Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Genetische profilering en drop-outscreening op genoomschaal om therapeutische doelen te identificeren in muismodellen van kwaadaardige perifere zenuwschedetumoren

Published: August 25, 2023 doi: 10.3791/65430
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1,2
1Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 3Department of Computational Medicine and Bioinformatics, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

We hebben een soortoverschrijdende vergelijkende oncogenomics-benadering ontwikkeld met behulp van genomische analyses en functionele genomische screenings om therapeutische doelen te identificeren en te vergelijken in tumoren die ontstaan in genetisch gemanipuleerde muismodellen en het overeenkomstige menselijke tumortype.

Abstract

Maligne perifere zenuwschedetumoren (MPNST's) zijn afgeleid van Schwann-cellen of hun voorlopers. Bij patiënten met het tumorgevoeligheidssyndroom neurofibromatose type 1 (NF1) zijn MPNST's de meest voorkomende maligniteit en de belangrijkste doodsoorzaak. Deze zeldzame en agressieve wekedelensarcomen bieden een grimmige toekomst, met 5-jaars ziektevrije overlevingspercentages van 34-60%. Behandelingsopties voor personen met MPNST's zijn teleurstellend beperkt, waarbij ontsierende chirurgie de belangrijkste behandelingsoptie is. Veel ooit veelbelovende therapieën zoals tipifarnib, een remmer van Ras-signalering, hebben klinisch gefaald. Evenzo hebben fase II klinische onderzoeken met erlotinib, dat zich richt op de epidermale groeifactor (EFGR), en sorafenib, dat zich richt op de vasculaire endotheliale groeifactorreceptor (VEGF), van bloedplaatjes afgeleide groeifactorreceptor (PDGF) en Raf, in combinatie met standaard chemotherapie, ook geen respons opgeleverd bij patiënten.

In de afgelopen jaren zijn functionele genomische screeningsmethoden in combinatie met genetische profilering van kankercellijnen nuttig gebleken voor het identificeren van essentiële cytoplasmatische signaleringsroutes en de ontwikkeling van doelspecifieke therapieën. In het geval van zeldzame tumortypes wordt een variatie op deze benadering, bekend als cross-species comparative oncogenomics, steeds vaker gebruikt om nieuwe therapeutische doelen te identificeren. In cross-species vergelijkende oncogenomica worden genetische profilering en functionele genomica uitgevoerd in genetisch gemanipuleerde muismodellen (GEM) en de resultaten worden vervolgens gevalideerd in de zeldzame menselijke specimens en cellijnen die beschikbaar zijn.

Dit artikel beschrijft hoe kandidaat-drivergenmutaties in MPNST-cellen van mensen en muizen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van whole exome sequencing (WES). Vervolgens beschrijven we hoe shRNA-screenings op genoomschaal kunnen worden uitgevoerd om kritieke signaalroutes in muizen en menselijke MPNST-cellen te identificeren en te vergelijken en geneeskrachtige doelen in deze routes te identificeren. Deze methodologieën bieden een effectieve benadering voor het identificeren van nieuwe therapeutische doelen in een verscheidenheid aan soorten kanker bij de mens.

Introduction

Maligne perifere zenuwschedetumoren (MPNST's) zijn zeer agressieve spindelcelneoplasmata die ontstaan in verband met het tumorgevoeligheidssyndroom neurofibromatose type 1 (NF1), sporadisch in de algemene bevolking en op plaatsen van eerdere radiotherapie 1,2,3. NF1-patiënten worden geboren met een wild-type kopie van het NF1-tumorsuppressorgen en een tweede NF1-allel met een mutatie met functieverlies. Deze toestand van haplo-insufficiëntie maakt NF1-patiënten vatbaar voor een tweede mutatie met functieverlies in hun wildtype NF1-gen, dat tumorigenese veroorzaakt. Wanneer deze "second hit" NF1-mutatie optreedt in een cel in de Schwann-cellijn, is de resulterende tumor ofwel een dermaal neurofibroom dat in de huid ontstaat of een plexiform neurofibroom dat zich ontwikkelt in grote zenuwen of zenuwplexussen. Hoewel de pathologie van dermale en plexiforme neurofibromen identiek is, is hun biologische gedrag heel anders - hoewel zowel dermale als plexiforme neurofibromen goedaardig zijn, kunnen alleen plexiforme neurofibromen transformatie ondergaan en aanleiding geven tot MPNST's. Naast het verlies van neurofibromine, het Ras GTPase-activerende eiwit dat wordt gecodeerd door het NF1-gen, dragen MPNST's mutaties van meerdere andere tumorsuppressorgenen, waaronder TP53 4,5,6,7, CDKN2A 8,9 en PTEN 10, mutaties van genen die coderen voor componenten van polycomb repressief complex 2 11,12 (PRC2; de SUZ12- en EED-genen) en afwijkende expressie van receptortyrosinekinasen 1,2. Mutaties van NF1 en de andere hierboven vermelde genen zijn ook aanwezig in sporadische en door straling geïnduceerde MPNST's11,12.

Hoewel deze vooruitgang in ons begrip van de genomische afwijkingen in MPNST's van onschatbare waarde is geweest voor het begrijpen van hun pathogenese, hebben ze nog niet geleid tot de ontwikkeling van effectieve nieuwe therapieën voor MPNST's. Een belangrijke barrière die de ontwikkeling van nieuwe behandelingen belemmert, is het feit dat MPNST's zeldzame vormen van kanker zijn. Hierdoor is het moeilijk om het grote aantal patiëntenmonsters te verkrijgen dat nodig is voor wereldwijde analyses die belangrijke drivermutaties definiëren, zoals die van The Cancer Genome Atlas (TCGA). Onze ervaring is dat het jaren kan duren om zelfs maar een bescheiden aantal menselijke MPNST-exemplaren te verzamelen. Om dergelijke beperkingen te overwinnen, hebben veel onderzoekers die andere zeldzame kankertypes bestuderen, zich gewend tot het gebruik van vergelijkende oncogenomica tussen soorten om essentiële driver-genmutaties te identificeren, de essentiële cytoplasmatische signaleringsroutes in hun tumor van belang te definiëren en nieuwe therapeutische doelen te identificeren. Aangezien de signaalroutes die essentieel zijn voor het ontstaan van tumoren sterk geconserveerd zijn tussen mensen en andere gewervelde soorten, kan het toepassen van functionele genomics-benaderingen zoals shRNA-schermen op genoomschaal een effectief middel zijn om deze nieuwe drivermutaties, signaalroutes en therapeutische doelen te identificeren 13,14,15,16,17,18,19, met name bij het bestuderen van zeldzame menselijke tumortypes die beschikbaar zijn in beperkende aantallen20.

In de hier gepresenteerde methodologieën beschrijven we deze benadering voor het uitvoeren van genomische profilering in menselijke MPNST-cellijnen en vroege passage MPNST-culturen afgeleid van P 0-GGFβ3-muizen, een genetisch gemanipuleerd muismodel (GEM) waarin Schwann-celspecifieke overexpressie van de groeifactor neureguline-1 (NRG1) de pathogenese van plexiforme neurofibromen en hun daaropvolgende progressie naar MPNST'sbevordert. 22,23. De eerste stap in deze aanpak is het identificeren van kandidaat-drivergenen in P 0-GGFβ3 MPNST's, menselijke MPNST-cellijnen en chirurgisch verwijderde menselijke MPNST's. Om de signaalroutes die door deze mutaties worden beïnvloed functioneel te valideren, gebruiken we vervolgens shRNA-schermen op genoomschaal om de genen te identificeren die nodig zijn voor proliferatie en overleving in MPNST-cellijnen van mensen en muizen. Na het identificeren van de genen die nodig zijn voor proliferatie en overleving, identificeren we vervolgens de geneeskrachtige genproducten binnen de verzameling "hits" met behulp van de Drug Gene Interaction Database. We vergelijken ook de "hits" in MPNST-cellen van mensen en muizen, om te bepalen of het GEM-model en menselijke MPNST's een vergelijkbare afhankelijkheid van dezelfde genen en signaalroutes vertonen. Het identificeren van overlappingen in de genen die nodig zijn voor proliferatie en overleving en de aangetaste signaalroutes dient als een middel om het P 0-GGFβ3-muismodel op moleculair niveau te valideren. Deze benadering benadrukt ook de effectiviteit van het combineren van menselijke en muisschermen om nieuwe therapeutische doelen te identificeren, waarbij het muismodel kan dienen als aanvulling op de menselijke schermen. De waarde van deze soortoverschrijdende benadering is vooral duidelijk bij het zoeken naar therapeutische doelwitten in zeldzame tumoren, waar menselijke tumoren en cellijnen moeilijk te verkrijgen zijn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Laat voorafgaand aan de start van de onderzoeken dierprocedures en protocollen voor het omgaan met virale vectoren beoordelen en goedkeuren door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en de Institutional Biosafety Committee (IBC). De hier beschreven procedures zijn goedgekeurd door de IACUC- en IBC-raden van de Medical University of South Carolina en werden uitgevoerd door goed opgeleid personeel in overeenstemming met de NIH-gids voor verzorging en gebruik van proefdieren en de institutionele richtlijnen voor dierenverzorging van MUSC.

1. WES-Seq-analyses en identificatie van pathogene varianten

  1. Isoleer genoom-DNA uit een tumormonster of subconfluente (70%) MPNST-cellen die zijn gekweekt op een schaal van 60 mm, met behulp van standaard in de handel verkrijgbare adsorptiemethoden op basis van silicagel (raadpleeg het protocol van de fabrikant voor gedetailleerde stappen). De algemene workflow is weergegeven in figuur 1.
  2. Dien ten minste 10 μl genoom-DNA van 50 ng/μl in bij de sequentiekern, tenzij verschillende hoeveelheden of concentraties genoom-DNA zijn gespecificeerd.
    1. De kernfaciliteit fragmenteert het genomische DNA door middel van sonicatie en zuivert het vervolgens met behulp van de voorkeursmethode. Het vastleggen van exomen en het bouwen van de bibliotheek worden uitgevoerd met behulp van de gewenste exoomsequencingkit en indextags worden toegevoegd aan het versterkte vastgelegde exoom.
    2. Dien monsters in bij de sequencingkern om sequencing van het hele exoom paired-end (WES; 100 bp gesequenced vanaf elk uiteinde) uit te voeren.
    3. FASTQ-bestanden die door de kern worden gegenereerd, worden aan de onderzoeker verstrekt. Gebruik alleen FASTQ-bestanden die voldoen aan kwaliteitsstatistieken voor analyse.
  3. Lijn de FASTQ-bestanden uit en analyseer ze met behulp van in de handel verkrijgbare softwareprogramma's (bijv. DNAStar19,20, Partek21 of Varsome). Lijn de FASTQ-bestanden uit met het muisreferentiegenoom GRCm38/mm10 met behulp van de standaardinstellingen.
    OPMERKING: Met behulp van DNAStar en een MPNST-monster van een muis als voorbeeld, wordt de algemene workflow in een diagram weergegeven in Figuur 1 en hieronder kort toegelicht.
    1. Open de DNAStar-software en kies de SeqMan NGen-workflow.
    2. Kies Workflow door Variantanalyse/Resequencing en het type sequentieanalyse NGS-Based Amplicon, genenpaneel of exoom te selecteren. Klik op Volgende.
    3. Kies de gewenste referentiesequentie door Download Genome Package en het juiste referentiegenoom (d.w.z. Mus_musculus-GRCm38-dbSNP146.zip of Homo sapien-GRCh37.p13.zip) te selecteren. Als de kernfaciliteit een bedbestand heeft verstrekt, uploadt u dit hulpbestand. Klik op Volgende.
    4. Kies Input Sequences door de juiste sequencertechnologie, Illumina, te selecteren en geef aan dat de sequencing reads paired-end zijn. Selecteer vervolgens de experimentconfiguratie, multi-sample en upload de FASTQ-sequentiebestanden door Toevoegen te selecteren. Als u meerdere monsters uitvoert, wijs dan elke set met een gepaarde uiteinde aan met een uniek experiment of monsternaam Tumor, Cellijn of A18, A202... Klik op Volgende.
    5. Stel de besturingsgegevensset in als die er is. Klik op Volgende en klik nogmaals op Volgende onder Assembly-opties. Klik onder Analyseopties op de juiste modus Variantdetectie als diploïde en klik vervolgens op Volgende. Geef onder Assembly-uitvoer de bestandsopslaglocatie van het project een naam en geef deze aan; klik op Volgende. Voer de assembly uit op de lokale computer of in de cloud.
      OPMERKING: De resulterende uitlijningsbestanden kunnen worden geopend in de ArrayStar-workflow voor variantannotatie van gedetecteerde single nucleotide polymorfismen (SNP's). Deze workflow detecteert SNP's, geen winst of verlies van het aantal genkopieën. Een afzonderlijke analyse, de zogenaamde SNP-array met hoge dichtheid, detecteert wijzigingen in het aantal kopieën; Whole Exome Sequencing detecteert geen betrouwbare veranderingen in het aantal kopieën. Raadpleeg de gebruikershandleiding van het programma voor de specifieke stappen die met het uitlijnprogramma moeten worden uitgevoerd.
    6. Pas door de gebruiker gedefinieerde filters toe op de variantannotatie van gedetecteerde SNP's om bepaalde gegevens op te nemen of uit te sluiten. Om een beknopte lijst van waarschijnlijk functioneel relevante varianten te verkrijgen, past u de volgende filters toe op de variantgegevenssets in deze hiërarchie: niet onder controle (als er een normale controlesteekproef beschikbaar is), populatiefrequentie (gnomAD, ExAC, 1.000 genoomfrequenties), allelfrequentie (inclusief ≤0,001 of 0,1%), dekkingsdiepte (exclusief <10 diepte), pathogeniteit of ClinVar-klasse (omvatten: pathogeen, waarschijnlijk pathogeen; exclusief: onzeker, waarschijnlijk goedaardig, goedaardig), en indien gewenst SNP-type en coderingseffect (omvatten: niet-synoniem, missense, onzin, frameshift, in-frame, splicing).
      OPMERKING: Een bekende relevante kankergenenlijst kan ook worden toegepast op de definitieve lijst om alleen specifieke ziekterelevante genen op te halen, zie stap 1.3.7. Deze filters kunnen de lijst met variantgenen terugbrengen tot minder dan 20 genen.
      1. Gebruik de variant-allelfrequentie om SNP's met sequentiefouten uit te filteren. Homozygote en heterozygote varianten zullen respectievelijk ongeveer 100% en 50% worden vertegenwoordigd voor een zuivere niet-contaminerende celpopulatie (een gevestigde tumor-afgeleide cellijn moet een enkele populatie van isogene tumorcellen vertegenwoordigen). Pas in dit geval 100-90% en 50-40% allelfrequenties toe voor varianten als filter, waarbij alle varianten daaronder worden verwijderd. Als er ook SNP-arraygegevens met hoge dichtheid beschikbaar zijn voor dezelfde gegevensset, past u de winst of het verlies van het aantal kopieën toe op SNP's met variant-allelfrequenties die kleiner zijn dan homozygote of heterozygote verhoudingen (d.w.z. de toename van het aantal kopieën die resulteert in 2 kopieën van allel A en 1 kopie van allel B zou geschikte variant-allelfrequenties van 75%, 25% opleveren, respectievelijk).
    7. Na het identificeren van pathogene varianten met ArrayStar, exporteert en bewaart u de variantgenenlijst als een csv-, txt- of xls-bestand en vergelijkt u de genen die deze mutaties bevatten met die in het cohort van door P 0-GGFβ3 gegenereerde tumoren om overlappende en unieke gemuteerde genlijsten te bepalen. Vergelijk de gemuteerde genen met bekende gemuteerde genen die geassocieerd zijn met hun menselijke tegenhangers (d.w.z. de Bushman Lab Cancer Gene-lijst of een door de gebruiker samengestelde lijst).
      1. Optioneel moet u het geannoteerde bestand exporteren en opslaan als een VCF-bestand voordat u door de gebruiker gedefinieerde filters (1.3.6) toepast.
        OPMERKING: Dit VCF-bestand kan worden geüpload naar andere variant-effectorvoorspellingssoftware Varsome of VEP voor vergelijking als secundaire analyse. Biologische en pathway-analyse kan ook worden uitgevoerd op de gefilterde variantgenenlijsten.
    8. Voer functionele classificatie uit van de variantgenenlijst via een door de gebruiker geprefereerde database om informatie over eiwitklasse, route, routecomponent en genfamilie en ontologie te verkrijgen.
      OPMERKING: PANTHER (pantherdp.org) wordt hier als voorbeeld gebruikt.
      1. Upload een gefilterde genenlijst met gen-ID.
      2. Selecteer het organisme (Mus musculus).
      3. Selecteer analyse (Functionele classificatie weergegeven in genenlijst) en klik op biologische analyse en routeanalyse verzenden op gefilterde variantgenlijsten.

2. ShRNA-schermen op genoomschaal

OPMERKING: Er zijn verschillende shRNA- en CRISPR-bibliotheken beschikbaar die kunnen worden gebruikt voor functionele schermen op genoomschaal met tumorculturen met een lage doorgang. Hier beschrijven we het gebruik van CELLECTA DECIPHER shRNA-bibliotheken als voorbeeld. CELLECTA DECIPHER lentivirale shRNA-bibliotheken zijn geoptimaliseerd voor RNAi-genetische schermen in gepoold formaat. Elk transcript is het doelwit van ten minste 5-6 unieke shRNA's en elke lentivirale shRNA-vector bevat een unieke genetische streepjescode geflankeerd door PCR-primerplaatsen. Deze bibliotheken bestrijken de meerderheid van de genen die relevant zijn voor de ziekte van mens en muis, maar dekken niet alle genen in het genoom. Cellecta humane bibliotheek plasmide DNA-pools zijn beschikbaar in drie modules (Human Module I, II, III; richt zich op 15.377 genen), terwijl de plasmidepools van de muisbibliotheek beschikbaar zijn in twee modules (Mouse Modules I en II; richt zich op 9.145 genen). Deze bibliotheken worden gebruikt om "drop-out"-tests uit te voeren waarin gerichte genen die nodig zijn voor proliferatie en/of overleving differentieel tot expressie worden gebracht op verschillende tijdstippen na virale transductie.

  1. Lentivirale verpakking
    1. Dag 0: Bord 10 schaaltjes van 10 miljoen 293T cellen/15 cm schaaltje in 30 ml/schaaltje antibioticavrije DMEM met 10% foetaal runderserum (FBS).
    2. Dag 1: Bevestig dat de cellen de volgende dag ~80% samenvloeien en klaar zijn om te transfecteren. Meng in een conische buis van 50 ml het volgende in deze volgorde: 600 μL verpakkingsplasmidemengsel (0,5 μg/μL), 60 μL plasmide-barcodebibliotheek, 12 ml DMEM (geen serum of antibiotica) en 600 μL transfectiereagens. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Doe 900 μL transfectiereagens en 12 ml DMEM in een apart conisch buisje van 15 ml en meng door middel van vortexen. Voeg 12,9 ml van het transfectiereagens/DMEM-mengsel toe aan het DNA-mengsel en veeg om te mengen. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur zonder verder te mengen. Voeg druppelsgewijs 2,5 ml van deze mix toe aan elke schaal van 15 cm met 293T-cellen en incubeer een nacht in een weefselkweekincubator.
    4. Dag 2: Vervang de media de volgende dag door gewone groeimedia die antibiotica bevatten.
    5. Dag 3: Oogst het virus door de media te verzamelen en door een filtratie-eenheid van 0,2 μm te leiden en in conische buisjes van 15 ml te aliquoteren; bereid ook vijf aliquots van 1 ml gefilterd virus in cryovials voor gebruik bij virale titering (beschouwd als 48-uurs virus); bewaar het virus in een vriezer van -80 °C. Vervang media één voor één door 30 ml groeimedia op de platen om uitdroging van de cellen te voorkomen.
    6. Dag 4: Oogst het virus door de media te verzamelen en door een filtratie-eenheid van 0,2 μm te leiden. Aliquot-virus in conische buisjes van 15 ml. Dit wordt beschouwd als een 72-uurs virus; bewaar het virus in een vriezer van -80 °C.
  2. Titer Lentivirale Pools
    1. Voeg 65 μL kationisch polymeer (10 mg/ml) toe aan 65 ml tumorcelgroeimedia. Pipetteer 1 ml/putje van het polymeerhoudende medium in elf weefselkweekplaten met 6 putjes. Probeer tumorcellen met vroege passage te trypsiniseren en cellen te tellen met behulp van de voorkeursmethode, zodat elk putje 50.000 cellen/ml/putje ontvangt. Ontdooi 1 ml aliquots van 48 h lentivirus uit de vriezer in een waterbad van 37 °C.
    2. Bereid voor elke virale module de infectie voor zoals weergegeven in tabel 1.
    3. Plaats alle 6-wells platen in een weefselkweekincubator. Verwijder de volgende dag virale media en vul aan met verse groeimedia. Voeg na 48 uur puromycine-bevattende media toe aan alle putjes die worden geselecteerd. Voordat controlecellen samenvloeien, voert u celtellingen van overlevende klonen uit met behulp van de voorkeursmethode.
      OPMERKING: De concentratie puromycine die nodig is om niet-getransduceerde cellen te doden, moet vooraf empirisch worden bepaald door een reeks concentraties in een "kill"-curve te testen. Gebruik de laagste concentratie die op uniforme wijze de dood van niet-getransduceerde culturen induceert.
  3. Lentivirale infectie van doelcellen
    1. Probeer MPNST-cellen te trypsiniseren en tel. Plaat 2,5 miljoen cellen per schaal van 15 cm voor een totaal van twintig schalen van 15 cm per module. Ontdooi het virus en transduceer de cellen met het virus bij een MOI van 0,5 in aanwezigheid van 5 μg/ml kationisch polymeer (figuur 2A).
    2. Verwijder virusbevattende media de volgende ochtend en vervang ze door nieuwe groeimedia. Kweek cellen gedurende nog eens 2 dagen om expressie van de selectiemarker mogelijk te maken en voeg vervolgens puromycine toe aan de culturen om niet-getransduceerde cellen te elimineren.
    3. Drie dagen na de toevoeging van puromycine, trypsiniseer de cellen en centrifugeer de helft van de celpopulatie bij 200 × g gedurende 5 minuten in een tafelcentrifuge. Bewaar de gepelleteerde cellen in de vriezer van -80 °C voor toekomstige genomische DNA-bereiding; dit is het referentietijdstip, of tijdstip 1 (T1).
    4. Breng de andere helft van de celpopulatie opnieuw op plaat en laat deze ongeveer 7 populatieverdubbelingen groeien voordat u deze oogst en centrifugeert zoals hierboven. Deze celpellet zal dienen als het laatste tijdstip (tijdstip 2, T2) en wordt opgeslagen bij -80 °C voor toekomstige genomische DNA-isolatie (figuur 2).
  4. Genoom-DNA isoleren van cellen die zijn getransduceerd met viruspools
    1. Ontdooi de celpellet uit de vriezer van -80 °C en suspendeer de pellet opnieuw in 10 ml resuspensiebuffer waaraan RNAse is toegevoegd, en splits onmiddellijk in twee polymethylpenteenbuisjes van 15 ml (figuur 2B).
    2. Voeg 500 μL 10% SDS per 5 ml toe, meng en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Plaats vervolgens buisjes in een DNA-knipapparaat om het DNA te sonificeren gedurende 25 cycli van 30 s aan/30 s uit, waarbij u ervoor zorgt dat de temperatuur op 4 °C blijft.
    3. Voeg 5 ml fenol/chloroform toe, pH 8,0 (bewaard bij 4 °C) en zorg ervoor dat u het fenol/chloroform goed mengt voor gebruik. Na de toevoeging van fenol/chloroform, goed mengen door krachtig te vortexen op maximale stand gedurende 45-60 s. Centrifugeer gedurende 60 min, -20 °C bij 7.200 × g.
      OPMERKING: Een schuimig/melkachtig uiterlijk na vortexing duidt op volledige resuspensie.
    4. Breng 3 ml van de heldere bovenste fase over in een vers buisje van 15 ml en voeg 0,5 ml 3 M natriumacetaat en 4 ml isopropanol toe en meng goed (Figuur 2C). Centrifugeer gedurende 30 minuten bij 20 °C bij 7.200 × g.
    5. Gooi na het centrifugeren het supernatans weg en pipetteer vervolgens voorzichtig de resterende vloeistof. Voeg 0,5 ml 70% ethanol toe en maak de pellet los door op en neer te pipetteren. Breng de geresuspendeerde pellet over in een centrifugebuis van 1,5 ml en combineer beide pellets van hetzelfde monster in één centrifugebuis van 1,5 ml. Centrifugeer op maximale snelheid in een tafelcentrifuge gedurende 5 minuten.
    6. Gooi het supernatans weg en gebruik een laboratoriumdoekje om eventuele resterende 70% ethanol te absorberen. Resuspendeer de pellet opnieuw in 0,5 ml gedestilleerd water en zorg ervoor dat de pellet niet uitdroogt, omdat dit resuspensie bemoeilijkt. Bewaar monsters bij 4 °C voordat u de DNA-concentratie meet.
  5. Geneste PCR om shRNA-streepjescodes te versterken
    OPMERKING: Haal DNA uit de opslag en plaats het op ijs. Als de DNA-concentratie lager is dan 100 ng/μL, laat het DNA dan snel vacuüm drogen en resuspendeer het in een geschikte hoeveelheid gedestilleerd water. We raden aan om slechts één module tegelijk te verwerken (tijdstip 1 (T1) of tijdstip 2 (T2)). Voer twee voorbereidingen uit van elk tijdstip die aan het einde moeten worden samengevoegd; Daarom is het belangrijk om gerepliceerde tijdstippen niet op dezelfde dag te verwerken. Het volgende protocol is voor één tijdstip van genoom-DNA.
    1. Zet 7 buisjes op en label ze zoals beschreven: negatieve controle, positieve controle, 4 buisjes voor genoom-DNA en één voor een mastermix (Figuur 3A). De negatieve controle is gedestilleerd water; de positieve controle is het plasmide-DNA dat wordt gebruikt in de 293T-transfectie om lentivirus te genereren.
    2. Voeg eerst water toe aan elke buis zoals aangegeven in tabel 2.
    3. Bereid een Master Mix (MM) zoals weergegeven in tabel 3.
    4. Voeg 18 μL MM toe aan elke buis met water. Voeg vervolgens 25 μL genoom-DNA toe aan elk van de 4 sjabloonbuisjes. Voeg vervolgens 1 μL positieve controle (10 ng/μL) toe aan de positieve controlebuis, waarbij u ervoor zorgt dat u andere buisjes niet besmet met positieve controle-DNA. Voeg ten slotte 2 μL polymerase toe aan elk buisje, voeg eerst toe aan de 4 monsterbuisjes en als laatste aan het positieve controlebuisje; meng en draai de PCR-buisjes naar beneden (Figuur 3).
    5. Voer een PCR-reactie uit onder de in tabel 4 vermelde omstandigheden.
    6. Terwijl de eerste PCR actief is, bereidt u buisjes voor op de 2ePCR zoals aangegeven in tabel 5. Stel zeven buisjes in: negatieve controle, positieve controle, 4 buisjes voor genoom-DNA en één voor MM (Figuur 3B).
    7. Voeg 22 μL MM toe aan elk buisje met water en wacht tot de eerste PCR-ronde is afgelopen voordat u het DNA en polymerase toevoegt.
      1. Zodra de eerste PCR-ronde is voltooid, combineert u 4 monsterbuisjes tot één microcentrifugebuis en mengt u.
      2. Voeg 25 μL toe aan elk monsterbuisje met water.
      3. Voeg vervolgens 2 μL van de eerste PCR-negatieve controle en 2 μL van de eerste PCR-positieve controle toe aan de correct geëtiketteerde buisjes.
      4. Voeg 2 μL polymerase toe aan elk buisje, voeg eerst toe aan de 4 monsterbuisjes en als laatste aan de negatieve controle.
    8. Voer een PCR-reactie uit zoals vermeld in tabel 6.
      OPMERKING: Na analyse van de resultaten van de eerste PCR-reactie door elektroforese op een 3,5% agarosegel, als een overvloed aan product wordt verkregen, kan het aantal cycli worden teruggebracht tot 9-10 voor de volgende herhaling van deze procedure; Evenzo, als de productopbrengst laag is, kunnen cycli worden verhoogd tot 14.
    9. Wanneer de tweede PCR-reactie is voltooid, combineert u 4 monsters in één microcentrifugebuis plus 80 μL 6x laadkleurstof. Gebruik voor positieve en negatieve controles 20 μl van het monster.
      1. Bereid een 3,5% agarosegel in Tris-Boraat-EDTA (TBE)-buffer (Figuur 4A). Om plaats te bieden aan het grote monstervolume, maakt u één groot putje in de gelkam door meerdere putjes aan elkaar te plakken (als er geen kam beschikbaar is die bij het volume past), waarbij u ervoor zorgt dat er twee putjes beschikbaar blijven voor de positieve en negatieve controles. Laat de gel gedurende 1 uur op 90 V draaien.
    10. Visualiseer de gel en bevestig een band op ongeveer 250 basenparen (bp).
  6. Eerste zuivering: gelextractie
    1. Gebruik een schoon scalpel of scheermesje om de band van 250 bp weg te snijden en zoveel mogelijk gel af te snijden. Verdeel de grote band in 4 stukken en breng elk stuk over in een schone microcentrifugebuis. Meet en noteer het gewicht van elk plakje gel.
      OPMERKING: Elk stuk moet ongeveer 200 mg of minder per tube bevatten.
    2. Voeg 6 volumes oplosbaarheidsbuffer toe (bijv. als het gelstuk 200 mg weegt, voeg dan 1,2 ml buffer toe). Plaats de buizen in een waterbad van 50 °C en draai ze elke 10-15 min totdat de gelplakken zijn opgelost. Voeg vervolgens 1 volume isopropanol toe aan elke tube (bijv. 0,2 ml isopropanol als het gelstuk 200 mg weegt).
    3. Gebruik twee spinkolommen voor zuivering en laad de monsters van alle 4 de buizen in de kolommen. Voer meerdere centrifuges uit om al het monstervolume te verwerken, aangezien de kolommen slechts 750 μL bevatten. Draai de kolommen gedurende 1 minuut op 17.900 × g in een conventionele tafelmicrocentrifuge en gooi de doorstroom elke keer weg.
    4. Was de kolommen met 750 μL wasbuffer en centrifugeer op 17.900 × g gedurende 1 minuut. Na het wassen gooit u de doorstroming weg en droogt u de centrifugeerkolom door gedurende 3 minuten te centrifugeren bij 17.900 × g . Eluer het DNA met 50 μL gedestilleerd water per kolom en centrifugeer zoals voorheen gedurende 1 minuut en combineer beide buisjes voor een totaal volume van 100 μL van het monster.
  7. Tweede zuivering
    1. Deze volgende zuiveringsstap maakt gebruik van Binding Buffer 2 (uit de PCR Purification Kit), die geen kleine fragmenten elimineert. Voeg 400 μL buffer toe aan de 100 μL DNA en laad het op een spinkolom (Figuur 4B). Centrifugeer het monster bij 17.900 × g gedurende 1 minuut.
    2. Was vervolgens het membraan met 650 μL wasbuffer en centrifugeer zoals eerder uitgevoerd. Droog de centrifugeerkolom met extra centrifugeren zoals hierboven gedurende 3 minuten.
    3. Elueer het DNA met 30 μL gedestilleerd water en draai gedurende 1 minuut op maximale snelheid. Controleer na elutie de concentratie op een spectrofotometer; zorg ervoor dat de concentratie niet lager is dan 10 ng/μl of hoger dan 70-80 ng/μl. Bewaar het DNA in een vriezer van -20 °C.
  8. Sequentiebepaling van versterkte streepjescodes
    1. Verdun voor sequencing gezuiverde barcodes tot 0,75 ng/μL met behulp van elutiebuffer (EB). Om sequentiediversiteit toe te voegen, worden amplicons geclusterd op 17 pM, inclusief 30% (v/v) PhiX. Voer single-end (SE) clustering uit op een geautomatiseerd clustergeneratiesysteem volgens het protocol van de fabrikant.
    2. Laat de sequencingkern in totaal 36 cycli van single-end sequencing uitvoeren op een NextGen-sequencer (Figuur 4C). Voeg aangepaste primer GexSeqS toe aan de Illumina-sequencingprimers op 0,5 μM.
    3. Gebruik de analysesoftware waarnaar wordt verwezen om Fastq-bestanden te genereren en verwerk ze met behulp van software om leeslengtes in te korten tot 18 nucleotiden.
    4. Gebruik Barcode Analyzer en Deconvoluter-software om bijgesneden lezingen te deconvolueren. Bereken vouwuitputtingsscores voor elk shRNA als de verhouding tussen het aantal gelezen exemplaren op het referentietijdstip (T1) en het uiteindelijke tijdstip (T2).
  9. Analyse van shRNA-screeningresultaten en identificatie van kandidaat-therapeutische doelen
    OPMERKING: In de Cellecta shRNA-bibliotheek zijn de meeste genen het doelwit van 5 (67%) of 6 verschillende shRNA's (32%). Verschillende huishoudgenen, die in de meeste cellen zouden moeten worden geraakt, zijn echter het doelwit van grote aantallen shRNA's en dienen als controles die het bereik van scores voor negatieven bepalen.
    1. Om vooringenomenheid ten opzichte van genen die het doelwit zijn van grotere aantallen shRNA's te voorkomen, logt u de uitputtingsscores om. Voer een kwantielschatting uit door het 80e percentiel voor elk gen te berekenen op basis van de empirische verdeling.
    2. Om een nulverdeling van log fold-depletiescores te genereren, gaat u ervan uit dat >95% van de genen niet uitgeput zal raken en dat hun log-kwantielscores een normale verdeling zullen hebben. Gebruik de mediaan van de empirische verdeling om het gemiddelde van de nulverdeling te schatten. Gebruik deze nulverdeling om alle genen met log-fold depletiescores die groter zijn dan het 95e percentiel van de nulverdeling te classificeren als 'hits'.
      OPMERKING: Alle treffers moeten ten minste twee shRNA's hebben met uitputtingsscores boven het afkappunt (Figuur 5).
    3. Om de kwaliteit van de RNAi-uitvalscreeninggegevens en de validiteit van het afkappunt te beoordelen, gebruikt u ter vergelijking een set genen die door het COLT Cancer RNAi-screeningsinitiatief24,25 als 'essentieel essentieel' zijn gedefinieerd. Verwijder CEG's uit de lijst met treffers om de eerste lijst met potentiële therapeutische doelen te produceren.
      OPMERKING: Genen in de COLT-set scoorden als een hit in >50% van de 72 kankercellijnen die door COLT werden gescreend. De kernlijst met essentiële genen bevat 640 genen.
    4. Om potentiële therapeutische doelwitten te identificeren die vaak of uniform nodig zijn voor meerdere MPNST-cellijnen, construeert u Venn-diagrammen van de niet-CEG-treffers die zijn geïdentificeerd in schermen van verschillende MPNST-cellijnen of vroege passageculturen (Figuur 6A). Geef prioriteit aan niet-CEG-treffers die vereist zijn in alle of de meeste MPNST-lijnen of -culturen.
      1. U kunt ook pathway-analyses uitvoeren op de niet-CEG-hitlijst van elke cellijn of vroege passagecultuur om genen te identificeren waarvan de producten coderen voor componenten van signaalroutes die nodig zijn voor de proliferatie en/of overleving van tumorcellen. Vergelijk vervolgens de signaalroutes die zijn geïdentificeerd in de routeanalyse van niet-CEG's met de signaalroutes die zijn geïdentificeerd als beïnvloed door mutaties die zijn geïdentificeerd met WES.
        OPMERKING: We vinden het bijzonder nuttig om signaalroutes te identificeren die consequent worden beïnvloed door mutaties die zijn geïdentificeerd in WES en deze te vergelijken met de signaalroutes die als kritisch zijn geïdentificeerd in shRNA-schermen.
    5. Om geneesmiddelgeschikte doelwitten te identificeren waarvoor al therapeutische middelen beschikbaar zijn, screent u de lijst met treffers die overblijven na verwijdering van de essentiële kerngenen met behulp van de Drug Gene Interaction Database (dgidb.org).
      OPMERKING: Deze database maakt het mogelijk om een lijst met genen tegelijkertijd in te voeren en te screenen en geeft richtlijnen voor geneesmiddelen die momenteel beschikbaar zijn om deze genen aan te pakken.
    6. Valideer eerst de geïdentificeerde geneeskrachtige doelwitten met een hoog belang door hun genexpressie neer te halen met shRNA's die verschillen van die welke worden gebruikt in het initiële bibliotheekscherm in een enkel batchformaat (niet een bibliotheekbatchformaat dat zojuist is beschreven). Om genexpressie uit te schakelen, gebruikt u twee tot drie verschillende lentivirale shRNA's. Bepaal drie tot vier dagen na infectie het effect dat dit heeft op de proliferatie en overleving van tumorcellen, zoals hieronder beschreven.

3. Voer cytometertests uit van celaantallen en levensvatbaarheid in MPNST-cellen die worden uitgedaagd met kandidaat-therapeutische middelen

  1. Kweek MPNST-cellen in DMEM tot 80% confluentie. Spoel de cellen met de uitgebalanceerde zoutoplossing (HBSS) van Hanks op kamertemperatuur.
    OPMERKING: Kweek geen cellen tot samenvloeiing, aangezien de groei van deze cellen na het opnieuw uitplateren enige tijd zal achterblijven.
  2. Maak de cellen los van het substraat door de cellen gedurende 30 s tot 1 minuut te bedekken met een niet-enzymatische celdissociatieoplossing. Voeg 5 ml DMEM per 1 ml dissociatieoplossing toe en pipetteer de cellen voorzichtig op en neer om ze los te maken van het substraat.
  3. Tel cellen met behulp van een hemocytometer. Plaatcellen met een dichtheid van 1.200 cellen per putje in zwartwandige platen met 96 putjes; Plaat ten minste drie putjes voor elke geneesmiddelverdunning die zal worden getest en voer drie biologische replicaten van deze experimenten uit.
  4. Om de initiële concentraties van het te testen geneesmiddel te bepalen, moet u de literatuur raadplegen om te beoordelen welke concentraties effectief zijn geweest tegen andere soorten kankercellen. Test in de eerste experimenten een bereik van twee ordes van grootte boven en twee ordes van grootte onder de geneesmiddelconcentratie die wordt gebruikt bij andere soorten kanker.
  5. Bereid verdunningen van het te testen medicijn voor en voeg elke verdunning of vehiculum toe aan ten minste drie replicatieputjes.
  6. Beoordeel directe celaantallen 1, 3, 5 en 7 dagen na toevoeging van medicijnen. Voeg Hoechst 33342 toe tot een eindconcentratie van 5 μg/ml en incubeer de platen gedurende 30 minuten bij 37 °C. Lees platen af op een high-throughput beeldvormingscytometer met behulp van de optie voor direct celgetal voor het totale aantal cellen met een belichtingstijd van 100.000 ms.
  7. Analyseer de metingen met behulp van de software en exporteer ze naar een spreadsheet en gebruik de juiste software voor statistische analyses.
  8. Als statistisch significante verminderingen van het aantal cellen worden waargenomen in met geneesmiddelen behandelde putten, voer dan een "Levend/Dood"-test uit om te bepalen of deze vermindering gedeeltelijk te wijten is aan de inductie van celdood.
    1. Plaatcellen in zwartwandige platen met 96 putjes, zoals beschreven in stap 3.3.
    2. Bereid medicijnen voor en voeg ze toe zoals beschreven in stap 3.5.
    3. Beoordeel de levensvatbaarheid en dood van de cel 1, 3, 5 en 7 dagen na de toevoeging van het geneesmiddel. Voeg calceïne AM toe tot een eindconcentratie van 1 μM en propidiumjodide tot een eindconcentratie van 1 μM in elk putje. Incubeer de cellen gedurende 15 minuten bij 37 °C.
    4. Breng cellen in beeld op een beeldvormende cytometer met behulp van de Live+Dead-softwareoptie . Analyseer de metingen met behulp van de software en exporteer ze naar een spreadsheet en gebruik de juiste software voor statistische analyses.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 5 grafieken tonen uitputtingsscores van essentiële kerngenen (CEG's) gelabeld als WAAR in vergelijking met niet-CEG's (gelabeld als ONWAAR) in elke menselijke cellijn die werd gescreend. Punten vertegenwoordigen log2 van vouwuitputtingsscores voor individuele genen, die worden uitgezet over een boxplot-weergave van de totale scoreverdeling. De t-toets van de student werd gebruikt om te testen op een significant verschil in het gemiddelde van de uitputtingsscores tussen de twee groepen in elke cellijn. De resulterende p-waarden worden in elk paneel aangegeven. Merk op dat de gemiddelde vouwuitputtingsscores significant hoger zijn voor de CEG's dan voor de niet-CEG's. Dit is te verwachten omdat essentiële kerngenen per definitie consequent nodig zijn voor proliferatie en/of overleving in de meeste celtypen.

Figuur 6A toont een Venn-diagram van de "hits" voor drie menselijke MPNST-cellijnen. We vinden meestal dat een groot aantal genen wordt gedeeld tussen meerdere lijnen; deze treffers hebben een hoge prioriteit omdat ze genen vertegenwoordigen die coderen voor eiwitten die waarschijnlijk essentieel zijn voor de proliferatie en/of overleving van een grote subset van MPNST's. Merk ook op dat er een aantal genen zijn die in slechts één cellijn worden geraakt. We komen dit vaak tegen en het moet niet worden opgevat als een indicatie dat de schermen van slechte kwaliteit zijn. De genen die veel voorkomen tussen meerdere lijnen worden vervolgens beoordeeld met behulp van de Drug Gene Interaction Database om genen binnen deze subset te identificeren die coderen voor eiwitten die kunnen worden behandeld met bestaande middelen. Vervolgens selecteren we er een aantal en voeren we een eerste validatie uit door de expressie van het corresponderende mRNA met shRNA's neer te halen. Omdat sommige shRNA's off-target effecten hebben, testen we altijd meerdere shRNA's die zich op hetzelfde transcript richten. Figuur 6B toont een representatief resultaat waarin we MPNST-cellen hebben getransduceerd met een niet-targetingcontrole en meerdere shRNA's gericht op BCL6. Het aantal cellen werd vervolgens op verschillende tijdstippen na de transductie bepaald. Merk op dat verschillende van de BCL6-shRNA's het aantal cellen aanzienlijk verminderden; zoals aangetoond in de begeleidende immunoblot, correleert de mate van afname van het aantal cellen met de mate van BCL6-knockdown. Figuur 6C toont een representatieve groeicurve voor een vroege passage P 0-GGFβ3 MPNST-cultuur.

Figure 1
Figuur 1: Workflow voor het uitvoeren van volledige exoomsequencing van MPNST-weefsel of MPNST-cellen met vroege passage. Schematisch illustreert de algemene workflow van variantdetectie die aanwezig is in tumor-afgeleide vroege passageculturen. Isoleer DNA van vroege passageculturen (1) en dien kwaliteits-DNA in bij de sequentiekern volgens hun indieningsprotocollen (2). De sequencingkern controleert de kwaliteit van het ingediende DNA en voert alle noodzakelijke monster- en genoombibliotheekvoorbereidingen uit. De kernfaciliteit zal gebruikers voorzien van FASTQ-sequencingbestanden met kwaliteitscontrolestatistieken (3). Gebruikers uploaden de FASTQ-bestanden naar een genoomuitlijnings- en variantbellerprogramma naar keuze. (4) Geannoteerde varianten worden gefilterd op door de gebruiker gedefinieerde criteria om niet-relevante varianten te verwijderen. Getoonde representatieve gegevens vergelijken gereseceerd humaan MPNST-tumormonster met een cellijn afgeleid van de tumor26. (5) Voer een functionele classificatieanalyse uit met PANTHER. Afkorting: MPNST = Maligne perifere zenuwschedetumor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Workflow voor het uitvoeren van virale transductie van de shRNA-bibliotheken in MPNST-cellen en het isoleren van genoom-DNA uit de cellen op tijdstip 1 en tijdstip 2. (A) Doelcellen worden bij een laag MOI van 0,3 geïnfecteerd met lentivirale deeltjes met streepjescode en gedurende 72 uur geselecteerd. Cellen worden gepasseerd gedurende 5-7 populatieverdubbelingen (ongeveer 7 dagen). Celpellets op dag 0 en dag 7 worden opgeslagen bij -80 °C voor genomische DNA-isolatie. Dag 0 wordt aangeduid als Tijdstip 1 (T1) en Dag 7 wordt Tijdstip 2 (T2) genoemd. (B) Genomische DNA-isolatie begint met resuspensie van celpellets in resuspensiebuffer die vervolgens worden gesplitst in twee buisjes van 15 ml. Om cellyse te vergemakkelijken, wordt 10% SDS aan elke buis toegevoegd en gesoniceerd gedurende 25 cycli van 30 s aan/30 s uit. Na sonicatie wordt fenol/chloroform aan elke buis toegevoegd en gedurende 45-60 s krachtig gewerveld. Vervolgens worden de buizen gecentrifugeerd. (C) Een heldere bovenste fase wordt afgepipetteerd en toegevoegd aan een schone buis met toevoeging van natriumacetaat/isopropanol en goed gemengd. Buizen worden opnieuw gecentrifugeerd. Deze keer wordt het supernatans weggegooid en wordt de pellet losgemaakt met toevoeging van 70% ethanol. Combineer de geresuspendeerde pellets in één buis en draai ze op maximale snelheid in een tafelcentrifuge. Gooi het supernatans weg en repareer de pellet in gedestilleerd water. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Workflow voor het amplificeren van barcodesequenties van lentivirale shRNA-vectoren ter voorbereiding op de kwantificering van barcodes met sequencing van de volgende generatie. (A) Weergave van hoe buisjes moeten worden ingesteld voor de eerste geneste PCR-reactie (7 buisjes: één voor negatieve controle, één voor positieve controle en de overige 4 buisjes voor genoom-DNA. De laatste buis zal dienen als de hoofdmixbuis). Na de eerste PCR-reactie combineert u de genomische DNA-buisjes in één buisje en mengt u. (B) De producten van de eerste geneste PCR-reactie zullen dienen als sjablonen voor de tweede geneste PCR-reactie. Combineer na de tweede PCR genomische DNA-buisjes in één buisje en meng. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Workflow voor het zuiveren van de geamplificeerde shRNA-barcodes en het sequencen van barcodes om hun representatie op tijdstip 1 en tijdstip 2 te kwantificeren . (A) Giet een 3,5% agarosegel. Omdat het volume van het gepoolde DNA de limiet voor één putje overschrijdt, plakt u 4-6 tanden van een gelkam aan elkaar om één groot putje te produceren. Bereid PCR-producten voor met 6x laadkleurstof en laad de positieve controle, negatieve controle en gepoold DNA in de gel. Na elektroforese zou een grote band van ongeveer 250 basenparen in de gepoolde DNA-baan moeten verschijnen. Snijd met een schoon scalpel de hele band weg en snijd deze vervolgens in 4 gelplakjes. Los de gelstukjes op en combineer ze vervolgens tot twee spinkolommen om DNA te elueren. Combineer het geëlueerde DNA in één buisje. (B) Het DNA wordt gezuiverd door middel van een tweede zuiveringsstap. Voeg bindingsbuffer 2 toe aan de buis met gepoold DNA en pipetteer vervolgens op een spinkolom. Was het membraan en elueer vervolgens het DNA in gedestilleerd water. (C) Dien het gezuiverde DNA in bij de sequentiekern. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Representatieve voorbeelden van de verdeling van Core Essential Genes na analyse zoals beschreven in het protocol. In dit voorbeeld werden drie menselijke MPNST-cellijnen (S462, T265 en 2XSB) cellen gescreend met Cellecta DECIPHER shRNA-bibliotheken. Voor elke menselijke MPNST-cellijn werd een boxplot gemaakt om depletiescores op genniveau te vergelijken voor genen in de lijst met Core Essential Genes (CEG; True box plot)25 aan die van genen die niet voorkomen in de lijst van CEG's (False box plot). Individuele datapunten worden bovenop elke boxplot gelaagd. P-waarden zijn afkomstig van een standaard t-test die de uitputtingsscores op genniveau van CEG's vergelijkt met niet-CEG's. Afkortingen: CEG = core essential gene; MPNST = kwaadaardige perifere zenuwschedetumor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Validatie van de schermresultaten . (A) Representatief Venndiagram van overlappende treffers in drie menselijke MPNST-cellijnen. (B) S462 menselijke MPNST-cellen getransduceerd met een niet-gerichte (NT) lentivirale vector en lentivirus die vier verschillende BCL6-shRNA's tot expressie brengen (shRNA1, shRNA2, shRNA3 en shRNA4). Cellen werden getransduceerd met lentivirus en vervolgens gedurende 3 dagen behandeld met een selectiemiddel (puromycine). Het aantal cellen werd vervolgens in de loop van de volgende zeven dagen beoordeeld. (C) Western blot-analyse die eiwitniveaus van BCL6 aantoont na transductie met NT, shRNA1, shRNA2, shRNA3 en shRNA4 lentivirus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Plaatlay-out voor lentivirale titering. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Initiële opzet van de eerste PCR-reacties. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: Bereiding van het mastermengsel voor de eerste PCR-reactie. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 4: Cellecta eerste PCR-parameters. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 5: Initiële instelling van de tweede PCR-reactie. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 6: Cellecta tweede PCR-parameters. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De gedetailleerde methoden die hier worden gepresenteerd, zijn ontwikkeld om neoplasie van het perifere zenuwstelsel en MPNST-pathogenese te bestuderen. Hoewel we hebben vastgesteld dat deze methoden effectief zijn, moet worden erkend dat er enkele potentiële beperkingen zijn aan de methoden die we hier beschrijven. Hieronder bespreken we enkele van die beperkingen en mogelijke strategieën om ze in andere modelsystemen te overwinnen.

We hebben ontdekt dat sequencing van het hele exoom effectief mutaties identificeert die van belang zijn in P 0-GGFβ3-muizen. Er moet echter worden erkend dat de hele exoomsequencing zelf beperkingen heeft. Ten eerste is sequencing van het hele exoom geen effectieve benadering voor het identificeren van fusiegenproducten. Dit komt omdat bij de meeste chromosomale breuken en daaropvolgende fusie voornamelijk intergene regio's en introns betrokken zijn, aangezien die regio's het grootste deel van het genoom vertegenwoordigen. In plaats daarvan hebben we ontdekt dat RNA-Seq met gepaarde uitlezingen veel effectiever fusiegenen identificeert. Er is ook de vraag hoe effectief sequencing van het hele exoom relatief grote regio's van chromosomaal verlies identificeert.

Hoewel er verschillende algoritmen zijn ontwikkeld voor het identificeren van dergelijke verliezen, is de term "whole exome sequencing" zelf misleidend omdat het vastleggen van het exoom, zelfs in goede runs, vaak tot 5-10% van de exonische regio's mist. Daarom vullen we routinematig de sequencing van het hele exoom aan met andere benaderingen, zoals array vergelijkende genomische hybridisatie (aCGH). Na het identificeren van winsten en verliezen, onderzoeken we de genen binnen deze intervallen en vergelijken we ze met de bekende drivermutaties die geassocieerd zijn met hun menselijke tegenhangers. Het muizengenoom is echter stabieler dan het menselijk genoom27. Bijgevolg vertonen muizentumoren meestal geen chromothripsis analoog aan wat wordt gezien bij menselijke neoplasmata. Het patroon in muizentumoren is in plaats daarvan veel eenvoudiger, neigend naar winst of verlies van het hele chromosoom of chromosoom met relatief weinig focale deleties die de neiging hebben om op te treden onder sterke selectieve druk22,23.

Er zijn enkele potentiële valkuilen die we zijn tegengekomen bij het uitvoeren van shRNA-screenings op genoomschaal. Een van de meest voorkomende problemen die we tegenkomen is de relatief slechte transductie van de lentivirale vectoren in de doelcellen. We merken meestal dat het probleem is ontstaan door onjuiste titering van de verpakte lentivirale pools. Omdat tumorcelculturen van muizen in een vroege passage een beperkende hulpbron zijn, zullen veel onderzoekers in plaats daarvan proberen hun lentivirus te titeren met behulp van een andere gevestigde cellijn die gemakkelijker beschikbaar is. Het probleem met deze aanpak is echter dat de efficiëntie van lentivirale transductie aanzienlijk kan variëren van celtype tot celtype. Het is om deze reden dat we aanbevelen om lentivirus te titeren op de eigenlijke cellen die in het experiment zullen worden gebruikt. We hebben ook problemen ondervonden met relatief lage virale titers. Dat probleem weerspiegelt meestal een slechte transfectie van 293T-cellen bij het produceren van het verpakte virus.

Het is mogelijk om vals-positieve treffers te verkrijgen bij het uitvoeren van shRNA-screenings op genoomschaal. Daarom valideren we, zodra we de potentieel geneeskrachtige doelen hebben geïdentificeerd die voor ons het meest interessant zijn, altijd de resultaten van onze shRNA-schermen. Doorgaans gebruiken we twee verschillende benaderingen om doelen met een hoge rente te valideren. Ten eerste schakelen we genexpressie uit met behulp van twee of meer shRNA's die verschillen van die welke in de eerste screening worden gebruikt en bepalen we het effect dat dit heeft op de proliferatie en overleving van tumorcellen. Ten tweede verkrijgen we het (de) geneesmiddel(en) geïdentificeerd in de Drug Gene Interaction Database en bepalen we het effect dat dit heeft op de proliferatie en overleving van tumorcellen. We gebruiken beide benaderingen samen omdat we omstandigheden zijn tegengekomen waarin de shRNA's werken en het medicijn niet. In ten minste enkele van die gevallen heeft onderzoek van de hele exoomsequentiedataset aangetoond dat het beoogde eiwit wordt geproduceerd door een gen dat een mutatie heeft die mogelijk van invloed is op geneesmiddel-eiwitinteracties.

De hierboven geschetste benaderingen zullen de onderzoeker een toepasbare manier bieden om potentiële drivermutaties te identificeren die optreden in zeldzame neoplasmata, functioneel de signaalroutes te identificeren die nodig zijn voor proliferatie en overleving, en prioriteit te geven aan doelen voor therapeutische ontwikkeling. We hopen dat andere onderzoekers deze benaderingen nuttig zullen vinden voor het identificeren van belangrijke therapeutische doelen bij andere menselijke kankers. De lezer moet zich er echter van bewust zijn dat er andere functionele genomische benaderingen zijn die kunnen worden gebruikt om genen te identificeren die betrokken zijn bij de pathogenese van tumoren en genen die coderen voor potentiële therapeutische doelen. Er zijn bijvoorbeeld CRISPR-bibliotheken beschikbaar die kunnen worden gebruikt op een manier die analoog is aan die we beschrijven voor shRNA-bibliotheken. Functionele screenings kunnen ook in vivo worden uitgevoerd om genen te identificeren die tumorigenese bevorderen. Als voorbeeld hiervan is het op transposon gebaseerde somatische mutagenesesysteem van Doornroosje eerder gebruikt om Schwann-cellen en hun voorlopers aan te vallen, wat resulteerde in de identificatie van enkele honderden genen die betrokken zijn bij de pathogenese van MPNST28. Aangezien deze systemen functionele genomica op verschillende manieren benaderen, raden we de onderzoeker aan om de doelen van hun geplande experimenten zorgvuldig te overwegen en hun selectie van een functionele genomics-methodologie op die doelen te baseren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353 en R01 NS109655 aan S.L.C.; R01 NS109655-03S1 aan D.P.J.), het National Cancer Institute (R01 CA122804 aan S.L.C.), en het Ministerie van Defensie (X81XWH-09-1-0086 en W81XWH-12-1-0164 aan S.L.C.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bioruptor Sonication System Diagenode  UCD-600
CASAVA 1.8.2
Cbot Illumina, San Diego, CA N/A
Celigo Image Cytometer Nexcelom N/A
Cellecta Barcode Analyzer and Deconvoluter software
Citrisolve Hybrid Decon Laboratories 5989-27-5
Corning 96-well Black Microplate Millipore Sigma CLS3603
Diagenode Bioruptor 15ml conical tubes Diagenode  C30010009
dNTP mix Clontech 639210
Eosin Y Thermo Scientific 7111
Elution buffer Qiagen  19086
Ethanol (200 Proof) Decon Laboratories 2716
Excel  Microsoft 
FWDGEX 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3’
FWDHTS 5’-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3’
GexSeqS (5’ AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3’ HPLC purified
GraphPad Prism Dotmatics
Harris Hematoxylin Fisherbrand 245-677
Illumina HiScanSQ Illumina, San Diego, CA N/A
Paraformaldehyde (4%) Thermo Scientific J19943-K2
PLUS Transfection Reagent Thermo Scientific 11514015
Polybrene Transfection Reagent Millipore Sigma TR1003G
PureLink Quick PCR Purification Kit Invitrogen K310001
Qiagen Buffer P1 Qiagen  19051
Qiagen Gel Extraction Kit Qiagen 28704
RevGEX 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’
RevHTS1 5’-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3’
Titanium Taq polymerase Clontech 639210
Trimmomatic software www.usadellab.org

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carroll, S. L. Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms. Acta Neuropathol. 123 (3), 321-348 (2012).
  2. Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L. Recent Advances in the Diagnosis and Pathogenesis of Neurofibromatosis Type 1 (NF1)-associated Peripheral Nervous System Neoplasms. Adv Anat Pathol. 25 (5), 353-368 (2018).
  3. Longo, J. F., Carroll, S. L. The RASopathies: Biology, genetics and therapeutic options. Adv Cancer Res. 153, 305-341 (2022).
  4. Birindelli, S., et al. Rb and TP53 pathway alterations in sporadic and NF1-related malignant peripheral nerve sheath tumors. Lab Invest. 81 (6), 833-844 (2001).
  5. Legius, E., et al. TP53 mutations are frequent in malignant NF1 tumors. Genes Chromosomes Cancer. 10 (4), 250-255 (1994).
  6. Menon, A. G., et al. Chromosome 17p deletions and p53 gene mutations associated with the formation of malignant neurofibrosarcomas in von Recklinghausen neurofibromatosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (14), 5435-5439 (1990).
  7. Upadhyaya, M., et al. Germline and somatic NF1 gene mutation spectrum in NF1-associated malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs). Hum Mutat. 29 (1), 74-82 (2008).
  8. Kourea, H. P., Orlow, I., Scheithauer, B. W., Cordon-Cardo, C., Woodruff, J. M. Deletions of the INK4A gene occur in malignant peripheral nerve sheath tumors but not in neurofibromas. Am J Pathol. 155 (6), 1855-1860 (1999).
  9. Nielsen, G. P., et al. Malignant transformation of neurofibromas in neurofibromatosis 1 is associated with CDKN2A/p16 inactivation. Am J Pathol. 155 (6), 1879-1884 (1999).
  10. Gregorian, C., et al. PTEN dosage is essential for neurofibroma development and malignant transformation. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (46), 19479-19484 (2009).
  11. Lee, W., et al. PRC2 is recurrently inactivated through EED or SUZ12 loss in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nat Genet. 46 (11), 1227-1232 (2014).
  12. Zhang, M., et al. Somatic mutations of SUZ12 in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nat Genet. 46 (11), 1170-1172 (2014).
  13. Varela, I., et al. Somatic structural rearrangements in genetically engineered mouse mammary tumors. Genome Biol. 11 (10), 100 (2010).
  14. Johnson, R. A., et al. Cross-species genomics matches driver mutations and cell compartments to model ependymoma. Nature. 466 (7306), 632-636 (2010).
  15. Kim, M., et al. Comparative oncogenomics identifies NEDD9 as a melanoma metastasis gene. Cell. 125 (7), 1269-1281 (2006).
  16. Zender, L., et al. Identification and validation of oncogenes in liver cancer using an integrative oncogenomic approach. Cell. 125 (7), 1253-1267 (2006).
  17. Uren, A. G., et al. Large-scale mutagenesis in p19(ARF)- and p53-deficient mice identifies cancer genes and their collaborative networks. Cell. 133 (4), 727-741 (2008).
  18. Starr, T. K., et al. A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer. Science. 323 (5922), 1747-1750 (2009).
  19. Dupuy, A. J., et al. A modified sleeping beauty transposon system that can be used to model a wide variety of human cancers in mice. Cancer Res. 69 (20), 8150-8156 (2009).
  20. Carroll, S. L. The Challenge of Cancer Genomics in Rare Nervous System Neoplasms: Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors as a Paradigm for Cross-Species Comparative Oncogenomics. Am J Pathol. 186 (3), 464-477 (2016).
  21. Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. J Neurosci. 23 (19), 7269-7280 (2003).
  22. Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. Am J Pathol. 182 (3), 646-667 (2013).
  23. Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropathol. 127 (4), 573-591 (2014).
  24. Hart, T., Brown, K. R., Sircoulomb, F., Rottapel, R., Moffat, J. Measuring error rates in genomic perturbation screens: gold standards for human functional genomics. Mol Syst Biol. 10 (7), 733 (2014).
  25. Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knockout Screens. G3. 7 (8), Bethesda. 2719-2727 (2017).
  26. Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Sci Rep. 11 (1), 5690 (2021).
  27. Maser, R. S., et al. Chromosomally unstable mouse tumours have genomic alterations similar to diverse human cancers. Nature. 447 (7147), 966-971 (2007).
  28. Rahrmann, E. P., et al. Forward genetic screen for malignant peripheral nerve sheath tumor formation identifies new genes and pathways driving tumorigenesis. Nat Genet. 45 (7), 756-766 (2013).

Tags

Genetische profilering Uitvalscreening op genoomschaal Therapeutische doelen Muismodellen Kwaadaardige perifere zenuwschedetumor Schwann-cellen Neurofibromatose Type 1 (NF1) Wekedelensarcoom Ziektevrije overlevingspercentages Behandelingsopties Ontsierende chirurgie Tipifarnib Ras-signaleringsremmer Erlotinib Epidermale groeifactor (EGFR)-remmer Sorafenib Vasculaire endotheliale groeifactorreceptor (VEGF)-remmer Bloedplaatjes-afgeleide groeifactorreceptor (PDGF)-remmer Raf-remmer Functionele genomische screening kankercellijnen cytoplasmatische signaleringsroutes doelspecifieke therapieën
Genetische profilering en drop-outscreening op genoomschaal om therapeutische doelen te identificeren in muismodellen van kwaadaardige perifere zenuwschedetumoren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Turner-Ivey, B., Longo, J. F.,… More

Turner-Ivey, B., Longo, J. F., Jenkins, D. P., Guest, S. T., Carroll, S. L. Genetic Profiling and Genome-Scale Dropout Screening to Identify Therapeutic Targets in Mouse Models of Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor. J. Vis. Exp. (198), e65430, doi:10.3791/65430 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter