्सएलएस फ़ाइल के रूप में निर्यात और सहेजें और इन उत्परिवर्तनों वाले जीनों की तुलना पी0-जीजीएफ 3 उत्पन्न ट्यूमर के समूह में उन लोगों से करें जो अतिव्यापी और अद्वितीय उत्परिवर्तित जीन सूचियों को निर्धारित करते हैं। उत्परिवर्तित जीन ों की तुलना उनके मानव समकक्षों (यानी बुशमैन लैब कैंसर जीन सूची या उपयोगकर्ता-क्यूरेटेड सूची) से जुड़े ज्ञात उत्परिवर्तित जीनों से करें।
      1. वैकल्पिक, किसी भी उपयोगकर्ता-निर्धारित फ़िल्टर (1.3.6) को लागू करने से पहले, एनोटेट फ़ाइल को VCF फ़ाइल के रूप में निर्यात और सहेजें.
        नोट: इस वीसीएफ फ़ाइल को द्वितीयक विश्लेषण के रूप में तुलना के लिए अन्य संस्करण प्रभावक प्रेडिक्टर सॉफ़्टवेयर वर्सोम या वीईपी पर अपलोड किया जा सकता है। फ़िल्टर किए गए संस्करण जीन सूचियों पर जैविक और मार्ग विश्लेषण भी किया जा सकता है।
    8. प्रोटीन वर्ग, मार्ग, मार्ग घटक, और जीन परिवार और ऑन्कोलॉजी जानकारी प्राप्त करने के लिए उपयोगकर्ता-पसंदीदा डेटाबेस के माध्यम से वेरिएंट जीन सूची का कार्यात्मक वर्गीकरण करें।
      नोट: पैंथर (pantherdp.org) का उपयोग यहां एक उदाहरण के रूप में किया जाता है।
      1. जीन आईडी के साथ फ़िल्टर की गई जीन सूची अपलोड करें।
      2. जीव (मस मस्कुलस) का चयन करें।
      3. विश्लेषण का चयन करें (जीन सूची में देखा गया कार्यात्मक वर्गीकरण) और फ़िल्टर किए गए संस्करण जीन सूचियों पर जैविक और मार्ग विश्लेषण सबमिट करें पर क्लिक करें।

2. जीनोम-स्केल एसएचआरएनए स्क्रीन

नोट: कई एसएचआरएनए और सीआरआईएसपीआर पुस्तकालय उपलब्ध हैं जिनका उपयोग कम मार्ग ट्यूमर संस्कृतियों के साथ जीनोम-स्केल कार्यात्मक स्क्रीन के लिए किया जा सकता है। यहां, हम एक उदाहरण के रूप में CELECTA डिक्रिप्ट SHRNA पुस्तकालयों के उपयोग का वर्णन करते हैं। CELLECTA डिक्रिप्ट लेंटिवायरल SHRNA पुस्तकालयों को पूल प्रारूप में RNAI आनुवंशिक स्क्रीन के लिए अनुकूलित किया गया है। प्रत्येक प्रतिलेख को कम से कम 5-6 अद्वितीय एसएचआरएनए द्वारा लक्षित किया जाता है और प्रत्येक लेंटिवायरल एसएचआरएनए वेक्टर में पीसीआर प्राइमर साइटों के साथ एक अद्वितीय आनुवंशिक बारकोड होता है। ये पुस्तकालय मानव और माउस रोग-प्रासंगिक जीन के बहुमत को कवर करते हैं लेकिन जीनोम में सभी जीनों को कवर नहीं करते हैं। सेलेक्टा मानव पुस्तकालय प्लास्मिड डीएनए पूल तीन मॉड्यूल (मानव मॉड्यूल I, II, III; लक्ष्य 15,377 जीन) में उपलब्ध हैं, जबकि माउस लाइब्रेरी प्लास्मिड पूल दो मॉड्यूल (माउस मॉड्यूल I और II; लक्ष्य 9,145 जीन) में उपलब्ध हैं। इन पुस्तकालयों का उपयोग "ड्रॉप आउट" परख करने के लिए किया जाता है जिसमें प्रसार और / या अस्तित्व के लिए आवश्यक लक्षित जीन वायरल पारगमन के बाद अलग-अलग समय बिंदुओं पर अलग-अलग व्यक्त किए जाते हैं।

  1. लेंटिवायरल पैकेजिंग
    1. दिन 0: 10 मिलियन 293 टी कोशिकाओं / 15 सेमी डिश के प्लेट 10 व्यंजन 30 एमएल / डिश एंटीबायोटिक-मुक्त डीएमईएम में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) युक्त होते हैं।
    2. दिन 1: पुष्टि करें कि कोशिकाएं अगले दिन ~ 80% कंफ्लुएंट हैं और स्थानांतरित करने के लिए तैयार हैं। एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में, निम्नलिखित को इस क्रम में मिलाएं: 600 μL पैकेजिंग प्लास्मिड मिश्रण (0.5 μg / μL), प्लास्मिड बारकोड लाइब्रेरी का 60 μL, डीएमईएम का 12 एमएल (कोई सीरम या एंटीबायोटिक्स नहीं), और 600 μL अभिकर्मक अभिकर्मक। 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    3. 900 μL अभिकर्मक अभिकर्मक और 12 mL DMEM को एक अलग 15 mL शंक्वाकार ट्यूब में रखें और भंवर द्वारा मिलाएं। डीएनए मिश्रण में अभिकर्मक / डीएमईएम मिश्रण के 12.9 एमएल जोड़ें और मिश्रण करने के लिए फ्लिक करें। आगे मिश्रण के बिना 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। 293 टी कोशिकाओं के प्रत्येक 15 सेमी डिश में इस मिश्रण के 2.5 एमएल को ड्रॉप-वाइज जोड़ें और टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में रात भर इनक्यूबेट करें।
    4. दिन 2: अगले दिन मीडिया को एंटीबायोटिक दवाओं युक्त नियमित विकास मीडिया के साथ बदलें।
    5. दिन 3: मीडिया को इकट्ठा करके और इसे 0.2 μm निस्पंदन इकाई के माध्यम से पारित करके और 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में विभाजित करके वायरस की कटाई करें; वायरल टिटरिंग (48 एच वायरस माना जाता है) में उपयोग के लिए क्रायोवियल में फ़िल्टर किए गए वायरस के पांच 1 एमएल एलिकोट भी तैयार करें; वायरस को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें। कोशिकाओं के सूखने से बचने के लिए प्लेटों पर एक बार में 30 एमएल विकास मीडिया के साथ मीडिया को बदलें।
    6. दिन 4: मीडिया को इकट्ठा करके और इसे 0.2 μm निस्पंदन इकाई के माध्यम से पारित करके वायरस की कटाई करें। 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में एलिकोट वायरस। इसे 72 एच वायरस माना जाता है; वायरस को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें।
  2. टिटर लेंटिवायरल पूल
    1. ट्यूमर सेल विकास मीडिया के 65 एमएल में 65 μL कैनेसिक पॉलिमर (10 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें। बहुलक युक्त माध्यम के पिपेट 1 एमएल / कुएं को ग्यारह 6-वेल ऊतक संवर्धन प्लेटों में विभाजित किया जाता है। ट्रिप्सिनप्रारंभिक मार्ग ट्यूमर कोशिकाओं को व्यवस्थित करें और पसंदीदा विधि का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें ताकि प्रत्येक अच्छी तरह से 50,000 कोशिकाओं / एमएल / 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में फ्रीजर से 48 एच लेंटिवायरस के 1 एमएल एलिकोट पिघलाएं।
    2. प्रत्येक वायरल मॉड्यूल के लिए, तालिका 1 में दिखाए गए अनुसार संक्रमण तैयार करें।
    3. सभी 6-वेल प्लेटों को एक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में रखें। अगले दिन, वायरल मीडिया को हटा दें और ताजा विकास मीडिया के साथ फिर से भरें। 48 घंटे में, चयन प्राप्त करने वाले सभी कुओं में प्यूरोमाइसिन युक्त मीडिया जोड़ें। इससे पहले कि नियंत्रण कोशिकाएं कंफ्लुएंट हों, पसंदीदा विधि का उपयोग करके जीवित क्लोनों की सेल गणना करें।
      नोट: गैर-ट्रांसड्यूस कोशिकाओं को मारने के लिए आवश्यक प्यूरोमाइसिन की एकाग्रता को "किल" वक्र में सांद्रता की एक श्रृंखला का परीक्षण करके पूर्व-निर्धारित किया जाना चाहिए। सबसे कम एकाग्रता का उपयोग करें जो समान रूप से गैर-ट्रांसड्यूस संस्कृतियों की मृत्यु को प्रेरित करता है।
  3. लक्ष्य कोशिकाओं का लेंटिवायरल संक्रमण
    1. एमपीएनएसटी कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज करें और गिनती करें। प्रति मॉड्यूल कुल बीस 15 सेमी व्यंजनों के लिए प्रति 15 सेमी डिश में 2.5 मिलियन कोशिकाओं को प्लेट करें। वायरस को पिघलाएं और 5 μg /mL धनात्मक बहुलक की उपस्थिति में 0.5 के MOI पर वायरस के साथ कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करें (चित्रा 2A)।
    2. अगली सुबह वायरस युक्त मीडिया को हटा दें और ताजा विकास मीडिया के साथ बदलें। चयन मार्कर की अभिव्यक्ति की अनुमति देने के लिए अतिरिक्त 2 दिनों के लिए कोशिकाओं को कल्चर करें और फिर गैर-ट्रांसड्यूस कोशिकाओं को खत्म करने के लिए संस्कृतियों में प्यूरोमाइसिन जोड़ें।
    3. प्यूरोमाइसिन को जोड़ने के तीन दिन बाद, ट्रिप्सिनकोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज्ड करें और टेबलटॉप सेंट्रीफ्यूज में 5 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर सेल आबादी के आधे हिस्से को सेंट्रीफ्यूज करें। भविष्य के जीनोमिक डीएनए तैयारी के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में पेलेट कोशिकाओं को स्टोर करें; यह संदर्भ समय बिंदु, या समय बिंदु 1 (T1) है।
    4. सेल आबादी के अन्य आधे हिस्से को फिर से तैयार करें और इसे कटाई से पहले लगभग 7 आबादी के लिए विकसित करें और ऊपर के रूप में सेंट्रीफ्यूजिंग करें। यह सेल गोली अंतिम समय बिंदु (समय बिंदु 2, टी 2) के रूप में काम करेगी और भविष्य के जीनोमिक डीएनए अलगाव (चित्रा 2) के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत की जाती है।
  4. वायरस पूल के साथ ट्रांसड्यूस की गई कोशिकाओं से जीनोमिक डीएनए को अलग करना
    1. सेल गोली को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से पिघलाएं और आरएनएस के साथ 10 एमएल रिसस्पेंशन बफर में गोली को फिर से निलंबित करें, और तुरंत दो 15 एमएल पॉलीमेथिलपेंटिन ट्यूबों में विभाजित करें (चित्रा 2 बी)।
    2. प्रति 5 एमएल 10% एसडीएस के 500 μL जोड़ें, मिलाएं, और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। इसके बाद, 30 सेकंड के 25 चक्रों के लिए डीएनए को सोनिकेट करने के लिए डीएनए कतरनी डिवाइस में ट्यूब रखें, जिससे तापमान 4 डिग्री सेल्सियस पर रखना सुनिश्चित हो सके।
    3. क्लोरोफॉर्म, पीएच 8.0 (4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) के 5 मिलीलीटर जोड़ें, उपयोग से पहले फिनोल / क्लोरोफॉर्म को अच्छी तरह से मिश्रण करना सुनिश्चित करें। क्लोरोफॉर्म को जोड़ने के बाद, 45-60 सेकंड के लिए अधिकतम सेटिंग पर जोर से भंवर करके अच्छी तरह मिलाएं। 60 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज, 7,200 × ग्राम पर -20 डिग्री सेल्सियस।
      नोट: भंवर के बाद एक झागदार / दूधिया उपस्थिति पूर्ण पुन: निलंबन का संकेत देगी।
    4. स्पष्ट ऊपरी चरण के 3 मिलीलीटर को एक ताजा 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और 3 एम सोडियम एसीटेट के 0.5 एमएल और आइसोप्रोपेनोल के 4 एमएल जोड़ें और अच्छी तरह मिलाएं (चित्रा 2 सी)। 7,200 × ग्राम पर 20 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
    5. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें और फिर शेष तरल को सावधानीपूर्वक पिपेट करें। 70% इथेनॉल का 0.5 एमएल जोड़ें और ऊपर और नीचे पाइप करके गोली को हटा दें। पुन: निलंबित गोली को 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और एक ही नमूने से दोनों छर्रों को एक एकल 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में मिलाएं। 5 मिनट के लिए एक बेंचटॉप सेंट्रीफ्यूज में अधिकतम गति से सेंट्रीफ्यूज।
    6. सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें और किसी भी अवशिष्ट 70% इथेनॉल को अवशोषित करने के लिए एक प्रयोगशाला पोंछे का उपयोग करें। 0.5 एमएल आसुत जल में गोली को फिर से निलंबित करें, यह सुनिश्चित करें कि गोली को सूखने न दें क्योंकि इससे पुन: निलंबन मुश्किल हो जाएगा। डीएनए एकाग्रता को मापने से पहले नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. एसएचआरएनए बारकोड को बढ़ाने के लिए नेस्टेड पीसीआर
    नोट: भंडारण से डीएनए पुनर्प्राप्त करें और बर्फ पर रखें। यदि डीएनए एकाग्रता 100 एनजी / μL से कम है, तो डीएनए को वैक्यूम-ड्राई करें और आसुत जल की उचित मात्रा में पुन: निलंबित करें। हम एक समय में केवल एक मॉड्यूल (समय बिंदु 1 (टी 1) या समय बिंदु 2 (टी 2)) को संसाधित करने की सलाह देते हैं। प्रत्येक समय बिंदु की दो तैयारी करें जिन्हें अंत में पूल किया जाना है; इसलिए, एक ही दिन में दोहराए गए समय बिंदुओं को संसाधित नहीं करना महत्वपूर्ण है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल जीनोमिक डीएनए के एक समय बिंदु के लिए है।
    1. 7 ट्यूब सेट अप करें और उन्हें वर्णित के रूप में लेबल करें: नकारात्मक नियंत्रण, सकारात्मक नियंत्रण, जीनोमिक डीएनए के लिए 4 ट्यूब, और एक मास्टर मिश्रण के लिए एक (चित्रा 3 ए)। नकारात्मक नियंत्रण आसुत जल है; सकारात्मक नियंत्रण प्लास्मिड डीएनए है जिसका उपयोग लेंटिवायरस उत्पन्न करने के लिए 293 टी अभिकर्मक में किया जाता है।
    2. तालिका 2 में दर्शाए अनुसार पहले प्रत्येक ट्यूब में पानी डालें।
    3. तालिका 3 में दिखाए अनुसार एक मास्टर मिक्स (एमएम) तैयार करें।
    4. पानी युक्त प्रत्येक ट्यूब में 18 μL MM जोड़ें। इसके बाद, 4 टेम्पलेट ट्यूबों में से प्रत्येक में जीनोमिक डीएनए के 25 μL जोड़ें। फिर, सकारात्मक नियंत्रण ट्यूब में सकारात्मक नियंत्रण (10 एनजी / μL) के 1 μL जोड़ें, सकारात्मक नियंत्रण डीएनए के साथ अन्य ट्यूबों को दूषित न करने के लिए सावधान रहें। अंत में, प्रत्येक ट्यूब में 2 μL पोलीमरेज़ जोड़ें, पहले 4 नमूना ट्यूबों में जोड़ें और सकारात्मक नियंत्रण ट्यूब अंत में; पीसीआर ट्यूबों को मिलाएं और नीचे घुमाएं (चित्रा 3)।
    5. तालिका 4 में बताई गई शर्तों के तहत पीसीआर प्रतिक्रिया करें।
    6. जबकि पहला पीसीआर चल रहा है, तालिका 5 में दर्शाए अनुसारदूसरे पीसीआर के लिए ट्यूब तैयार करें। सात ट्यूब सेट करें: नकारात्मक नियंत्रण, सकारात्मक नियंत्रण, जीनोमिक डीएनए के लिए 4 ट्यूब, और एमएम के लिए एक (चित्रा 3 बी)।
    7. पानी युक्त प्रत्येक ट्यूब में 22 μL MM जोड़ें और डीएनए और पोलीमरेज़ जोड़ने से पहले पीसीआर के पहले दौर के समाप्त होने की प्रतीक्षा करें।
      1. एक बार पीसीआर का पहला दौर पूरा हो जाने के बाद, 4 नमूना ट्यूबों को एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में मिलाएं और मिलाएं।
      2. पानी युक्त प्रत्येक नमूना ट्यूब में 25 μL जोड़ें।
      3. इसके बाद, उचित रूप से लेबल किए गए ट्यूबों में पहले पीसीआर नकारात्मक नियंत्रण के 2 μL और पहले पीसीआर सकारात्मक नियंत्रण के 2 μL जोड़ें।
      4. प्रत्येक ट्यूब में पोलीमरेज़ के 2 μL जोड़ें, पहले 4 नमूना ट्यूबों में जोड़ें और अंत में नकारात्मक नियंत्रण।
    8. तालिका 6 में बताए अनुसार पीसीआर प्रतिक्रिया करें।
      नोट: 3.5% एगारोस जेल पर वैद्युतकणसंचलन द्वारा पहली पीसीआर प्रतिक्रिया के परिणामों का विश्लेषण करने पर, यदि उत्पाद की बहुतायत प्राप्त होती है, तो इस प्रक्रिया के अगले दोहराव के लिए चक्रों की संख्या 9-10 तक कम हो सकती है; इसी तरह, यदि उत्पाद की उपज कम है, तो चक्र ों को 14 तक बढ़ाया जा सकता है।
    9. जब दूसरी पीसीआर प्रतिक्रिया पूरी हो जाती है, तो 4 नमूनों को एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब और 6x लोडिंग डाई के 80 μL में मिलाएं। सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के लिए, नमूने के 20 μL का उपयोग करें।
      1. ट्रिस-बोरेट-ईडीटीए (टीबीई) बफर (चित्रा 4 ए) में 3.5% एगारोस जेल तैयार करें। बड़े नमूने की मात्रा को समायोजित करने के लिए, जेल कंघी में एक बड़ा कुआं बनाएं जिसमें कई कुओं को एक साथ टैप किया जाए (यदि मात्रा को फिट करने के लिए एक कंघी उपलब्ध नहीं है), सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के लिए दो कुओं को उपलब्ध छोड़ना सुनिश्चित करें। जेल को 1 घंटे के लिए 90 वोल्ट पर चलाएं।
    10. जेल की कल्पना करें और लगभग 250 बेस जोड़े (बीपी) पर एक बैंड की पुष्टि करें।
  6. पहला शुद्धिकरण: जेल निष्कर्षण
    1. एक साफ स्केलपेल या रेजर ब्लेड का उपयोग करके, 250 बीपी बैंड को एक्साइज करें, जितना संभव हो उतना जेल काट लें। बड़े बैंड को 4 टुकड़ों में विभाजित करें और प्रत्येक टुकड़े को एक साफ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। प्रत्येक जेल स्लाइस के वजन को मापें और रिकॉर्ड करें।
      नोट: प्रत्येक टुकड़ा प्रति ट्यूब लगभग 200 मिलीग्राम या उससे कम होना चाहिए।
    2. घुलनशीलता बफर के 6 वॉल्यूम जोड़ें (उदाहरण के लिए, यदि जेल के टुकड़े का वजन 200 मिलीग्राम है, तो 1.2 एमएल बफर जोड़ें)। ट्यूबों को 50 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें और जेल स्लाइस के घुलने तक हर 10-15 मिनट में घुमाएं। फिर, प्रत्येक ट्यूब में आइसोप्रोपेनोल की 1 मात्रा जोड़ें (उदाहरण के लिए, 0.2 एमएल आइसोप्रोपेनोल यदि जेल के टुकड़े का वजन 200 मिलीग्राम है)।
    3. शुद्धिकरण के लिए दो स्पिन कॉलम का उपयोग करके, सभी 4 ट्यूबों से नमूने कॉलम में लोड करें। सभी नमूना मात्रा को संसाधित करने के लिए कई स्पिन करें क्योंकि कॉलम केवल 750 μL रखते हैं। एक पारंपरिक बेंचटॉप माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में 1 मिनट के लिए कॉलम को 17,900 × ग्राम पर घुमाएं और हर बार प्रवाह को छोड़ दें।
    4. 1 मिनट के लिए 17,900 × ग्राम पर 750 μL वॉश बफर और सेंट्रीफ्यूज के साथ कॉलम धोएं। धोने के बाद, प्रवाह को छोड़ दें और 3 मिनट के लिए 17,900 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करके स्पिन कॉलम को सुखाएं। डीएनए को प्रति स्तंभ 50 μL आसुत जल के साथ एलुट करें और पहले की तरह 1 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें और नमूने के 100 μL की कुल मात्रा के लिए दोनों ट्यूबों को मिलाएं।
  7. दूसरा शुद्धिकरण
    1. यह अगला शुद्धिकरण चरण बाइंडिंग बफर 2 (पीसीआर शुद्धिकरण किट से) का उपयोग करेगा, जो छोटे टुकड़ों को खत्म नहीं करता है। डीएनए के 100 μL में 400 μL बफर जोड़ें, और इसे एक स्पिन कॉलम (चित्रा 4 बी) पर लोड करें। 1 मिनट के लिए 17,900 × ग्राम पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें।
    2. इसके बाद, झिल्ली को 650 μL वॉश बफर के साथ धोएं और पहले किए गए अनुसार स्पिन करें। 3 मिनट के लिए ऊपर दिए गए अतिरिक्त सेंट्रीफ्यूजेशन के साथ स्पिन कॉलम को सुखाएं।
    3. डीएनए को 30 μL आसुत जल के साथ मिलाएं और 1 मिनट के लिए अधिकतम गति से घुमाएं। क्षालन के बाद, स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर एकाग्रता की जांच करें; सुनिश्चित करें कि एकाग्रता 10 ng / μL से कम या 70-80 ng / μL से अधिक नहीं है। डीएनए को -20 °C फ्रीजर में स्टोर करें।
  8. प्रवर्धित बारकोड का अनुक्रमण।
    1. अनुक्रमण के लिए, क्षालन बफर (ईबी) का उपयोग करके शुद्ध बारकोड को 0.75 एनजी / μL तक पतला करें। अनुक्रम विविधता जोड़ने के लिए, एम्प्लिकॉन को 17 pM पर क्लस्टर किया जाता है, जिसमें 30% (v / v) PHIX शामिल हैं। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक स्वचालित क्लस्टर पीढ़ी प्रणाली पर एकल-अंत (एसई) क्लस्टरिंग करें।
    2. अनुक्रमण कोर को नेक्स्टजेन अनुक्रमक (चित्रा 4 सी) पर एकल-अंत अनुक्रमण के कुल 36 चक्र ों का प्रदर्शन करना है। 0.5 μM पर Illumina अनुक्रमण प्राइमरों में कस्टम प्राइमर GexSeqS जोड़ें।
    3. फास्टक्यू फ़ाइलों को उत्पन्न करने के लिए संदर्भित विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें और उन्हें 18 न्यूक्लियोटाइड तक पढ़ने की लंबाई को ट्रिम करने के लिए सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके संसाधित करें।
    4. छंटनी किए गए रीड को कम करने के लिए बारकोड विश्लेषक और डीकॉन्वोल्यूटर सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। संदर्भ समय बिंदु (टी 1) बनाम अंतिम समय बिंदु (टी 2) पर पढ़ने का अनुपात गणना के रूप में प्रत्येक एसएचआरएनए के लिए फोल्ड रिक्तीकरण स्कोर की गणना करें।
  9. एसएचआरएनए स्क्रीन परिणामों का विश्लेषण और उम्मीदवार चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान
    नोट: Cellecta SHRNA लाइब्रेरी में, अधिकांश जीन या तो 5 (67%) या 6 अलग-अलग SHRNA (32%) द्वारा लक्षित होते हैं। हालांकि, कई हाउसकीपिंग जीन, जो अधिकांश कोशिकाओं में हिट होने चाहिए, बड़ी संख्या में एसएचआरएनए द्वारा लक्षित होते हैं और नियंत्रण के रूप में काम करते हैं जो नकारात्मक के लिए स्कोर की सीमा को परिभाषित करते हैं।
    1. बड़ी संख्या में एसएचआरएनए द्वारा लक्षित जीन के प्रति पूर्वाग्रह को रोकने के लिए, लॉग कमी स्कोर को बदल देता है। अपने अनुभवजन्य वितरण से प्रत्येक जीन के लिए 80 वें प्रतिशत की गणना करके एक मात्रात्मक अनुमान करें।
    2. लॉग फोल्ड-रिक्तीकरण स्कोर का शून्य वितरण उत्पन्न करने के लिए, मान लें कि >95% जीन समाप्त नहीं होंगे और उनके लॉग-मात्रात्मक स्कोर का सामान्य वितरण होगा। शून्य वितरण के औसत का अनुमान लगाने के लिए अनुभवजन्य वितरण के औसत का उपयोग करें। इस शून्य वितरण का उपयोग करके, लॉग-फोल्ड रिक्तीकरण स्कोर वाले सभी जीनों को वर्गीकृत करें जो शून्य वितरण के 95 वें प्रतिशत से बड़े हैं।
      नोट: सभी हिट ्स में कट-पॉइंट से ऊपर रिक्तीकरण स्कोर के साथ कम से कम दो एसएचआरएनए होने चाहिए (चित्रा 5)।
    3. आरएनएआई ड्रॉपआउट स्क्रीन डेटा की गुणवत्ता और कट-पॉइंट की वैधता का आकलन करने के लिए, जीन के एक सेट का उपयोग करें जिसे तुलना के लिए कोल्ट कैंसर आरएनएआई स्क्रीनिंग पहल24,25 द्वारा 'कोर आवश्यक' के रूप में परिभाषित किया गया है। संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की प्रारंभिक सूची का उत्पादन करने के लिए हिट की सूची से सीईजी को हटा दें।
      नोट: कोल्ट सेट में जीन ने 72 कैंसर सेल लाइनों में से >50% में हिट के रूप में स्कोर किया, जिन्हें कोल्ट द्वारा जांच की गई थी। कोर आवश्यक जीन सूची में 640 जीन होते हैं।
    4. संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए जो आमतौर पर या समान रूप से कई एमपीएनएसटी सेल लाइनों द्वारा आवश्यक होते हैं, विभिन्न एमपीएनएसटी सेल लाइनों या प्रारंभिक मार्ग संस्कृतियों की स्क्रीन में पहचाने जाने वाले गैर-सीईजी हिट के वेन आरेख ों का निर्माण करें (चित्रा 6 ए)। गैर-सीईजी हिट को प्राथमिकता दें जो सभी या अधिकांश एमपीएनएसटी लाइनों या संस्कृतियों में आवश्यक हैं।
      1. वैकल्पिक रूप से, प्रत्येक सेल लाइन या प्रारंभिक मार्ग संस्कृति से गैर-सीईजी हिट सूची पर मार्ग विश्लेषण करें ताकि उन जीनों की पहचान की जा सके जिनके उत्पाद सिग्नलिंग मार्गों के घटकों को एन्कोड करते हैं जो ट्यूमर सेल प्रसार और / या अस्तित्व के लिए आवश्यक हैं। फिर, गैर-सीईजी के मार्ग विश्लेषण में पहचाने जाने वाले सिग्नलिंग मार्गों की तुलना उन सिग्नलिंग मार्गों से करें जिन्हें डब्ल्यूईएस के साथ पहचाने गए उत्परिवर्तन से प्रभावित के रूप में पहचाना गया था।
        नोट: हम सिग्नलिंग मार्गों की पहचान करना विशेष रूप से उपयोगी पाते हैं जो डब्ल्यूईएस में पहचाने गए उत्परिवर्तन से लगातार प्रभावित होते हैं और उनकी तुलना एसएचआरएनए स्क्रीन में महत्वपूर्ण के रूप में पहचाने जाने वाले सिग्नलिंग मार्गों से करते हैं।
    5. दवा योग्य लक्ष्यों की पहचान करने के लिए जिनके लिए चिकित्सीय एजेंट पहले से ही उपलब्ध हैं, ड्रग जीन इंटरैक्शन डेटाबेस (dgidb.org) का उपयोग करके मुख्य आवश्यक जीन को हटाने के बाद शेष हिट की सूची को स्क्रीन करें।
      नोट: यह डेटाबेस जीन की एक सूची को एक साथ दर्ज करने और जांच करने की अनुमति देता है और उन दवाओं पर मार्गदर्शन प्रदान करता है जो वर्तमान में इन जीनों को लक्षित करने के लिए उपलब्ध हैं।
    6. पहचान किए गए दवा योग्य उच्च-रुचि लक्ष्यों को पहले एकल बैच प्रारूप में प्रारंभिक लाइब्रेरी स्क्रीन में उपयोग किए जाने वाले एसएचआरएनए से अलग एसएचआरएनए के साथ उनके जीन अभिव्यक्ति को खटखटाकर मान्य करें (अभी वर्णित लाइब्रेरी-बैच प्रारूप नहीं)। जीन अभिव्यक्ति को कम करने के लिए, दो से तीन अलग-अलग लेंटिवायरल एसएचआरएनए का उपयोग करें। संक्रमण के तीन से चार दिन बाद, ट्यूमर सेल प्रसार और अस्तित्व पर इसके प्रभाव को निर्धारित करें जैसा कि नीचे वर्णित है।

3. उम्मीदवार चिकित्सीय एजेंटों के साथ चुनौती दी गई एमपीएनएसटी कोशिकाओं में सेल संख्या और व्यवहार्यता के साइटोमीटर परीक्षण करें

  1. डीएमईएम में एमपीएनएसटी कोशिकाओं को 80% कंफ्लुएंसी तक बढ़ाएं। कमरे के तापमान हैंक्स के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) के साथ कोशिकाओं को कुल्ला करें।
    नोट: कोशिकाओं को संकुचित करने के लिए विकसित न करें क्योंकि इन कोशिकाओं का विकास रीप्लेटिंग के बाद कुछ समय के लिए पिछड़ जाएगा।
  2. गैर-एंजाइमेटिक सेल पृथक्करण समाधान के साथ 30 एस से 1 मिनट के लिए कोशिकाओं को कवर करके सब्सट्रेट से कोशिकाओं को अलग करें। पृथक्करण समाधान के प्रति 1 एमएल डीएमईएम के 5 एमएल जोड़ें और सब्सट्रेट से अलग होने के लिए धीरे से कोशिकाओं को ऊपर और नीचे पाइप करें।
  3. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। काली दीवार वाली 96-वेल प्लेटों में प्रति कुएं 1,200 कोशिकाओं के घनत्व पर प्लेट कोशिकाएं; प्रत्येक दवा को कमजोर करने के लिए कम से कम तीन कुओं को प्लेट करें जिनका परीक्षण किया जाएगा और इन प्रयोगों की तीन जैविक प्रतिकृतियां की जाएंगी।
  4. परीक्षण की जाने वाली दवा की प्रारंभिक सांद्रता निर्धारित करने के लिए, अन्य कैंसर सेल प्रकारों के खिलाफ कौन सी सांद्रता प्रभावी रही है, इसका आकलन करने के लिए साहित्य की समीक्षा करें। प्रारंभिक प्रयोगों में, अन्य कैंसर प्रकारों के साथ उपयोग की जाने वाली दवा एकाग्रता से ऊपर परिमाण के दो आदेशों और परिमाण के दो आदेशों की सीमा का परीक्षण करें।
  5. परीक्षण के लिए दवा के कमजोर पड़ने की तैयारी करें और प्रत्येक कमजोर पड़ने या वाहन को कम से कम तीन प्रतिकृति कुओं में जोड़ें।
  6. दवाओं को जोड़ने के बाद प्रत्यक्ष सेल संख्या 1, 3, 5 और 7 दिनों का आकलन करें। होकस्ट 33342 को 5 μg / mL की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए प्लेटों को इनक्यूबेट करें। 100,000 एमएस एक्सपोजर समय के साथ कुल सेल नंबर विकल्प के लिए प्रत्यक्ष सेल गिनती का उपयोग करके उच्च-थ्रूपुट इमेजिंग साइटोमीटर पर प्लेटों को पढ़ें।
  7. सॉफ्टवेयर का उपयोग करके पढ़ने का विश्लेषण करें और उन्हें स्प्रेडशीट में निर्यात करें और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए उपयुक्त सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें।
  8. यदि दवा-उपचारित कुओं में कोशिका संख्या में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण कमी देखी जाती है, तो यह निर्धारित करने के लिए "जीवित / मृत" परख करें कि क्या यह कमी कोशिका मृत्यु के प्रेरण के कारण है।
    1. चरण 3.3 में वर्णित काली दीवार वाले 96 कुएं प्लेटों में प्लेट कोशिकाएं।
    2. चरण 3.5 में वर्णित दवाओं को तैयार करें और जोड़ें।
    3. दवा को जोड़ने के 1, 3, 5 और 7 दिनों के बाद सेल व्यवहार्यता और मृत्यु का आकलन करें। प्रत्येक कुएं में 1 μM की अंतिम सांद्रता में कैल्सीन एएम और 1 μM की अंतिम एकाग्रता में प्रोपिडियम आयोडाइड जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    4. लाइव + डेड सॉफ़्टवेयर विकल्प का उपयोग करके इमेजिंग साइटोमीटर पर छवि कोशिकाएं। सॉफ्टवेयर का उपयोग करके पढ़ने का विश्लेषण करें और उन्हें स्प्रेडशीट में निर्यात करें और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए उपयुक्त सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें।

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Representative Results

चित्रा 5 प्लॉट प्रत्येक मानव सेल लाइन में गैर-सीईजी (झूठे के रूप में लेबल) की तुलना में ट्रू के रूप में लेबल किए गए कोर आवश्यक जीन (सीईजी) के कमी स्कोर प्रदर्शित करते हैं। अंक अलग-अलग जीनों के लिए गुना कमी स्कोर के लॉग 2 का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो समग्र स्कोर वितरण के बॉक्सप्लॉट प्रतिनिधित्व पर प्लॉट किए जाते हैं। प्रत्येक सेल लाइन में दो समूहों के बीच कमी के स्कोर के औसत में महत्वपूर्ण अंतर के लिए छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग किया गया था। परिणामी पी-मान प्रत्येक पैनल में इंगित किए जाते हैं। ध्यान दें कि गैर-सीईजी की तुलना में सीईजी के लिए औसत गुना कमी स्कोर काफी अधिक है। यह अपेक्षित है क्योंकि कोर आवश्यक जीन, परिभाषा के अनुसार, अधिकांश सेल प्रकारों में प्रसार और / या अस्तित्व के लिए लगातार आवश्यक हैं।

चित्रा 6 ए तीन मानव एमपीएनएसटी सेल लाइनों के लिए "हिट्स" का वेन आरेख प्रस्तुत करता है। हम आम तौर पर पाते हैं कि कई लाइनों के बीच बड़ी संख्या में जीन साझा किए जाते हैं; ये हिट एक उच्च प्राथमिकता हैं क्योंकि वे प्रोटीन को एन्कोडिंग करने वाले जीन का प्रतिनिधित्व करते हैं जो एमपीएनएसटी के एक बड़े उप-समूह के प्रसार और / या अस्तित्व के लिए आवश्यक होने की संभावना है। हम आमतौर पर इसका सामना करते हैं और इसे एक संकेत के रूप में नहीं लिया जाना चाहिए कि स्क्रीन खराब गुणवत्ता की हैं। कई लाइनों के बीच आम हिट होने वाले जीन का मूल्यांकन ड्रग जीन इंटरैक्शन डेटाबेस का उपयोग करके किया जाता है ताकि इस उप-समूह के भीतर जीन की पहचान की जा सके जो प्रोटीन को एन्कोड करते हैं जो मौजूदा एजेंटों के साथ दवा योग्य हैं। फिर हम इनमें से कई का चयन करते हैं और एसएचआरएनए के साथ संबंधित एमआरएनए की अभिव्यक्ति को खटखटाकर प्रारंभिक सत्यापन करते हैं। चूंकि कुछ एसएचआरएनए में ऑफ-टारगेट प्रभाव होंगे, इसलिए हम हमेशा एक ही प्रतिलेख को लक्षित करने वाले कई एसएचआरएनए का परीक्षण करते हैं। चित्रा 6 बी एक प्रतिनिधि परिणाम दिखाता है जिसमें हमने एमपीएनएसटी कोशिकाओं को गैर-लक्ष्यीकरण नियंत्रण और बीसीएल 6 को लक्षित करने वाले कई एसएचआरएनए के साथ ट्रांसड्यूस किया है। सेल नंबर तब पारगमन के बाद अलग-अलग समय पर निर्धारित किए गए थे। ध्यान दें कि बीसीएल 6 एसएचआरएनए में से कई ने सेल संख्या को स्पष्ट रूप से कम कर दिया; जैसा कि साथ में इम्यूनोब्लॉट में दिखाया गया है, सेल संख्या में कमी की डिग्री बीसीएल 6 वध की डिग्री से संबंधित है। चित्रा 6 सी प्रारंभिक मार्ग पी 0-जीजीएफ 3 एमपीएनएसटी संस्कृति के लिए एक प्रतिनिधि विकास वक्र दिखाता है।

Figure 1
चित्रा 1: एमपीएनएसटी ऊतक या प्रारंभिक मार्ग एमपीएनएसटी कोशिकाओं के पूरे एक्सोम अनुक्रमण करने के लिए वर्कफ़्लो। योजनाबद्ध ट्यूमर-व्युत्पन्न प्रारंभिक मार्ग संस्कृतियों में मौजूद वेरिएंट का पता लगाने के सामान्य वर्कफ़्लो को दर्शाता है। प्रारंभिक मार्ग संस्कृतियों (1) से डीएनए को अलग करें और उनके सबमिशन प्रोटोकॉल (2) के अनुसार अनुक्रमण कोर में गुणवत्ता वाले डीएनए प्रस्तुत करें। अनुक्रमण कोर प्रस्तुत डीएनए की गुणवत्ता की जांच करेगा और सभी आवश्यक नमूना और जीनोम लाइब्रेरी की तैयारी करेगा। कोर सुविधा उपयोगकर्ताओं को गुणवत्ता नियंत्रण मैट्रिक्स (3) के साथ FASTQ अनुक्रमण फ़ाइलों के साथ प्रदान करेगी। उपयोगकर्ता FASTQ फ़ाइलों को अपनी पसंद के जीनोम संरेखण और वेरिएंट कॉलर प्रोग्राम में अपलोड करेंगे। (4) गैर-प्रासंगिक वेरिएंट को हटाने के लिए उपयोगकर्ता-परिभाषित मानदंडों पर एनोटेट किए गए वेरिएंट को फ़िल्टर किया जाता है। दिखाए गए प्रतिनिधि डेटा ने ट्यूमर26 से प्राप्त सेल लाइन बनाम मानव एमपीएनएसटी ट्यूमर नमूने की तुलना की। (5) पैंथर के साथ कार्यात्मक वर्गीकरण विश्लेषण करें। संक्षिप्त नाम: एमपीएनएसटी = घातक परिधीय तंत्रिका शीथ ट्यूमर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एमपीएनएसटी कोशिकाओं में एसएचआरएनए पुस्तकालयों के वायरल ट्रांसडक्शन करने और समय बिंदु 1 और समय बिंदु 2 पर कोशिकाओं से जीनोमिक डीएनए को अलग करने के लिए वर्कफ़्लो। (ए) लक्ष्य कोशिकाओं को बारकोडेड लेंटिवायरल कणों के साथ 0.3 के कम एमओआई पर संक्रमित किया जाता है और 72 घंटे के लिए चुना जाता है। कोशिकाओं को 5-7 जनसंख्या दोहरीकरण (लगभग 7 दिन) के लिए पारित किया जाता है। दिन 0 और दिन 7 में सेल छर्रों को जीनोमिक डीएनए अलगाव के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है। दिन 0 को समय बिंदु 1 (टी 1) और दिन 7 को समय बिंदु 2 (टी 2) के रूप में संदर्भित किया जाता है। (बी) जीनोमिक डीएनए अलगाव रीसस्पेंशन बफर में सेल छर्रों के पुन: निलंबन के साथ शुरू होता है जो बाद में दो 15 एमएल ट्यूबों में विभाजित होते हैं। सेल लाइसिस की सुविधा के लिए, प्रत्येक ट्यूब में 10% एसडीएस जोड़ा जाता है और 30 सेकंड की दूरी पर 25 चक्रों के लिए सोनिक किया जाता है। सोनिकेशन के बाद, फिनोल / क्लोरोफॉर्म को प्रत्येक ट्यूब में जोड़ा जाता है और 45-60 सेकंड के लिए जोर से भंवर किया जाता है। ट्यूबों को फिर सेंट्रीफ्यूज किया जाता है। (सी) एक स्पष्ट ऊपरी चरण को पाइप किया जाता है और सोडियम एसीटेट / आइसोप्रोपेनोल के साथ एक साफ ट्यूब में जोड़ा जाता है और अच्छी तरह से मिलाया जाता है। ट्यूबों को फिर से सेंट्रीफ्यूज किया जाता है। इस बार, सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दिया जाता है, और गोली को 70% इथेनॉल के साथ हटा दिया जाता है। पुन: निलंबित छर्रों को एक ट्यूब में मिलाएं और एक बेंचटॉप सेंट्रीफ्यूज में अधिकतम गति से घुमाएं। सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें और आसुत जल में गोली को फिर से निलंबित करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के साथ बारकोड की मात्रा का ठहराव करने की तैयारी में लेंटिवायरल एसएचआरएनए वैक्टर से बारकोड अनुक्रमों को बढ़ाने के लिए वर्कफ़्लो। (ए) पहली नेस्टेड पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए ट्यूब स्थापित करने के तरीके का प्रतिनिधित्व (7 ट्यूब: नकारात्मक नियंत्रण के लिए एक, सकारात्मक नियंत्रण के लिए एक, और जीनोमिक डीएनए के लिए शेष 4 ट्यूब)। अंतिम ट्यूब मास्टर मिक्स ट्यूब के रूप में काम करेगी)। पहली पीसीआर प्रतिक्रिया के बाद, जीनोमिक डीएनए ट्यूबों को एक ट्यूब में मिलाएं और मिश्रण करें। (बी) पहले नेस्टेड पीसीआर प्रतिक्रिया के उत्पाद दूसरे नेस्टेड पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए टेम्पलेट के रूप में काम करेंगे। दूसरे पीसीआर के बाद, जीनोमिक डीएनए ट्यूबों को एक ट्यूब में मिलाएं और मिलाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: प्रवर्धित एसएचआरएनए बारकोड को शुद्ध करने के लिए वर्कफ़्लो और समय बिंदु 1 और समय बिंदु 2 पर उनके प्रतिनिधित्व को निर्धारित करने के लिए बारकोड को अनुक्रमित करें । (ए) 3.5% एगारोस जेल डालें। चूंकि पूल किए गए डीएनए की मात्रा एक कुएं की सीमा से अधिक है, इसलिए एक जेल कंघी के 4-6 दांतों को एक साथ टेप करके एक बड़े कुएं का उत्पादन किया जाता है। 6x लोडिंग डाई के साथ पीसीआर उत्पाद तैयार करें और जेल में सकारात्मक नियंत्रण, नकारात्मक नियंत्रण और पूल किए गए डीएनए लोड करें। वैद्युतकणसंचलन के बाद, लगभग 250 आधार जोड़े पर एक बड़ा बैंड पूल डीएनए लेन में दिखाई देना चाहिए। एक साफ स्केलपेल का उपयोग करके, पूरे बैंड को एक्साइज करें, और फिर 4 जेल स्लाइस में काट लें। जेल के टुकड़ों को घुलनशील करें और फिर डीएनए को अलग करने के लिए उन्हें दो स्पिन कॉलम में मिलाएं। एक ट्यूब में इल्यूटेड डीएनए को मिलाएं। (बी) डीएनए को दूसरे शुद्धिकरण चरण के माध्यम से शुद्ध किया जाता है। पूल किए गए डीएनए की ट्यूब में बाइंडिंग बफर 2 जोड़ें, और फिर एक स्पिन कॉलम पर पिपेट करें। झिल्ली को धोएं और फिर आसुत जल में डीएनए को पिघलाएं। (सी) शुद्ध डीएनए को अनुक्रमण कोर में जमा करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: प्रोटोकॉल में वर्णित विश्लेषण के बाद कोर आवश्यक जीन के वितरण के प्रतिनिधि उदाहरण। इस उदाहरण में, तीन मानव एमपीएनएसटी सेल लाइनों (एस 462, टी 265, और 2एक्सएसबी) कोशिकाओं को सेलेक्ट ा डिक्रिप्ट एसएचआरएनए पुस्तकालयों के साथ जांचा गया था। प्रत्येक मानव एमपीएनएसटी सेल लाइन के लिए, कोर आवश्यक जीन (सीईजी) की सूची में जीन के लिए जीन-स्तर की कमी के स्कोर की तुलना करने के लिए एक बॉक्सप्लॉट बनाया गया था। ट्रू बॉक्स प्लॉट) 25 उन जीनों के लिए जो सीईजी (झूठे बॉक्स प्लॉट) की सूची में नहीं पाए जाते हैं। प्रत्येक बॉक्स प्लॉट के शीर्ष पर अलग-अलग डेटा पॉइंट स्तरित होते हैं। पी-मान एक मानक टी-टेस्ट से होते हैं जो सीईजी के जीन-स्तर की कमी के स्कोर की तुलना गैर-सीईजी से करते हैं। संक्षेप: सीईजी = कोर आवश्यक जीन; एमपीएनएसटी = घातक परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: स्क्रीन परिणामों का सत्यापन । (ए) तीन मानव एमपीएनएसटी सेल लाइनों में अतिव्यापी हिट का प्रतिनिधि वेन आरेख। (बी) एस 462 मानव एमपीएनएसटी कोशिकाओं को एक गैर-लक्ष्यीकरण (एनटी) लेंटिवायरल वेक्टर और लेंटिवायरस के साथ ट्रांसड्यूस किया जाता है जो चार अलग-अलग बीसीएल 6 एसएचआरएनए (एसएचआरएनए1, एसएचआरएनए2, एसएचआरएनए3 और एसएचआरएनए4) को व्यक्त करता है। कोशिकाओं को लेंटिवायरस के साथ ट्रांसड्यूस किया गया और फिर 3 दिनों के लिए एक चयन एजेंट (प्यूरोमाइसिन) के साथ इलाज किया गया। फिर अगले सात दिनों में सेल नंबरों का आकलन किया गया। (सी) पश्चिमी धब्बा विश्लेषण एनटी, एसएचआरएनए 1, एसएचआरएनए 2, एसएचआरएनए 3 और एसएचआरएनए 4 लेंटीवायरस के साथ पारगमन के बाद बीसीएल 6 के प्रोटीन स्तर को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: लेंटिवायरल टिटरिंग के लिए प्लेट लेआउट। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 2: पहली पीसीआर प्रतिक्रियाओं का प्रारंभिक सेटअप। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 3: पहली पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए मास्टर मिश्रण की तैयारी। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 4: सेलक्टा पहला पीसीआर पैरामीटर। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 5: दूसरी पीसीआर प्रतिक्रिया का प्रारंभिक सेटअप। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 6: सेलक्टा दूसरा पीसीआर पैरामीटर। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

यहां प्रस्तुत विस्तृत तरीकों को परिधीय तंत्रिका तंत्र नियोप्लासिया और एमपीएनएसटी रोगजनन का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था। यद्यपि हमने इन तरीकों को प्रभावी पाया है, यह माना जाना चाहिए कि हमारे द्वारा यहां वर्णित तरीकों की कुछ संभावित सीमाएं हैं। नीचे, हम उन सीमाओं में से कुछ और अन्य मॉडल प्रणालियों में उन पर काबू पाने के लिए संभावित रणनीतियों पर चर्चा करते हैं।

हमने पाया है कि पूरे एक्सोम अनुक्रमण प्रभावी रूप से पी 0-जीजीएफ 3 चूहों में रुचि के उत्परिवर्तन की पहचान करता है। हालांकि, यह पहचाना जाना चाहिए कि पूरे एक्सोम अनुक्रमण की सीमाएं हैं। सबसे पहले, संलयन जीन उत्पादों की पहचान करने के लिए पूरे एक्सोम अनुक्रमण एक प्रभावी दृष्टिकोण नहीं है। ऐसा इसलिए है क्योंकि क्रोमोसोमल ब्रेक और बाद के संलयन के बहुमत में मुख्य रूप से इंटरजेनिक क्षेत्र और इंट्रोन्स शामिल होते हैं क्योंकि वे क्षेत्र जीनोम के बहुमत का प्रतिनिधित्व करते हैं। इसके बजाय हमने पाया है कि युग्मित-अंत पढ़ने के साथ आरएनए-सेक संलयन जीन की अधिक प्रभावी ढंग से पहचान करता है। यह भी सवाल है कि पूरे एक्सोम अनुक्रमण क्रोमोसोमल हानि के अपेक्षाकृत बड़े क्षेत्रों की पहचान कैसे प्रभावी ढंग से करता है।

यद्यपि इस तरह के नुकसान की पहचान करने के लिए कई एल्गोरिदम विकसित किए गए हैं, "संपूर्ण एक्सोम अनुक्रमण" शब्द अपने आप में भ्रामक है क्योंकि अच्छे रन में भी एक्सोम का कब्जा अक्सर एक्सोनिक क्षेत्रों के 5-10% तक चूक जाता है। इस वजह से, हम नियमित रूप से सरणी तुलनात्मक जीनोमिक संकरण (एसीजीएच) जैसे अन्य दृष्टिकोणों के साथ पूरे एक्सोम अनुक्रमण को पूरक करते हैं। लाभ और हानि की पहचान करने के बाद, हम इन अंतरालों के भीतर जीन की जांच करते हैं और उनकी तुलना ज्ञात ड्राइवर उत्परिवर्तन से करते हैं जो उनके मानव समकक्षों से जुड़े होते हैं। हालांकि, माउस जीनोम मानव जीनोम27 की तुलना में अधिक स्थिर है। नतीजतन, माउस ट्यूमर आमतौर पर मानव नियोप्लाज्म में देखे जाने वाले क्रोमोथ्रिप्सिस के अनुरूप नहीं दिखाते हैं। माउस ट्यूमर में पैटर्न इसके बजाय बहुत सरल है, जो अपेक्षाकृत कम फोकल विलोपन के साथ पूरे गुणसूत्र या गुणसूत्र लाभ या हानि की ओर इशारा करता है जो मजबूत चयनात्मक दबाव22,23 के तहत होते हैं।

जीनोम-स्केल एसएचआरएनए स्क्रीन करते समय हमें कुछ संभावित नुकसान का सामना करना पड़ा है। सबसे आम समस्याओं में से एक जो हम सामना करते हैं वह लक्ष्य कोशिकाओं में लेंटिवायरल वैक्टर का अपेक्षाकृत खराब पारगमन है। हम अक्सर पाते हैं कि समस्या पैक किए गए लेंटिवायरल पूल के अनुचित टिटरिंग से उत्पन्न हुई। क्योंकि प्रारंभिक मार्ग माउस ट्यूमर सेल संस्कृतियां एक सीमित संसाधन हैं, कई जांचकर्ता इसके बजाय एक और स्थापित सेल लाइन का उपयोग करके अपने लेंटिवायरस को टिटर करने का प्रयास करेंगे जो अधिक आसानी से उपलब्ध है। हालांकि, इस दृष्टिकोण के साथ समस्या यह है कि लेंटिवायरल ट्रांसडक्शन की दक्षता सेल प्रकार से सेल प्रकार में काफी भिन्न हो सकती है। यह इस कारण से है कि हम प्रयोग में उपयोग की जाने वाली वास्तविक कोशिकाओं पर टिटरिंग लेंटिवायरस की सिफारिश करते हैं। हमें अपेक्षाकृत कम वायरल टिटर्स के साथ समस्याओं का भी सामना करना पड़ा है। यह समस्या अक्सर पैक किए गए वायरस का उत्पादन करते समय 293 टी कोशिकाओं के खराब अभिकर्मक को दर्शाती है।

जीनोम-स्केल एसएचआरएनए स्क्रीन करते समय झूठी सकारात्मक हिट प्राप्त करना संभव है। इस वजह से, एक बार जब हम संभावित दवा योग्य लक्ष्यों की पहचान कर लेते हैं जो हमारे लिए सबसे अधिक रुचि रखते हैं, तो हम हमेशा अपने एसएचआरएनए स्क्रीन के परिणामों को मान्य करते हैं। आमतौर पर, हम उच्च ब्याज वाले लक्ष्यों को मान्य करने के लिए दो अलग-अलग दृष्टिकोणों का उपयोग करेंगे। सबसे पहले, हम प्रारंभिक स्क्रीन में उपयोग किए जाने वाले लोगों से अलग दो या दो से अधिक एसएचआरएनए का उपयोग करके जीन अभिव्यक्ति को खटखटाते हैं और ट्यूमर सेल प्रसार और अस्तित्व पर इसके प्रभाव को निर्धारित करते हैं। दूसरा, हम ड्रग जीन इंटरैक्शन डेटाबेस में पहचाने गए दवा (ओं) को प्राप्त करते हैं और ट्यूमर सेल प्रसार और अस्तित्व पर इसके प्रभाव को निर्धारित करते हैं। हम दोनों दृष्टिकोणों का उपयोग करते हैं क्योंकि हमने उन परिस्थितियों का सामना किया है जिनमें एसएचआरएनए काम करते हैं और दवा नहीं करती है। कम से कम उन उदाहरणों में से कुछ में, पूरे एक्सोम अनुक्रम डेटासेट की जांच से पता चला है कि लक्षित प्रोटीन एक जीन द्वारा निर्मित होता है जिसमें एक उत्परिवर्तन होता है जो संभावित रूप से दवा-प्रोटीन इंटरैक्शन को प्रभावित करता है।

ऊपर उल्लिखित दृष्टिकोण अन्वेषक को दुर्लभ नियोप्लाज्म में होने वाले संभावित ड्राइवर म्यूटेशन की पहचान करने, कार्यात्मक रूप से प्रसार और अस्तित्व के लिए आवश्यक सिग्नलिंग मार्गों की पहचान करने और चिकित्सीय विकास के लिए लक्ष्यों को प्राथमिकता देने का एक लागू साधन प्रदान करेंगे। हमें उम्मीद है कि अन्य जांचकर्ता इन दृष्टिकोणों को अन्य मानव कैंसर में प्रमुख चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए उपयोगी पाएंगे। पाठक को पता होना चाहिए, हालांकि, अन्य कार्यात्मक जीनोमिक दृष्टिकोण हैं जिनका उपयोग ट्यूमर रोगजनन में शामिल जीन और संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों को एन्कोडिंग करने वाले जीन की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। एक उदाहरण के रूप में, CRISPR पुस्तकालय उपलब्ध हैं जिनका उपयोग उसी तरीके से किया जा सकता है जैसा कि हम SHRNA पुस्तकालयों के लिए वर्णन करते हैं। ट्यूमरजेनिसिस को बढ़ावा देने वाले जीन की पहचान करने के लिए विवो में कार्यात्मक स्क्रीन भी की जा सकती है। इसके एक उदाहरण के रूप में, स्लीपिंग ब्यूटी ट्रांसपोसन-आधारित दैहिक म्यूटेनेसिस प्रणाली का उपयोग पहले श्वान कोशिकाओं और उनके अग्रदूतों को लक्षित करने के लिए किया गया है, जिसके परिणामस्वरूप एमपीएनएसटी रोगजनन28 में शामिल कई सौ जीनों की पहचान हुई है। चूंकि ये प्रणालियां अलग-अलग तरीकों से कार्यात्मक जीनोमिक्स से संपर्क करती हैं, इसलिए हम अनुशंसा करते हैं कि अन्वेषक अपने नियोजित प्रयोगों के लक्ष्यों पर सावधानीपूर्वक विचार करें और उन लक्ष्यों पर एक कार्यात्मक जीनोमिक्स पद्धति के अपने चयन को आधार बनाएं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिजीज एंड स्ट्रोक (आर 01 NS048353 और आर 01 NS109655 एसएलसी से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था; R01 NS109655-03S1 से D.P.J.), राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (R01 CA122804 S.L.C.), और रक्षा विभाग (X81XWH-09-1-0086 और W81XWH-12-1-0164 से S.L.C.)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bioruptor Sonication System Diagenode  UCD-600
CASAVA 1.8.2
Cbot Illumina, San Diego, CA N/A
Celigo Image Cytometer Nexcelom N/A
Cellecta Barcode Analyzer and Deconvoluter software
Citrisolve Hybrid Decon Laboratories 5989-27-5
Corning 96-well Black Microplate Millipore Sigma CLS3603
Diagenode Bioruptor 15ml conical tubes Diagenode  C30010009
dNTP mix Clontech 639210
Eosin Y Thermo Scientific 7111
Elution buffer Qiagen  19086
Ethanol (200 Proof) Decon Laboratories 2716
Excel  Microsoft 
FWDGEX 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3’
FWDHTS 5’-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3’
GexSeqS (5’ AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3’ HPLC purified
GraphPad Prism Dotmatics
Harris Hematoxylin Fisherbrand 245-677
Illumina HiScanSQ Illumina, San Diego, CA N/A
Paraformaldehyde (4%) Thermo Scientific J19943-K2
PLUS Transfection Reagent Thermo Scientific 11514015
Polybrene Transfection Reagent Millipore Sigma TR1003G
PureLink Quick PCR Purification Kit Invitrogen K310001
Qiagen Buffer P1 Qiagen  19051
Qiagen Gel Extraction Kit Qiagen 28704
RevGEX 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’
RevHTS1 5’-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3’
Titanium Taq polymerase Clontech 639210
Trimmomatic software www.usadellab.org

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References

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