Summary
Denne protokol præsenterer et assay til modellering af forstoppelse i en alfa-synucleinbaseret Drosophila-model af Parkinsons sygdom.
Abstract
Ikke-motoriske symptomer i Parkinsons sygdom (PD) er almindelige, vanskelige at behandle og forringer livskvaliteten betydeligt. Et udbredt ikke-motorisk symptom er forstoppelse, som kan gå forud for diagnosen PD med år eller endda årtier. Forstoppelse er blevet underudforsket i dyremodeller af PD og mangler specifikke terapier. Dette assay anvender en Drosophila-model af PD, hvor humant alfa-synuclein udtrykkes under en pan-neuronal driver. Fluer, der udtrykker alfa-synuclein, udvikler kendetegnende træk ved PD: tabet af dopaminerge neuroner, motorisk svækkelse og alfa-synucleinindeslutninger.
Denne protokol skitserer en metode til at studere forstoppelse i disse fluer. Fluer placeres på fluemad med et blåt farvetilsætningsstof natten over og overføres derefter til standardfoder den følgende dag. De flyttes efterfølgende til nye hætteglas med standard fluefoder hver time i 8 timer. Før hver overførsel beregnes procentdelen af blåfarvede fækale pletter sammenlignet med de samlede fækale pletter på hætteglasvæggen. Kontrolfluer, der mangler alfa-synuclein, udviser alt det blå farvestof timer før fluer, der udtrykker alfa-synuclein. Derudover kan passagen af blåfarvet mad fra tarmen overvåges med simpel fotografering. Enkelheden af dette assay gør det muligt at anvende det i fremadrettede genetiske eller kemiske skærme til at identificere modifikatorer af forstoppelse i Drosophila.
Introduction
Parkinsons sygdom (PD) er en progressiv neurodegenerativ lidelse karakteriseret klinisk ved tilstedeværelsen af motoriske symptomer såsom bradykinesi, stivhed og tremor, hvilket resulterer i signifikant sygelighed1. Patologisk defineres PD ved tabet af dopaminerge neuroner i substantia nigra og misfoldning af alfa-synuclein, hvilket fører til dannelsen af Lewy-kroppe og Lewy-neuritter. Patogenesen af PD er stadig dårligt forstået, sandsynligvis som følge af et komplekst samspil mellem genetiske og miljømæssige faktorer 2,3. I øjeblikket er sygdomsmodificerende terapier ikke tilgængelige, muligvis delvis på grund af det avancerede stadium af patologi, der er til stede på diagnosetidspunktet. Undersøgelser har vist, at mere end 60% af dopaminerge neuroner i substantia nigra allerede er gået tabt ved begyndelsen af motoriske symptomer, hvilket understreger behovet for at udforske potentielle biomarkører til tidlig sygdomspåvisning4. En sådan klinisk biomarkør er forstoppelse, som er almindelig hos PD-patienter 5,6 og kan gå forud for motorisk symptomdebut med år eller endda årtier.
På trods af PD's kliniske definition baseret på motoriske symptomer er forstoppelse et af flere ikke-motoriske symptomer, der er mere udfordrende at behandle symptomatisk og forårsager betydelig forringelse af patienternes livskvalitet7. Ændringer i tarm-hjerneaksen, som repræsenterer tovejskommunikation mellem hjernen og det enteriske nervesystem, har været impliceret i PD-patogenese. Alfa-synucleinaggregater er fundet i vævsprøver fra mave-tarmkanalen hos PD-patienter8, og dyremodeller tyder på, at alfa-synucleinaggregater i det enteriske nervesystem spredes på en prionlignende måde til centralnervesystemet9. Derudover udviser PD-patienter abnormiteter i tarmmikrobiomet10 og kan opleve overdreven tarmbetændelse11. Forstoppelse i PD er blevet underundersøgt, med få rapporterede modeller af Parkinsons-associeret forstoppelse hos fluer 12,13eller gnavere14,15.
Dette assay anvender en Drosophila-model af PD, hvor fluer udtrykker det humane alfa-synuclein-gen under kontrol af en pan-neuronal driver, n-synaptobrevin. Disse fluer udviser alle kendetegnende træk ved PD, herunder alfa-synucleinaggregering, motorisk dysfunktion og aldersrelateret neurodegeneration, hvilket resulterer i tab af dopaminerge neuroner16,17. Tidligere undersøgelser har introduceret måling af fækal produktion i fluer for at vurdere tarmdysfunktion, kvantificering af fluefækalt stof og sammenligning af udskillelsesmængder på tværs af forskellige genetiske linjer for at afsløre funktionelle forskelle i fordøjelsessystemet 18,19,20. Her demonstrerer vi forstoppelsesanalysen ved hjælp af fluer, der udtrykker humant alfa-synuclein. Dette enkle, men værdifulde værktøj muliggør undersøgelse af et vigtigt ikke-motorisk symptom på PD.
Protocol
Fluer anvendt i dette assay: kontrol: nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+; alfa-synuclein flyver: nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alfa-synuclein / +; 1- og 10-dages efter lukning han- og hunfluer (parrede og uparrede) fluer (se materialetabel).
1. Tilberedning af den farvede fluemad
- Bland blå blød gelpasta madfarve (se materialetabel) med destilleret vand i forholdet 1: 1 (v / v).
BEMÆRK: Brug kommerciel madfarve, der kun indeholder ikke-absorberbare farvestoffer, da nogle blå farvestoffer har vist sig at have neuroprotektive virkninger21. - Mikrobølge hætteglassene med fluemad bestående af standard majsmel-agar (se materialetabel) i intervaller på 10-15 s, indtil maden er smeltet til en væske eller gylle. Lad ikke mad koge over.
- Tilsæt farvestofblandingen til hvert hætteglas med mad for at opnå en ensartet farve mellem hætteglassene. Bland farvestofblandingen i, indtil fødevaren er homogent blå (figur 1). Tilsæt en mængde af den blå farvestofblanding, således at fødevarens farve er mættet, og der er ingen variation i farve mellem hætteglassene.
BEMÆRK: Dette trin skal udføres kort efter mikrobølgeovn, da maden størkner hurtigt. Hvis maden størkner, mikrobølges hætteglasset igen. - Lad hætteglassene med farvet mad lufttørre, indtil det størkner. Læg et tyndt køkkenrulle over hætteglassets åbninger, mens du tørrer for at forhindre, at omstrejfende fluer lander i hætteglasset.
- Når maden er afkølet og størknet, overføres de fluer, der skal bruges til testning, til den blå mad.
BEMÆRK: For smalle hætteglas (25 mm) anbefales det, at der tilsættes 9-14 fluer til hvert hætteglas. For brede hætteglas (28,5 mm) anbefales det, at der tilsættes 10-20 fluer til hvert hætteglas. Fluer er ikke adskilt efter køn eller parringserfaring og omfatter en blandet population af han- og hunfluer med både parrede og uparrede hunner. - Hætteglassene inkuberes med fluer natten over ved 25 °C i en inkubator.
2. Billeddannelse af fluerne
BEMÆRK: Dette trin er valgfrit (figur 2).
- Den følgende morgen (tid 0) bedøves repræsentanten fluer med kuldioxid i 60 s. Placer fluen, så den ventrale side vender opad.
- Brug et kamera (se Materialetabel) til at tage billeder af fluerne hver time for at visualisere mængden af blå mad, der er tilbage i fordøjelsessystemet.
BEMÆRK: Disse fluer bør ikke bruges til den kvantitative del af analysen (trin 3), da anæstesi kan påvirke resultaterne. - På hver time bedøve og billede nye fluer.
3. Udførelse af forstoppelsesanalysen
- Overfør de resterende (ikke-bedøvede) fluer til hætteglas med standard Drosophila-mad . Nummerer hvert hætteglas.
- Lad fluerne blive i inkubatoren ved 25 °C i 60 min.
- Efter 60 minutter overføres fluerne til nye hætteglas med standard Drosophila-foder . Start dataregistrering fra det første sæt hætteglas.
- Tegn en stiplet linje ned langs hætteglassets længde for at markere det punkt, hvorfra tællingen starter.
- Tæl manuelt antallet af små, runde prikker på væggen i hvert hætteglas. Tæl ikke prikker, der findes på mad- eller hætteglasproppen.
- Begynd med at tælle antallet af blå prikker på væggen i hvert hætteglas.
- Tæl antallet af uigennemsigtige, farveløse prikker på væggen i hvert hætteglas.
BEMÆRK: Hver prik er flueekskrementer, som er en kombination af urin og fækalt stof22. Lejlighedsvis kan en flue gå over ekskrementer og efterlade et spor, i hvilket tilfælde kun tælle den oprindelige prik, ikke hvert enkelt mærke i stien. - Registrer forholdet mellem blå prikker og det samlede antal prikker for hvert hætteglas.
BEMÆRK: Det samlede antal prikker er antallet af blå prikker på væggen i et hætteglas tilføjet til antallet af farveløse prikker på væggen i det samme hætteglas. Dette vil blive brugt til at beregne procentdelen af blåt fækalt stof pr. Time. - Gentag trin 3.2-3.8 syv gange mere, og indsaml data hver time i alt 8 timer.
4. Analyse af data
- Graf procentdelen blå fækalt stof i timen for hver tilstand.
- Sammenlign dataene mellem betingelser.
BEMÆRK: Statistisk signifikans kan bestemmes på 3 måder: ved at sammenligne individuelle tidspunkter mellem forhold, ved at måle linjens hældning over tid eller ved at sammenligne arealet under kurven.
Representative Results
Fordi Drosophila maven er gennemsigtig, kan blå mad visualiseres inde i tarmen i levende bedøvede fluer. Kvalitative forskelle i tarmtransit kan vurderes ved at tage billeder af fluerne på forskellige tidspunkter. I kontrolfluer udvises den blå mad hurtigt, mens den blå mad hos alfa-synucleinfluer forbliver til stede i tarmen i så længe som 8 timer (figur 2).
Alfa-synucleinfluerne viser aldersrelateret neurodegeneration, med en robust fænotype, der udvikler sig 10 dage efter eclosion10. På dette tidspunkt ses forskelle i tarmtransittid sammenlignet med kontrolfluer ved at sammenligne individuelle tidspunkter mellem forhold, ved at måle linjens hældning over tid eller ved at sammenligne arealet under kurven (figur 3). Der observeres ingen forskelle i tarmtransit mellem kontrol- og alfa-synucleinfluer på et tidligere tidspunkt, dag 1 efter eclosion, når motorisk dysfunktion og neurodegeneration heller ikke er til stede (figur 4).
Figur 1: Blå madhætteglas og fækale pletter. (A) Alle hætteglas indeholder blåfarvet mad. På dette tidspunkt er fluer netop blevet introduceret til den blå mad, og der er ikke noget blåt fækalt stof synligt. (B) Et hætteglas efter w1118-fluer er blevet overført til friske fødevarer i 1 time og derefter fjernet. Den venstre indsats er forstørret i (C), og den højre indsats er forstørret i (D). C) Et område, der er udelukket fra analysen på grund af forekomst af fluefoder. (D) Forstørret billede af fækale pletter, der angiver blå (sorte pile) og ikke-blå pletter (gule pile). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Visualisering af tarmtransit af den farvede mad over tid. Kontrolfluer og fluer, der udtrykker humant alfa-synuclein i neuroner, blev efterladt på blåfarvet mad natten over og derefter overført til standardmedier den næste dag. Fluer blev serielt overført til ny standard fluemad hver time. Repræsentative billeder på tidspunktet nul og 2, 4, 6 og 8 timer efter overførsel vises. Kontrol- og alfa-synucleinfluer viser lignende pletter af blå mad i tarmen på tidspunktet nul. På efterfølgende tidspunkter har kontrolfluer mindre blå mad end alfa-synucleinfluer, og al blå mad er væk på 8 timers tidspunktet i kontrolfluer. Genotyperne for hver flueline er som følger: kontrol (nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); alfa-synuclein fluer (nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alfa-synuclein / +). Kvindelige fluer bruges til billeddannelse på grund af deres lettere evne til at visualisere maven på grund af deres større størrelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Forstoppelsesanalyse på dag 10 fluer efter eclosion. Kontrolfluer og fluer, der udtrykker humant alfa-synuclein i neuroner, blev efterladt på blåfarvet mad natten over og derefter overført til standard fluemad den næste dag. Fluer blev serielt overført til nye standardmedier hver time. (A) Procent blåt fækalt stof pr. Time. Fejlbjælker repræsenterer standardafvigelse. N = 6 hætteglas pr. genotype; Hvert hætteglas indeholdt 9-14 fluer. Alle statistiske analyser blev udført i Graphpad Prisme (se Materialetabel). Statistisk signifikans på hvert tidspunkt blev beregnet ved hjælp af tovejs ANOVA. Linjens hældning og forskellen mellem skråninger blev beregnet ved hjælp af den lineære regressionsanalyse. (B) Arealet under kurven for hver genotype blev beregnet. Fejlbjælker repræsenterer standardafvigelse. Genotyperne for hver flueline er som følger: kontrol (nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); alfa-synuclein fluer (nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alfa-synuclein / +). Både han- og hunfluer indgår i nogenlunde lige mange fluer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Forstoppelsesanalyse i dag 1 fluer efter eclosion. Kontrolfluer og fluer, der udtrykker humant alfa-synuclein i neuroner, blev efterladt på blåfarvet mad natten over og derefter overført til standardmedier den næste dag. Fluer blev serielt overført til ny standard fluemad hver time. (A) Procent blåt fækalt stof pr. Time. Fejlbjælker repræsenterer standardafvigelse. N = mindst 5 hætteglas pr. genotype Hvert hætteglas indeholdt 9-14 fluer. Alle statistiske analyser blev udført i Graphpad Prisme. Statistisk signifikans på hvert tidspunkt blev beregnet ved hjælp af tovejs ANOVA. Linjens hældning og forskellen mellem skråninger blev beregnet ved hjælp af den lineære regressionsanalyse. (B) Arealet under kurven for hver genotype blev beregnet. Fejlbjælker repræsenterer standardafvigelse. Genotyperne for hver flueline er som følger: kontrol (nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); alfa-synuclein fluer (nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alfa-synuclein / +). Både han- og hunfluer indgår i nogenlunde lige mange fluer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Der er flere trin i denne protokol, der vil hjælpe med en vellykket gennemførelse af analysen. For det første er det vigtigt at sikre, at tidsintervallerne mellem hver runde for hvert hætteglas er konsistente gennem hele eksperimentet. Mærkning af hætteglassene med tal hjælper med at undgå behovet for lange genotypebeskrivelser, hvilket sparer tid. Derudover er det afgørende, at metoden til tælling af fækalt stof22 forbliver konsistent gennem hele eksperimentet. Mens blåt fækalt stof er synligt på fødevare- og hætteglasproppen, er farveløst fækalt stof ikke. Tæl derfor ikke de blå prikker på mad- eller hætteglasproppen.
Med adfærdsmæssige analyser er der altid mulighed for uoverensstemmelser i resultaterne på grund af udsving i flueadfærd eller ukendte variabler, der påvirker analysen. Vi anbefaler at bruge det samme Drosophila-medie , det samme madfarvestof og det samme mærke hætteglas til alle eksperimenter. Interessant nok blev det i flere forsøg observeret, at fluer har tendens til at afværge sjældnere tidligt på eftermiddagen, muligvis på grund af fluernes døgnrytme23. Denne adfærd er imidlertid konsistent i både kontrolfluer og fluer, der udtrykker alfa-synuclein, så det bør ikke give anledning til bekymring.
Hvis fluerne ikke udskiller blåt fækalt stof i begyndelsen af analysen, er det muligt, at det anvendte farvestof ikke er pigmenteret nok. I dette tilfælde kan man øge forholdet mellem farvestof og destilleret vand i overensstemmelse hermed. Det er også muligt, at når der kun er en lille mængde blå mad tilbage i fluens fordøjelseskanalen, kan det være svært at afgøre, om fækalt stof er lyseblåt eller farveløst. Når dette sker, vil placering af et hvidt ark papir bag hætteglasset hjælpe med at bestemme farven på fækalprikken. Selvom fækalt stof er meget lyseblåt, er det bedst at registrere det som blåt fækalt stof snarere end farveløst fækalt stof.
En begrænsning af dette assay er, at det kræver manuel tælling af fækale pletter. For at forbedre potentialet for screening med høj kapacitet kan denne protokol ændres i fremtiden for at muliggøre automatiseret kvantificering af blå fækale pletter produceret af individuelle fluer i plader med flere brønde. En anden begrænsning er, at selvom alfa-synuclein-modellen har potentialet til at blive udviklet til en prodromal model af PD, er der endnu ikke identificeret et optimalt tidspunkt, hvor forstoppelse er til stede uden neurodegeneration.
Sammenfattende tilbyder denne metode en enkel, ligetil tilgang til modellering af forstoppelse, et understuderet ikke-motorisk PD-symptom, i en Drosophila-model af PD.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi anerkender Dr. Mel Feany på Brigham and Women's Hospital og Harvard Medical School for den venlige gave af kontrol og alfa-synuclein, der udtrykker Drosophila-linjer . Vi anerkender følgende kilder til tilskud til Dr. Olsen: NINDS K08, American Parkinson Disease Association George C. Cotzias Fellowship, Department of Defense Parkinsons sygdom Early Investigator Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1400 g sucrose | MP Biomedicals | 904713 | |
| 1800 g dextrose | MP Biomedicals | 901521 | |
| 2884 g yeast | MP Biomedicals | 903312 | |
| 428 g agar | Fisher Scientific | 10253156 | |
| 4600 mL molasses | Grandma's Molasses | 7971942 | |
| 68 L water | N/A | N/A | |
| 680 mL tegosept mix (1200 g tegosept in 6 L ethanol) | |||
| 6864 g cornmeal | Pearl Milling | 125045 | |
| 800 mL acid mix (83 mL phosphoric acid in 1 L water + 836 mL propionic acid in 1 L water) | |||
| cellSens Standard software | Olympus | N/A | |
| Ethanol | Pharmco-Aper | 111ACS200 | |
| Flugs for wide plastic vials | Genesee Scientific | 49-101 | |
| Flystuff wide Drosophila vials, polystyrene | Genesee Scientific | 32-117 | |
| Graphpad Prism | GraphPad | N/A | Version 9.5.1 |
| Olympus DP23 camera | Olympus | N/A | |
| Olympus SZX12 Stereo Microscope | Olympus | N/A | |
| Phosphoric Acid | Fisher Scientific | S25470A | |
| Propionic Acid | Fisher Scientific | A258 - 500 | |
| Soft gel paste food color, Royal blue | AmeriColor | 202 | |
| Tegosept | Apex | 20-258 | |
| Drosophila Stocks | |||
| nSyb-QF2, nSyb-Gal4 | All lines provided by Dr. Mel Feany | N/A | Lines are available directly from Dr. Feany |
| nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha synuclein | N/A | ||
| w1118 | N/A |
References
- Kalia, L. V., Lang, A. E.
- Bloem, B. R., Okun, M. S., Klein, C.
- Ball, N., Teo, W. P., Chandra, S., Chapman, J.
- Zhou, J., Li, J., Papaneri, A. B., Kobzar, N. P., Cui, G. Dopamine neuron challenge test for early detection of Parkinson's disease. NPJ Parkinsons Dis. 7 (1), 116 (2021).
- Ueki, A., Otsuka, M. Life style risks of Parkinson's disease: association between decreased water intake and constipation. J Neurol. 251 (Suppl 7), vII18-vII23 (2004).
- Houser, M. C., Tansey, M. G. The gut-brain axis: is intestinal inflammation a silent driver of Parkinson's disease pathogenesis. NPJ Parkinsons Dis. 3, 3 (2017).
- Pfeiffer, R. F.
- Klann, E. M., et al. The Gut-brain axis and its relation to parkinson's disease: A review. Front Aging Neurosci. 13, 782082 (2021).
- Mukherjee, A., Biswas, A., Das, S. K.
- Yemula, N., Dietrich, C., Dostal, V., Hornberger, M. Parkinson's disease and the gut: symptoms, nutrition, and microbiota. J Parkinsons Dis. 11 (4), 1491-1505 (2021).
- Chen, S. J., Lin, C. H. Gut microenvironmental changes as a potential trigger in Parkinson's disease through the gut-brain axis. J Biomed Sci. 29 (1), 54 (2022).
- Hawrysh, P. J., et al. PRKN/parkin-mediated mitophagy is induced by the probiotics Saccharomyces boulardii and Lactococcus lactis. Autophagy. 19 (7), 2094-2110 (2023).
- Liu, W., Lim, K. L., Tan, E. K. Intestine-derived α-synuclein initiates and aggravates pathogenesis of Parkinson's disease in Drosophila. Transl Neurodegener. 11 (1), 44 (2022).
- Rota, L., et al. Constipation, deficit in colon contractions and alpha-synuclein inclusions within the colon precede motor abnormalities and neurodegeneration in the central nervous system in a mouse model of alpha-synucleinopathy. Transl Neurodegener. 8, 5 (2019).
- Diwakarla, S., et al. ATH434 reverses colorectal dysfunction in the A53T mouse model of Parkinson's disease. J Parkinsons Dis. 11 (4), 1821-1832 (2021).
- Ordonez, D. G., Lee, M. K., Feany, M. B. α-synuclein Induces mitochondrial dysfunction through spectrin and the actin cytoskeleton. Neuron. 97 (1), 108.e6-124.e6 (2018).
- Olsen, A. L., Feany, M. B. Glial α-synuclein promotes neurodegeneration characterized by a distinct transcriptional program in vivo. Glia. 67 (10), 1933-1957 (2019).
- Cognigni, P., Bailey, A. P., Miguel-Aliaga, I. Enteric neurons and systemic signals couple nutritional and reproductive status with intestinal homeostasis. Cell Metab. 13 (1), 92-104 (2011).
- Urquhart-Cronish, M., Sokolowski, M. B. Gene-environment interplay in Drosophila melanogaster: chronic nutritional deprivation in larval life affects adult fecal output. J Insect Physiol. 69, 95-100 (2014).
- Popovic, R., et al. Blocking dPerk in the intestine suppresses neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson's disease. Cell Death Dis. 14 (3), 206 (2023).
- Poteet, E., et al. Neuroprotective actions of methylene blue and its derivatives. PLoS One. 7 (10), e48279 (2012).
- Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster. Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).
- Schlichting, M., et al. A neural network underlying circadian entrainment and photoperiodic adjustment of sleep and activity in Drosophila. J Neurosci. 36 (35), 9084-9096 (2016).
