Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Genetisk profilering og genom-skala dropout screening for at identificere terapeutiske mål i musemodeller af ondartet perifer nerveskede tumor

Published: August 25, 2023 doi: 10.3791/65430
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1,2
1Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 3Department of Computational Medicine and Bioinformatics, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Vi har udviklet en komparativ onkogenomisk tilgang på tværs af arter ved hjælp af genomiske analyser og funktionelle genomiske screeninger til at identificere og sammenligne terapeutiske mål i tumorer, der opstår i genetisk manipulerede musemodeller og den tilsvarende humane tumortype.

Abstract

Maligne perifere nerveskedetumorer (MPNST'er) er afledt af Schwann-celler eller deres forstadier. Hos patienter med tumorfølsomhedssyndromet neurofibromatosis type 1 (NF1) er MPNST'er den mest almindelige malignitet og den største dødsårsag. Disse sjældne og aggressive bløddelssarkomer tilbyder en skarp fremtid med 5-årige sygdomsfrie overlevelsesrater på 34-60%. Behandlingsmuligheder for personer med MPNST'er er skuffende begrænsede, hvor skæmmende kirurgi er den vigtigste behandlingsmulighed. Mange engang lovende terapier såsom tipifarnib, en hæmmer af Ras-signalering, har fejlet klinisk. Ligeledes har kliniske fase II-forsøg med erlotinib, som er rettet mod den epidermale vækstfaktor (EFGR), og sorafenib, som er rettet mod den vaskulære endotelvækstfaktorreceptor (VEGF), blodpladeafledte vækstfaktorreceptor (PDGF) og Raf, i kombination med standard kemoterapi, heller ikke givet respons hos patienter.

I de senere år har funktionelle genomiske screeningsmetoder kombineret med genetisk profilering af kræftcellelinjer vist sig nyttige til at identificere essentielle cytoplasmatiske signalveje og udvikling af målspecifikke terapier. I tilfælde af sjældne tumortyper anvendes en variation af denne tilgang kendt som komparativ oncogenomics på tværs af arter i stigende grad til at identificere nye terapeutiske mål. I krydsartskomparativ onkogenomik udføres genetisk profilering og funktionel genomforskning i genetisk manipulerede musemodeller (GEM), og resultaterne valideres derefter i de sjældne humane prøver og cellelinjer, der er tilgængelige.

Dette papir beskriver, hvordan man identificerer kandidatdrivergenmutationer i MPNST-celler fra mennesker og mus ved hjælp af heleksomsekventering (WES). Vi beskriver derefter, hvordan man udfører genomskala shRNA-skærme for at identificere og sammenligne kritiske signalveje i mus og humane MPNST-celler og identificere lægemiddelbare mål i disse veje. Disse metoder giver en effektiv tilgang til at identificere nye terapeutiske mål i en række humane kræftformer.

Introduction

Maligne perifere nerveskedetumorer (MPNST'er) er meget aggressive spindelcelleneoplasmer, der opstår i forbindelse med tumorfølsomhedssyndromet neurofibromatosis type 1 (NF1), sporadisk i den generelle befolkning og på steder med tidligere strålebehandling 1,2,3. NF1-patienter fødes med en vildtypekopi af NF1-tumorsuppressorgenet og en anden NF1-allel med en funktionstabsmutation. Denne tilstand af haploinsufficiens gør NF1-patienter modtagelige for en anden tab-af-funktion-mutation i deres vildtype NF1-gen, som udløser tumorgenese. Når denne "anden hit" NF1-mutation forekommer i en celle i Schwann-celleafstamningen, er den resulterende tumor enten et dermalt neurofibroma, der opstår i huden eller et plexiform neurofibroma, der udvikler sig i store nerver eller nerveplexuser. Selvom patologien af dermale og plexiforme neurofibromer er identisk, er deres biologiske adfærd helt anderledes - selvom både dermale og plexiforme neurofibromer er godartede, kan kun plexiforme neurofibromer gennemgå transformation og give anledning til MPNST'er. Ud over tabet af neurofibromin, det Ras GTPase-aktiverende protein kodet af NF1-genet, bærer MPNST'er mutationer af flere andre tumorsuppressorgener, herunder TP53 4,5,6,7, CDKN2A 8,9 og PTEN 10, mutationer af gener, der koder for komponenter i polycomb-repressivt kompleks 2 11,12 (PRC2;SUZ12 og EED-gener) og afvigende ekspression af receptortyrosinkinaser 1,2. Mutationer af NF1 og de andre gener, der er nævnt ovenfor, er også til stede i sporadiske og strålingsinducerede MPNST'er11,12.

Mens disse fremskridt i vores forståelse af de genomiske abnormiteter i MPNST'er har været uvurderlige for forståelsen af deres patogenese, har de endnu ikke resulteret i udviklingen af effektive nye terapier til MPNST'er. En væsentlig hindring for udviklingen af nye behandlinger er, at MPNST'er er sjældne kræftformer. På grund af dette er det vanskeligt at få det store antal patientprøver, der kræves til globale analyser, der definerer centrale drivermutationer som dem, der foretages af The Cancer Genome Atlas (TCGA). Det er vores erfaring, at det kan tage år at akkumulere selv et beskedent antal MPNST-eksemplarer. For at overvinde sådanne begrænsninger har mange forskere, der studerer andre sjældne kræftformer, henvendt sig til brugen af komparativ oncogenomics på tværs af arter til at identificere essentielle drivergenmutationer, definere de væsentlige cytoplasmatiske signalveje i deres tumor af interesse og identificere nye terapeutiske mål. Da signalveje, der er afgørende for tumorigenese, er stærkt bevaret mellem mennesker og andre hvirveldyrarter, kan anvendelse af funktionelle genomiske tilgange såsom genomskala shRNA-skærme være et effektivt middel til at identificere disse nye drivermutationer, signalveje og terapeutiske mål 13,14,15,16,17,18,19, især når man studerer sjældne humane tumortyper, der er tilgængelige i begrænsende antal20.

I de metoder, der præsenteres her, beskriver vi denne tilgang til udførelse af genomisk profilering i humane MPNST-cellelinjer og MPNST-kulturer med tidlig passage afledt af P 0-GGFβ3-mus, en genetisk manipuleret musemodel (GEM), hvor Schwann-cellespecifik overekspression af vækstfaktorneuregulin-1 (NRG1) fremmer patogenesen af plexiforme neurofibromer og deres efterfølgende progression til MPNST'er21, 22,23. Det første skridt i denne tilgang er at identificere kandidatdrivergener i P 0-GGFβ3 MPNST'er, humane MPNST-cellelinjer og kirurgisk resekterede humane MPNST'er. For funktionelt at validere de signalveje, der påvirkes af disse mutationer, bruger vi derefter shRNA-skærme i genomskala til at identificere de gener, der kræves for spredning og overlevelse i MPNST-cellelinjer hos mennesker og mus. Efter at have identificeret de gener, der kræves for spredning og overlevelse, identificerer vi derefter de medicinerbare genprodukter inden for samlingen af "hits" ved hjælp af Drug Gene Interaction Database. Vi sammenligner også "hits" i MPNST-celler fra mennesker og mus for at afgøre, om GEM-modellen og humane MPNST'er viser lignende afhængighed af de samme gener og signalveje. Identifikation af overlapninger i de gener, der kræves for spredning og overlevelse og de berørte signalveje, tjener som et middel til at validere P 0-GGFβ3-musemodellen på molekylært niveau. Denne tilgang understreger også effektiviteten af at kombinere menneskelige og museskærme for at identificere nye terapeutiske mål, hvor musemodellen kan tjene som et supplement til de menneskelige skærme. Værdien af denne tilgang på tværs af arter er særlig tydelig, når man leder efter terapeutiske mål i sjældne tumorer, hvor humane tumorer og cellelinjer er vanskelige at opnå.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Inden undersøgelserne påbegyndes, skal dyreprocedurer og protokoller til håndtering af virale vektorer gennemgås og godkendes af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og Institutional Biosafety Committee (IBC). De procedurer, der er beskrevet her, blev godkendt af Medical University of South Carolinas IACUC- og IBC-bestyrelser og blev udført af korrekt uddannet personale i overensstemmelse med NIH Guide for Care and Use of Laboratory Animals og MUSCs institutionelle retningslinjer for dyrepleje.

1. WES-Seq-analyser og identifikation af patogene varianter

  1. Isoler genomisk DNA fra en tumorprøve eller sub-sammenflydende (70%) MPNST-celler dyrket på en 60 mm skål ved hjælp af standard kommercielt tilgængelige adsorptionssilica-gelbaserede metoder (se producentens protokol for detaljerede trin). Den generelle arbejdsgang er vist i figur 1.
  2. Der indsendes mindst 10 μL genomisk DNA ved 50 ng/μL til sekventeringskernen, medmindre der er angivet forskellige mængder eller koncentrationer af genomisk DNA.
    1. Kernefaciliteten fragmenterer det genomiske DNA ved sonikering og renser det derefter ved hjælp af den foretrukne metode. Exome-optagelse og bibliotekskonstruktion udføres ved hjælp af det foretrukne eksomsekventeringssæt, og indeksmærker føjes til det forstærkede fangede eksom.
    2. Indsend prøver til sekventeringskernen for at få udført hele eksomparret-ende-sekventering (WES; 100 bp sekventeret fra hver ende).
    3. FASTQ-filer, der genereres af kernen, leveres til efterforskeren. Brug kun FASTQ-filer, der består kvalitetsmålinger til analyse.
  3. Juster og analyser FASTQ-filerne ved hjælp af kommercielt tilgængelige softwareprogrammer (f.eks. DNAStar19,20, Partek21 eller Varsome). Juster FASTQ-filerne til musereferencegenomet GRCm38/mm10 ved hjælp af standardindstillingerne.
    BEMÆRK: Ved hjælp af DNAStar og en MPNST-prøve med mus som eksempel er den generelle arbejdsgang skitseret i Figur 1 og kort forklaret nedenfor.
    1. Åbn DNAStar-softwaren, og vælg SeqMan NGen-arbejdsgangen.
    2. Vælg Arbejdsproces ved at vælge Variantanalyse/Resekventering og typen af sekventeringsanalyse NGS-baseret amplicon, genpanel eller eksom. Klik på Næste.
    3. Vælg den foretrukne referencesekvens ved at vælge Download genompakke og det relevante referencegenom (dvs. Mus_musculus-GRCm38-dbSNP146.zip eller Homo sapien-GRCh37.p13.zip). Hvis kernefaciliteten leverede en sengefil, skal du uploade denne hjælpefil. Klik på Næste.
    4. Vælg Inputsekvenser ved at vælge den passende sequencer-teknologi, Illumina, og udpeg, at sekventeringslæsningerne er parret-ende. Vælg derefter eksperimentopsætningen, multiprøven, og upload de sekventerede FASTQ-filer ved at vælge Tilføj. Hvis du kører flere prøver, skal du udpege hvert parret slutsæt med et unikt eksperiment eller prøvenavn Tumor, cellelinje eller A18, A202... Klik på Næste.
    5. Angiv kontroldatasættet , hvis der er et. Klik på Næste , og klik på Næste igen under Samlingsindstillinger. Under Analyseindstillinger skal du klikke på den relevante variantregistreringstilstand som Diploide og derefter klikke på Næste. Under Assembly Output skal du navngive og angive projektets fillagringsplacering; klik på Næste. Kør samlingen på den lokale computer eller skyen.
      BEMÆRK: De resulterende justeringsfiler kan åbnes i ArrayStar-arbejdsprocessen til variantannotering af detekterede SNP'er (Single Nucleotide Polymorphisms). Denne arbejdsgang registrerer SNP'er, ikke gevinster eller tab ved genkopiantal. En separat analyse kaldet SNP-array med høj densitet registrerer ændringer i kopiantallet. Hele Exom-sekventering registrerer ikke pålideligt ændringer i kopinummer. Se brugervejledningen til programmet for at få oplysninger om de specifikke trin, der skal udføres med justeringsprogrammet.
    6. Anvend brugerdefinerede filtre på variantannoteringen af registrerede SNP'er for at medtage eller udelade bestemte data. For at få en komprimeret liste over sandsynlige funktionelt relevante varianter skal du anvende følgende filtre på variantdatasættene i dette hierarki: ikke i kontrol (hvis en normal kontrolprøve er tilgængelig), populationsfrekvens (gnomAD, ExAC, 1.000 genomfrekvenser), allelfrekvens (inkluderer ≤0,001 eller 0,1%), dækningsdybde (ekskl. <10 dybde), patogenicitet eller ClinVar-klasse (inkluderer: patogen, sandsynligvis patogen; ekskluderer: usikker, sandsynlig godartet, godartet) og om ønsket SNP-type og kodningseffekt (inkluderer: ikke-synonym, missense, nonsens, frameshift, in-frame, splejsning).
      BEMÆRK: En kendt relevant kræftgenliste kan også anvendes på den endelige liste for kun at trække specifikke sygdomsrelevante gener, se trin 1.3.7. Disse filtre kan reducere variantgenlisten ned til mindre end 20 gener.
      1. Brug variantallelfrekvensen til at filtrere sekventeringsfejl SNP'er fra. Homozygote og heterozygote varianter vil være repræsenteret henholdsvis ca. 100% og 50% for en ren ikke-kontaminerende cellepopulation (en etableret tumorafledt cellelinje skal repræsentere en enkelt population af isogene tumorceller). I dette tilfælde skal du anvende 100-90% og 50-40% allelfrekvenser for varianter som et filter, hvorved eventuelle varianter under dette fjernes. Hvis SNP-arraydata med høj densitet også er tilgængelige for det samme datasæt, skal du anvende kopinummergevinst eller -tab på SNP'er med variantallelfrekvenser, der er mindre end homozygote eller heterozygote forhold (dvs. kopinummerforøgelse, der resulterer i 2 kopier af allel A, og 1 kopi af allel B ville give passende variantallelfrekvenser på 75%, 25%, henholdsvis).
    7. Efter at have identificeret patogene varianter med ArrayStar, skal du eksportere og gemme variantgenlisten som en csv-, txt- eller xls-fil og sammenligne generne, der indeholder disse mutationer, med dem i kohorten af P 0-GGFβ3-genererede tumorer for at bestemme overlappende og unikke muterede genlister. Sammenlign de muterede gener med kendte muterede gener, der er forbundet med deres menneskelige modstykker (dvs. Bushman Lab Cancer Gene liste eller en bruger-kurateret liste).
      1. Før du anvender brugerdefinerede filtre (1.3.6), skal du eventuelt eksportere og gemme den kommenterede fil som en VCF-fil.
        BEMÆRK: Denne VCF fil kan uploades til andre variant effektor prædiktor software Varsome eller VEP til sammenligning som en sekundær analyse. Biologisk analyse og pathway analyse kan også udføres på de filtrerede variant genlister.
    8. Udfør funktionel klassificering af variantgenliste via en brugerforetrukken database for at opnå proteinklasse, vej, vejkomponent og genfamilie og ontologiinformation.
      BEMÆRK: PANTHER (pantherdp.org) bruges som eksempel her.
      1. Upload filtreret genliste med gen-id.
      2. Vælg organismen (Mus musculus).
      3. Vælg analyse (Funktionel klassifikation vist i genlisten), og klik på indsend biologisk analyse og vejanalyse på filtrerede variantgenlister.

2. Genom-skala shRNA-skærme

BEMÆRK: Flere shRNA- og CRISPR-biblioteker er tilgængelige, der kan bruges til funktionelle skærme i genomskala med tumorkulturer med lav passage. Her beskriver vi brugen af CELLECTA DECIPHER shRNA-biblioteker som et eksempel. CELLECTA DECIPHER lentivirale shRNA-biblioteker er optimeret til RNAi-genetiske skærme i poolet format. Hvert transkript er målrettet mod mindst 5-6 unikke shRNA'er, og hver lentiviral shRNA-vektor indeholder en unik genetisk stregkode flankeret af PCR-primersteder. Disse biblioteker dækker størstedelen af sygdomsrelevante gener hos mennesker og mus, men dækker ikke alle gener i genomet. Cellecta humant bibliotek plasmid DNA-puljer er tilgængelige i tre moduler (Human Module I, II, III; mål 15.377 gener), mens musebibliotekets plasmidpuljer er tilgængelige i to moduler (musemodul I og II; mål 9.145 gener). Disse biblioteker bruges til at udføre "drop out" assays, hvor målrettede gener, der er nødvendige for spredning og / eller overlevelse, udtrykkes forskelligt på forskellige tidspunkter efter viral transduktion.

  1. Lentiviral emballage
    1. Dag 0: Tallerken 10 skåle med 10 millioner 293T-celler/15 cm fad i 30 ml/fad antibiotikafrit DMEM indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS).
    2. Dag 1: Bekræft, at cellerne er ~ 80% sammenflydende den næste dag og klar til at transfektere. I et 50 ml konisk rør blandes følgende i denne rækkefølge: 600 μL emballageplasmidblanding (0,5 μg / μL), 60 μL plasmidstregkodebibliotek, 12 ml DMEM (intet serum eller antibiotika) og 600 μL transfektionsreagens. Inkuber ved stuetemperatur i 15 min.
    3. Anbring 900 μL transfektionsreagens og 12 ml DMEM i et separat 15 ml konisk rør og bland ved hvirvelstrøm. Tilsæt 12,9 ml transfektionsreagens/DMEM-blandingen til DNA-blandingen, og svip for at blande. Inkuber ved stuetemperatur i 15 minutter uden yderligere blanding. Tilsæt 2,5 ml af denne blanding, dråbevis, til hver 15 cm skål med 293T-celler og inkuber natten over i en vævskulturinkubator.
    4. Dag 2: Udskift medier den følgende dag med almindelige vækstmedier, der indeholder antibiotika.
    5. Dag 3: Høst virussen ved at opsamle mediet og føre det gennem en 0,2 μm filtreringsenhed og aliquotere i 15 ml koniske rør; Der fremstilles også fem 1 ml alikvoter filtreret virus i kryoialer til brug ved viral titering (betragtes som 48 timers virus); Opbevar virussen i en fryser til -80 °C. Udskift medier med 30 ml vækstmedier på pladerne en ad gangen for at undgå udtørring af celler.
    6. Dag 4: Høst virus ved at opsamle mediet og føre det gennem en 0,2 μm filtreringsenhed. Aliquot virus i 15 ml koniske rør. Dette betragtes som 72 timers virus; Opbevar virussen i en fryser til -80 °C.
  2. Titer Lentivirale puljer
    1. Tilsæt 65 μL kationisk polymer (10 mg / ml) til 65 ml tumorcellevækstmedier. Der pipetteres 1 ml/hul af det polymerholdige medium i elleve 6-brønds vævskulturplader. Trypsiniser tumorceller i tidlig passage og tæl celler ved hjælp af den foretrukne metode, så hver brønd modtager 50.000 celler / ml / brønd. 1 ml alikvoter af 48 timers lentivirus optøs fra fryseren i et 37 °C vandbad.
    2. For hvert viralt modul skal du forberede infektionen som vist i tabel 1.
    3. Placer alle 6-brøndplader i en vævskulturinkubator. Den følgende dag skal du fjerne virale medier og genopfylde med friske vækstmedier. Ved 48 timer tilsættes puromycinholdige medier til alle huller, der modtager udvælgelse. Før kontrolceller er sammenflydende, skal du udføre celletællinger af overlevende kloner ved hjælp af den foretrukne metode.
      BEMÆRK: Den koncentration af puromycin, der kræves for at dræbe ikke-transducerede celler, skal forudbestemmes empirisk ved at teste et koncentrationsområde i en "kill" -kurve. Brug den laveste koncentration, der ensartet fremkalder død af ikke-transducerede kulturer.
  3. Lentiviral infektion af målceller
    1. Trypsinize MPNST celler og tælle. Plade 2,5 millioner celler pr. 15 cm fad til i alt tyve 15 cm skåle pr. Modul. Optø virussen og transducer cellerne med virussen ved en MOI på 0,5 i nærværelse af 5 μg/ml kationisk polymer (figur 2A).
    2. Fjern virusholdige medier den følgende morgen og erstat med friske vækstmedier. Kulturceller i yderligere 2 dage for at tillade ekspression af selektionsmarkøren og tilsæt derefter puromycin til kulturerne for at eliminere ikke-transducerede celler.
    3. Tre dage efter tilsætning af puromycin trypsiniserer cellerne og centrifugerer halvdelen af cellepopulationen ved 200 × g i 5 minutter i en bordpladecentrifuge. De pelleterede celler opbevares i fryseren -80 °C med henblik på fremtidig genomisk DNA-forberedelse. dette er referencetidspunktet eller tidspunktet 1 (T1).
    4. Omplade den anden halvdel af cellepopulationen og dyrk den i ca. 7 populationsfordoblinger før høst og centrifugering som ovenfor. Denne cellepille vil tjene som det sidste tidspunkt (tidspunkt 2, T2) og opbevares ved -80 °C til fremtidig genomisk DNA-isolering (figur 2).
  4. Isolering af genomisk DNA fra celler transduceret med viruspuljer
    1. Cellepellet optøs fra -80 °C-fryseren, og pellet opslæmmes igen i 10 ml resuspensionsbuffer tilsat RNAse, og det opdeles straks i to 15 ml polymethylpentenrør (figur 2B).
    2. Tilsæt 500 μL 10% SDS pr. 5 ml, bland og inkuber ved stuetemperatur i 5 min. Derefter placeres rør i en DNA-skæreanordning for at sonikere DNA'et i 25 cyklusser på 30 s on / 30 s off, og sørg for at holde temperaturen på 4 ° C.
    3. Tilsæt 5 ml phenol/chloroform, pH 8,0 (opbevares ved 4 °C), og sørg for at blande phenol/chloroformen godt før brug. Efter tilsætning af phenol/chloroform blandes godt ved hvirvelstrømmen kraftigt ved maksimal indstilling i 45-60 s. Der centrifugeres i 60 min, -20 °C ved 7.200 × g.
      BEMÆRK: Et skummende/mælkeagtigt udseende efter hvirvelstrømmen signalerer fuldstændig resuspension.
    4. 3 ml af den klare øvre fase overføres til et frisk 15 ml rør og tilsættes 0,5 ml 3 M natriumacetat og 4 ml isopropanol og blandes godt (figur 2C). Der centrifugeres i 30 minutter ved 20 °C ved 7.200 × g.
    5. Efter centrifugering kasseres supernatanten, og derefter pipetteres den resterende væske forsigtigt af. Tilsæt 0,5 ml 70% ethanol og løsn pelleten ved pipettering op og ned. Overfør den resuspenderede pellet til et 1,5 ml centrifugerør og kombiner begge pellets fra den samme prøve til et enkelt 1,5 ml centrifugerør. Centrifuger ved maksimal hastighed i en bordcentrifuge i 5 min.
    6. Supernatanten kasseres, og der absorberes eventuelt 70 % ethanol med en laboratorieserviet. Resuspender pellet i 0,5 ml destilleret vand, og sørg for ikke at lade pelleten tørre ud, da dette vil gøre resuspension vanskelig. Prøverne opbevares ved 4 °C, inden DNA-koncentrationen måles.
  5. Indlejret PCR for at forstærke shRNA-stregkoder
    BEMÆRK: Hent DNA fra opbevaring og læg det på is. Hvis DNA-koncentrationen er lavere end 100 ng/μl, vakuumtørres DNA'et hurtigt, og det resuspenderes i en passende mængde destilleret vand. Vi anbefaler, at du kun behandler ét modul ad gangen (tidspunkt 1 (T1) eller tidspunkt 2 (T2)). Udfør to forberedelser af hvert tidspunkt, som skal samles i slutningen; Derfor er det vigtigt ikke at behandle replikerede tidspunkter samme dag. Følgende protokol er for et tidspunkt af genomisk DNA.
    1. Opsæt 7 rør og mærk dem som beskrevet: Negativ kontrol, positiv kontrol, 4 rør til genomisk DNA og et til en masterblanding (figur 3A). Den negative kontrol er destilleret vand; den positive kontrol er plasmid-DNA'et, der anvendes i 293T-transfektionen til at generere lentivirus.
    2. Tilsæt vand til hvert rør først som angivet i tabel 2.
    3. Forbered en Master Mix (MM) som vist i tabel 3.
    4. Der tilsættes 18 μL MM til hvert vandholdigt glas. Derefter tilsættes 25 μL genomisk DNA til hvert af de 4 skabelonrør. Derefter tilsættes 1 μL positiv kontrol (10 ng / μL) til det positive kontrolrør, og pas på ikke at forurene andre rør med positivt kontrol-DNA. Til sidst tilsættes 2 μL polymerase til hvert glas, idet der først tilsættes de 4 prøveglas og det positive kontrolrør sidst; bland og drej PCR-rørene ned (figur 3).
    5. Udfør PCR-reaktion under de betingelser, der er angivet i tabel 4.
    6. Mens den første PCR kører, skal du forberede rør til 2. PCR som angivet i tabel 5. Opsæt syv rør: Negativ kontrol, positiv kontrol, 4 rør til genomisk DNA og et til MM (figur 3B).
    7. Tilsæt 22 μL MM til hvert rør, der indeholder vand, og vent på, at den første runde PCR er færdig, før du tilsætter DNA og polymerase.
      1. Når den første runde PCR er afsluttet, kombineres 4 prøveglas i et mikrocentrifugerør og blandes.
      2. Der tilsættes 25 μl til hvert prøveglas med vand.
      3. Derefter tilsættes 2 μL af den første PCR-negative kontrol og 2 μL af den første PCR-positive kontrol til passende mærkede rør.
      4. Der tilsættes 2 μL polymerase til hvert glas, idet der først tilsættes de 4 prøveglas og den negative kontrol til sidst.
    8. Udfør PCR-reaktion som angivet i tabel 6.
      BEMÆRK: Ved analyse af resultater fra den første PCR-reaktion ved elektroforese på en 3,5% agarosegel, hvis der opnås en overflod af produkt, kan antallet af cyklusser reduceres til 9-10 til den næste gentagelse af denne procedure; Ligeledes, hvis produktudbyttet er lavt, kan cyklusser øges til 14.
    9. Når den anden PCR-reaktion er afsluttet, kombineres 4 prøver i et mikrocentrifugerør plus 80 μL 6x påfyldningsfarvestof. Ved positive og negative kontroller anvendes 20 μL af prøven.
      1. Forbered en 3,5% agarosegel i Tris-Borat-EDTA (TBE) buffer (figur 4A). For at imødekomme det store prøvevolumen skal du oprette en stor brønd i gelkammen ved at tape flere brønde sammen (hvis en kam, der passer til volumenet, ikke er tilgængelig), og sørg for at lade to brønde være tilgængelige til de positive og negative kontroller. Kør gelen ved 90 V i 1 time.
    10. Visualiser gelen og bekræft et bånd ved ca. 250 basepar (bp).
  6. Første oprensning: Gelekstraktion
    1. Brug en ren skalpel eller barberblad til at skære 250 bp-båndet og skære så meget gel af som muligt. Del det store bånd i 4 stykker, og overfør hvert stykke til et rent mikrocentrifugerør. Mål og registrer hver gelskives vægt.
      BEMÆRK: Hvert stykke skal være ca. 200 mg eller mindre pr. Rør.
    2. Tilsæt 6 volumener opløselighedsbuffer (f.eks. Hvis gelstykket vejer 200 mg, tilsættes 1,2 ml buffer). Anbring rørene i et 50 °C vandbad og drej hvert 10.-15. minut, indtil gelskiverne er opløst. Derefter tilsættes 1 volumen isopropanol til hvert glas (f.eks. 0,2 ml isopropanol, hvis gelstykket vejer 200 mg).
    3. Brug to spinkolonner til rensning til at indlæse prøverne fra alle 4 rør i kolonnerne. Udfør flere centrifugeringer for at behandle hele prøvevolumenet, da kolonnerne kun rummer 750 μL. Drej kolonnerne ved 17.900 × g i 1 min i en konventionel bordmikrocentrifuge, og kassér gennemstrømningen hver gang.
    4. Kolonnerne vaskes med 750 μL vaskebuffer og centrifugeres ved 17.900 × g i 1 min. Efter vasken kasseres gennemstrømningen, og centrifugeringssøjlen tørres ved centrifugering ved 17.900 × g i 3 minutter. Eluer DNA'et med 50 μL destilleret vand pr. kolonne og centrifuger som tidligere i 1 min, og kombiner begge glas til et samlet volumen på 100 μL af prøven.
  7. Anden rensning
    1. Dette næste rensningstrin bruger bindingsbuffer 2 (fra PCR-rensningssættet), som ikke eliminerer små fragmenter. Der tilsættes 400 μL buffer til de 100 μL DNA, og den lægges på en centrifugeringskolonne (figur 4B). Centrifuger prøven ved 17.900 × g i 1 min.
    2. Derefter vaskes membranen med 650 μL vaskebuffer og centrifugeres som tidligere udført. Centrifugeringskolonnen tørres med yderligere centrifugering som ovenfor i 3 minutter.
    3. Eluer DNA'et med 30 μL destilleret vand og drej med maksimal hastighed i 1 min. Efter eluering kontrolleres koncentrationen på et spektrofotometer. sikre, at koncentrationen ikke er lavere end 10 ng/μL eller højere end 70-80 ng/μL. Opbevar DNA'et i en -20 °C fryser.
  8. Sekventering af forstærkede stregkoder
    1. Til sekventering fortyndes de rensede stregkoder til 0,75 ng/μL ved hjælp af elueringsbuffer (EB). For at tilføje sekvensdiversitet grupperes amplicons ved 17 pM, inklusive 30% (v / v) PhiX. Udfør single-end (SE) klyngedannelse på et automatiseret klyngegenereringssystem i henhold til producentens protokol.
    2. Få sekventeringskernen til at udføre i alt 36 cyklusser med single-end-sekventering på en NextGen-sequencer (figur 4C). Tilføj brugerdefineret primer GexSeqS til Illumina-sekventeringsprimere ved 0,5 μM.
    3. Brug den refererede analysesoftware til at generere Fastq-filer og behandle dem ved hjælp af software til at trimme læselængder til 18 nukleotider.
    4. Brug stregkodeanalysator og deconvoluter-software til at deconvolute trimmede læsninger. Beregn foldudtømningsscorer for hvert shRNA som forholdet mellem læsetællingerne ved referencetidspunktet (T1) versus det endelige tidspunkt (T2).
  9. Analyse af shRNA-skærmresultater og identifikation af terapeutiske kandidatmål
    BEMÆRK: I Cellecta shRNA-biblioteket er de fleste gener målrettet mod enten 5 (67%) eller 6 forskellige shRNA'er (32%). Imidlertid er flere husholdningsgener, som burde være hits i de fleste celler, målrettet mod et stort antal shRNA'er og tjener som kontroller, der definerer rækkevidden af score for negativer.
    1. For at forhindre bias mod gener, der er målrettet mod et større antal shRNA'er, skal log transformere udtømningsscorerne. Udfør en kvantil estimering ved at beregne 80. percentilen for hvert gen ud fra dets empiriske fordeling.
    2. For at generere en nulfordeling af log fold-depletion scores, antage at >95% af generne ikke vil blive udtømt, og at deres log-quantile score vil have en normalfordeling. Brug medianen af den empiriske fordeling til at estimere middelværdien af nulfordelingen. Ved hjælp af denne nulfordeling klassificeres alle gener med log-fold depletion scores, der er større end 95th percentilen af null fordelingen som 'hits'.
      BEMÆRK: Alle hits skal have mindst to shRNA'er med udtømningsscore over skæringspunktet (figur 5).
    3. For at vurdere kvaliteten af RNAi-dropout-screeningsdataene og validiteten af skæringspunktet skal du bruge et sæt gener, der er defineret som 'kerneessentielle' af COLT Cancer RNAi-screeningsinitiativet24,25 til sammenligning. Fjern CEG'er fra listen over hits for at producere den oprindelige liste over potentielle terapeutiske mål.
      BEMÆRK: Gener i COLT-sættet scorede som et hit i >50% af de 72 kræftcellelinjer, der blev screenet af COLT. Listen over essentielle kernegener indeholder 640 gener.
    4. For at identificere potentielle terapeutiske mål, der almindeligvis eller ensartet kræves af flere MPNST-cellelinjer, konstruere Venn-diagrammer over de ikke-CEG-hits, der er identificeret i skærme af forskellige MPNST-cellelinjer eller tidlige passagekulturer (figur 6A). Prioriter ikke-CEG-hits, der kræves i alle eller de fleste MPNST-linjer eller kulturer.
      1. Alternativt kan du udføre vejanalyser på ikke-CEG-hitlisten fra hver cellelinje eller tidlig passagekultur for at identificere gener, hvis produkter koder for komponenter i signalveje, der er nødvendige for tumorcelleproliferation og / eller overlevelse. Sammenlign derefter de signalveje, der er identificeret i vejanalysen af ikke-CEG'er, med de signalveje, der blev identificeret som påvirket af mutationer identificeret med WES.
        BEMÆRK: Vi finder det særligt nyttigt at identificere signalveje, der konsekvent påvirkes af mutationer identificeret i WES og sammenligne dem med de signalveje, der er identificeret som kritiske i shRNA-skærme.
    5. For at identificere lægemiddelbare mål, for hvilke terapeutiske midler allerede er tilgængelige, screenes listen over hits, der er tilbage efter fjernelse af de centrale essentielle gener, ved hjælp af Drug Gene Interaction Database (dgidb.org).
      BEMÆRK: Denne database gør det muligt at indtaste og screene en liste over gener samtidigt og giver vejledning om lægemidler, der i øjeblikket er tilgængelige for at målrette disse gener.
    6. Valider de identificerede lægemiddelbare højinteressemål først ved at slå deres genekspression ned med shRNA'er, der adskiller sig fra dem, der bruges i den oprindelige biblioteksskærm i et enkelt batchformat (ikke et biblioteksbatchformat, der netop er beskrevet). For at slå ned genekspression skal du bruge to til tre forskellige lentivirale shRNA'er. Tre til fire dage efter infektion, bestemme den effekt, som dette har på tumorcelleproliferation og overlevelse som beskrevet nedenfor.

3. Udfør cytometeranalyser af celleantal og levedygtighed i MPNST-celler udfordret med kandidatterapeutiske midler

  1. Dyrk MPNST-celler i DMEM til 80% sammenløb. Skyl cellerne med stuetemperatur Hanks' afbalancerede saltopløsning (HBSS).
    BEMÆRK: Dyrk ikke celler til sammenløb, da væksten af disse celler vil halte i et stykke tid efter genplettering.
  2. Fjern celler fra substratet ved at dække celler i 30 s til 1 min med en ikke-enzymatisk celledissociationsopløsning. Der tilsættes 5 ml DMEM pr. 1 ml dissociationsopløsning, og pipetcellerne pipetteres forsigtigt op og ned for at løsne sig fra substratet.
  3. Tæl celler ved hjælp af et hæmocytometer. Pladeceller med en tæthed på 1.200 celler pr. brønd i sortvæggede plader med 96 brønde; plade mindst tre brønde for hver lægemiddelfortynding, der vil blive testet og udføre tre biologiske replikater af disse eksperimenter.
  4. For at bestemme de indledende koncentrationer af lægemidlet, der vil blive testet, skal du gennemgå litteraturen for at vurdere, hvilke koncentrationer der har været effektive mod andre kræftcelletyper. I indledende eksperimenter testes et interval på to størrelsesordener over og to størrelsesordener under lægemiddelkoncentrationen, der anvendes med andre kræfttyper.
  5. Der fremstilles fortyndinger af lægemidlet, der skal testes, og hvert fortyndingsmiddel eller bærestof tilsættes til mindst tre replikate brønde.
  6. Vurder direkte cellenumre 1, 3, 5 og 7 dage efter tilsætning af lægemidler. Hoechst 33342 tilsættes til en slutkoncentration på 5 μg/ml og inkubationspladerne i 30 minutter ved 37 °C. Aflæs plader på et billedcytometer med høj kapacitet ved hjælp af indstillingen direkte celletal for total cellenummer med eksponeringstider på 100.000 ms.
  7. Analyser læsningerne ved hjælp af softwaren og eksporter dem til et regneark og brug passende software til statistiske analyser.
  8. Hvis der observeres statistisk signifikante reduktioner i celleantallet i lægemiddelbehandlede brønde, skal du udføre et "Live / Dead" -assay for at afgøre, om denne reduktion delvis skyldes induktion af celledød.
    1. Pladeceller i sortvæggede 96 brøndplader som beskrevet i trin 3.3.
    2. Forbered og tilføj lægemidler som beskrevet i trin 3.5.
    3. Vurder cellelevedygtighed og død 1, 3, 5 og 7 dage efter tilsætning af lægemidlet. Calcein AM tilsættes til en slutkoncentration på 1 μM og propidiumiodid til en slutkoncentration på 1 μM i hvert hul. Inkuber cellerne i 15 minutter ved 37 °C.
    4. Billedceller på et billedcytometer ved hjælp af Live + Dead-softwareindstillingen. Analyser læsningerne ved hjælp af softwaren og eksporter dem til et regneark og brug passende software til statistiske analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 5 plots viser udtømningsresultater af kerneessentielle gener (CEG'er) mærket som SAND sammenlignet med ikke-CEG'er (mærket som FALSE) i hver human cellelinje, der blev screenet. Point repræsenterer log2 af foldudtømningsscorer for individuelle gener, som er plottet over en boxplot-repræsentation af den samlede scorefordeling. Elevens t-test blev brugt til at teste for en signifikant forskel i gennemsnittet af udtømningsscore mellem de to grupper i hver cellelinje. De resulterende p-værdier er angivet i hvert panel. Bemærk, at den gennemsnitlige score for foldudtømning er betydeligt højere for CEG'erne end for ikke-CEG'erne. Dette forventes, da Core Essential Genes pr. definition konsekvent kræves for spredning og / eller overlevelse i de fleste celletyper.

Figur 6A viser et Venn-diagram over "hits" for tre menneskelige MPNST-cellelinjer. Vi finder typisk, at et stort antal gener deles mellem flere linjer; disse hits er en høj prioritet, da de repræsenterer gener, der koder for proteiner, der sandsynligvis er afgørende for spredning og / eller overlevelse af en stor delmængde af MPNST'er. Bemærk også, at der er et antal gener, der kun er hits i en cellelinje. Vi støder på dette almindeligt, og det skal ikke tages som en indikation af, at skærmene er af dårlig kvalitet. De gener, der er almindelige hits mellem flere linjer, vurderes derefter ved hjælp af Drug Gene Interaction Database for at identificere gener inden for denne delmængde, der koder for proteiner, der kan medicineres med eksisterende midler. Vi vælger derefter flere af disse og udfører en indledende validering ved at slå ekspressionen af det tilsvarende mRNA ned med shRNA'er. Da nogle shRNA'er vil have off-target-effekter, tester vi altid flere shRNA'er rettet mod det samme transkript. Figur 6B viser et repræsentativt resultat, hvor vi har transduceret MPNST-celler med en ikke-målrettet kontrol og flere shRNA'er rettet mod BCL6. Cellenumre blev derefter bestemt på forskellige tidspunkter efter transduktion. Bemærk, at flere af BCL6 shRNA'erne markant reducerede celleantallet; som vist i den ledsagende immunblot, korrelerer graden af fald i celleantal med graden af BCL6 knockdown. Figur 6C viser en repræsentativ vækstkurve for en tidlig passage P 0-GGFβ3 MPNST-kultur.

Figure 1
Figur 1: Arbejdsproces til udførelse af hele eksomsekventering af MPNST-væv eller MPNST-celler med tidlig passage. Skematisk illustrerer den generelle arbejdsgang for variantdetektion, der er til stede i tumorafledte tidlige passagekulturer. Isolere DNA fra tidlige passagekulturer (1) og indsende kvalitets-DNA til sekventeringskernen i henhold til deres indsendelsesprotokoller (2). Sekventeringskernen kontrollerer kvaliteten af det indsendte DNA og udfører alle nødvendige prøve- og genombiblioteksforberedelser. Kernefaciliteten vil give brugerne FASTQ-sekventeringsfiler med kvalitetskontrolmålinger (3). Brugere uploader FASTQ-filerne til et genomjusterings- og variantopkaldsprogram efter eget valg. (4) Annoterede varianter filtreres efter brugerdefinerede kriterier for at fjerne ikke-relevante varianter. Repræsentative data vist sammenligne resekteret human MPNST tumorprøve vs. en cellelinje afledt af tumoren26. (5) Udfør funktionel klassifikationsanalyse med PANTHER. Forkortelse: MPNST = Malignt perifer nerveskede tumor. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Workflow til udførelse af viral transduktion af shRNA-bibliotekerne til MPNST-celler og isolering af genomisk DNA fra cellerne på tidspunktet 1 og tidspunkt 2. (A) Målceller inficeres ved en lav MOI på 0,3 med stregkodede lentivirale partikler og vælges i 72 timer. Celler passeres i 5-7 populationsfordoblinger (ca. 7 dage). Cellepellets på dag 0 og dag 7 opbevares ved -80 °C til genomisk DNA-isolering. Dag 0 kaldes Tidspunkt 1 (T1), og Dag 7 kaldes Tidspunkt 2 (T2). (B) Genomisk DNA-isolering begynder med resuspension af cellepellets i resuspensionsbuffer, der derefter opdeles i to 15 ml rør. For at lette cellelyse, 10% SDS tilsættes til hvert rør og sonikeres i 25 cyklusser af 30 s on / 30 s off. Efter sonikering tilsættes phenol / chloroform til hvert rør og hvirvler kraftigt i 45-60 s. Rør centrifugeres derefter. C) En klar øvre fase pipetteres af og tilsættes til et rent glas med tilsætning af natriumacetat/isopropanol og blandes godt. Rør centrifugeres igen. Denne gang kasseres supernatanten, og pelleten løsnes med tilsætning af 70% ethanol. Kombiner de opvredne pellets i et rør og drej med maksimal hastighed i en bordcentrifuge. Supernatanten kasseres, og pelletpen resuspenderes i destilleret vand. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Workflow til forstærkning af stregkodesekvenser fra lentivirale shRNA-vektorer som forberedelse til kvantificering af stregkoder med næste generations sekventering. (A) Repræsentation af, hvordan man opsætter rør til den første indlejrede PCR-reaktion (7 rør: et til negativ kontrol, et til positiv kontrol og de resterende 4 rør til genomisk DNA. Det sidste rør fungerer som masterblandingsrøret). Efter den første PCR-reaktion kombineres de genomiske DNA-rør i et rør og blandes. B) Produkterne fra den første indlejrede PCR-reaktion tjener som skabeloner for den anden indlejrede PCR-reaktion. Efter den anden PCR kombineres genomiske DNA-rør i et rør og blandes. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Workflow til rensning af de amplificerede shRNA-stregkoder og sekventeringsstregkoder for at kvantificere deres repræsentation ved tidspunkt 1 og tidspunkt 2 . (A) Hæld en 3,5% agarosegel. Fordi volumenet af det samlede DNA overstiger grænsen for en brønd, skal du tape 4-6 tænder af en gel kamme sammen for at producere en stor brønd. Forbered PCR-produkter med 6x ilægning af farvestof, og læg den positive kontrol, negativ kontrol og samlet DNA i gelen. Efter elektroforese skal et stort bånd på ca. 250 basepar vises i den poolede DNA-bane. Brug en ren skalpel til at skære hele båndet og derefter skære i 4 gelskiver. Opløs gelstykkerne og kombiner dem derefter til to spinkolonner for at eluere DNA. Kombiner det eluerede DNA i et rør. (B) DNA'et renses gennem et andet oprensningstrin. Tilføj bindingsbuffer 2 til røret med poolet DNA, og pipette derefter på en spin-søjle. Vask membranen og eluer derefter DNA'et i destilleret vand. (C) Indsend det rensede DNA til sekventeringskernen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Repræsentative eksempler på fordelingen af kerneessentielle gener efter analyse som beskrevet i protokollen. I dette eksempel blev tre humane MPNST-cellelinjer (S462, T265 og 2XSB) celler screenet med Cellecta DECIPHER shRNA-biblioteker. For hver human MPNST-cellelinje blev der oprettet et boxplot for at sammenligne udtømningsscore på genniveau for gener på listen over Core Essential Genes (CEG; Ægte boksplot)25 til det for gener, der ikke findes på listen over CEG'er (False box plot). Individuelle datapunkter er lagdelt oven på hvert boksplot. P-værdier er fra en standard t-test, der sammenligner depleteringsscore på genniveau for CEG'er med ikke-CEG'er. Forkortelser: CEG = kerne essentielt gen; MPNST = ondartet perifer nerveskede tumor. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Validering af skærmresultater . (A) Repræsentativt Venn-diagram over overlappende hits i tre menneskelige MPNST-cellelinjer. (B) S462 humane MPNST-celler transduceret med en ikke-målrettet (NT) lentiviral vektor og lentivirus, der udtrykker fire forskellige BCL6-shRNA'er (shRNA1, shRNA2, shRNA3 og shRNA4). Celler blev transduceret med lentivirus og derefter behandlet med et selektionsmiddel (puromycin) i 3 dage. Cellenumre blev derefter vurderet i løbet af de næste syv dage. (C) Western blot-analyse, der viser proteinniveauer af BCL6 efter transduktion med NT, shRNA1, shRNA2, shRNA3 og shRNA4 lentivirus. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Pladelayout for lentiviral titering. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Indledende opsætning af første PCR-reaktioner. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 3: Fremstilling af mastermix til første PCR-reaktion. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 4: Cellecta første PCR-parametre. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 5: Indledende opsætning af anden PCR-reaktion. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 6: Cellecta anden PCR-parametre. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De detaljerede metoder, der præsenteres her, blev udviklet til at studere neoplasi i perifert nervesystem og MPNST-patogenese. Selvom vi har fundet disse metoder effektive, skal det erkendes, at der er nogle potentielle begrænsninger for de metoder, vi beskriver her. Nedenfor diskuterer vi nogle af disse begrænsninger og potentielle strategier til at overvinde dem i andre modelsystemer.

Vi har fundet ud af, at hele eksomsekventering effektivt identificerer mutationer af interesse i P 0-GGFβ3-mus. Det skal dog erkendes, at hele eksomsekvensering i sig selv har begrænsninger. For det første er heleksomsekventering ikke en effektiv tilgang til identifikation af fusionsgenprodukter. Dette skyldes, at størstedelen af kromosombrud og efterfølgende fusion overvejende involverer intergene regioner og introner, da disse regioner repræsenterer størstedelen af genomet. Vi har i stedet fundet ud af, at RNA-Seq med parrede endelæsninger identificerer fusionsgener meget mere effektivt. Der er også spørgsmålet om, hvor effektivt hele eksomsekventering identificerer relativt store områder med kromosomtab.

Selvom der er udviklet flere algoritmer til at identificere sådanne tab, er udtrykket "hel eksomsekventering" i sig selv vildledende, fordi indfangningen af eksomet selv i gode kørsler ofte savner op til 5-10% af exoniske regioner. På grund af dette supplerer vi rutinemæssigt hele eksomsekventering med andre tilgange såsom array komparativ genomisk hybridisering (aCGH). Efter at have identificeret gevinster og tab, undersøger vi generne inden for disse intervaller og sammenligner dem med de kendte drivermutationer, der er forbundet med deres menneskelige modstykker. Musens genom er imidlertid mere stabilt end det menneskelige genom27. Derfor viser musetumorer typisk ikke kromothripsis analogt med det, der ses i humane neoplasmer. Mønsteret i musetumorer er i stedet meget enklere og har tendens til hele kromosom- eller kromosomgevinster eller -tab med relativt få fokale deletioner, der har tendens til at forekomme under stærkt selektivt tryk22,23.

Der er nogle potentielle faldgruber, som vi er stødt på, når vi udfører genom-skala shRNA-skærme. Et af de mest almindelige problemer, vi støder på, er den relativt dårlige transduktion af lentivirale vektorer ind i målcellerne. Vi finder oftest, at problemet opstod ved forkert titering af de pakkede lentivirale puljer. Fordi tidlige passage musetumorcellekulturer er en begrænsende ressource, vil mange efterforskere i stedet forsøge at titere deres lentivirus ved hjælp af en anden etableret cellelinje, der er lettere tilgængelig. Problemet med denne tilgang er dog, at effektiviteten af lentiviral transduktion kan variere betydeligt fra celletype til celletype. Det er af denne grund, at vi anbefaler titering af lentivirus på de faktiske celler, der vil blive brugt i eksperimentet. Vi har også stødt på problemer med relativt lave virale titere. Dette problem afspejler oftest dårlig transfektion af 293T-celler, når der produceres den emballerede virus.

Det er muligt at opnå falske positive hits, når man udfører genom-skala shRNA-skærme. På grund af dette, når vi har identificeret de potentielt medicinerbare mål, der er mest interessante for os, validerer vi altid resultaterne af vores shRNA-skærme. Typisk vil vi bruge to forskellige tilgange til at validere højrentemål. Først slår vi ned genekspression ved hjælp af to eller flere shRNA'er, der adskiller sig fra dem, der anvendes i den indledende skærm og bestemmer den effekt, som dette har på tumorcelleproliferation og overlevelse. For det andet får vi det eller de lægemidler, der er identificeret i Drug Gene Interaction Database, og bestemmer den effekt, som dette har på tumorcelleproliferation og overlevelse. Vi bruger begge tilgange sammen, fordi vi har stødt på omstændigheder, hvor shRNA'erne virker, og stoffet ikke gør. I det mindste nogle af disse tilfælde har undersøgelse af hele eksomsekvensdatasættet vist, at det målrettede protein produceres af et gen, der har en mutation, der potentielt påvirker lægemiddel-proteininteraktioner.

De ovenfor skitserede tilgange vil give investigator et anvendeligt middel til at identificere potentielle drivermutationer, der forekommer i sjældne neoplasmer, funktionelt identificere de signalveje, der kræves for spredning og overlevelse, og prioritere mål for terapeutisk udvikling. Vi håber, at andre forskere vil finde disse tilgange nyttige til at identificere vigtige terapeutiske mål i andre humane kræftformer. Læseren skal dog være opmærksom på, at der er andre funktionelle genomiske tilgange, der kan bruges til at identificere gener involveret i tumorpatogenese og gener, der koder for potentielle terapeutiske mål. Som et eksempel er CRISPR-biblioteker tilgængelige, der kan bruges på en måde, der svarer til den, vi beskriver for shRNA-biblioteker. Funktionelle skærme kan også udføres in vivo for at identificere gener, der fremmer tumorgenese. Som et eksempel på dette er det transposonbaserede somatiske mutagenesesystem Sleeping Beauty tidligere blevet anvendt til at målrette Schwann-celler og deres forstadier, hvilket har resulteret i identifikation af flere hundrede gener, der er involveret i MPNST-patogenese28. Da disse systemer nærmer sig funktionel genomik på forskellige måder, anbefaler vi, at forskeren nøje overvejer målene for deres planlagte eksperimenter og baserer deres valg af en funktionel genomikmetode på disse mål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353 og R01 NS109655 til S.L.C.; R01 NS109655-03S1 til D.P.J.), National Cancer Institute (R01 CA122804 til S.L.C.) og forsvarsministeriet (X81XWH-09-1-0086 og W81XWH-12-1-0164 til S.L.C.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bioruptor Sonication System Diagenode  UCD-600
CASAVA 1.8.2
Cbot Illumina, San Diego, CA N/A
Celigo Image Cytometer Nexcelom N/A
Cellecta Barcode Analyzer and Deconvoluter software
Citrisolve Hybrid Decon Laboratories 5989-27-5
Corning 96-well Black Microplate Millipore Sigma CLS3603
Diagenode Bioruptor 15ml conical tubes Diagenode  C30010009
dNTP mix Clontech 639210
Eosin Y Thermo Scientific 7111
Elution buffer Qiagen  19086
Ethanol (200 Proof) Decon Laboratories 2716
Excel  Microsoft 
FWDGEX 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3’
FWDHTS 5’-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3’
GexSeqS (5’ AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3’ HPLC purified
GraphPad Prism Dotmatics
Harris Hematoxylin Fisherbrand 245-677
Illumina HiScanSQ Illumina, San Diego, CA N/A
Paraformaldehyde (4%) Thermo Scientific J19943-K2
PLUS Transfection Reagent Thermo Scientific 11514015
Polybrene Transfection Reagent Millipore Sigma TR1003G
PureLink Quick PCR Purification Kit Invitrogen K310001
Qiagen Buffer P1 Qiagen  19051
Qiagen Gel Extraction Kit Qiagen 28704
RevGEX 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’
RevHTS1 5’-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3’
Titanium Taq polymerase Clontech 639210
Trimmomatic software www.usadellab.org

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carroll, S. L. Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms. Acta Neuropathol. 123 (3), 321-348 (2012).
  2. Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L. Recent Advances in the Diagnosis and Pathogenesis of Neurofibromatosis Type 1 (NF1)-associated Peripheral Nervous System Neoplasms. Adv Anat Pathol. 25 (5), 353-368 (2018).
  3. Longo, J. F., Carroll, S. L. The RASopathies: Biology, genetics and therapeutic options. Adv Cancer Res. 153, 305-341 (2022).
  4. Birindelli, S., et al. Rb and TP53 pathway alterations in sporadic and NF1-related malignant peripheral nerve sheath tumors. Lab Invest. 81 (6), 833-844 (2001).
  5. Legius, E., et al. TP53 mutations are frequent in malignant NF1 tumors. Genes Chromosomes Cancer. 10 (4), 250-255 (1994).
  6. Menon, A. G., et al. Chromosome 17p deletions and p53 gene mutations associated with the formation of malignant neurofibrosarcomas in von Recklinghausen neurofibromatosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (14), 5435-5439 (1990).
  7. Upadhyaya, M., et al. Germline and somatic NF1 gene mutation spectrum in NF1-associated malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs). Hum Mutat. 29 (1), 74-82 (2008).
  8. Kourea, H. P., Orlow, I., Scheithauer, B. W., Cordon-Cardo, C., Woodruff, J. M. Deletions of the INK4A gene occur in malignant peripheral nerve sheath tumors but not in neurofibromas. Am J Pathol. 155 (6), 1855-1860 (1999).
  9. Nielsen, G. P., et al. Malignant transformation of neurofibromas in neurofibromatosis 1 is associated with CDKN2A/p16 inactivation. Am J Pathol. 155 (6), 1879-1884 (1999).
  10. Gregorian, C., et al. PTEN dosage is essential for neurofibroma development and malignant transformation. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (46), 19479-19484 (2009).
  11. Lee, W., et al. PRC2 is recurrently inactivated through EED or SUZ12 loss in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nat Genet. 46 (11), 1227-1232 (2014).
  12. Zhang, M., et al. Somatic mutations of SUZ12 in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nat Genet. 46 (11), 1170-1172 (2014).
  13. Varela, I., et al. Somatic structural rearrangements in genetically engineered mouse mammary tumors. Genome Biol. 11 (10), 100 (2010).
  14. Johnson, R. A., et al. Cross-species genomics matches driver mutations and cell compartments to model ependymoma. Nature. 466 (7306), 632-636 (2010).
  15. Kim, M., et al. Comparative oncogenomics identifies NEDD9 as a melanoma metastasis gene. Cell. 125 (7), 1269-1281 (2006).
  16. Zender, L., et al. Identification and validation of oncogenes in liver cancer using an integrative oncogenomic approach. Cell. 125 (7), 1253-1267 (2006).
  17. Uren, A. G., et al. Large-scale mutagenesis in p19(ARF)- and p53-deficient mice identifies cancer genes and their collaborative networks. Cell. 133 (4), 727-741 (2008).
  18. Starr, T. K., et al. A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer. Science. 323 (5922), 1747-1750 (2009).
  19. Dupuy, A. J., et al. A modified sleeping beauty transposon system that can be used to model a wide variety of human cancers in mice. Cancer Res. 69 (20), 8150-8156 (2009).
  20. Carroll, S. L. The Challenge of Cancer Genomics in Rare Nervous System Neoplasms: Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors as a Paradigm for Cross-Species Comparative Oncogenomics. Am J Pathol. 186 (3), 464-477 (2016).
  21. Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. J Neurosci. 23 (19), 7269-7280 (2003).
  22. Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. Am J Pathol. 182 (3), 646-667 (2013).
  23. Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropathol. 127 (4), 573-591 (2014).
  24. Hart, T., Brown, K. R., Sircoulomb, F., Rottapel, R., Moffat, J. Measuring error rates in genomic perturbation screens: gold standards for human functional genomics. Mol Syst Biol. 10 (7), 733 (2014).
  25. Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knockout Screens. G3. 7 (8), Bethesda. 2719-2727 (2017).
  26. Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Sci Rep. 11 (1), 5690 (2021).
  27. Maser, R. S., et al. Chromosomally unstable mouse tumours have genomic alterations similar to diverse human cancers. Nature. 447 (7147), 966-971 (2007).
  28. Rahrmann, E. P., et al. Forward genetic screen for malignant peripheral nerve sheath tumor formation identifies new genes and pathways driving tumorigenesis. Nat Genet. 45 (7), 756-766 (2013).

Tags

Genetisk profilering Screening for frafald i genomskala Terapeutiske mål Musemodeller Ondartet perifer nerveskedetumor Schwann-celler Neurofibromatose Type 1 (NF1) Bløddelssarkom Sygdomsfri overlevelsesrater Behandlingsmuligheder Vansirende kirurgi Tipifarnib Ras-signalhæmmer Erlotinib Epidermal vækstfaktor (EGFR)-hæmmer Sorafenib Vaskulær endotelvækstfaktorreceptor (VEGF)-hæmmer Trombocytafledt vækstfaktorreceptor (PDGF)-hæmmer Raf-hæmmer Funktionel genomisk screening kræftcellelinjer cytoplasmatiske signalveje målspecifikke terapier
Genetisk profilering og genom-skala dropout screening for at identificere terapeutiske mål i musemodeller af ondartet perifer nerveskede tumor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Turner-Ivey, B., Longo, J. F.,… More

Turner-Ivey, B., Longo, J. F., Jenkins, D. P., Guest, S. T., Carroll, S. L. Genetic Profiling and Genome-Scale Dropout Screening to Identify Therapeutic Targets in Mouse Models of Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor. J. Vis. Exp. (198), e65430, doi:10.3791/65430 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter