Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Генетическое профилирование и скрининг отсева на уровне генома для выявления терапевтических мишеней в мышиных моделях злокачественной опухоли оболочки периферических нервов

Published: August 25, 2023 doi: 10.3791/65430
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1,2
1Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 3Department of Computational Medicine and Bioinformatics, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Мы разработали межвидовой сравнительный подход к онкогеномике, использующий геномный анализ и функциональный геномный скрининг для выявления и сравнения терапевтических мишеней в опухолях, возникающих на генетически модифицированных мышиных моделях, и соответствующего типа опухоли человека.

Abstract

Злокачественные опухоли оболочки периферических нервов (MPNST) происходят из шванновских клеток или их предшественников. У пациентов с синдромом предрасположенности к опухолям нейрофиброматозом 1 типа (НФ1) МПНТ являются наиболее распространенным злокачественным новообразованием и ведущей причиной смерти. Эти редкие и агрессивные саркомы мягких тканей предлагают суровое будущее, с 5-летней безрецидивной выживаемостью 34-60%. Варианты лечения людей с МПНСТ разочаровывающе ограничены, при этом обезображивающая хирургия является основным вариантом лечения. Многие некогда многообещающие методы лечения, такие как типифарниб, ингибитор передачи сигналов RAS, потерпели клиническую неудачу. Аналогичным образом, клинические испытания II фазы эрлотиниба, который нацелен на эпидермальный фактор роста (EFGR), и сорафениба, который нацелен на рецептор фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGF) и Raf, в сочетании со стандартной химиотерапией, также не вызвали ответа у пациентов.

В последние годы методы функционального геномного скрининга в сочетании с генетическим профилированием линий раковых клеток доказали свою полезность для выявления основных цитоплазматических сигнальных путей и разработки таргетно-специфической терапии. В случае редких типов опухолей разновидность этого подхода, известная как межвидовая сравнительная онкогеномика, все чаще используется для выявления новых терапевтических мишеней. В межвидовой сравнительной онкогеномике генетическое профилирование и функциональная геномика выполняются на генетически модифицированных мышиных моделях (GEM), а затем результаты подтверждаются на редких человеческих образцах и клеточных линиях, которые доступны.

В данной статье описывается, как идентифицировать гены-кандидаты-драйверы в клетках MPNST человека и мыши с помощью секвенирования всего экзома (WES). Затем мы опишем, как проводить скрининг шРНК на уровне генома для выявления и сравнения критических сигнальных путей в клетках MPNST мыши и человека и идентификации лекарственных мишеней в этих путях. Эти методологии обеспечивают эффективный подход к выявлению новых терапевтических мишеней при различных типах рака человека.

Introduction

Злокачественные опухоли оболочки периферических нервов (МПНСТ) представляют собой высокоагрессивные веретеноклеточные новообразования, которые возникают в связи с синдромом восприимчивости к опухоли нейрофиброматозом 1 типа (НФ1), спорадически в общей популяции и в местах предшествующей лучевой терапии 1,2,3. Пациенты с НФ1 рождаются с копией гена-супрессора опухолей NF1 дикого типа и вторым аллелем NF1 с мутацией с потерей функции. Это состояние гаплонедостаточности делает пациентов с НФ1 восприимчивыми ко второй мутации с потерей функции в гене НФ1 дикого типа, которая запускает опухолегенез. Когда эта мутация NF1 происходит в клетке шванновской клеточной линии, результирующая опухоль представляет собой либо дермальную нейрофиброму, возникающую в коже, либо плексиформную нейрофиброму, которая развивается в крупных нервах или нервных сплетениях. Несмотря на то, что патология дермальных и плексиформных нейрофибром идентична, их биологическое поведение совершенно различно: хотя и дермальные, и плексиформные нейрофибромы являются доброкачественными, только плексиформные нейрофибромы могут претерпевать трансформацию и давать начало МПНСТ. В дополнение к потере нейрофибромина, белка, активирующего Ras ГТФазу, кодируемого геном NF1, MPNST несут мутации множества других генов-супрессоров опухолей, включая TP53 4,5,6,7, CDKN2A 8,9 и PTEN 10, мутации генов, кодирующих компоненты поликомбного репрессивного комплекса 2 11,12 (PRC2 ; SUZ12 и EED) и аберрантная экспрессия рецепторных тирозинкиназ 1,2. Мутации NF1 и других генов, отмеченных выше, также присутствуют в спорадических и радиационно-индуцированных MPNST11,12.

Несмотря на то, что эти достижения в нашем понимании геномных аномалий у МПНТ были неоценимы для понимания их патогенеза, они еще не привели к разработке новых эффективных методов лечения МПНСТ. Основным препятствием, препятствующим разработке новых методов лечения, является тот факт, что MPNST являются редкими видами рака. Из-за этого трудно получить большое количество образцов пациентов, которые необходимы для глобального анализа, определяющего ключевые мутации, такие как те, которые проводятся Атласом генома рака (TCGA). По нашему опыту, накопление даже небольшого количества человеческих образцов MPNST может занять годы. Чтобы преодолеть эти ограничения, многие исследователи, изучающие другие редкие типы рака, обратились к использованию межвидовой сравнительной онкогеномики для выявления существенных мутаций генов-драйверов, определения основных цитоплазматических сигнальных путей в интересующей их опухоли и определения новых терапевтических мишеней. Поскольку сигнальные пути, необходимые для опухолегенеза, очень консервативны между человеком и другими видами позвоночных, применение подходов функциональной геномики, таких как скрининг шРНК на уровне генома, может быть эффективным средством идентификации этих новых драйверных мутаций, сигнальных путей и терапевтических мишеней 13,14,15,16,17,18,19 , особенно при изучении редких типов опухолей человека, которые доступны в предельных количествах20.

В представленных здесь методологиях мы описываем этот подход к выполнению геномного профилирования в клеточных линиях MPNST человека и культурах раннего пассажа MPNST, полученных от мышей P 0-GGFβ3, генетически модифицированной мышиной модели (GEM), в которой шванновская клеткоспецифическая гиперэкспрессия фактора роста нейрегулина-1 (NRG1) способствует патогенезу плексиформных нейрофибром и их последующей прогрессии до MPNST 21, С. 22,23. Первым шагом в этом подходе является идентификация генов-кандидатов в MPNST P 0-GGFβ3, клеточных линиях MPNST человека и хирургически резецированных MPNST человека. Для функциональной валидации сигнальных путей, затронутых этими мутациями, мы используем скрининг шРНК на уровне генома для идентификации генов, необходимых для пролиферации и выживания в клеточных линиях MPNST человека и мыши. После идентификации генов, необходимых для пролиферации и выживания, мы определяем лекарственные генные продукты в коллекции «хитов» с помощью базы данных по взаимодействию генов с лекарственными препаратами. Мы также сравниваем «попадания» в клетки человека и мыши MPNST, чтобы определить, демонстрируют ли модель GEM и MPNST человека одинаковую зависимость от одних и тех же генов и сигнальных путей. Идентификация перекрытий в генах, необходимых для пролиферации и выживания, а также в затронутых сигнальных путях служит средством валидации мышиной модели P 0-GGFβ3 на молекулярном уровне. Этот подход также подчеркивает эффективность комбинирования скринингов человека и мыши для выявления новых терапевтических мишеней, где мышиная модель может служить дополнением к человеческим экранам. Ценность этого межвидового подхода особенно очевидна при поиске терапевтических мишеней в редких опухолях, где трудно получить человеческие опухоли и клеточные линии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Перед началом исследований необходимо пересмотреть и утвердить процедуры и протоколы обращения с вирусными векторами на животных и их использование Комитетом по уходу за животными (IACUC) и Комитетом по биобезопасности (IBC). Процедуры, описанные здесь, были одобрены советами IACUC и IBC Медицинского университета Южной Каролины и выполнялись надлежащим образом обученным персоналом в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных и рекомендациями MUSC по уходу за животными.

1. Анализ WES-Seq и идентификация патогенных вариантов

  1. Выделите геномную ДНК из образца опухоли или субконфлюентных (70%) клеток MPNST, выращенных на 60-миллиметровой чашке, используя стандартные коммерчески доступные методы адсорбции на основе силикагеля (подробные шаги см. в протоколе производителя). Общий рабочий процесс показан на рисунке 1.
  2. Введите не менее 10 мкл геномной ДНК с концентрацией 50 нг/мкл в секвенирующий ядро, если не указано другое количество или концентрация геномной ДНК.
    1. Основная установка фрагментирует геномную ДНК с помощью ультразвука, а затем очищает ее предпочтительным методом. Захват экзома и построение библиотеки выполняются с использованием предпочтительного набора для секвенирования экзома, а индексные теги добавляются к усиленному захваченному экзому.
    2. Отправьте образцы в центр секвенирования для проведения секвенирования всего экзома с парными концами (WES; секвенирование 100.н. с каждого конца).
    3. Файлы FASTQ, сгенерированные ядром, предоставляются исследователю. Используйте для анализа только файлы FASTQ, которые передают метрики качества.
  3. Выровняйте и проанализируйте файлы FASTQ с помощью коммерчески доступных программ (например, DNAStar19,20, Partek21 или Varsome). Выровняйте файлы FASTQ по референсному геному мыши GRCm38/mm10, используя настройки по умолчанию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используя DNAStar и образец MPNST мыши в качестве примера, общий рабочий процесс представлен в виде диаграммы Рисунок 1 и кратко объяснено ниже.
    1. Откройте программное обеспечение DNAStar и выберите рабочий процесс SeqMan NGen.
    2. Выберите «Рабочий процесс», выбрав « Анализ вариантов/повторное секвенирование » и тип анализа секвенирования : «Ампликон на основе NGS», «Панель генов» или «Экзом». Нажмите кнопку Далее.
    3. Выберите предпочтительную референсную последовательность, выбрав «Загрузить пакет генома » и соответствующий референсный геном (например , Mus_musculus-GRCm38-dbSNP146.zip или Homo sapien-GRCh37.p13.zip). Если основное учреждение предоставило файл кровати, загрузите этот вспомогательный файл. Нажмите кнопку Далее.
    4. Выберите Входные последовательности, выбрав соответствующую технологию секвенсора, Illumina, и укажите, что чтение секвенирования является парным. Затем выберите настройку эксперимента, несколько образцов и загрузите файлы FASTQ для секвенирования, нажав кнопку Добавить. Если вы работаете с несколькими образцами, обозначьте каждый набор с парным концом уникальным названием эксперимента или образца: « Опухоль», «Клеточная линия» или «А18, А202...» Нажмите кнопку Далее.
    5. Задайте контрольный набор данных, если он есть. Нажмите кнопку "Далее" и снова нажмите кнопку "Далее" в разделе "Параметры сборки". В разделе «Параметры анализа» выберите соответствующий режим «Обнаружение вариантов» как «Диплоид», а затем нажмите кнопку «Далее». В разделе "Выходные данные сборки" назовите и укажите место сохранения файла проекта; нажмите кнопку Далее. Запустите сборку на локальном компьютере или в облаке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Результирующие файлы выравнивания могут быть открыты в рабочем процессе ArrayStar для аннотирования вариантов обнаруженных однонуклеотидных полиморфизмов (SNP). Этот рабочий процесс обнаруживает однонуклеотидные полиморфизмы, а не прирост или потерю числа копий генов. Отдельный анализ, называемый массивом SNP высокой плотности, обнаруживает изменения числа копий; Секвенирование всего экзома не позволяет надежно обнаружить изменения числа копий. Обратитесь к руководству пользователя программы, чтобы узнать о конкретных действиях, которые необходимо выполнить с программой выравнивания.
    6. Применяйте пользовательские фильтры к аннотации вариантов обнаруженных SNP, чтобы включить или исключить определенные данные. Чтобы получить сжатый список вероятных функционально значимых вариантов, примените следующие фильтры к наборам данных вариантов в этой иерархии: не в контроле (при наличии нормальной контрольной выборки), частота популяции (gnomAD, ExAC, 1000 частот геномов), частота аллелей (включая ≤0,001 или 0,1%), глубина охвата (исключая глубину <10), патогенность или класс ClinVar (включают: патогенный, вероятно патогенный; исключают: неопределенный, вероятно доброкачественный, доброкачественный), и, при желании, тип SNP и кодирование воздействия (включают: несинонимичный, миссенс, нонсенс, сдвиг кадра, внутрикадровый, сплайсинг).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Известный список релевантных генов рака также может быть применен к окончательному списку, чтобы извлечь только определенные гены, относящиеся к заболеванию, см. шаг 1.3.7. Эти фильтры могут сократить список вариантов генов до менее чем 20 генов.
      1. Гомозиготные и гетерозиготные варианты будут представлены приблизительно на 100% и 50% соответственно для чистой неконтаминирующей клеточной популяции (установленная клеточная линия, полученная из опухоли, должна представлять одну популяцию изогенных опухолевых клеток). В этом случае примените 100-90 % и 50-40% частот аллелей для вариантов в качестве фильтра, тем самым удаляя любые варианты ниже этого. Если данные массива SNP высокой плотности также доступны для того же набора данных, примените усиление или потерю числа копий к однонуклеотидным полиморфикам с частотами вариаций аллелей меньшими, чем гомозиготные или гетерозиготные отношения (т. е. увеличение числа копий, приводящее к 2 копиям аллеля A и 1 копии аллеля B, даст соответствующие частоты вариаций аллелей 75%, 25%, соответственно).
    7. После идентификации патогенных вариантов с помощью ArrayStar экспортируйте и сохраните список вариантов генов в виде файла csv, txt или xls и сравните гены, содержащие эти мутации, с генами в когорте опухолей, сгенерированных P 0-GGFβ3, чтобы определить перекрывающиеся и уникальные списки мутировавших генов. Сравните мутировавшие гены с известными мутировавшими генами, связанными с их человеческими аналогами (например, со списком генов рака Bushman Lab или списком, курируемым пользователем).
      1. Необязательно, прежде чем применять какие-либо пользовательские фильтры (1.3.6), экспортируйте и сохраните аннотированный файл как файл VCF.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Этот файл VCF может быть загружен в другое программное обеспечение для прогнозирования эффекторов вариантов Varsome или VEP для сравнения в качестве вторичного анализа. Биологический анализ и анализ путей также могут быть выполнены на отфильтрованных списках вариантов генов.
    8. Выполняйте функциональную классификацию списка вариантов генов с помощью предпочитаемой пользователем базы данных для получения информации о классе белка, пути, компоненте пути, семействе генов и онтологии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве примера здесь используется PANTHER (pantherdp.org).
      1. Загрузите отфильтрованный список генов с идентификатором гена.
      2. Выберите организм (Mus musculus).
      3. Выберите анализ (Функциональная классификация, просмотренная в списке генов) и нажмите Отправить биологический анализ и анализ путей в отфильтрованных списках вариантов генов.

2. Скрининг шРНК на уровне генома

ПРИМЕЧАНИЕ: Существует несколько библиотек шРНК и CRISPR, которые могут быть использованы для функциональных скринингов геномного масштаба с культурами опухолей с низким пассажем. В этой статье мы опишем использование библиотек шРНК CELLECTA DECIPHER в качестве примера. Библиотеки лентивирусных шРНК CELLECTA DECIPHER оптимизированы для генетических скринингов РНК-интерференции в объединенном формате. Каждый транскрипт нацелен по меньшей мере на 5-6 уникальных шРНК, а каждый лентивирусный вектор шРНК содержит уникальный генетический штрих-код, окруженный сайтами праймеров ПЦР. Эти библиотеки охватывают большинство генов, связанных с болезнями человека и мышей, но не охватывают все гены в геноме. Пулы плазмидной ДНК библиотеки человека Cellecta доступны в трех модулях (модуль I, II, III; нацелен на 15 377 генов), в то время как пулы плазмид библиотеки мышей доступны в двух модулях (модули I и II мыши; нацелены на 9 145 генов). Эти библиотеки используются для проведения анализов «отсева», в которых целевые гены, необходимые для пролиферации и/или выживания, дифференцированно экспрессируются в разные моменты времени после вирусной трансдукции.

  1. Лентивирусная упаковка
    1. День 0: Тарелка 10 пробирок по 10 миллионов 293 Т-клеток/15-сантиметровая чашка в 30 мл/чашка DMEM без антибиотиков, содержащая 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS).
    2. День 1: Подтвердите, что клетки сливаются на ~80% на следующий день и готовы к трансфекции. В конической пробирке объемом 50 мл смешайте следующее в следующем порядке: 600 мкл смеси плазмид упаковки (0,5 мкг/мкл), 60 мкл библиотеки штрих-кодов плазмид, 12 мл DMEM (без сыворотки или антибиотиков) и 600 мкл реагента для трансфекции. Выдерживают при комнатной температуре 15 мин.
    3. Поместите 900 мкл трансфекционного реагента и 12 мл DMEM в отдельную коническую пробирку объемом 15 мл и перемешайте вихревым способом. Добавьте 12,9 мл смеси реагента для трансфекции и DMEM в смесь ДНК и перемешайте. Выдерживать при комнатной температуре 15 минут без дополнительного перемешивания. Добавьте 2,5 мл этой смеси по каплям в каждую 15-сантиметровую чашку с 293Т-клетками и инкубируйте в течение ночи в инкубаторе для тканевых культур.
    4. День 2: На следующий день замените питательную среду обычной питательной средой, содержащей антибиотики.
    5. День 3: Собирают вирус, собирая среду, пропуская ее через фильтрационную установку 0,2 мкм и аликвотируя в конические пробирки объемом 15 мл; также готовят пять аликвот отфильтрованного вируса по 1 мл в криовиалах для использования в титровании вируса (считается вирусом через 48 ч); хранить вирус в морозильной камере при температуре -80 °C. Замените среду 30 мл питательной среды на планшеты по одной, чтобы избежать высыхания клеток.
    6. День 4: Собирайте вирус, собирая среду и пропуская ее через фильтрующую установку 0,2 мкм. Аликвотный вирус в конические пробирки по 15 мл. Это считается 72-часовым вирусом; хранить вирус в морозильной камере при температуре -80 °C.
  2. Титровые лентивирусные пулы
    1. Добавьте 65 мкл катионного полимера (10 мг/мл) к 65 мл среды для выращивания опухолевых клеток. Пипетку по 1 мл/лунку полимерсодержащей среды в одиннадцать 6-луночных тканевых культуральных планшетов. Трипсинизация опухолевых клеток раннего пассажа и подсчет клеток предпочтительным методом таким образом, чтобы каждая лунка получала 50 000 клеток/мл/лунку. Разморозьте 1 мл аликвоты лентивируса в течение 48 ч из морозильной камеры на водяной бане с температурой 37 °C.
    2. Для каждого вирусного модуля подготовьте инфекцию, как показано в таблице 1.
    3. Поместите все планшеты с 6 лунками в инкубатор для тканевых культур. На следующий день удалите вирусные среды и пополните их свежими. Через 48 ч добавьте пуромицинсодержащую среду во все лунки, получающие отбор. Перед слиянием контрольных клеток выполните подсчет клеток выживших клонов, используя предпочтительный метод.
      Примечание: Концентрация пуромицина, необходимая для уничтожения нетрансдуцированных клеток, должна быть предварительно определена эмпирически путем тестирования диапазона концентраций на кривой «убийства». Используйте самую низкую концентрацию, которая равномерно индуцирует гибель нетрансмиссивных культур.
  3. Лентивирусная инфекция клеток-мишеней
    1. Трипсинизируйте клетки MPNST и подсчитывайте. Тарелка 2,5 миллиона ячеек на 15-сантиметровую тарелку, всего двадцать 15-сантиметровых тарелок на модуль. Разморозьте вирус и трансдуцируйте клетки с вирусом при MOI 0,5 в присутствии 5 мкг/мл катионного полимера (рис. 2A).
    2. На следующее утро удалите вируссодержащие среды и замените их свежими. Культивируйте клетки в течение дополнительных 2 дней, чтобы обеспечить экспрессию маркера отбора, а затем добавляйте пуромицин в культуры для удаления нетрансдуцированных клеток.
    3. Через три дня после добавления пуромицина трипсинизируют клетки и центрифугируют половину клеточной популяции при 200 × г в течение 5 мин в настольной центрифуге. Храните гранулированные клетки в морозильной камере при температуре -80 °C для будущего препарирования геномной ДНК; это точка отсчета времени, или точка времени 1 (T1).
    4. Пересадите другую половину клеточной популяции и выращивайте ее в течение примерно 7 удвоений популяции перед сбором и центрифугированием, как указано выше. Эта клеточная гранула будет служить конечной точкой времени (точка времени 2, T2) и хранится при -80 °C для будущего выделения геномной ДНК (рис. 2).
  4. Выделение геномной ДНК из клеток, трансдуцированных с помощью вирусных пулов
    1. Разморозьте клеточную гранулу из морозильной камеры при температуре -80 °C и повторно суспендируйте гранулу в 10 мл буфера для ресуспензии с добавлением РНКазы и сразу же разделите на две полиметилпентеновые пробирки по 15 мл (Рисунок 2B).
    2. Добавьте 500 мкл 10% SDS на 5 мл, перемешайте и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 минут. Затем поместите пробирки в устройство для резки ДНК для ультразвуковой обработки ДНК в течение 25 циклов по 30 с включение/30 с выключение, следя за тем, чтобы температура была на уровне 4 °C.
    3. Добавьте 5 мл фенола/хлороформа, pH 8,0 (хранить при 4 °C), обязательно хорошо перемешав фенол/хлороформ перед использованием. После добавления фенола/хлороформа хорошо перемешать, энергично вихревая на максимальной настройке в течение 45-60 с. Центрифуга в течение 60 мин, -20 °C при 7 200 × г.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пенистый/молочный вид после вихря будет сигнализировать о полной ресуспензии.
    4. Перелейте 3 мл прозрачной верхней фазы в свежую пробирку объемом 15 мл, добавьте 0,5 мл 3 М ацетата натрия и 4 мл изопропанола и хорошо перемешайте (рисунок 2C). Центрифуга в течение 30 мин при 20 °C при 7 200 × г.
    5. После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость, а затем осторожно удалите пипеткой оставшуюся жидкость. Добавьте 0,5 мл 70% этанола и вытесните гранулу пипеткой вверх и вниз. Переложите повторно взвешенную гранулу в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл и смешайте обе гранулы из одного образца в одну центрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Центрифуга на максимальной скорости в настольной центрифуге в течение 5 мин.
    6. Выбросьте надосадочную жидкость и используйте лабораторную салфетку, чтобы абсорбировать остатки 70% этанола. Повторно суспендируйте гранулу в 0,5 мл дистиллированной воды, следя за тем, чтобы гранула не высохла, так как это затруднит повторную суспендию. Перед измерением концентрации ДНК храните образцы при температуре 4 °C.
  5. Вложенная ПЦР для амплификации штрихкодов шРНК
    ПРИМЕЧАНИЕ: Извлеките ДНК из хранилища и положите на лед. Если концентрация ДНК ниже 100 нг/мкл, то быстро высушите ДНК в вакууме и ресуспендируйте в соответствующем объеме дистиллированной воды. Мы рекомендуем обрабатывать только один модуль за раз (точка времени 1 (T1) или точка времени 2 (T2)). Выполните две подготовки каждого временного момента, которые должны быть объединены в конце; Следовательно, важно не обрабатывать повторяющиеся моменты времени в один и тот же день. Следующий протокол предназначен для одной временной точки геномной ДНК.
    1. Установите 7 пробирок и пометьте их, как описано: отрицательный контроль, положительный контроль, 4 пробирки для геномной ДНК и одна для мастер-смеси (рис. 3A). Отрицательным контролем является дистиллированная вода; положительным контролем является плазмидная ДНК, используемая при трансфекции 293T для генерации лентивируса.
    2. Сначала добавьте воду в каждую трубку, как указано в таблице 2.
    3. Приготовьте мастер-микс (ММ), как показано в таблице 3.
    4. Добавьте 18 мкл ММ в каждую пробирку с водой. Затем добавьте 25 мкл геномной ДНК в каждую из 4 матричных пробирок. Затем добавьте 1 мкл положительного контроля (10 нг/мкл) в пробирку с положительным контролем, стараясь не загрязнять другие пробирки положительной контрольной ДНК. Наконец, добавьте 2 мкл полимеразы в каждую пробирку, сначала в 4 пробирки с образцами, а затем в пробирку с положительным контролем; смешать и открутить пробирки для ПЦР (рис. 3).
    5. Проводят ПЦР-реакцию в условиях, указанных в таблице 4.
    6. Во время проведения первой ПЦР подготовьте пробирки для2-й ПЦР, как указано в таблице 5. Установите семь пробирок: отрицательный контроль, положительный контроль, 4 пробирки для геномной ДНК и одну для ММ (рис. 3B).
    7. Добавьте 22 мкл ММ в каждую пробирку, содержащую воду, и дождитесь окончания первого раунда ПЦР, прежде чем добавлять ДНК и полимеразу.
      1. После завершения первого раунда ПЦР объедините 4 пробирки с образцами в одну микроцентрифужную пробирку и перемешайте.
      2. Добавьте 25 мкл в каждую пробирку с водой.
      3. Затем добавьте 2 мкл первого отрицательного контроля ПЦР и 2 мкл первого положительного контроля ПЦР в пробирки с соответствующей маркировкой.
      4. Добавьте по 2 мкл полимеразы в каждую пробирку, сначала в 4 пробирки с образцами, а затем в отрицательный контроль.
    8. Проведите ПЦР-реакцию, как указано в таблице 6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При анализе результатов первой реакции ПЦР методом электрофореза на 3,5% агарозном геле, если получено изобилие продукта, количество циклов может быть сокращено до 9-10 для следующего повторения этой процедуры; Точно так же, если выход продукта низкий, количество циклов может быть увеличено до 14.
    9. Когда вторая реакция ПЦР будет завершена, объедините 4 образца в одну микроцентрифужную пробирку плюс 80 мкл красителя с 6-кратной загрузкой. Для положительного и отрицательного контроля используют 20 мкл образца.
      1. Приготовьте 3,5% агарозный гель в буфере Трис-Борат-ЭДТА (КЭ) (Рисунок 4А). Чтобы вместить большой объем образца, создайте одну большую лунку в гелевом гребне, соединив несколько лунок вместе (если гребень, подходящий для этого объема, недоступен), обязательно оставляя две лунки доступными для положительного и отрицательного контроля. Запустите гель при 90 В в течение 1 ч.
    10. Визуализируйте гель и подтвердите полосу примерно на 250 парах оснований (.о.).
  6. Первая очистка: гелевая экстракция
    1. Используя чистый скальпель или бритвенное лезвие, удалите ленту 250.н., срезав как можно больше геля. Разрежьте большую ленту на 4 части и переложите каждый кусочек в чистую пробирку для микроцентрифуги. Измерьте и запишите вес каждого кусочка геля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый кусочек должен содержать примерно 200 мг или меньше на тюбик.
    2. Добавьте 6 объемов буфера для солюбилизации (например, если кусочек геля весит 200 мг, добавьте 1,2 мл буфера). Поместите пробирки на водяную баню с температурой 50 °C и вращайте каждые 10-15 минут, пока кусочки геля не растворятся. Затем добавьте 1 объем изопропанола в каждую пробирку (например, 0,2 мл изопропанола, если кусочек геля весит 200 мг).
    3. Используя две центрифуговые колонны для очистки, загрузите пробы из всех 4 пробирок в колонны. Выполните несколько отжимов, чтобы обработать весь объем образца, так как колонки вмещают только 750 мкл. Отжим колонки при давлении 17 900 × г в течение 1 мин в обычной настольной микроцентрифуге и каждый раз отбрасывайте проточный поток.
    4. Промойте колонки промывочным буфером объемом 750 мкл и центрифугой при 17 900 × г в течение 1 мин. После промывки выбросьте проточный поток и высушите центрифугирование при 17 900 × г в течение 3 минут. Элюируют ДНК с помощью 50 мкл дистиллированной воды на колонку и центрифугируют, как и раньше, в течение 1 мин и объединяют обе пробирки для получения общего объема образца 100 мкл.
  7. Второе очищение
    1. На следующем этапе очистки будет использоваться связывающий буфер 2 (из набора для очистки ПЦР), который не удаляет мелкие фрагменты. Добавьте 400 мкл буфера к 100 мкл ДНК и загрузите его на одну спиновую колонку (рис. 4B). Центрифугируют образец при 17 900 × г в течение 1 мин.
    2. Затем промойте мембрану 650 мкл промывочного буфера и отжимите, как это было сделано ранее. Высушите центрифугирование с помощью дополнительного центрифугирования, как указано выше, в течение 3 минут.
    3. Элюируют ДНК с помощью 30 мкл дистиллированной воды и вращают с максимальной скоростью в течение 1 минуты. После элюирования проверяют концентрацию на спектрофотометре; Убедитесь, что концентрация не ниже 10 нг/мкл и не выше 70-80 нг/мкл. Храните ДНК в морозильной камере при температуре -20 °C.
  8. Секвенирование усиленных штрих-кодов
    1. Для секвенирования разбавляйте очищенные штрихкоды до 0,75 нг/мкл с помощью элюирующего буфера (EB). Чтобы добавить разнообразие последовательностей, ампликоны кластеризуются при 17 пМ, включая 30% (v/v) PhiX. Выполнить одностороннюю (SE) кластеризацию на автоматизированной системе генерации кластеров по протоколу производителя.
    2. Ядро секвенирования выполнит в общей сложности 36 циклов одностороннего секвенирования на секвенсоре NextGen (рис. 4C) . Добавьте специальный праймер GexSeqS к праймерам секвенирования Illumina на 0,5 мкМ.
    3. Используйте указанное программное обеспечение для анализа для создания файлов Fastq и обработки их с помощью программного обеспечения для обрезки длины считывания до 18 нуклеотидов.
    4. Используйте программное обеспечение Barcode Analyzer и Deconvoluter для деконволютирования обрезанных считываний. Рассчитайте баллы по сворачиванию для каждой шРНК как отношение количества считанных в контрольный момент времени (T1) к конечной точке времени (T2).
  9. Анализ результатов шРНК-скрининга и идентификация потенциальных терапевтических мишеней
    ПРИМЕЧАНИЕ: В библиотеке шРНК Cellecta большинство генов нацелены либо на 5 (67%), либо на 6 различных шРНК (32%). Тем не менее, несколько генов, отвечающих за поддержание работоспособности, которые должны быть хитами в большинстве клеток, являются мишенью для большого количества шРНК и служат в качестве контроля, определяющего диапазон оценок для отрицательных результатов.
    1. Чтобы предотвратить смещение в сторону генов, на которые нацелено большее количество шРНК, логарифмическое преобразование показателей истощения. Выполните квантильную оценку, вычислив 80-й процентиль для каждого гена по его эмпирическому распределению.
    2. Чтобы получить нулевое распределение баллов логарифмического складчатого истощения, предположим, что >95% генов не будут истощены и что их логарифмические квантильные оценки будут иметь нормальное распределение. Используйте медиану эмпирического распределения для оценки среднего значения нулевого распределения. Используя это нулевое распределение, классифицируйте все гены с логарифмическими показателями истощения, которые превышают 95-й процентиль нулевого распределения, как «хиты».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все удары должны содержать, по крайней мере, две шРНК с показателями истощения выше точки отсечения (рис. 5).
    3. Для оценки качества данных скрининга выпадения РНК-интерференции и валидности точки отсечения используйте для сравнения набор генов, которые были определены как «основные основные» в рамках инициативы скрининга РНК-интерференции рака COLT24,25. Удалите CEG из списка попаданий, чтобы получить первоначальный список потенциальных терапевтических мишеней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гены в наборе COLT оказались хитовыми в >50% из 72 линий раковых клеток, которые были проверены с помощью COLT. Основной список основных генов содержит 640 генов.
    4. Для идентификации потенциальных терапевтических мишеней, которые обычно или равномерно требуются нескольким клеточным линиям MPNST, постройте диаграммы Венна для не-CEG попаданий, идентифицированных в скрининге различных клеточных линий MPNST или культур раннего пассажа (рис. 6A). Приоритизируйте попадания, не относящиеся к CEG, которые требуются во всех или большинстве линий или культур MPNST.
      1. В качестве альтернативы можно провести анализ путей в списке попаданий, отличных от CEG, из каждой клеточной линии или культуры раннего пассажа для выявления генов, продукты которых кодируют компоненты сигнальных путей, необходимых для пролиферации и/или выживания опухолевых клеток. Затем сравните сигнальные пути, которые были идентифицированы при анализе путей не-CEG, с сигнальными путями, которые были идентифицированы как затронутые мутациями, идентифицированными с WES.
        Примечание: Мы считаем особенно полезным идентифицировать сигнальные пути, на которые последовательно влияют мутации, идентифицированные в WES, и сравнивать их с сигнальными путями, идентифицированными как критические в скринингах шРНК.
    5. Чтобы определить лекарственные мишени, для которых уже доступны терапевтические агенты, проверьте список хитов, оставшихся после удаления основных важных генов, используя базу данных по взаимодействию генов лекарственных средств (dgidb.org).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта база данных позволяет вводить и проверять гены одновременно, а также предоставляет рекомендации по препаратам, которые в настоящее время доступны для воздействия на эти гены.
    6. Сначала валидируйте идентифицированные лекарственные мишени с высоким интересом, сбивая экспрессию их генов с помощью шРНК, отличных от тех, которые использовались на начальном библиотечном скрининге, в формате одной партии (а не в формате библиотечного пакета, который только что описан). Чтобы подавить экспрессию генов, используют две-три лентивирусные шРНК. Через три-четыре дня после заражения определите влияние, которое это оказывает на пролиферацию и выживаемость опухолевых клеток, как описано ниже.

3. Проведение цитометрического анализа количества клеток и жизнеспособности клеток MPNST, подвергнутых воздействию потенциальных терапевтических агентов

  1. Увеличьте количество клеток MPNST в DMEM до 80% слияния. Промойте клетки сбалансированным солевым раствором Хэнкса комнатной температуры (HBSS).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не выращивайте клетки до слияния, так как рост этих клеток будет замедляться в течение некоторого времени после замены покрытия.
  2. Отделите клетки от субстрата, накрыв клетки на срок от 30 с до 1 мин раствором для неферментативной диссоциации клеток. Добавьте 5 мл DMEM на 1 мл раствора диссоциации и осторожно пропитывайте клетки вверх и вниз, чтобы отделить их от субстрата.
  3. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Пластинчатые ячейки с плотностью 1 200 ячеек на лунку в 96-луночных пластинах с черными стенками; Наметьте не менее трех лунок для каждого лекарственного разведения, которое будет тестироваться, и выполните три биологических повторения этих экспериментов.
  4. Чтобы определить первоначальные концентрации препарата, которые будут тестироваться, просмотрите литературу, чтобы оценить, какие концентрации были эффективны против других типов раковых клеток. В первоначальных экспериментах тестируйте диапазон на два порядка выше и на два порядка ниже концентрации препарата, используемого при других типах рака.
  5. Подготовьте разведенные растворы препарата, который будет испытуем, и добавьте каждое разведение или транспортное средство по крайней мере в три реплицированные лунки.
  6. Оценивают прямые номера клеток через 1, 3, 5 и 7 дней после добавления препаратов. Добавьте Hoechst 33342 до конечной концентрации 5 мкг/мл и инкубируйте планшеты в течение 30 минут при 37 °C. Считывание пластин на высокопроизводительном цитометре с визуализацией с помощью опции прямого подсчета клеток для общего количества клеток со временем экспозиции 100 000 мс.
  7. Анализируйте показания с помощью программного обеспечения и экспортируйте их в электронную таблицу, а также используйте соответствующее программное обеспечение для статистического анализа.
  8. Если в скважинах, обработанных лекарственными препаратами, наблюдается статистически значимое снижение количества клеток, проведите анализ «Живой/мертвый», чтобы определить, связано ли это снижение, отчасти, с индукцией гибели клеток.
    1. Пластинчатые ячейки в 96-луночных планшетах с черными стенками, как описано в шаге 3.3.
    2. Подготовьте и добавьте лекарственные препараты, как описано в шаге 3.5.
    3. Оценивают жизнеспособность и гибель клеток через 1, 3, 5 и 7 дней после добавления препарата. Добавьте кальцеин AM до конечной концентрации 1 мкМ и йодид пропидия до конечной концентрации 1 мкМ в каждой лунке. Инкубируют клетки в течение 15 мин при 37 °C.
    4. Визуализация клеток на цитометре с помощью программного обеспечения Live+Dead . Анализируйте показания с помощью программного обеспечения и экспортируйте их в электронную таблицу, а также используйте соответствующее программное обеспечение для статистического анализа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 5 показаны показатели истощения основных основных важных генов (CEG), помеченных как TRUE, по сравнению с не-CEG (помеченных как FALSE) в каждой клеточной линии человека, которая была проверена. Баллы представляют собой log2 баллов кратного истощения для отдельных генов, которые отображаются на блочной диаграмме общего распределения баллов. t-критерий Стьюдента был использован для проверки значимой разницы в средних баллах истощения между двумя группами в каждой клеточной линии. Результирующие p-значения указываются на каждой панели. Обратите внимание, что средние баллы по истощению складок значительно выше для CEG, чем для не-CEG. Это ожидаемо, поскольку основные важные гены, по определению, постоянно необходимы для пролиферации и/или выживания в большинстве типов клеток.

На рисунке 6А представлена диаграмма Венна «попаданий» для трех клеточных линий MPNST человека. Обычно мы обнаруживаем, что большое количество генов является общим для нескольких линий; Эти хиты имеют высокий приоритет, поскольку они представляют собой гены, кодирующие белки, которые, вероятно, необходимы для пролиферации и/или выживания большого подмножества MPNST. Заметим также, что существует ряд генов, которые являются хитами только в одной клеточной линии. Мы часто сталкиваемся с этим, и это не следует воспринимать как признак того, что экраны плохого качества. Гены, которые являются общими хитами между несколькими линиями, затем оцениваются с помощью базы данных по взаимодействию генов лекарств для выявления генов в этом подмножестве, которые кодируют белки, которые могут быть лекарственными с помощью существующих агентов. Затем мы выбираем несколько из них и выполняем первоначальную проверку, сбивая экспрессию соответствующей мРНК с помощью шРНК. Поскольку некоторые шРНК будут иметь нецелевые эффекты, мы всегда тестируем несколько шРНК, нацеленных на один и тот же транскрипт. На рисунке 6B показан репрезентативный результат, в котором мы трансдуцировали клетки MPNST с нетаргетным контролем и несколько шРНК, нацеленных на BCL6. Затем количество клеток определяли в разное время после трансдукции. Обратите внимание, что некоторые из шРНК BCL6 заметно уменьшали количество клеток; как показано в прилагаемом иммуноблоттинге, степень снижения количества клеток коррелирует со степенью нокдауна BCL6. На рисунке 6C показана репрезентативная кривая роста для культуры раннего пассажа P 0-GGFβ3 MPNST.

Figure 1
Рисунок 1: Рабочий процесс для выполнения полноэкзомного секвенирования тканей MPNST или клеток раннего пассажа MPNST. Схема иллюстрирует общий рабочий процесс обнаружения вариантов, присутствующих в культурах раннего пассажа, полученных из опухолей. Изолируют ДНК из ранних пассажных культур (1) и отправляют качественную ДНК в ядро секвенирования в соответствии с их протоколами (2). Ядро секвенирования проверит качество представленной ДНК и выполнит всю необходимую подготовку образцов и библиотек генома. Основной объект будет предоставлять пользователям файлы секвенирования FASTQ с показателями контроля качества (3). Пользователи будут загружать файлы FASTQ в программу выравнивания генома и вызова вариантов по своему выбору. (4) Аннотированные варианты фильтруются по заданным пользователем критериям для удаления нерелевантных вариантов. Показанные репрезентативные данные сравнивают резецированный образец опухоли MPNST человека с клеточной линией, полученной из опухоли26. (5) Выполните анализ функциональной классификации с помощью PANTHER. Аббревиатура: MPNST = злокачественная опухоль оболочки периферического нерва. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Рабочий процесс для выполнения вирусной трансдукции библиотек шРНК в клетки MPNST и выделения геномной ДНК из клеток в момент времени 1 и момент времени 2. (A) Клетки-мишени инфицируют при низком MOI 0,3 лентивирусными частицами со штрих-кодом и отбирают в течение 72 ч. Клетки пассажируют в течение 5-7 удвоений популяции (примерно 7 дней). Клеточные гранулы на 0-й и 7-й день хранятся при -80 °C для выделения геномной ДНК. День 0 называется точкой времени 1 (T1), а день 7 — точкой времени 2 (T2). (B) Выделение геномной ДНК начинается с ресуспендирования клеточных гранул в буфере ресуспензии, которые затем разделяются на две пробирки по 15 мл. Чтобы облегчить лизис клеток, в каждую пробирку добавляют 10% SDS и обрабатывают ультразвуком в течение 25 циклов по 30 с вкл/30 с выкл. После ультразвуковой обработки в каждую пробирку добавляют фенол/хлороформ и энергично вихряют в течение 45-60 с. Затем пробирки центрифугируют. (C) Прозрачную верхнюю фазу пипетируют и добавляют в чистую пробирку с добавлением ацетата натрия/изопропанола и хорошо перемешивают. Пробирки снова центрифугируют. На этот раз надосадочную жидкость отбрасывают, а гранулу вытесняют с добавлением 70% этанола. Соедините ресуспендированные гранулы в одну пробирку и вращайте на максимальной скорости в настольной центрифуге. Выбросьте надосадочную жидкость и снова взвесьте гранулу в дистиллированной воде. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Рабочий процесс для амплификации последовательностей штрих-кодов из лентивирусных векторов шРНК при подготовке к количественной оценке штрих-кодов с помощью секвенирования нового поколения. (A) Представление о том, как настроить пробирки для первой вложенной реакции ПЦР (7 пробирок: одна для отрицательного контроля, одна для положительного контроля, а остальные 4 пробирки для геномной ДНК. Последняя трубка будет служить трубкой для мастер-микса). После первой реакции ПЦР соедините пробирки с геномной ДНК в одну пробирку и перемешайте. (B) Продукты, полученные в результате первой вложенной ПЦР-реакции, будут служить шаблонами для второй вложенной ПЦР-реакции. После второй ПЦР соедините пробирки с геномной ДНК в одну пробирку и перемешайте. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Рабочий процесс для очистки амплифицированных штрих-кодов shRNA и секвенирования штрих-кодов для количественной оценки их представления в момент времени 1 и момент времени 2 . (A) Влейте 3,5% агарозный гель. Поскольку объем объединенной ДНК превышает предел для одной лунки, склейте 4-6 зубцов гелевого гребня вместе, чтобы получить одну большую лунку. Приготовьте продукты для ПЦР с 6-кратной загрузкой красителя и загрузите в гель положительный контроль, отрицательный контроль и объединенную ДНК. После электрофореза в объединенной полосе ДНК должна появиться большая полоса, состоящая примерно из 250 пар оснований. С помощью чистого скальпеля иссеките всю ленту, а затем разрежьте на 4 гелевые дольки. Солюбилизируйте кусочки геля, а затем объедините их в две спиновые колонки для вымывания ДНК. Соедините элюированную ДНК в одну пробирку. (Б) ДНК очищается на втором этапе очистки. Добавьте связывающий буфер 2 в пробирку с объединенной ДНК, а затем пипетку на спиновую колонку. Промойте мембрану, а затем элюируйте ДНК в дистиллированной воде. (C) Отправьте очищенную ДНК в секвенирование. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Репрезентативные примеры распределения основных эссенциальных генов после анализа, как описано в протоколе. В этом примере три клетки клеток MPNST человека (S462, T265 и 2XSB) были проверены библиотеками шРНК Cellecta DECIPHER. Для каждой клеточной линии MPNST человека была создана блочная диаграмма для сравнения показателей истощения на уровне генов для генов из списка основных основных генов (CEG; Истинная ящичковая диаграмма)25 к генам, которые не найдены в списке CEG (ложная ящичковая диаграмма). Отдельные точки данных накладываются поверх каждой ящичковой диаграммы. P-значения взяты из стандартного t-критерия, сравнивающего показатели истощения CEG на уровне генов с показателями отсутствия CEG. Сокращения: CEG = основной эссенциальный ген; MPNST = злокачественная опухоль оболочки периферического нерва. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Валидация результатов скрининга . (A) Репрезентативная диаграмма Венна перекрывающихся попаданий в трех клеточных линиях MPNST человека. (B) Клетки MPNST человека S462, трансдуцированные лентивирусным вектором без мишени (NT) и лентивирусом, экспрессирующим четыре различных РНК BCL6 (shRNA1, shRNA2, shRNA3 и shRNA4). Клетки трансдуцировали лентивирусом, а затем обрабатывали селекционным агентом (пуромицином) в течение 3 дней. Затем в течение следующих семи дней оценивали количество клеток. (C) Вестерн-блоттинг-анализ, показывающий уровни белка BCL6 после трансдукции лентивирусом NT,shRNA1, shRNA2, shRNA3 и shRNA4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Расположение пластин для лентивирусного титрования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Первичная настройка первых ПЦР-реакций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 3: Приготовление мастер-смеси для первой реакции ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 4: Первые параметры ПЦР Cellecta. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 5: Первичная настройка второй ПЦР-реакции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 6: Параметры второй ПЦР Cellecta. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Детально представленные методы были разработаны для изучения неоплазии периферической нервной системы и патогенеза МПНСТ. Несмотря на то, что мы считаем эти методы эффективными, следует признать, что существуют некоторые потенциальные ограничения для методов, которые мы здесь описываем. Ниже мы обсудим некоторые из этих ограничений и потенциальные стратегии их преодоления в других модельных системах.

Мы обнаружили, что секвенирование всего экзома эффективно идентифицирует интересующие мутации у мышей P 0-GGFβ3. Следует, однако, признать, что секвенирование всего экзома само по себе имеет ограничения. Во-первых, секвенирование всего экзома не является эффективным подходом к идентификации продуктов слияния генов. Это связано с тем, что большинство хромосомных разрывов и последующее слияние преимущественно связаны с межгенными областями и интронами, поскольку эти области представляют большую часть генома. Вместо этого мы обнаружили, что RNA-Seq с парными концами гораздо более эффективно идентифицирует гены слияния. Существует также вопрос о том, насколько эффективно секвенирование всего экзома выявляет относительно большие участки хромосомной потери.

Несмотря на то, что для выявления таких потерь было разработано несколько алгоритмов, термин «секвенирование всего экзома» сам по себе вводит в заблуждение, поскольку захват экзома даже при хороших прогонах часто пропускает до 5-10% экзонных областей. В связи с этим мы регулярно дополняем секвенирование всего экзома другими подходами, такими как матричная сравнительная геномная гибридизация (aCGH). После определения прибылей и потерь мы изучаем гены в этих интервалах и сравниваем их с известными драйверными мутациями, которые связаны с их человеческими аналогами. Однако геном мыши более стабилен, чем геном человека27. Следовательно, опухоли у мышей, как правило, не проявляют хромотрипсиса, аналогичного тому, что наблюдается при новообразованиях человека. Картина в мышиных опухолях гораздо проще, она имеет тенденцию к приросту или потере всей хромосомы или хромосомам с относительно небольшим количеством очаговых делеций, которые, как правило, происходят под сильным селективным давлением22,23.

Есть несколько потенциальных подводных камней, с которыми мы столкнулись при проведении скрининга шРНК на уровне генома. Одной из наиболее распространенных проблем, с которой мы сталкиваемся, является относительно плохая трансдукция лентивирусных векторов в клетки-мишени. Чаще всего мы обнаруживаем, что проблема возникла из-за неправильного титрования упакованных лентивирусных пулов. Поскольку культуры опухолевых клеток мышей с ранним пассажем являются ограничивающим ресурсом, многие исследователи вместо этого пытаются определить титр лентивируса, используя другую установленную клеточную линию, которая более доступна. Проблема с этим подходом, однако, заключается в том, что эффективность лентивирусной трансдукции может значительно варьироваться от типа клетки к типу клеток. Именно по этой причине мы рекомендуем титровать лентивирус на реальных клетках, которые будут использоваться в эксперименте. Мы также столкнулись с проблемами с относительно низкими титрами вируса. Эта проблема чаще всего отражает плохую трансфекцию 293Т-клеток при производстве упакованного вируса.

Возможно получение ложноположительных результатов при проведении скрининга шРНК на уровне генома. В связи с этим, после того, как мы определили потенциально лекарственные мишени, которые представляют для нас наибольший интерес, мы всегда проверяем результаты наших шРНК-скринингов. Как правило, мы используем два разных подхода для проверки целей с высоким процентом. Во-первых, мы сбиваем экспрессию генов с помощью двух или более шРНК, отличных от тех, которые использовались в первоначальном скрининге, и определяем эффект, который это оказывает на пролиферацию и выживание опухолевых клеток. Во-вторых, мы получаем препарат(ы), идентифицированные в базе данных по взаимодействию генов лекарственных средств, и определяем влияние, которое это оказывает на пролиферацию и выживаемость опухолевых клеток. Мы используем оба подхода в тандеме, потому что мы сталкивались с обстоятельствами, в которых шРНК работают, а лекарство нет. По крайней мере, в некоторых из этих случаев изучение всего набора данных последовательности экзома показало, что белок-мишень продуцируется геном, который имеет мутацию, потенциально влияющую на взаимодействие лекарств с белками.

Описанные выше подходы предоставят исследователю применимые средства идентификации потенциальных драйверных мутаций, возникающих в редких новообразованиях, функциональной идентификации сигнальных путей, необходимых для пролиферации и выживания, и определения приоритетов мишеней для терапевтических разработок. Мы надеемся, что другие исследователи найдут эти подходы полезными для определения ключевых терапевтических мишеней при других видах рака человека. Однако читатель должен знать, что существуют и другие функциональные геномные подходы, которые могут быть использованы для идентификации генов, участвующих в патогенезе опухолей, и генов, кодирующих потенциальные терапевтические мишени. В качестве примера можно привести библиотеки CRISPR, которые можно использовать аналогично тому, что мы описываем для библиотек шРНК. Функциональный скрининг также может быть выполнен in vivo для выявления генов, способствующих опухолегенезу. В качестве примера можно привести систему соматического мутагенеза, основанную на транспозоне «Спящей красавицы», которая ранее использовалась для нацеливания на шванновские клетки и их предшественники, в результате чего было идентифицировано несколько сотен генов, участвующих в патогенезе MPNST28. Поскольку эти системы по-разному подходят к функциональной геномике, мы рекомендуем исследователю тщательно обдумать цели запланированных экспериментов и основывать выбор методологии функциональной геномики на этих целях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами Национального института неврологических заболеваний и инсульта (R01 NS048353 и R01 NS109655 S.L.C.; R01 NS109655-03S1 в D.P.J.), Национальный институт рака (R01 CA122804 в S.L.C.) и Министерство обороны (X81XWH-09-1-0086 и W81XWH-12-1-0164 в S.L.C.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bioruptor Sonication System Diagenode  UCD-600
CASAVA 1.8.2
Cbot Illumina, San Diego, CA N/A
Celigo Image Cytometer Nexcelom N/A
Cellecta Barcode Analyzer and Deconvoluter software
Citrisolve Hybrid Decon Laboratories 5989-27-5
Corning 96-well Black Microplate Millipore Sigma CLS3603
Diagenode Bioruptor 15ml conical tubes Diagenode  C30010009
dNTP mix Clontech 639210
Eosin Y Thermo Scientific 7111
Elution buffer Qiagen  19086
Ethanol (200 Proof) Decon Laboratories 2716
Excel  Microsoft 
FWDGEX 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3’
FWDHTS 5’-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3’
GexSeqS (5’ AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3’ HPLC purified
GraphPad Prism Dotmatics
Harris Hematoxylin Fisherbrand 245-677
Illumina HiScanSQ Illumina, San Diego, CA N/A
Paraformaldehyde (4%) Thermo Scientific J19943-K2
PLUS Transfection Reagent Thermo Scientific 11514015
Polybrene Transfection Reagent Millipore Sigma TR1003G
PureLink Quick PCR Purification Kit Invitrogen K310001
Qiagen Buffer P1 Qiagen  19051
Qiagen Gel Extraction Kit Qiagen 28704
RevGEX 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’
RevHTS1 5’-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3’
Titanium Taq polymerase Clontech 639210
Trimmomatic software www.usadellab.org

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carroll, S. L. Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms. Acta Neuropathol. 123 (3), 321-348 (2012).
  2. Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L. Recent Advances in the Diagnosis and Pathogenesis of Neurofibromatosis Type 1 (NF1)-associated Peripheral Nervous System Neoplasms. Adv Anat Pathol. 25 (5), 353-368 (2018).
  3. Longo, J. F., Carroll, S. L. The RASopathies: Biology, genetics and therapeutic options. Adv Cancer Res. 153, 305-341 (2022).
  4. Birindelli, S., et al. Rb and TP53 pathway alterations in sporadic and NF1-related malignant peripheral nerve sheath tumors. Lab Invest. 81 (6), 833-844 (2001).
  5. Legius, E., et al. TP53 mutations are frequent in malignant NF1 tumors. Genes Chromosomes Cancer. 10 (4), 250-255 (1994).
  6. Menon, A. G., et al. Chromosome 17p deletions and p53 gene mutations associated with the formation of malignant neurofibrosarcomas in von Recklinghausen neurofibromatosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (14), 5435-5439 (1990).
  7. Upadhyaya, M., et al. Germline and somatic NF1 gene mutation spectrum in NF1-associated malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs). Hum Mutat. 29 (1), 74-82 (2008).
  8. Kourea, H. P., Orlow, I., Scheithauer, B. W., Cordon-Cardo, C., Woodruff, J. M. Deletions of the INK4A gene occur in malignant peripheral nerve sheath tumors but not in neurofibromas. Am J Pathol. 155 (6), 1855-1860 (1999).
  9. Nielsen, G. P., et al. Malignant transformation of neurofibromas in neurofibromatosis 1 is associated with CDKN2A/p16 inactivation. Am J Pathol. 155 (6), 1879-1884 (1999).
  10. Gregorian, C., et al. PTEN dosage is essential for neurofibroma development and malignant transformation. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (46), 19479-19484 (2009).
  11. Lee, W., et al. PRC2 is recurrently inactivated through EED or SUZ12 loss in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nat Genet. 46 (11), 1227-1232 (2014).
  12. Zhang, M., et al. Somatic mutations of SUZ12 in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nat Genet. 46 (11), 1170-1172 (2014).
  13. Varela, I., et al. Somatic structural rearrangements in genetically engineered mouse mammary tumors. Genome Biol. 11 (10), 100 (2010).
  14. Johnson, R. A., et al. Cross-species genomics matches driver mutations and cell compartments to model ependymoma. Nature. 466 (7306), 632-636 (2010).
  15. Kim, M., et al. Comparative oncogenomics identifies NEDD9 as a melanoma metastasis gene. Cell. 125 (7), 1269-1281 (2006).
  16. Zender, L., et al. Identification and validation of oncogenes in liver cancer using an integrative oncogenomic approach. Cell. 125 (7), 1253-1267 (2006).
  17. Uren, A. G., et al. Large-scale mutagenesis in p19(ARF)- and p53-deficient mice identifies cancer genes and their collaborative networks. Cell. 133 (4), 727-741 (2008).
  18. Starr, T. K., et al. A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer. Science. 323 (5922), 1747-1750 (2009).
  19. Dupuy, A. J., et al. A modified sleeping beauty transposon system that can be used to model a wide variety of human cancers in mice. Cancer Res. 69 (20), 8150-8156 (2009).
  20. Carroll, S. L. The Challenge of Cancer Genomics in Rare Nervous System Neoplasms: Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors as a Paradigm for Cross-Species Comparative Oncogenomics. Am J Pathol. 186 (3), 464-477 (2016).
  21. Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. J Neurosci. 23 (19), 7269-7280 (2003).
  22. Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. Am J Pathol. 182 (3), 646-667 (2013).
  23. Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropathol. 127 (4), 573-591 (2014).
  24. Hart, T., Brown, K. R., Sircoulomb, F., Rottapel, R., Moffat, J. Measuring error rates in genomic perturbation screens: gold standards for human functional genomics. Mol Syst Biol. 10 (7), 733 (2014).
  25. Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knockout Screens. G3. 7 (8), Bethesda. 2719-2727 (2017).
  26. Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Sci Rep. 11 (1), 5690 (2021).
  27. Maser, R. S., et al. Chromosomally unstable mouse tumours have genomic alterations similar to diverse human cancers. Nature. 447 (7147), 966-971 (2007).
  28. Rahrmann, E. P., et al. Forward genetic screen for malignant peripheral nerve sheath tumor formation identifies new genes and pathways driving tumorigenesis. Nat Genet. 45 (7), 756-766 (2013).

Tags

Генетическое профилирование скрининг отсева на уровне генома терапевтические мишени мышиные модели злокачественная опухоль оболочки периферических нервов шванновские клетки нейрофиброматоз 1 типа (NF1) саркома мягких тканей безрецидивная выживаемость варианты лечения обезображивающая хирургия типифарниб ингибитор сигнализации ras эрлотиниб ингибитор эпидермального фактора роста (EGFR) сорафениб ингибитор рецептора эндотелиального фактора роста сосудов (VEGF) ингибитор рецептора тромбоцитарного фактора роста (PDGF) ингибитор Raf Функциональный геномный скрининг линии раковых клеток цитоплазматические сигнальные пути таргетно-специфическая терапия
Генетическое профилирование и скрининг отсева на уровне генома для выявления терапевтических мишеней в мышиных моделях злокачественной опухоли оболочки периферических нервов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Turner-Ivey, B., Longo, J. F.,… More

Turner-Ivey, B., Longo, J. F., Jenkins, D. P., Guest, S. T., Carroll, S. L. Genetic Profiling and Genome-Scale Dropout Screening to Identify Therapeutic Targets in Mouse Models of Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor. J. Vis. Exp. (198), e65430, doi:10.3791/65430 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter