Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Genetisk profilering och screening av bortfall i genomskala för att identifiera terapeutiska mål i musmodeller av malign perifer nervskidetumör

Published: August 25, 2023 doi: 10.3791/65430
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1,2
1Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 3Department of Computational Medicine and Bioinformatics, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Vi har utvecklat en artöverskridande onkogenomisk metod som använder genomiska analyser och funktionella genomiska screeningar för att identifiera och jämföra terapeutiska mål i tumörer som uppstår i genetiskt modifierade musmodeller och motsvarande humana tumörtyp.

Abstract

Maligna perifera nervskidetumörer (MPNST) härrör från Schwann-celler eller deras föregångare. Hos patienter med tumörkänslighetssyndromet neurofibromatos typ 1 (NF1) är MPNST den vanligaste maligniteten och den vanligaste dödsorsaken. Dessa sällsynta och aggressiva mjukdelssarkom erbjuder en krass framtid, med en 5-årig sjukdomsfri överlevnad på 34-60%. Behandlingsalternativen för personer med MPNST är tyvärr begränsade, med vanprydande kirurgi som det främsta behandlingsalternativet. Många en gång lovande terapier som tipifarnib, en hämmare av Ras-signalering, har misslyckats kliniskt. På samma sätt har kliniska fas II-prövningar med erlotinib, som riktar sig mot den epidermala tillväxtfaktorn (EFGR), och sorafenib, som riktar sig mot den vaskulära endotelial tillväxtfaktorreceptorn (VEGF), trombocythärledd tillväxtfaktorreceptor (PDGF) och Raf, i kombination med standardkemoterapi, också misslyckats med att ge ett svar hos patienter.

Under de senaste åren har funktionsgenomiska screeningmetoder i kombination med genetisk profilering av cancercellinjer visat sig vara användbara för att identifiera viktiga cytoplasmatiska signalvägar och utveckla målspecifika terapier. När det gäller sällsynta tumörtyper används i allt högre grad en variant av detta tillvägagångssätt som kallas cross-species comparative oncogenomics för att identifiera nya terapeutiska mål. I jämförande onkogenomik mellan arter utförs genetisk profilering och funktionell genomik i genetiskt modifierade musmodeller (GEM) och resultaten valideras sedan i de sällsynta humana prover och cellinjer som finns tillgängliga.

Denna artikel beskriver hur man identifierar kandidatmutationer i MPNST-celler hos människa och mus med hjälp av helexomsekvensering (WES). Vi beskriver sedan hur man utför shRNA-skärmar i genomskala för att identifiera och jämföra kritiska signalvägar i möss och humana MPNST-celler och identifiera läkemedelsbara mål i dessa vägar. Dessa metoder ger ett effektivt tillvägagångssätt för att identifiera nya terapeutiska mål i en mängd olika mänskliga cancertyper.

Introduction

Maligna perifera nervskidetumörer (MPNST) är mycket aggressiva spindelcellstumörer som uppstår i samband med tumörkänslighetssyndromet neurofibromatos typ 1 (NF1), sporadiskt i den allmänna befolkningen och på platser för tidigare strålbehandling 1,2,3. NF1-patienter föds med en vildtypskopia av NF1-tumörsuppressorgenen och en andra NF1-allel med en mutation som leder till förlust av funktion. Detta tillstånd av haploinsufficiens gör NF1-patienter mottagliga för en andra förlust av funktionsmutation i sin vildtyps-NF1-gen, vilket utlöser tumörbildning. När denna "andra träff" NF1-mutation inträffar i en cell i Schwann-cellinjen, är den resulterande tumören antingen ett dermalt neurofibrom som uppstår i huden eller ett plexiformt neurofibrom som utvecklas i stora nerver eller nervplexus. Även om patologin för dermala och plexiforma neurofibrom är identisk, är deras biologiska beteende ganska olika - även om både dermala och plexiforma neurofibrom är godartade, kan endast plexiforma neurofibrom genomgå transformation och ge upphov till MPNST. Förutom förlusten av neurofibromin, det Ras GTPasaktiverande proteinet som kodas av NF1-genen, bär MPNST på mutationer av flera andra tumörsuppressorgener, inklusive TP53 4,5,6,7, CDKN2A 8,9 och PTEN 10, mutationer av gener som kodar för komponenter i polycomb-repressivt komplex 2 11,12 (PRC2 ; SUZ12 och EED-gener) och avvikande uttryck av receptortyrosinkinaser 1,2. Mutationer av NF1 och de andra generna som nämns ovan finns också i sporadiska och strålningsinducerade MPNST11,12.

Även om dessa framsteg i vår förståelse av de genomiska abnormiteterna i MPNST har varit ovärderliga för att förstå deras patogenes, har de ännu inte resulterat i utvecklingen av effektiva nya terapier för MPNST. Ett stort hinder för utvecklingen av nya behandlingar är det faktum att MPNST är sällsynta cancerformer. På grund av detta är det svårt att få tag på det stora antal patientprover som krävs för globala analyser som definierar viktiga drivkraftsmutationer som de som utförs av The Cancer Genome Atlas (TCGA). Enligt vår erfarenhet kan det ta flera år att samla på sig även ett blygsamt antal mänskliga MPNST-prover. För att övervinna sådana begränsningar har många forskare som studerar andra sällsynta cancertyper vänt sig till användningen av jämförande onkogenomik mellan arter för att identifiera viktiga drivande genmutationer, definiera de väsentliga cytoplasmatiska signalvägarna i deras tumör av intresse och identifiera nya terapeutiska mål. Eftersom de signalvägar som är viktiga för tumörbildning är mycket bevarade mellan människor och andra ryggradsdjur, kan tillämpning av funktionella genomiska metoder såsom shRNA-skärmar på genomnivå vara ett effektivt sätt att identifiera dessa nya drivkraftsmutationer, signalvägar och terapeutiska mål 13,14,15,16,17,18,19, särskilt när man studerar sällsynta mänskliga tumörtyper som finns i ett begränsat antal20.

I de metoder som presenteras här beskriver vi detta tillvägagångssätt för att utföra genomisk profilering i humana MPNST-cellinjer och MPNST-kulturer med tidig passage härledda från P 0-GGFβ3-möss, en genetiskt modifierad musmodell (GEM) där Schwann-cellspecifikt överuttryck av tillväxtfaktorn neuregulin-1 (NRG1) främjar patogenesen av plexiforma neurofibrom och deras efterföljande progression till MPNSTs 21, 22,23. Det första steget i detta tillvägagångssätt är att identifiera kandidatdrivande gener i P 0-GGFβ3 MPNSTs, humana MPNST-cellinjer och kirurgiskt resekerade humana MPNSTs. För att funktionellt validera de signalvägar som påverkas av dessa mutationer använder vi sedan shRNA-skärmar i genomskala för att identifiera de gener som krävs för proliferation och överlevnad i MPNST-cellinjer hos människa och mus. Efter att ha identifierat de gener som krävs för proliferation och överlevnad identifierar vi sedan de läkemedelsbara genprodukterna i samlingen av "träffar" med hjälp av Drug Gene Interaction Database. Vi jämför också "träffarna" i MPNST-celler hos människa och mus för att avgöra om GEM-modellen och humana MPNST uppvisar liknande beroende av samma gener och signalvägar. Att identifiera överlappningar i de gener som krävs för proliferation och överlevnad och de påverkade signalvägarna fungerar som ett sätt att validera P 0-GGFβ3-musmodellen på molekylär nivå. Detta tillvägagångssätt betonar också effektiviteten av att kombinera human- och musskärmar för att identifiera nya terapeutiska mål, där musmodellen kan fungera som ett komplement till de mänskliga skärmarna. Värdet av detta artöverskridande tillvägagångssätt är särskilt tydligt när man letar efter terapeutiska mål i sällsynta tumörer, där mänskliga tumörer och cellinjer är svåra att få tag på.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Innan studierna påbörjas ska djurprocedurer och protokoll för hantering av virusvektorer granskas och godkännas av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) och Institutional Biosafety Committee (IBC). De procedurer som beskrivs här har godkänts av Medical University of South Carolinas IACUC- och IBC-styrelser och utfördes av korrekt utbildad personal i enlighet med NIH:s guide för vård och användning av försöksdjur och MUSC:s riktlinjer för institutionell djurvård.

1. WES-SEQ-analyser och identifiering av patogena varianter

  1. Isolera genomiskt DNA från ett tumörprov eller subkonfluenta (70 %) MPNST-celler odlade på en 60 mm skål, med hjälp av kommersiellt tillgängliga standardmetoder baserade på adsorptionskiselgel (se tillverkarens protokoll för detaljerade steg). Det allmänna arbetsflödet visas i bild 1.
  2. Lämna in minst 10 μl genomiskt DNA vid 50 ng/μl till sekvenseringskärnan, såvida inte olika mängder eller koncentrationer av genomiskt DNA anges.
    1. Kärnanläggningen fragmenterar det genomiska DNA:t genom ultraljudsbehandling och renar det sedan med den föredragna metoden. Exominsamling och bibliotekskonstruktion utförs med hjälp av det föredragna exomsekvenseringssatsen och indextaggar läggs till i den förstärkta infångade exomen.
    2. Skicka in prover till sekvenseringskärnan för att få helexomsekvensering (WES; 100 bp sekvenserad från varje ände) utförd.
    3. FASTQ-filer som genereras av kärnan tillhandahålls till utredaren. Använd endast FASTQ-filer som skickar kvalitetsmått för analys.
  3. Justera och analysera FASTQ-filerna med hjälp av kommersiellt tillgängliga program (t.ex. DNAStar19,20, Partek21 eller Varsome). Rikta in FASTQ files till musreferensgenomet GRCm38/mm10 med standardinställningarna.
    OBS: Med hjälp av DNAStar och ett MPNST-musprov som example, är det allmänna arbetsflödet diagrammet i Figur 1 och förklaras kortfattat nedan.
    1. Öppna programvaran DNAStar och välj arbetsflödet SeqMan NGen.
    2. Välj Arbetsflöde genom att välja Variantanalys/Omsekvensering och typ av sekvenseringsanalys NGS-Based Amplicon, genpanel eller exome. Klicka på Nästa.
    3. Välj önskad referenssekvens genom att välja Ladda ner genompaket och lämpligt referensgenom (dvs. Mus_musculus-GRCm38-dbSNP146.zip eller Homo sapien-GRCh37.p13.zip). Om kärnanläggningen tillhandahöll en sängfil, ladda upp den här hjälpfilen. Klicka på Nästa.
    4. Välj Ingångssekvenser genom att välja lämplig sequencer-teknik, Illumina, och ange att sekvensläsningarna är parade. Välj sedan experimentkonfigurationen, multiexemplet och ladda upp sekvenserings-FASTQ-filerna genom att välja Lägg till. Om du kör flera samples, ange varje parad uppsättning med ett unikt experiment eller provnamn Tumör, Cellinje eller A18, A202... Klicka på Nästa.
    5. Ange kontrolldatauppsättningen om det finns en. Klicka på Nästa och klicka på Nästa igen under Monteringsalternativ. Under Analysalternativ klickar du på lämpligt variantdetekteringsläge som Diploid och klickar sedan på Nästa. Under Sammansättningsutdata namnger och anger du platsen där filen sparas för projektet. klicka på Nästa. Kör sammansättningen på den lokala datorn eller i molnet.
      OBS: De resulterande justeringsfilerna kan öppnas i ArrayStar-arbetsflödet för variantannotering av detekterade enstaka nukleotidpolymorfismer (SNP). Det här arbetsflödet identifierar SNP:er, inte vinster eller förluster av antalet genkopior. En separat analys som kallas SNP-matris med hög densitet identifierar ändringar av kopieringsnummer. Helexomsekvensering detekterar inte ändringar i antalet kopior på ett tillförlitligt sätt. Se programmets användarhandbok för de specifika steg som ska utföras med inriktningsprogrammet.
    6. Tillämpa användardefinierade filter på variantanteckningen av identifierade SNP:er för att inkludera eller exkludera vissa data. För att få en komprimerad lista över sannolikt funktionellt relevanta varianter, använd följande filter på variantdatauppsättningarna i den här hierarkin: inte i kontroll (om ett normalt kontrollurval är tillgängligt), populationsfrekvens (gnomAD, ExAC, 1 000 genomfrekvenser), allelfrekvens (inkluderar ≤0,001 eller 0,1 %), täckningsdjup (exkluderar <10 djup), patogenicitet eller ClinVar-klass (inkluderar: patogen, sannolikt patogen; exkludera: osäker, sannolikt godartad, godartad), och om så önskas SNP-typ och kodningspåverkan (inkluderar: icke-synonym, missense, nonsens, frameshift, in-frame, splitsning).
      OBS: En känd relevant lista över cancergener kan också tillämpas på den slutliga listan för att endast hämta specifika sjukdomsrelevanta gener, se steg 1.3.7. Dessa filter kan reducera listan över variantgener till mindre än 20 gener.
      1. Homozygota och heterozygota varianter kommer att representeras ungefär till 100 % respektive 50 % för en ren icke-kontaminerande cellpopulation (en etablerad tumörhärledd cellinje bör representera en enda population av isogena tumörceller). I det här fallet använder du allelfrekvenserna 100–90 % och 50–40 % för varianter som ett filter och tar därmed bort alla varianter under det. Om SNP-arraydata med hög densitet också är tillgängliga för samma datauppsättning, tillämpa ökning eller förlust av kopieringsnummer på SNP:er med variantallelfrekvenser som är mindre än homozygota eller heterozygota förhållanden (dvs. kopienummerförstärkning som resulterar i 2 kopior av allel A och 1 kopia av allel B skulle göra lämpliga variantallelfrekvenser på 75 %, 25 %, respektive).
    7. Efter att ha identifierat patogena varianter med ArrayStar, exportera och spara variantgenlistan som en csv-, txt- eller xls-fil och jämför generna som innehåller dessa mutationer med de i kohorten av P 0-GGFβ3-genererade tumörer för att bestämma överlappande och unika muterade genlistor. Jämför de muterade generna med kända muterade gener som är associerade med deras mänskliga motsvarigheter (t.ex. Bushman Lab Cancer Gene list eller en användarkurerad lista).
      1. Du kan också exportera och spara den kommenterade filen som en VCF-fil innan du använder användardefinierade filter (1.3.6).
        OBS: Denna VCF file kan laddas upp till andra varianter av effektorprediktorprogramvara Varsome eller VEP för jämförelse som en sekundär analys. Biologisk analys och analys av signalvägar kan också utföras på de filtrerade variantgenlistorna.
    8. Utföra funktionell klassificering av variantgenlista via en användarföredragen databas för att erhålla information om proteinklass, signalväg, signalvägskomponent och genfamilj och ontologi.
      NOTERA: PANTHER (pantherdp.org) används som ett exempel här.
      1. Ladda upp filtrerad genlista med gen-ID.
      2. Välj organism (Mus musculus).
      3. Välj analys (Funktionell klassificering visad i genlistan) och klicka på skicka biologisk analys och väganalys på filtrerade variantgenlistor.

2. ShRNA-skärmar på genomnivå

OBS: Flera shRNA- och CRISPR-bibliotek finns tillgängliga som kan användas för funktionella skärmar i genomskala med tumörkulturer med låg passage. Här beskriver vi användningen av CELLECTA DECIPHER shRNA-bibliotek som ett exempel. CELLECTA DECIPHER lentivirala shRNA-bibliotek är optimerade för RNAi-genetiska skärmar i poolat format. Varje transkription är riktad mot minst 5-6 unika shRNA och varje lentiviral shRNA-vektor innehåller en unik genetisk streckkod flankerad av PCR-primerplatser. Dessa bibliotek täcker majoriteten av gener som är relevanta för sjukdomar hos människor och möss, men täcker inte alla gener i genomet. Cellectas plasmid-DNA-pooler finns i tre moduler (Human Module I, II, III; riktar sig mot 15 377 gener) medan plasmidpoolerna i musbiblioteket finns tillgängliga i två moduler (Mouse Modules I och II; riktar sig mot 9 145 gener). Dessa bibliotek används för att utföra "drop out"-analyser där riktade gener som krävs för proliferation och/eller överlevnad uttrycks på olika sätt vid olika tidpunkter efter viral transduktion.

  1. Lentiviral förpackning
    1. Dag 0: Tallrik 10 rätter med 10 miljoner 293T-celler/15 cm skål i 30 ml/skål antibiotikafri DMEM innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS).
    2. Dag 1: Bekräfta att cellerna är ~80 % konfluenta nästa dag och redo att transfekta. Blanda följande i denna ordning i ett 50 ml koniskt rör: 600 μL förpackningsplasmidblandning (0,5 μg/μL), 60 μL plasmidstreckkodsbibliotek, 12 ml DMEM (inget serum eller antibiotika) och 600 μL transfektionsreagens. Inkubera i rumstemperatur i 15 min.
    3. Placera 900 μl transfektionsreagens och 12 ml DMEM i ett separat 15 ml koniskt rör och blanda genom virvling. Tillsätt 12,9 ml av transfektionsreagenset/DMEM-blandningen till DNA-blandningen och snärta till blandningen. Inkubera i rumstemperatur i 15 minuter utan ytterligare blandning. Tillsätt 2,5 ml av denna blandning, droppvis, till varje 15 cm skål med 293T-celler och inkubera över natten i en vävnadsodlingsinkubator.
    4. Dag 2: Byt ut media följande dag mot vanliga odlingssubstrat som innehåller antibiotika.
    5. Dag 3: Skörda viruset genom att samla upp mediet och låta det passera genom en 0,2 μm filtreringsenhet och alikvotera i 15 ml koniska rör; Bered också fem 1 ml alikvoter av filtrerat virus i kryovialer för användning vid viral titrering (anses vara 48-timmarsvirus). förvara viruset i en frys på -80 °C. Byt ut media mot 30 ml odlingsmedia på plattorna en i taget för att undvika att cellerna torkar ut.
    6. Dag 4: Skörda virus genom att samla upp mediet och låta det passera genom en 0,2 μm filtreringsenhet. Alikvotvirus i 15 ml koniska rör. Detta anses vara 72-timmarsvirus; förvara viruset i en frys på -80 °C.
  2. Titer Lentivirala Pooler
    1. Tillsätt 65 μl katjonisk polymer (10 mg/ml) till 65 ml tumörcellstillväxtmedia. Pipettera 1 ml/brunn av det polymerinnehållande mediet till elva 6-håls vävnadsodlingsplattor. Trypsinisera tumörceller i tidig passage och räkna celler med den föredragna metoden så att varje brunn får 50 000 celler/ml/brunn. Tina 1 ml alikvoter av 48 h lentivirus från frysen i ett 37 °C vattenbad.
    2. För varje virusmodul bereds infektionen enligt tabell 1.
    3. Placera alla 6-brunnsplattor i en vävnadsodlingsinkubator. Följande dag, ta bort virala medier och fyll på med nya tillväxtmedier. Vid 48 timmar, tillsätt puromycinhaltiga medier till alla brunnar som tar emot urvalet. Innan kontrollcellerna är sammanflytande ska cellräkningen av överlevande kloner utföras med den föredragna metoden.
      OBS: Koncentrationen av puromycin som krävs för att döda icke-transducerade celler måste bestämmas empiriskt genom att testa ett intervall av koncentrationer i en "kill"-kurva. Använd den lägsta koncentrationen som enhetligt inducerar döden av icke-transducerade kulturer.
  3. Lentiviral infektion i målceller
    1. Trypsinisera MPNST-celler och räkna. Tallrik 2,5 miljoner celler per 15 cm fat för totalt tjugo 15 cm fat per modul. Tina upp viruset och transducera cellerna med viruset vid ett MOI på 0,5 i närvaro av 5 μg/ml katjonisk polymer (figur 2A).
    2. Ta bort virusinnehållande media följande morgon och ersätt med nytt odlingsmedium. Odla cellerna i ytterligare 2 dagar för att selektionsmarkören ska kunna uttryckas och tillsätt sedan puromycin till odlingarna för att eliminera icke-transducerade celler.
    3. Tre dagar efter tillsats av puromycin, trypsinisera cellerna och centrifugera hälften av cellpopulationen vid 200 × g i 5 minuter i en bordscentrifug. Förvara pelleterade celler i frysen -80 °C för framtida genomisk DNA-beredning; Detta är referenstidpunkten, eller tidpunkt 1 (T1).
    4. Platta om den andra halvan av cellpopulationen och odla den för cirka 7 populationsfördubblingar innan skörd och centrifugering enligt ovan. Denna cellpellet kommer att fungera som den slutliga tidpunkten (tidpunkt 2, T2) och lagras vid -80 °C för framtida genomisk DNA-isolering (figur 2).
  4. Isolering av genomiskt DNA från celler som transducerats med viruspooler
    1. Tina cellpelleten från frysen vid -80 °C och suspendera pelleten på nytt i 10 ml resuspensionsbuffert med tillsatt RNAse och dela omedelbart upp den i två 15 ml polymetylpentenrör (figur 2B).
    2. Tillsätt 500 μL 10 % SDS per 5 ml, blanda och inkubera i rumstemperatur i 5 minuter. Placera sedan rör i en DNA-klippningsanordning för att sonikera DNA i 25 cykler med 30 s på/30 s av, och se till att hålla temperaturen vid 4 °C.
    3. Tillsätt 5 ml fenol/kloroform, pH 8,0 (förvaras vid 4 °C), var noga med att blanda fenolen/kloroformen väl före användning. Efter tillsats av fenol/kloroform, blanda väl genom att virvla kraftigt på maximal inställning i 45-60 s. Centrifugera i 60 min, -20 °C vid 7 200 × g.
      OBS: Ett skummande/mjölkaktigt utseende efter vortexing kommer att signalera fullständig omblandning.
    4. Överför 3 ml av den klara övre fasen till ett nytt 15 ml rör och tillsätt 0,5 ml 3 M natriumacetat och 4 ml isopropanol och blanda väl (figur 2C). Centrifugera i 30 minuter vid 20 °C vid 7 200 × g.
    5. Efter centrifugeringen kasseras supernatanten och pipetteras sedan försiktigt bort den återstående vätskan. Tillsätt 0,5 ml 70 % etanol och lossa pelleten genom att pipettera upp och ner. Överför den återsuspenderade pelleten till ett 1.5 ml centrifugrör och kombinera båda pelletsen från samma sample till ett enda 1.5 ml centrifugrör. Centrifugera med maximal hastighet i en bänkcentrifug i 5 minuter.
    6. Kassera supernatanten och använd en laboratorieservett för att absorbera eventuella rester av 70 % etanol. Blanda om pelleten i 0.5 ml destillerat vatten, se till att inte låta pelleten torka ut eftersom detta kommer att göra det svårt att blanda om. Förvara samples vid 4 °C innan du mäter DNA-koncentrationen.
  5. Kapslad PCR för att förstärka shRNA-streckkoder
    OBS: Hämta DNA från förvaringen och lägg på is. Om DNA-koncentrationen är lägre än 100 ng/μL, vakuumtorka DNA:t snabbt och återsuspendera i en lämplig volym destillerat vatten. Vi rekommenderar att du endast bearbetar en modul i taget (tidpunkt 1 (T1) eller tidpunkt 2 (T2)). Utför två förberedelser för varje tidpunkt som ska slås samman i slutet; Därför är det viktigt att inte bearbeta replikerade tidpunkter samma dag. Följande protokoll är för en gång genomiskt DNA.
    1. Ställ in 7 rör och märk dem enligt beskrivningen: Negativ kontroll, positiv kontroll, 4 rör för genomiskt DNA och ett för en masterblandning (Figur 3A). Den negativa kontrollen är destillerat vatten; den positiva kontrollen är plasmid-DNA som används i 293T-transfektionen för att generera lentivirus.
    2. Tillsätt vatten till varje rör först enligt tabell 2.
    3. Förbered en Master Mix (MM) som visas i tabell 3.
    4. Tillsätt 18 μL MM till varje rör som innehåller vatten. Tillsätt sedan 25 μL genomiskt DNA till vart och ett av de 4 mallrören. Tillsätt sedan 1 μL positiv kontroll (10 ng/μL) till det positiva kontrollröret, var noga med att inte kontaminera andra rör med positivt kontroll-DNA. Tillsätt slutligen 2 μl polymeras till varje rör, tillsätt först de 4 provrören och det positiva kontrollröret sist. Blanda och snurra ner PCR-rören (figur 3).
    5. Utför PCR-reaktion under de förhållanden som anges i tabell 4.
    6. Medan den första PCR:n är igång, förbered slangarna för den 2:a PCR:n enligt tabell 5. Ställ in sju rör: Negativ kontroll, positiv kontroll, 4 rör för genomiskt DNA och ett för MM (figur 3B).
    7. Tillsätt 22 μL MM till varje rör som innehåller vatten och vänta tills den första omgången PCR är klar innan du tillsätter DNA och polymeras.
      1. När den första omgången PCR är klar, kombinera 4 provrör i ett mikrocentrifugrör och blanda.
      2. Tillsätt 25 μl till varje provrör som innehåller vatten.
      3. Tillsätt sedan 2 μl av den första negativa PCR-kontrollen och 2 μL av den första positiva PCR-kontrollen till lämpligt märkta rör.
      4. Tillsätt 2 μl polymeras till varje rör, tillsätt först till de 4 provrören och sist den negativa kontrollen.
    8. Utför PCR-reaktion enligt tabell 6.
      OBS: Vid analys av resultat från den första PCR-reaktionen med elektrofores på en 3.5% agarosgel, om ett överflöd av produkten erhålls, kan antalet cykler minskas till 9-10 för nästa upprepning av denna procedur; På samma sätt, om produktutbytet är lågt, kan cyklerna ökas till 14.
    9. När den andra PCR-reaktionen är klar, kombinera 4 prover i ett mikrocentrifugrör plus 80 μL 6x laddningsfärgämne. För positiva och negativa kontroller, använd 20 μL av provet.
      1. Bered en 3,5 % agarosgel i Tris-Borat-EDTA (TBE) buffert (Figur 4A). För att få plats med den stora provvolymen, skapa en stor brunn i gelkammen genom att tejpa ihop flera brunnar (om en kam som passar volymen inte är tillgänglig), var noga med att lämna två brunnar tillgängliga för de positiva och negativa kontrollerna. Kör gelen på 90 V i 1 timme.
    10. Visualisera gelen och bekräfta ett band vid cirka 250 baspar (bp).
  6. Första reningen: Gelextraktion
    1. Använd en ren skalpell eller rakblad för att ta bort 250 bp-bandet och skär bort så mycket gel som möjligt. Dela det stora bandet i 4 bitar och överför varje bit till ett rent mikrocentrifugrör. Mät och registrera varje gelskivas vikt.
      OBS: Varje bit bör vara cirka 200 mg eller mindre per rör.
    2. Tillsätt 6 volymer solubiliseringsbuffert (t.ex. om gelbiten väger 200 mg, tillsätt 1,2 ml buffert). Placera rören i ett 50 °C vattenbad och rotera var 10-15:e minut tills gelskivorna är upplösta. Tillsätt sedan 1 volym isopropanol till varje rör (t.ex. 0,2 ml isopropanol om gelbiten väger 200 mg).
    3. Använd två centrifugkolonner för rening, ladda proverna från alla 4 rören i kolonnerna. Utför flera centrifuger för att bearbeta all provvolym eftersom kolonnerna endast rymmer 750 μL. Centrifugera kolonnerna med 17 900 × g i 1 minut i en konventionell bänkmikrocentrifug och kassera genomströmningen varje gång.
    4. Tvätta kolonnerna med 750 μl tvättbuffert och centrifugera vid 17 900 × g i 1 minut. Efter tvätten, kassera genomströmningen och torka centrifugkolonnen genom centrifugering vid 17 900 × g i 3 minuter. Eluera DNA med 50 μL destillerat vatten per kolonn och centrifugera som tidigare i 1 minut och kombinera båda rören för en total volym av 100 μL av provet.
  7. Andra reningen
    1. Detta nästa reningssteg kommer att använda Binding Buffer 2 (från PCR Purification Kit), som inte eliminerar små fragment. Tillsätt 400 μl buffert till 100 μL DNA och ladda den på en spinnkolonn (figur 4B). Centrifugera provet vid 17 900 × g i 1 minut.
    2. Tvätta sedan membranet med 650 μL tvättbuffert och centrifugera som tidigare utfört. Torka centrifugkolonnen med ytterligare centrifugering enligt ovan i 3 min.
    3. Eluera DNA:t med 30 μL destillerat vatten och snurra på maxhastighet i 1 min. Efter eluering, kontrollera koncentrationen på en spektrofotometer; se till att koncentrationen inte är lägre än 10 ng/μL eller högre än 70-80 ng/μL. Förvara DNA i en frys vid -20 °C.
  8. Sekvensering av förstärkta streckkoder
    1. För sekvensering, späd renade streckkoder till 0,75 ng/μL med hjälp av elueringsbuffert (EB). För att lägga till sekvensdiversitet är amplikoner grupperade vid 17 pM, inklusive 30 % (v/v) PhiX. Utför kluster med en enda ände (SE) på ett automatiserat klustergenereringssystem enligt tillverkarens protokoll.
    2. Låt sekvenseringskärnan utföra totalt 36 cykler av sekvensering med en enda ände på en NextGen-sekvenserare (figur 4C). Tillsätt anpassad primer GexSeqS till Illumina-sekvensprimers vid 0,5 μM.
    3. Använd den refererade analysprogramvaran för att generera Fastq-filer och bearbeta dem med hjälp av programvara för att trimma läslängder till 18 nukleotider.
    4. Använd Barcode Analyzer och Deconvoluter-programvara för att avkonvolutera trimmade läsningar. Beräkna poäng för vikningsutarmning för varje shRNA som förhållandet mellan antalet läsningar vid referenstidpunkten (T1) jämfört med den slutliga tidpunkten (T2).
  9. Analys av shRNA-screeningresultat och identifiering av potentiella terapeutiska mål
    OBS: I Cellectas shRNA-bibliotek är de flesta gener riktade mot antingen 5 (67%) eller 6 olika shRNA (32%). Men flera hushållsgener, som borde vara träffar i de flesta celler, är måltavlor för ett stort antal shRNA och fungerar som kontroller som definierar intervallet för poäng för negativa.
    1. För att förhindra bias mot gener som är måltavlor för ett större antal shRNA, log transformera utarmningspoängen. Utför en kvantiluppskattning genom att beräkna den 80:e percentilen för varje gen från dess empiriska fördelning.
    2. Om du vill generera en nollfördelning av log-fold-depletion-poäng antar vi att >95 % av generna inte kommer att utarmas och att deras log-quantile-poäng kommer att ha en normalfördelning. Använd medianen för den empiriska fördelningen för att uppskatta medelvärdet av nollfördelningen. Med hjälp av den här nollfördelningen klassificerar du alla gener med log-fold-utarmningspoäng som är större än den 95:e percentilen av nollfördelningen som "träffar".
      OBS: Alla träffar bör ha minst två shRNA med utarmningspoäng över brytpunkten (figur 5).
    3. För att bedöma kvaliteten på RNAi-avhoppsscreeningdata och giltigheten av brytpunkten, använd en uppsättning gener som har definierats som "kärnväsentliga" av COLT Cancer RNAi-screeninginitiativet24,25 för jämförelse. Ta bort CEG från listan över träffar för att skapa den första listan över potentiella terapeutiska mål.
      OBS: Gener i COLT-uppsättningen fick en träff i >50 % av de 72 cancercellinjer som screenades med COLT. Den viktigaste genlistan innehåller 640 gener.
    4. För att identifiera potentiella terapeutiska mål som vanligtvis eller enhetligt krävs av flera MPNST-cellinjer, konstruera Venndiagram över de icke-CEG-träffar som identifierats i skärmar av olika MPNST-cellinjer eller tidiga passagekulturer (Figur 6A). Prioritera icke-CEG-träffar som krävs i alla eller de flesta MPNST-rader eller -kulturer.
      1. Alternativt kan du utföra väganalyser på icke-CEG-träfflistan från varje cellinje eller tidig passagekultur för att identifiera gener vars produkter kodar för komponenter i signalvägar som krävs för tumörcellsproliferation och/eller överlevnad. Jämför sedan de signalvägar som identifieras i väganalysen av icke-CEG med de signalvägar som identifierades som påverkade av mutationer identifierade med WES.
        OBS: Vi tycker att det är särskilt användbart att identifiera signalvägar som konsekvent påverkas av mutationer som identifierats i WES och jämföra dem med de signalvägar som identifierats som kritiska i shRNA-skärmar.
    5. För att identifiera läkemedelsbara mål för vilka terapeutiska medel redan finns tillgängliga, screena listan över träffar som återstår efter avlägsnande av de viktigaste essentiella generna med hjälp av Drug Gene Interaction Database (dgidb.org).
      OBS: Denna databas gör det möjligt att mata in och screena gener samtidigt och ger vägledning om läkemedel som för närvarande är tillgängliga för att rikta in sig på dessa gener.
    6. Validera de identifierade läkemedelsbara högintressanta målen först genom att slå ner deras genuttryck med shRNA som skiljer sig från de som används i den initiala biblioteksskärmen i ett enda batchformat (inte ett biblioteksbatchformat som just beskrivits). För att slå ner genuttrycket, använd två till tre distinkta lentivirala shRNA. Tre till fyra dagar efter infektion, bestäm effekten som detta har på tumörcellproliferation och överlevnad enligt beskrivningen nedan.

3. Utföra cytometeranalyser av cellantal och viabilitet i MPNST-celler som utmanas med kandidatterapeutiska medel

  1. Odla MPNST-celler i DMEM till 80 % sammanflöde. Skölj cellerna med rumstemperatur Hanks balanserade saltlösning (HBSS).
    OBS: Odla inte celler till sammanflöde eftersom tillväxten av dessa celler kommer att släpa efter en tid efter omplätering.
  2. Lossa cellerna från substratet genom att täcka cellerna i 30 s till 1 min med en icke-enzymatisk celldissociationslösning. Tillsätt 5 ml DMEM per 1 ml dissociationslösning och pipettera försiktigt cellerna upp och ner för att lossna från substratet.
  3. Räkna celler med hjälp av en hemocytometer. Plattceller med en densitet av 1 200 celler per brunn i svartväggiga 96-brunnars plattor; Minst tre brunnar för varje läkemedelsutspädning som kommer att testas och utföra tre biologiska replikat av dessa experiment.
  4. För att bestämma de initiala koncentrationerna av läkemedlet som kommer att testas, granska litteraturen för att bedöma vilka koncentrationer som har varit effektiva mot andra cancercelltyper. I de första experimenten testas ett intervall på två storleksordningar över och två storleksordningar under läkemedelskoncentrationen som används med andra cancertyper.
  5. Bered spädningar av läkemedlet som ska testas och tillsätt varje spädning eller vehikel till minst tre replikatbrunnar.
  6. Bedöm direkta cellnummer 1, 3, 5 och 7 dagar efter tillägg av läkemedel. Tillsätt Hoechst 33342 till en slutlig koncentration på 5 μg/ml och inkubera plattorna i 30 minuter vid 37 °C. Läs plattorna på en bildcytometer med hög genomströmning med hjälp av alternativet direkt cellantal för totalt cellantal med 100 000 ms exponeringstider.
  7. Analysera läsningarna med hjälp av programvaran och exportera dem till ett kalkylblad och använd lämplig programvara för statistiska analyser.
  8. Om statistiskt signifikanta minskningar av cellantalet observeras i läkemedelsbehandlade brunnar, utför en "levande/död"-analys för att avgöra om denna minskning delvis beror på induktion av celldöd.
    1. Plattceller i svartväggiga 96-brunnsplattor enligt beskrivningen i steg 3.3.
    2. Bered och tillsätt läkemedel enligt beskrivningen i steg 3.5.
    3. Bedöm cellviabilitet och död 1, 3, 5 och 7 dagar efter tillsats av läkemedlet. Tillsätt kalcein AM till en slutlig koncentration av 1 μM och propidiumjodid till en slutlig koncentration av 1 μM i varje brunn. Inkubera cellerna i 15 minuter vid 37 °C.
    4. Bildceller på en avbildningscytometer med hjälp av programvarualternativet Live+Dead . Analysera läsningarna med hjälp av programvaran och exportera dem till ett kalkylblad och använd lämplig programvara för statistiska analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Diagram 5 visar utarmningspoäng för viktiga kärngener (CEG) märkta som SANNA jämfört med icke-CEG (märkta som FALSKA) i varje mänsklig cellinje som screenades. Poäng representerar log2 av poäng för utarmning av vikning för enskilda gener, som plottas över en boxplot-representation av den totala poängfördelningen. Studentens t-test användes för att testa för en signifikant skillnad i medelvärdet av utarmningspoäng mellan de två grupperna i varje cellinje. De resulterande p-värdena anges i varje panel. Observera att de genomsnittliga poängen för utarmning av vikningen är betydligt högre för CEG:erna än för icke-CEG:erna. Detta är förväntat eftersom Core Essential Genes per definition konsekvent krävs för proliferation och/eller överlevnad i de flesta celltyper.

Figur 6A visar ett Venndiagram över "träffarna" för tre humana MPNST-cellinjer. Vi finner vanligtvis att ett stort antal gener delas mellan flera linjer; Dessa träffar har hög prioritet eftersom de representerar gener som kodar för proteiner som sannolikt är nödvändiga för proliferation och/eller överlevnad av en stor undergrupp av MPNST. Observera också att det finns ett antal gener som bara träffar i en cellinje. Vi stöter ofta på detta och det ska inte tas som en indikation på att skärmarna är av dålig kvalitet. De gener som är vanliga träffar mellan flera linjer utvärderas sedan med hjälp av Drug Gene Interaction Database för att identifiera gener inom denna undergrupp som kodar för proteiner som kan dras med befintliga medel. Vi väljer sedan ut flera av dessa och utför en initial validering genom att slå ner uttrycket av motsvarande mRNA med shRNA. Eftersom vissa shRNA kommer att ha off-target-effekter, testar vi alltid flera shRNA som riktar sig mot samma transkript. Figur 6B visar ett representativt resultat där vi har transducerat MPNST-celler med en icke-målsökande kontroll och flera shRNA som riktar sig mot BCL6. Cellantalet bestämdes sedan vid olika tidpunkter efter transduktionen. Observera att flera av BCL6 shRNA markant minskade cellantalet; Som visas i den medföljande immunoblot, korrelerar graden av minskning av cellantalet med graden av BCL6-knockdown. Figur 6C visar en representativ tillväxtkurva för en tidig passage P 0-GGFβ3 MPNST-kultur.

Figure 1
Figur 1: Arbetsflöde för att utföra helexomsekvensering av MPNST-vävnad eller MPNST-celler med tidig passage. Schematisk illustrerar det allmänna arbetsflödet för variantdetektion som finns i tumörhärledda tidiga passagekulturer. Isolera DNA från tidiga passagekulturer (1) och skicka kvalitets-DNA till sekvenseringskärnan enligt deras inlämningsprotokoll (2). Sekvenseringskärnan kommer att kontrollera kvaliteten på det inlämnade DNA:t och utföra alla nödvändiga prov- och genombiblioteksförberedelser. Kärnfaciliteten kommer att förse användarna med FASTQ-sekvenseringsfiler med mätvärden för kvalitetskontroll (3). Användare kommer att ladda upp FASTQ-filerna till ett genomjusterings- och variantanropsprogram som de väljer. (4) Kommenterade varianter filtreras efter användardefinierade kriterier för att ta bort icke-relevanta varianter. Representativa data som visas jämför resekerat humant MPNST-tumörprov med en cellinje som härrör från tumören26. (5) Utför funktionell klassificeringsanalys med PANTHER. Förkortning: MPNST = Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Arbetsflöde för att utföra viral transduktion av shRNA-biblioteken till MPNST-celler och isolera genomiskt DNA från cellerna vid tidpunkt 1 och tidpunkt 2. (A) Målcellerna infekteras med ett lågt MOI på 0,3 med streckkodade lentivirala partiklar och selekteras under 72 timmar. Cellerna passerar för 5-7 populationsfördubblingar (cirka 7 dagar). Cellpellets dag 0 och dag 7 lagras vid -80 °C för genomisk DNA-isolering. Dag 0 kallas Tidpunkt 1 (T1) och Dag 7 kallas Tidpunkt 2 (T2). (B) Genomisk DNA-isolering börjar med resuspension av cellpellets i resuspensionsbuffert som sedan delas upp i två 15 ml rör. För att underlätta celllys, 10% SDS tillsätts till varje rör och sonikeras i 25 cykler med 30 s på / 30 s av. Efter ultraljudsbehandling tillsätts fenol / kloroform till varje rör och virvlas kraftigt i 45-60 s. Rören centrifugeras sedan. (C) En klar övre fas pipetteras av och tillsätts till ett rent rör med tillsats av natriumacetat/isopropanol och blandas väl. Rören centrifugeras igen. Den här gången kasseras supernatanten och pelleten lossnar med tillsats av 70% etanol. Kombinera de återsuspenderade pelletsen till ett rör och centrifugera med maximal hastighet i en bänkcentrifug. Kassera supernatanten och blanda pelleten i destillerat vatten igen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Arbetsflöde för amplifiering av streckkodssekvenser från lentivirala shRNA-vektorer som förberedelse för kvantifiering av streckkoder med nästa generations sekvensering. (A) Representation av hur man ställer in rör för den första kapslade PCR-reaktionen (7 rör: ett för negativ kontroll, ett för positiv kontroll och de återstående 4 rören för genomiskt DNA. Det sista röret kommer att fungera som huvudblandningsröret). Efter den första PCR-reaktionen, kombinera de genomiska DNA-rören till ett rör och blanda. B) Produkterna från den första kapslade PCR-reaktionen kommer att fungera som mallar för den andra kapslade PCR-reaktionen. Efter den andra PCR:n kombinerar du genomiska DNA-rör till ett rör och blandar. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Arbetsflöde för rening av de amplifierade shRNA-streckkoderna och sekvensering av streckkoder för att kvantifiera deras representation vid tidpunkt 1 och tidpunkt 2 . (A) Häll en 3,5 % agarosgel. Eftersom volymen av det poolade DNA:t överskrider gränsen för en brunn, tejpa ihop 4-6 tänder i en gelkam för att producera en stor brunn. Förbered PCR-produkter med 6x laddningsfärgämne och ladda den positiva kontrollen, negativa kontrollen och poolade DNA i gelen. Efter elektrofores bör ett stort band med cirka 250 baspar framträda i den poolade DNA-banan. Använd en ren skalpell, skär ut hela bandet och skär det sedan i 4 gelskivor. Solubilisera gelbitarna och kombinera dem sedan till två spinnkolonner för att eluera DNA. Kombinera det eluerade DNA:t i ett rör. (B) DNA:t renas genom ett andra reningssteg. Tillsätt Binding Buffer 2 till röret med poolat DNA och pipettera sedan på en spinnkolonn. Tvätta membranet och eluera sedan DNA:t i destillerat vatten. C) Skicka in det renade DNA:t till sekvenseringskärnan. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Representativa exempel på fördelningen av essentiella kärngener efter analys enligt beskrivningen i protokollet. I detta exempel screenades tre humana MPNST-cellinjer (S462, T265 och 2XSB) celler med Cellecta DECIPHER shRNA-bibliotek. För varje human MPNST-cellinje skapades ett boxplot för att jämföra utarmningspoäng på gennivå för gener i listan över Core Essential Genes (CEG; True box plot)25 till den för gener som inte finns i listan över CEGs (False box plot). Enskilda datapunkter läggs ovanpå varje lådagram. P-värdena kommer från ett standardiserat t-test som jämför utarmningspoäng på gennivå för CEG med icke-CEG. Förkortningar: CEG = core essential gene; MPNST = Malign Peripheral Nerve Sheath Tumor. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Validering av skärmresultat . (A) Representativt Venndiagram över överlappande träffar i tre humana MPNST-cellinjer. (B) Humana MPNST-celler från S462 som transducerats med en icke-målsökande (NT) lentiviral vektor och lentivirus som uttrycker fyra olika BCL6-shRNA (shRNA1, shRNA2, shRNA3 och shRNA4). Cellerna transducerades med lentivirus och behandlades sedan med ett selektionsmedel (puromycin) i 3 dagar. Cellantalet bedömdes sedan under de följande sju dagarna. (C) Western blot-analys som visar proteinnivåer av BCL6 efter transduktion med NT,shRNA1, shRNA2, shRNA3 och shRNA4 lentivirus. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: Plattlayout för lentiviral titering. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 2: Initial uppställning av de första PCR-reaktionerna. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 3: Beredning av mastermix för första PCR-reaktion. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 4: Cellectas första PCR-parametrar. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 5: Initial inställning av andra PCR-reaktion. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 6: Cellecta andra PCR-parametrar. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De detaljerade metoderna som presenteras här har utvecklats för att studera perifer nervsystemets neoplasi och MPNST-patogenes. Även om vi har funnit att dessa metoder är effektiva, bör det erkännas att det finns vissa potentiella begränsningar för de metoder vi beskriver här. Nedan diskuterar vi några av dessa begränsningar och potentiella strategier för att övervinna dem i andra modellsystem.

Vi har funnit att helexomsekvensering effektivt identifierar mutationer av intresse i P 0-GGFβ3-möss. Man bör dock vara medveten om att hela exomsekvenseringen i sig har begränsningar. För det första är helexomsekvensering inte en effektiv metod för att identifiera fusionsgenprodukter. Detta beror på att majoriteten av kromosombrott och efterföljande fusion huvudsakligen involverar intergena regioner och introner eftersom dessa regioner representerar majoriteten av genomet. Vi har istället funnit att RNA-Seq med parade ändar mycket mer effektivt identifierar fusionsgener. Det finns också frågan om hur effektivt helexomsekvensering identifierar relativt stora regioner med kromosomförlust.

Även om flera algoritmer har utvecklats för att identifiera sådana förluster, är termen "helexomsekvensering" i sig missvisande eftersom fångsten av exomet även i bra körningar ofta missar upp till 5-10 % av exoniska regioner. På grund av detta kompletterar vi rutinmässigt helexomsekvensering med andra metoder såsom array comparative genomic hybridization (aCGH). Efter att ha identifierat vinster och förluster undersöker vi generna inom dessa intervall och jämför dem med de kända drivkraftsmutationer som är associerade med deras mänskliga motsvarigheter. Musgenomet är dock mer stabilt än det mänskliga genomet27. Följaktligen uppvisar mustumörer vanligtvis inte kromothrips som är analog med vad som ses i mänskliga neoplasmer. Mönstret i mustumörer är istället mycket enklare och tenderar mot hela kromosomen eller kromosomvinster eller kromosomförluster med relativt få fokala deletioner som tenderar att inträffa under starkt selektivt tryck22,23.

Det finns några potentiella fallgropar som vi har stött på när vi har utfört shRNA-skärmar på genomnivå. Ett av de vanligaste problemen som vi stöter på är den relativt dåliga transduktionen av de lentivirala vektorerna in i målcellerna. Vi finner oftast att problemet uppstod på grund av felaktig titering av de förpackade lentivirala poolerna. Eftersom cellkulturer från mustumörer i tidig passage är en begränsande resurs, kommer många forskare istället att försöka titera sitt lentivirus med hjälp av en annan etablerad cellinje som är mer lättillgänglig. Problemet med detta tillvägagångssätt är dock att effektiviteten av lentiviral transduktion kan variera avsevärt från celltyp till celltyp. Det är av denna anledning som vi rekommenderar titrering av lentivirus på de celler som kommer att användas i experimentet. Vi har också stött på problem med relativt låga virustitrar. Det problemet beror oftast på dålig transfektion av 293T-celler när det förpackade viruset produceras.

Det är möjligt att få falskt positiva träffar när man utför shRNA-screeningar på genomnivå. På grund av detta, när vi väl har identifierat de potentiellt läkemedelsbara mål som är av störst intresse för oss, validerar vi alltid resultaten av våra shRNA-skärmar. Vanligtvis kommer vi att använda två olika tillvägagångssätt för att validera högintressanta mål. Först slår vi ner genuttryck med hjälp av två eller flera shRNA som skiljer sig från de som användes i den initiala screeningen och bestämmer vilken effekt detta har på tumörcellproliferation och överlevnad. För det andra får vi fram det eller de läkemedel som identifierats i Drug Gene Interaction Database och bestämmer vilken effekt detta har på tumörcellers proliferation och överlevnad. Vi använder båda metoderna tillsammans eftersom vi har stött på omständigheter där shRNA fungerar och läkemedlet inte gör det. I åtminstone några av dessa fall har undersökning av hela exomsekvensdatasetet visat att det riktade proteinet produceras av en gen som har en mutation som potentiellt påverkar läkemedels-proteininteraktioner.

Tillvägagångssätten som beskrivs ovan kommer att ge utredaren ett tillämpligt sätt att identifiera potentiella drivande mutationer som förekommer i sällsynta neoplasmer, funktionellt identifiera de signalvägar som krävs för proliferation och överlevnad och prioritera mål för terapeutisk utveckling. Vi hoppas att andra forskare kommer att finna dessa tillvägagångssätt användbara för att identifiera viktiga terapeutiska mål i andra mänskliga cancerformer. Läsaren bör dock vara medveten om att det finns andra funktionella genomiska metoder som kan användas för att identifiera gener som är involverade i tumörpatogenes och gener som kodar för potentiella terapeutiska mål. Som ett exempel finns CRISPR-bibliotek tillgängliga som kan användas på ett sätt som är analogt med det vi beskriver för shRNA-bibliotek. Funktionella screeningar kan också utföras in vivo för att identifiera gener som främjar tumörbildning. Som ett exempel på detta har Sleeping Beautys transposonbaserade somatiska mutagenessystem tidigare använts för att rikta in sig på Schwann-celler och deras prekursorer, vilket resulterat i identifieringen av flera hundra gener som är involverade i MPNST-patogenes28. Eftersom dessa system närmar sig funktionell genomik på olika sätt, rekommenderar vi att forskaren noggrant överväger målen för sina planerade experiment och baserar sitt val av en funktionell genomisk metodik på dessa mål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av anslag från National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353 och R01 NS109655 till S.L.C.; R01 NS109655-03S1 till D.P.J.), National Cancer Institute (R01 CA122804 till S.L.C.) och försvarsdepartementet (X81XWH-09-1-0086 och W81XWH-12-1-0164 till S.L.C.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bioruptor Sonication System Diagenode  UCD-600
CASAVA 1.8.2
Cbot Illumina, San Diego, CA N/A
Celigo Image Cytometer Nexcelom N/A
Cellecta Barcode Analyzer and Deconvoluter software
Citrisolve Hybrid Decon Laboratories 5989-27-5
Corning 96-well Black Microplate Millipore Sigma CLS3603
Diagenode Bioruptor 15ml conical tubes Diagenode  C30010009
dNTP mix Clontech 639210
Eosin Y Thermo Scientific 7111
Elution buffer Qiagen  19086
Ethanol (200 Proof) Decon Laboratories 2716
Excel  Microsoft 
FWDGEX 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3’
FWDHTS 5’-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3’
GexSeqS (5’ AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3’ HPLC purified
GraphPad Prism Dotmatics
Harris Hematoxylin Fisherbrand 245-677
Illumina HiScanSQ Illumina, San Diego, CA N/A
Paraformaldehyde (4%) Thermo Scientific J19943-K2
PLUS Transfection Reagent Thermo Scientific 11514015
Polybrene Transfection Reagent Millipore Sigma TR1003G
PureLink Quick PCR Purification Kit Invitrogen K310001
Qiagen Buffer P1 Qiagen  19051
Qiagen Gel Extraction Kit Qiagen 28704
RevGEX 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’
RevHTS1 5’-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3’
Titanium Taq polymerase Clontech 639210
Trimmomatic software www.usadellab.org

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carroll, S. L. Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms. Acta Neuropathol. 123 (3), 321-348 (2012).
  2. Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L. Recent Advances in the Diagnosis and Pathogenesis of Neurofibromatosis Type 1 (NF1)-associated Peripheral Nervous System Neoplasms. Adv Anat Pathol. 25 (5), 353-368 (2018).
  3. Longo, J. F., Carroll, S. L. The RASopathies: Biology, genetics and therapeutic options. Adv Cancer Res. 153, 305-341 (2022).
  4. Birindelli, S., et al. Rb and TP53 pathway alterations in sporadic and NF1-related malignant peripheral nerve sheath tumors. Lab Invest. 81 (6), 833-844 (2001).
  5. Legius, E., et al. TP53 mutations are frequent in malignant NF1 tumors. Genes Chromosomes Cancer. 10 (4), 250-255 (1994).
  6. Menon, A. G., et al. Chromosome 17p deletions and p53 gene mutations associated with the formation of malignant neurofibrosarcomas in von Recklinghausen neurofibromatosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (14), 5435-5439 (1990).
  7. Upadhyaya, M., et al. Germline and somatic NF1 gene mutation spectrum in NF1-associated malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs). Hum Mutat. 29 (1), 74-82 (2008).
  8. Kourea, H. P., Orlow, I., Scheithauer, B. W., Cordon-Cardo, C., Woodruff, J. M. Deletions of the INK4A gene occur in malignant peripheral nerve sheath tumors but not in neurofibromas. Am J Pathol. 155 (6), 1855-1860 (1999).
  9. Nielsen, G. P., et al. Malignant transformation of neurofibromas in neurofibromatosis 1 is associated with CDKN2A/p16 inactivation. Am J Pathol. 155 (6), 1879-1884 (1999).
  10. Gregorian, C., et al. PTEN dosage is essential for neurofibroma development and malignant transformation. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (46), 19479-19484 (2009).
  11. Lee, W., et al. PRC2 is recurrently inactivated through EED or SUZ12 loss in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nat Genet. 46 (11), 1227-1232 (2014).
  12. Zhang, M., et al. Somatic mutations of SUZ12 in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nat Genet. 46 (11), 1170-1172 (2014).
  13. Varela, I., et al. Somatic structural rearrangements in genetically engineered mouse mammary tumors. Genome Biol. 11 (10), 100 (2010).
  14. Johnson, R. A., et al. Cross-species genomics matches driver mutations and cell compartments to model ependymoma. Nature. 466 (7306), 632-636 (2010).
  15. Kim, M., et al. Comparative oncogenomics identifies NEDD9 as a melanoma metastasis gene. Cell. 125 (7), 1269-1281 (2006).
  16. Zender, L., et al. Identification and validation of oncogenes in liver cancer using an integrative oncogenomic approach. Cell. 125 (7), 1253-1267 (2006).
  17. Uren, A. G., et al. Large-scale mutagenesis in p19(ARF)- and p53-deficient mice identifies cancer genes and their collaborative networks. Cell. 133 (4), 727-741 (2008).
  18. Starr, T. K., et al. A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer. Science. 323 (5922), 1747-1750 (2009).
  19. Dupuy, A. J., et al. A modified sleeping beauty transposon system that can be used to model a wide variety of human cancers in mice. Cancer Res. 69 (20), 8150-8156 (2009).
  20. Carroll, S. L. The Challenge of Cancer Genomics in Rare Nervous System Neoplasms: Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors as a Paradigm for Cross-Species Comparative Oncogenomics. Am J Pathol. 186 (3), 464-477 (2016).
  21. Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. J Neurosci. 23 (19), 7269-7280 (2003).
  22. Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. Am J Pathol. 182 (3), 646-667 (2013).
  23. Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropathol. 127 (4), 573-591 (2014).
  24. Hart, T., Brown, K. R., Sircoulomb, F., Rottapel, R., Moffat, J. Measuring error rates in genomic perturbation screens: gold standards for human functional genomics. Mol Syst Biol. 10 (7), 733 (2014).
  25. Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knockout Screens. G3. 7 (8), Bethesda. 2719-2727 (2017).
  26. Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Sci Rep. 11 (1), 5690 (2021).
  27. Maser, R. S., et al. Chromosomally unstable mouse tumours have genomic alterations similar to diverse human cancers. Nature. 447 (7147), 966-971 (2007).
  28. Rahrmann, E. P., et al. Forward genetic screen for malignant peripheral nerve sheath tumor formation identifies new genes and pathways driving tumorigenesis. Nat Genet. 45 (7), 756-766 (2013).

Tags

Genetisk profilering screening av avhopp på genomnivå terapeutiska mål musmodeller malign perifer nervskidetumör Schwann-celler neurofibromatos typ 1 (NF1) mjukdelssarkom sjukdomsfri överlevnad behandlingsalternativ vanprydande kirurgi tipifarnib ras-signalhämmare erlotinib epidermal tillväxtfaktor (EGFR) hämmare sorafenib vaskulär endotelial tillväxtfaktorreceptor (VEGF) trombocythärledd tillväxtfaktorreceptor (PDGF) RAF-hämmare Funktionsgenomisk screening cancercellinjer cytoplasmatiska signalvägar målspecifika terapier
Genetisk profilering och screening av bortfall i genomskala för att identifiera terapeutiska mål i musmodeller av malign perifer nervskidetumör
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Turner-Ivey, B., Longo, J. F.,… More

Turner-Ivey, B., Longo, J. F., Jenkins, D. P., Guest, S. T., Carroll, S. L. Genetic Profiling and Genome-Scale Dropout Screening to Identify Therapeutic Targets in Mouse Models of Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor. J. Vis. Exp. (198), e65430, doi:10.3791/65430 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter