Summary
यह प्रोटोकॉल पार्किंसंस रोग के अल्फा-सिंक्यूक्लिन आधारित ड्रोसोफिला मॉडल में कब्ज मॉडलिंग के लिए एक परख प्रस्तुत करता है।
Abstract
पार्किंसंस रोग (पीडी) में गैर-मोटर लक्षण आम हैं, इलाज करना मुश्किल है, और जीवन की गुणवत्ता को काफी कम करता है। एक प्रचलित गैर-मोटर लक्षण कब्ज है, जो पीडी के निदान से पहले वर्षों या दशकों तक हो सकता है। पीडी के पशु मॉडल में कब्ज का पता नहीं लगाया गया है और विशिष्ट उपचारों का अभाव है। यह परख पीडी के ड्रोसोफिला मॉडल का उपयोग करता है जिसमें मानव अल्फा-सिंक्यूक्लिन को पैन-न्यूरोनल ड्राइवर के तहत व्यक्त किया जाता है। अल्फा-सिंक्यूक्लिन व्यक्त करने वाली मक्खियाँ पीडी की पहचान विशेषताओं को विकसित करती हैं: डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स, मोटर हानि और अल्फा-सिंक्यूक्लिन समावेशन का नुकसान।
यह प्रोटोकॉल इन मक्खियों में कब्ज का अध्ययन करने के लिए एक विधि की रूपरेखा तैयार करता है। मक्खियों को रात भर नीले रंग के योज्य के साथ मक्खी के भोजन पर रखा जाता है और फिर अगले दिन मानक भोजन में स्थानांतरित कर दिया जाता है। बाद में उन्हें 8 घंटे के लिए हर घंटे मानक मक्खी भोजन के साथ नई शीशियों में ले जाया जाता है। प्रत्येक हस्तांतरण से पहले, शीशी की दीवार पर कुल फेकल स्पॉट की तुलना में नीले रंग के फेकल स्पॉट का प्रतिशत गणना की जाती है। नियंत्रण मक्खियों कि अल्फा-सिंक्यूक्लिन की कमी अल्फा-सिंक्यूक्लिन व्यक्त मक्खियों से पहले सभी नीले डाई घंटे निष्कासित कर दिया. इसके अतिरिक्त, आंत से नीले रंग के भोजन के पारित होने की निगरानी सरल फोटोग्राफी के साथ की जा सकती है। इस परख की सादगी ड्रोसोफिला में कब्ज के संशोधक की पहचान करने के लिए आगे आनुवंशिक या रासायनिक स्क्रीन में इसके उपयोग को सक्षम बनाती है।
Introduction
पार्किंसंस रोग (पीडी) एक प्रगतिशील न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार है जो नैदानिक रूप से ब्रैडीकिनेसिया, कठोरता और कंपकंपी जैसे मोटर लक्षणों की उपस्थिति से विशेषता है, जिसके परिणामस्वरूप महत्वपूर्ण रुग्णता1. पैथोलॉजिकल रूप से, पीडी को पर्याप्त नाइग्रा में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के नुकसान और अल्फा-सिंक्यूक्लिन के मिसफोल्डिंग से परिभाषित किया जाता है, जिससे लेवी निकायों और लेवी न्यूराइट्स का निर्माण होता है। पीडी के रोगजनन खराब समझा रहता है, संभावना आनुवंशिक और पर्यावरणीय कारकों 2,3 की एक जटिल परस्पर क्रिया से उत्पन्न होती है. वर्तमान में, रोग-संशोधित उपचार अनुपलब्ध हैं, संभवतः निदान के समय मौजूद पैथोलॉजी के उन्नत चरण के कारण। अध्ययनों से पता चला है कि पर्याप्त नाइग्रा में 60% से अधिक डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स पहले से ही मोटर लक्षणों की शुरुआत से खो चुके हैं, प्रारंभिक रोग का पता लगाने के लिए संभावित बायोमार्कर का पता लगाने की आवश्यकता को रेखांकित करते हैं4. ऐसा ही एक नैदानिक बायोमार्कर कब्ज है, जो पीडी रोगियोंमें आम है 5,6 और साल या यहां तक कि दशकों से मोटर लक्षण शुरुआत से पहले हो सकता है।
मोटर लक्षणों के आधार पर पीडी की नैदानिक परिभाषा के बावजूद, कब्ज कई गैर-मोटर लक्षणों में से एक है जो रोगसूचक रूप से इलाज करने के लिए अधिक चुनौतीपूर्ण हैं और रोगियोंके जीवन की गुणवत्ता में महत्वपूर्ण हानि का कारण बनते हैं। आंत-मस्तिष्क अक्ष में परिवर्तन, जो मस्तिष्क और एंटरिक तंत्रिका तंत्र के बीच द्विदिश संचार का प्रतिनिधित्व करता है, को पीडी रोगजनन में फंसाया गया है। अल्फा-सिंक्यूक्लिन समुच्चय पीडी रोगियों8 के जठरांत्र संबंधी मार्ग से ऊतक के नमूनों में पाए गए हैं, और पशु मॉडल का सुझाव है कि आंत्र तंत्रिका तंत्र में अल्फा-सिंक्यूक्लिन समुच्चय केंद्रीयतंत्रिका तंत्र 9 के लिए प्रियन की तरह तरीके से फैलता है। इसके साथ ही, पीडी रोगियों आंत माइक्रोबायोम10 में असामान्यताएं प्रदर्शित और अत्यधिक आंतसूजन 11 अनुभव हो सकता है. पीडी में कब्ज का अध्ययन किया गया है, मक्खियों 12,13 या कृन्तकों 14,15 में पार्किंसंस से जुड़े कब्ज के कुछ रिपोर्ट किए गए मॉडल के साथ।
यह परख पीडी के ड्रोसोफिला मॉडल को नियोजित करता है जिसमें मक्खियों ने पैन-न्यूरोनल ड्राइवर, एन-सिनैप्टोब्रेविन के नियंत्रण में मानव अल्फा-सिंक्यूक्लिन जीन को व्यक्त किया। इन मक्खियों पीडी के सभी बानगी सुविधाओं का प्रदर्शन, अल्फा सिंक्यूक्लिन एकत्रीकरण, मोटर शिथिलता, और उम्र से संबंधित neurodegeneration, डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स16,17 के नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप. पिछले अध्ययनों ने मक्खियों में फेकल आउटपुट के माप को आंत की शिथिलता का आकलन करने, फ्लाई फेकल पदार्थ की मात्रा निर्धारित करने और पाचन तंत्र 18,19,20में कार्यात्मक अंतर प्रकट करने के लिए विभिन्न आनुवंशिक रेखाओं में मलमूत्र मात्रा की तुलना करने के लिए पेश किया है। यहां, हम मानव अल्फा-सिंक्यूक्लिन को व्यक्त करने वाली मक्खियों का उपयोग करके कब्ज परख का प्रदर्शन करते हैं। यह सरल लेकिन मूल्यवान उपकरण पीडी के एक महत्वपूर्ण गैर-मोटर लक्षण के अध्ययन को सक्षम बनाता है।
Protocol
इस परख में प्रयुक्त मक्खियों: नियंत्रण: nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+; अल्फा-सिंक्यूक्लिन मक्खियों: nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-अल्फा-सिंक्यूक्लिन/+; 1- और 10 दिनों के बाद संलग्नक; नर और मादा (संभोग और असंमेय) मक्खियों ( सामग्री की तालिकादेखें)।
1. रंगे मक्खी भोजन तैयार करना
- 1: 1 अनुपात (वी / वी) में आसुत जल के साथ नीले नरम जेल पेस्ट खाद्य रंग (सामग्री की तालिकादेखें) मिलाएं।
नोट: वाणिज्यिक खाद्य रंग है कि केवल गैर शोषक रंजक होते हैं का उपयोग करें, के रूप में कुछ नीले रंग न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव21 दिखाया गया है . - 10-15 एस अंतराल में मानक कॉर्नमील-अगर ( सामग्री की तालिकादेखें) से युक्त मक्खी के भोजन की शीशियों को माइक्रोवेव करें जब तक कि भोजन तरल या घोल में पिघल न जाए। खाने को उबलने न दें।
- शीशियों के बीच एक समान रंग प्राप्त करने के लिए भोजन की प्रत्येक शीशी में डाई मिश्रण जोड़ें। डाई मिश्रण में तब तक मिलाएं जब तक कि भोजन समरूप रूप से नीला न हो जाए (चित्र 1)। नीले रंग के मिश्रण की एक मात्रा जोड़ें ताकि भोजन का रंग संतृप्त हो, और शीशियों के बीच रंग में कोई भिन्नता न हो।
नोट: यह कदम माइक्रोवेव करने के तुरंत बाद किया जाना चाहिए, क्योंकि भोजन जल्दी से जम जाता है। यदि भोजन जम जाता है, तो शीशी को फिर से माइक्रोवेव करें। - रंगे हुए भोजन की शीशियों को हवा में सूखने के लिए छोड़ दें जब तक कि यह जम न जाए। शीशी में उतरने से किसी भी आवारा मक्खियों को रोकने के लिए सूखने के दौरान शीशी के उद्घाटन पर एक पतली कागज तौलिया रखें।
- एक बार जब भोजन ठंडा और जम जाता है, तो मक्खियों को स्थानांतरित करें जिनका उपयोग नीले भोजन के परीक्षण के लिए किया जाएगा।
नोट: संकीर्ण शीशियों (25 मिमी) के लिए, यह अनुशंसित है कि 9-14 मक्खियों प्रत्येक शीशी में जोड़ा जाता है। चौड़ी शीशियों (28.5 मिमी) के लिए, यह सिफारिश की है कि 10-20 मक्खियों प्रत्येक शीशी के लिए जोड़ रहे हैं. मक्खियों को सेक्स या संभोग के अनुभव से अलग नहीं किया जाता है और इसमें नर और मादा मक्खियों की मिश्रित आबादी शामिल होती है, जिसमें संभोग और असंमेय दोनों मादाएं होती हैं। - एक इनक्यूबेटर में 25 डिग्री सेल्सियस पर रात भर मक्खियों के साथ शीशियों सेते हैं.
2. मक्खियों इमेजिंग
नोट: यह चरण वैकल्पिक है (चित्र 2)।
- अगली सुबह (समय 0), 60 एस के लिए कार्बन डाइऑक्साइड के साथ प्रतिनिधि मक्खियों को एनेस्थेटाइज करें। मक्खी प्लेस इतना है कि उदर पक्ष ऊपर की ओर का सामना करना पड़ रहा है.
- एक कैमरे का उपयोग करना ( सामग्री की तालिकादेखें), पाचन तंत्र में छोड़े गए नीले भोजन की मात्रा की कल्पना करने के लिए प्रत्येक घंटे में मक्खियों की छवियों को कैप्चर करें।
नोट: इन मक्खियों परख (चरण 3) के मात्रात्मक भाग के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए, के रूप में संज्ञाहरण परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं. - हर घंटे में, एनेस्थेटाइज़ करें और नई मक्खियों की छवि बनाएं।
3. कब्ज परख करना
- शेष (गैर-एनेस्थेटाइज्ड) मक्खियों को मानक ड्रोसोफिला भोजन के साथ शीशियों में स्थानांतरित करें। प्रत्येक शीशी को नंबर दें।
- 60 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में मक्खियों छोड़ दें.
- 60 मिनट के बाद, मानक ड्रोसोफिला भोजन के साथ नई शीशियों के लिए मक्खियों हस्तांतरण. शीशियों के पहले सेट से डेटा रिकॉर्डिंग शुरू करें।
- शीशी की लंबाई के नीचे एक बिंदीदार रेखा खींचें ताकि उस बिंदु को चिह्नित किया जा सके जहां से गिनती शुरू होगी।
- मैन्युअल रूप से प्रत्येक शीशी की दीवार पर छोटे, गोल डॉट्स की संख्या गिनती. भोजन या शीशी प्लग पर पाए जाने वाले बिंदुओं की गिनती न करें।
- प्रत्येक शीशी की दीवार पर नीले डॉट्स की संख्या की गिनती से शुरू करें।
- प्रत्येक शीशी की दीवार पर अपारदर्शी, रंगहीन डॉट्स की संख्या की गणना करें।
नोट: प्रत्येक बिंदु मक्खी मलमूत्र है, जो मूत्र और फेकल पदार्थ22 का एक संयोजन है। कभी-कभी, एक मक्खी मलमूत्र पर चल सकती है और एक निशान छोड़ सकती है, इस मामले में, केवल मूल बिंदु की गणना करें, न कि निशान में प्रत्येक व्यक्तिगत निशान। - प्रत्येक शीशी के लिए डॉट्स की कुल संख्या के लिए नीले डॉट्स के अनुपात रिकॉर्ड.
नोट: डॉट्स की कुल संख्या एक शीशी की दीवार पर रंगहीन डॉट्स की संख्या में जोड़ा एक शीशी की दीवार पर नीले डॉट्स की संख्या है। इसका उपयोग प्रति घंटे नीले फेकल पदार्थ के प्रतिशत की गणना करने के लिए किया जाएगा। - दोहराएँ कदम 3.2-3.8 सात बार अधिक, 8 घंटे की कुल भर में हर घंटे डेटा एकत्र.
4. डेटा विश्लेषण
- प्रत्येक स्थिति के लिए प्रति घंटे प्रतिशत नीले फेकल पदार्थ को ग्राफ करें।
- शर्तों के बीच डेटा की तुलना करें।
नोट: सांख्यिकीय महत्व 3 तरीकों से निर्धारित किया जा सकता है: शर्तों के बीच अलग-अलग समय बिंदुओं की तुलना करके, समय के साथ रेखा के ढलान को मापकर, या वक्र के नीचे के क्षेत्र की तुलना करके।
Representative Results
क्योंकि ड्रोसोफिला पेट पारदर्शी है, नीले भोजन को जीवित एनेस्थेटाइज्ड मक्खियों में आंत के अंदर देखा जा सकता है। आंत पारगमन में गुणात्मक अंतर विभिन्न समय बिंदुओं पर मक्खियों की छवियों लेने के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. नियंत्रण मक्खियों में, नीला भोजन जल्दी से निष्कासित हो जाता है, जबकि अल्फा-सिंक्यूक्लिन मक्खियों में, नीला भोजन आंत में 8 घंटे तक मौजूद रहता है (चित्र 2)।
अल्फा-सिंक्यूक्लिन मक्खियों उम्र से संबंधित न्यूरोडीजेनेरेशन प्रदर्शित करती है, जिसमें एक मजबूत फेनोटाइप 10 दिनों के बाद10 दिनों तक विकसित होता है। इस समय बिंदु पर, नियंत्रण मक्खियों की तुलना में आंत पारगमन समय में अंतर स्थितियों के बीच अलग-अलग समय बिंदुओं की तुलना करके, समय के साथ लाइन के ढलान को मापकर, या वक्र (चित्रा 3) के तहत क्षेत्र की तुलना करके देखा जाता है। नियंत्रण और अल्फा-सिंक्यूक्लिन मक्खियों के बीच पहले के समय बिंदु पर आंत पारगमन में कोई अंतर नहीं देखा जाता है, दिन 1 पोस्ट-इक्लोजन, जब मोटर डिसफंक्शन और न्यूरोडीजेनेरेशन भी अभी तक मौजूद नहीं हैं (चित्रा 4)।
चित्रा 1: नीले भोजन की शीशियों और फेकल धब्बे। (ए) सभी शीशियों नीले रंग का भोजन होते हैं. इस समय, मक्खियों को सिर्फ नीले भोजन के लिए पेश किया गया है, और कोई नीला फेकल पदार्थ दिखाई नहीं देता है। (बी) w1118 मक्खियों के बाद एक शीशी को 1 घंटे के लिए ताजा भोजन में स्थानांतरित किया गया है, फिर हटा दिया गया है। बाएं इनसेट को (सी) में बड़ा किया गया है, और दाएं इनसेट को (डी) में बड़ा किया गया है। (सी) मक्खी के भोजन की उपस्थिति के कारण विश्लेषण से बाहर रखा गया क्षेत्र। (डी) फेकल स्पॉट का बड़ा दृश्य, नीले (काले तीर) और गैर-नीले धब्बे (पीले तीर) का संकेत देता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: समय के साथ रंगे भोजन के आंत पारगमन का दृश्य। न्यूरॉन्स में मानव अल्फा-सिंक्यूक्लिन को व्यक्त करने वाली नियंत्रण मक्खियों और मक्खियों को रात भर नीले-रंगे भोजन पर छोड़ दिया गया और फिर अगले दिन मानक मीडिया में स्थानांतरित कर दिया गया। मक्खियों को हर घंटे नए मानक फ्लाई फूड में क्रमिक रूप से स्थानांतरित किया गया था। स्थानांतरण के बाद शून्य और 2, 4, 6 और 8 घंटे के समय प्रतिनिधि छवियां दिखाई जाती हैं। नियंत्रण और अल्फा-सिंक्यूक्लिन मक्खियों शून्य समय पर आंत में नीले भोजन के समान पैच दिखाते हैं। बाद के समय में, नियंत्रण मक्खियों में अल्फा-सिंक्यूक्लिन मक्खियों की तुलना में कम नीला भोजन होता है, और सभी नीले भोजन नियंत्रण मक्खियों में 8 घंटे के समय बिंदु पर चले जाते हैं। प्रत्येक फ्लाई लाइन के लिए जीनोटाइप इस प्रकार हैं: नियंत्रण (nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); अल्फा-सिंक्यूक्लिन मक्खियों (nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-अल्फा-सिंक्यूक्लिन/+)। मादा मक्खियों उनके बड़े आकार की वजह से पेट कल्पना करने के लिए उनकी आसान क्षमता के कारण इमेजिंग के लिए उपयोग किया जाता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: दिन 10 पोस्ट-इक्लोशन मक्खियों में कब्ज परख करता है। न्यूरॉन्स में मानव अल्फा-सिंक्यूक्लिन को व्यक्त करने वाली नियंत्रण मक्खियों और मक्खियों को रात भर नीले रंग के भोजन पर छोड़ दिया गया और फिर अगले दिन मानक मक्खी भोजन में स्थानांतरित कर दिया गया। मक्खियों को हर घंटे नए मानक मीडिया में क्रमिक रूप से स्थानांतरित किया गया था। (ए) प्रति घंटे प्रतिशत नीला फेकल पदार्थ। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं। एन = 6 शीशियों प्रति जीनोटाइप; प्रत्येक शीशी में 9-14 मक्खियाँ होती हैं। सभी सांख्यिकीय विश्लेषण ग्राफपैड प्रिज्म में किए गए थे ( सामग्री की तालिकादेखें)। प्रत्येक टाइमपॉइंट पर सांख्यिकीय महत्व की गणना दो-तरफा एनोवा का उपयोग करके की गई थी। रेखा के ढलान और ढलानों के बीच अंतर की गणना रैखिक प्रतिगमन विश्लेषण का उपयोग करके की गई थी। (बी) प्रत्येक जीनोटाइप के लिए वक्र के तहत क्षेत्र की गणना की गई थी। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं। प्रत्येक फ्लाई लाइन के लिए जीनोटाइप इस प्रकार हैं: नियंत्रण (nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); अल्फा-सिंक्यूक्लिन मक्खियों (nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-अल्फा-सिंक्यूक्लिन/+)। नर और मादा दोनों मक्खियों को लगभग समान संख्या में शामिल किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: दिन 1 पोस्ट-इक्लोशन मक्खियों में कब्ज परख करता है। न्यूरॉन्स में मानव अल्फा-सिंक्यूक्लिन को व्यक्त करने वाली नियंत्रण मक्खियों और मक्खियों को रात भर नीले-रंगे भोजन पर छोड़ दिया गया और फिर अगले दिन मानक मीडिया में स्थानांतरित कर दिया गया। मक्खियों को हर घंटे नए मानक फ्लाई फूड में क्रमिक रूप से स्थानांतरित किया गया था। (ए) प्रति घंटे प्रतिशत नीला फेकल पदार्थ। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं। एन = जीनोटाइप प्रति न्यूनतम 5 शीशियों; प्रत्येक शीशी में 9-14 मक्खियाँ होती हैं। सभी सांख्यिकीय विश्लेषण ग्राफपैड प्रिज्म में किए गए थे। प्रत्येक टाइमपॉइंट पर सांख्यिकीय महत्व की गणना दो-तरफा एनोवा का उपयोग करके की गई थी। रेखा के ढलान और ढलानों के बीच अंतर की गणना रैखिक प्रतिगमन विश्लेषण का उपयोग करके की गई थी। (बी) प्रत्येक जीनोटाइप के लिए वक्र के तहत क्षेत्र की गणना की गई थी। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं। प्रत्येक फ्लाई लाइन के लिए जीनोटाइप इस प्रकार हैं: नियंत्रण (nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); अल्फा-सिंक्यूक्लिन मक्खियों (nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-अल्फा-सिंक्यूक्लिन/+)। नर और मादा दोनों मक्खियों को लगभग समान संख्या में शामिल किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Discussion
इस प्रोटोकॉल में कई कदम हैं जो परख के सफल समापन में सहायता करेंगे। सबसे पहले, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक शीशी के लिए प्रत्येक दौर के बीच समय अंतराल प्रयोग भर में सुसंगत हैं. संख्याओं के साथ शीशियों को लेबल करने से समय की बचत, लंबे जीनोटाइप विवरण की आवश्यकता से बचने में मदद मिलेगी। इसके अतिरिक्त, यह महत्वपूर्ण है कि फेकल पदार्थ22 की गिनती के लिए विधि प्रयोग भर में सुसंगत रहता है. जबकि नीला फेकल पदार्थ भोजन और शीशी प्लग पर दिखाई देता है, रंगहीन फेकल पदार्थ नहीं होता है। इसलिए, भोजन या शीशी प्लग पर नीले बिंदुओं की गिनती न करें।
व्यवहार परख के साथ, परख को प्रभावित करने वाले मक्खी के व्यवहार या अज्ञात चर में उतार-चढ़ाव के कारण परिणामों में विसंगतियों की संभावना हमेशा होती है। हम सभी प्रयोगों के लिए एक ही ड्रोसोफिला मीडिया, एक ही खाद्य डाई और शीशियों के एक ही ब्रांड का उपयोग करने की सलाह देते हैं। दिलचस्प बात यह है कि कई परीक्षणों में, यह देखा गया कि मक्खियों की दोपहर में कम बार शौच करती हैं, संभवतः मक्खियों के सर्कैडियन लय23 के कारण। हालांकि, यह व्यवहार अल्फा-सिंक्यूक्लिन को व्यक्त करने वाली नियंत्रण मक्खियों और मक्खियों दोनों में सुसंगत है, इसलिए इसे चिंताओं को नहीं उठाना चाहिए।
यदि मक्खियों परख की शुरुआत में नीले फेकल पदार्थ का उत्सर्जन नहीं करते हैं, तो संभव है कि इस्तेमाल की जाने वाली डाई पर्याप्त रंजित न हो। इस मामले में, कोई तदनुसार आसुत जल के लिए डाई के अनुपात को बढ़ा सकता है। यह भी संभव है कि जब मक्खी के पाचन तंत्र में केवल थोड़ी मात्रा में नीला भोजन बचा हो, तो यह निर्धारित करना मुश्किल हो सकता है कि फेकल पदार्थ हल्का नीला या रंगहीन है या नहीं। जब ऐसा होता है, तो शीशी के पीछे कागज की एक सफेद शीट रखने से फेकल डॉट के रंग को निर्धारित करने में मदद मिलेगी। यहां तक कि अगर फेकल पदार्थ बहुत हल्का नीला है, तो इसे रंगहीन फेकल पदार्थ के बजाय नीले फेकल पदार्थ के रूप में रिकॉर्ड करना सबसे अच्छा है।
इस परख की एक सीमा यह है कि यह fecal धब्बे की मैनुअल गिनती की आवश्यकता है. उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग की क्षमता में सुधार करने के लिए, इस प्रोटोकॉल को भविष्य में संशोधित किया जा सकता है ताकि बहु-अच्छी प्लेटों में व्यक्तिगत मक्खियों द्वारा उत्पादित नीले फेकल स्पॉट के स्वचालित परिमाणीकरण की अनुमति मिल सके। एक और सीमा यह है कि, हालांकि अल्फा-सिंक्यूक्लिन मॉडल में पीडी के एक प्रोड्रोमल मॉडल में विकसित होने की क्षमता है, एक इष्टतम समय बिंदु जिस पर न्यूरोडीजेनेरेशन के बिना कब्ज मौजूद है, अभी तक पहचाना नहीं गया है।
सारांश में, यह विधि पीडी के ड्रोसोफिला मॉडल में कब्ज, एक गैर-मोटर पीडी लक्षण, मॉडलिंग के लिए एक सरल, सीधा दृष्टिकोण प्रदान करती है।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
हम ड्रोसोफिला लाइनों को व्यक्त करने वाले नियंत्रण और अल्फा-सिंक्यूक्लिन के प्रकार के उपहार के लिए ब्रिघम और महिला अस्पताल और हार्वर्ड मेडिकल स्कूल में डॉ मेल फेनी को स्वीकार करते हैं। हम डॉ. ऑलसेन को अनुदान सहायता के निम्नलिखित स्रोतों को स्वीकार करते हैं: NINDS K08, अमेरिकन पार्किंसंस डिजीज एसोसिएशन जॉर्ज सी. कोटज़ियास फैलोशिप, डिपार्टमेंट ऑफ़ डिफेंस पार्किंसंस डिजीज अर्ली इन्वेस्टिगेटर अवार्ड।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1400 g sucrose | MP Biomedicals | 904713 | |
| 1800 g dextrose | MP Biomedicals | 901521 | |
| 2884 g yeast | MP Biomedicals | 903312 | |
| 428 g agar | Fisher Scientific | 10253156 | |
| 4600 mL molasses | Grandma's Molasses | 7971942 | |
| 68 L water | N/A | N/A | |
| 680 mL tegosept mix (1200 g tegosept in 6 L ethanol) | |||
| 6864 g cornmeal | Pearl Milling | 125045 | |
| 800 mL acid mix (83 mL phosphoric acid in 1 L water + 836 mL propionic acid in 1 L water) | |||
| cellSens Standard software | Olympus | N/A | |
| Ethanol | Pharmco-Aper | 111ACS200 | |
| Flugs for wide plastic vials | Genesee Scientific | 49-101 | |
| Flystuff wide Drosophila vials, polystyrene | Genesee Scientific | 32-117 | |
| Graphpad Prism | GraphPad | N/A | Version 9.5.1 |
| Olympus DP23 camera | Olympus | N/A | |
| Olympus SZX12 Stereo Microscope | Olympus | N/A | |
| Phosphoric Acid | Fisher Scientific | S25470A | |
| Propionic Acid | Fisher Scientific | A258 - 500 | |
| Soft gel paste food color, Royal blue | AmeriColor | 202 | |
| Tegosept | Apex | 20-258 | |
| Drosophila Stocks | |||
| nSyb-QF2, nSyb-Gal4 | All lines provided by Dr. Mel Feany | N/A | Lines are available directly from Dr. Feany |
| nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha synuclein | N/A | ||
| w1118 | N/A |
References
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