Summary
Este protocolo presenta un ensayo para modelar el estreñimiento en un modelo de Drosophila basado en alfa-sinucleína de la enfermedad de Parkinson.
Abstract
Los síntomas no motores en la enfermedad de Parkinson (EP) son comunes, difíciles de tratar y afectan significativamente la calidad de vida. Un síntoma no motor prevalente es el estreñimiento, que puede preceder al diagnóstico de EP por años o incluso décadas. El estreñimiento ha sido poco explorado en modelos animales de EP y carece de terapias específicas. Este ensayo utiliza un modelo de Drosophila de EP en el que la alfa-sinucleína humana se expresa bajo un controlador panneuronal. Las moscas que expresan alfa-sinucleína desarrollan las características distintivas de la EP: la pérdida de neuronas dopaminérgicas, el deterioro motor y las inclusiones de alfa-sinucleína.
Este protocolo describe un método para estudiar el estreñimiento en estas moscas. Las moscas se colocan en la comida para moscas con un aditivo de color azul durante la noche y luego se transfieren a la comida estándar al día siguiente. Posteriormente, se trasladan a nuevos viales con alimento estándar para moscas cada hora durante 8 h. Antes de cada transferencia, se calcula el porcentaje de manchas fecales de color azul en comparación con el total de manchas fecales en la pared del vial. Las moscas de control que carecen de alfa-sinucleína expulsan todo el tinte azul horas antes que las moscas que expresan alfa-sinucleína. Además, el paso de los alimentos de color azul desde el intestino se puede controlar con una simple fotografía. La simplicidad de este ensayo permite su uso en cribados genéticos o químicos para identificar modificadores del estreñimiento en Drosophila.
Introduction
La enfermedad de Parkinson (EP) es un trastorno neurodegenerativo progresivo caracterizado clínicamente por la presencia de síntomas motores como bradicinesia, rigidez y temblor, lo que resulta en una morbilidad significativa1. Desde el punto de vista patológico, la EP se define por la pérdida de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra y el mal plegamiento de la alfa-sinucleína, lo que conduce a la formación de cuerpos de Lewy y neuritas de Lewy. La patogenia de la EP sigue siendo poco conocida, probablemente debido a una compleja interacción de factores genéticos y ambientales 2,3. En la actualidad, las terapias modificadoras de la enfermedad no están disponibles, posiblemente debido en parte al estadio avanzado de la patología presente en el momento del diagnóstico. Los estudios han demostrado que más del 60% de las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra ya se han perdido con la aparición de los síntomas motores, lo que subraya la necesidad de explorar posibles biomarcadores para la detección precoz de la enfermedad4. Uno de estos biomarcadores clínicos es el estreñimiento, que es común en pacientes con EP 5,6 y puede preceder a la aparición de los síntomas motores durante años o incluso décadas.
A pesar de la definición clínica de la EP basada en los síntomas motores, el estreñimiento es uno de los varios síntomas no motores que son más difíciles de tratar sintomáticamente y causan un deterioro significativo en la calidad de vida de los pacientes7. Las alteraciones en el eje intestino-cerebro, que representa la comunicación bidireccional entre el cerebro y el sistema nervioso entérico, se han implicado en la patogénesis de la EP. Se han encontrado agregados de alfa-sinucleína en muestras de tejido del tracto gastrointestinal de pacientes con EP8, y los modelos animales sugieren que los agregados de alfa-sinucleína en el sistema nervioso entérico se propagan de manera similar a un prión al sistema nervioso central9. Además, los pacientes con EP presentan anomalías en el microbioma intestinal10 y pueden experimentar una inflamación intestinal excesiva11. El estreñimiento en la EP ha sido poco estudiado, con pocos modelos reportados de estreñimiento asociado al Parkinson en moscas12,13 o roedores14,15.
Este ensayo emplea un modelo de Drosophila de EP en el que las moscas expresan el gen de la alfa-sinucleína humana bajo el control de un impulsor panneuronal, la n-sinaptobrevina. Estas moscas exhiben todas las características distintivas de la EP, incluida la agregación de alfa-sinucleína, la disfunción motora y la neurodegeneración relacionada con la edad, lo que resulta en la pérdida de neuronas dopaminérgicas16,17. Estudios previos han introducido la medición de la excreción fecal en moscas para evaluar la disfunción intestinal, cuantificando la materia fecal de la mosca y comparando las cantidades de excretas a través de varias líneas genéticas para revelar diferencias funcionales en el sistema digestivo 18,19,20. Aquí, demostramos el ensayo de estreñimiento utilizando moscas que expresan alfa-sinucleína humana. Esta sencilla pero valiosa herramienta permite el estudio de un importante síntoma no motor de la EP.
Protocol
Moscas utilizadas en este ensayo: control: nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+; moscas de alfa-sinucleína: nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alfa-sinucleína/+; 1 y 10 días después de la eclosión; moscas macho y hembra (apareadas y no apareadas) (ver Tabla de Materiales).
1. Preparación de la comida para moscas teñida
- Mezcle colorante alimentario en pasta de gel suave azul (consulte la Tabla de materiales) con agua destilada en una proporción de 1:1 (v/v).
NOTA: Use colorantes alimentarios comerciales que contengan solo colorantes no absorbibles, ya que se ha demostrado que algunos colorantes azules tienen efectos neuroprotectores21. - Calentar en el microondas los viales de comida para moscas que consisten en agar harina de maíz estándar (ver Tabla de Materiales) en intervalos de 10 a 15 s hasta que la comida se haya derretido en un líquido o suspensión. No permita que los alimentos se desborden.
- Agregue la mezcla de colorante a cada vial de alimento para obtener una coloración uniforme entre viales. Mezcle la mezcla de tinte hasta que la comida esté homogéneamente azul (Figura 1). Agregue una cantidad de la mezcla de colorante azul de modo que el color de la comida esté saturado y no haya variación de color entre los viales.
NOTA: Este paso debe realizarse poco después de calentar en el microondas, ya que los alimentos se solidifican rápidamente. Si el alimento se solidifica, vuelva a calentar el vial en el microondas. - Deje que los viales de alimentos teñidos se sequen al aire hasta que se solidifiquen. Coloque una toalla de papel delgada sobre las aberturas del vial mientras se seca para evitar que las moscas callejeras se posen en el vial.
- Una vez que la comida se haya enfriado y solidificado, transfiera las moscas que se utilizarán para la prueba a la comida azul.
NOTA: Para viales estrechos (25 mm), se recomienda agregar de 9 a 14 moscas a cada vial. Para viales anchos (28,5 mm), se recomienda añadir de 10 a 20 moscas a cada vial. Las moscas no están separadas por sexo o experiencia de apareamiento e incluyen una población mixta de moscas macho y hembra, con hembras apareadas y no apareadas. - Incubar los viales con moscas durante la noche a 25 °C en una incubadora.
2. Imágenes de las moscas
NOTA: Este paso es opcional (Figura 2).
- A la mañana siguiente (hora 0), anestesiar las moscas representativas con dióxido de carbono durante 60 s. Coloca la mosca de modo que el lado ventral quede hacia arriba.
- Usando una cámara (ver Tabla de Materiales), capture imágenes de las moscas a cada hora para visualizar la cantidad de comida azul que queda en el sistema digestivo.
NOTA: Estas moscas no deben utilizarse para la parte cuantitativa del ensayo (paso 3), ya que la anestesia puede afectar a los resultados. - A cada hora, anestesia y visualiza nuevas moscas.
3. Realización del ensayo de estreñimiento
- Transfiera las moscas restantes (no anestesiadas) a viales con alimento estándar para Drosophila . Numere cada vial.
- Deje las moscas en la incubadora a 25 °C durante 60 min.
- Después de 60 minutos, transfiera las moscas a viales nuevos con alimento estándar para Drosophila . Comience el registro de datos desde el primer juego de viales.
- Dibuje una línea punteada a lo largo del vial para marcar el punto a partir del cual comenzará el conteo.
- Cuente manualmente el número de puntos pequeños y redondos en la pared de cada vial. No cuente los puntos que se encuentran en el tapón de alimentos o viales.
- Comience contando el número de puntos azules en la pared de cada vial.
- Cuente el número de puntos opacos e incoloros en la pared de cada vial.
NOTA: Cada punto es excremento de mosca, que es una combinación de orina y materia fecal22. En ocasiones, una mosca puede caminar sobre el excremento y dejar un rastro, en cuyo caso, cuente solo el punto original, no cada marca individual en el rastro. - Registre la proporción de puntos azules con respecto al número total de puntos de cada vial.
NOTA: El número total de puntos es el número de puntos azules en la pared de un vial sumado al número de puntos incoloros en la pared del mismo vial. Esto se utilizará para calcular el porcentaje de materia fecal azul por hora. - Repita los pasos 3.2-3.8 siete veces más, recopilando datos cada hora durante un total de 8 horas.
4. Análisis de datos
- Grafique el porcentaje de materia fecal azul por hora para cada afección.
- Compare los datos entre condiciones.
NOTA: La significación estadística se puede determinar de 3 maneras: comparando puntos de tiempo individuales entre condiciones, midiendo la pendiente de la línea a lo largo del tiempo o comparando el área bajo la curva.
Representative Results
Debido a que el abdomen de Drosophila es transparente, se puede visualizar el alimento azul dentro del intestino en moscas vivas anestesiadas. Las diferencias cualitativas en el tránsito intestinal se pueden evaluar tomando imágenes de las moscas en varios puntos de tiempo. En las moscas control, el alimento azul se expulsa rápidamente, mientras que en las moscas alfa-sinucleína, el alimento azul permanece presente en el intestino hasta 8 horas (Figura 2).
Las moscas alfa-sinucleína muestran neurodegeneración relacionada con la edad, con un fenotipo robusto que se desarrolla 10 días después de la eclosión10. En este punto de tiempo, las diferencias en el tiempo de tránsito intestinal en comparación con las moscas de control se observan comparando puntos de tiempo individuales entre condiciones, midiendo la pendiente de la línea a lo largo del tiempo o comparando el área bajo la curva (Figura 3). No se observan diferencias en el tránsito intestinal entre las moscas control y las moscas alfa-sinucleína en un momento más temprano, el día 1 después de la eclosión, cuando la disfunción motora y la neurodegeneración aún no están presentes (Figura 4).
Figura 1: Viales de alimentos azules y manchas fecales. (A) Todos los viales contienen alimentos de color azul. En este momento, las moscas acaban de ser introducidas en el alimento azul y no se ve materia fecal azul. (B) Un vial después de que las moscas w1118 se hayan transferido a alimentos frescos durante 1 h, y luego se haya retirado. El recuadro izquierdo se agranda en (C) y el recuadro derecho se agranda en (D). (C) Un área excluida del análisis debido a la presencia de alimento para moscas. (D) Vista ampliada de las manchas fecales, que indican manchas azules (flechas negras) y no azules (flechas amarillas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Visualización del tránsito intestinal de los alimentos teñidos a lo largo del tiempo. Las moscas de control y las moscas que expresaban alfa-sinucleína humana en las neuronas se dejaron en alimentos teñidos de azul durante la noche y luego se transfirieron a medios estándar al día siguiente. Las moscas se transfirieron en serie a un nuevo alimento estándar para moscas cada hora. Se muestran imágenes representativas en el momento cero y 2, 4, 6 y 8 h después de la transferencia. Las moscas de control y las moscas de alfa-sinucleína muestran parches similares de comida azul en el intestino en el tiempo cero. En los puntos de tiempo posteriores, las moscas de control tienen menos alimento azul que las moscas de alfa-sinucleína, y todo el alimento azul desaparece en el punto de tiempo de 8 h en las moscas de control. Los genotipos para cada línea de mosca son los siguientes: control (nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); moscas de alfa-sinucleína (nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alfa-sinucleína/+). Las moscas hembras se utilizan para la obtención de imágenes debido a su capacidad más fácil para visualizar el abdomen debido a su mayor tamaño. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ensayo de estreñimiento en moscas post-eclosión del día 10. Las moscas de control y las moscas que expresaban alfa-sinucleína humana en las neuronas se dejaron en alimentos teñidos de azul durante la noche y luego se transfirieron a alimentos estándar para moscas al día siguiente. Las moscas se transfirieron en serie a nuevos medios estándar cada hora. (A) Porcentaje de materia fecal azul por hora. Las barras de error representan la desviación estándar. N = 6 viales por genotipo; Cada frasco contenía entre 9 y 14 moscas. Todos los análisis estadísticos se realizaron en Graphpad Prism (ver Tabla de Materiales). La significación estadística en cada punto de tiempo se calculó mediante ANOVA de dos vías. La pendiente de la recta y la diferencia entre pendientes se calcularon mediante el análisis de regresión lineal. (B) Se calculó el área bajo la curva para cada genotipo. Las barras de error representan la desviación estándar. Los genotipos para cada línea de mosca son los siguientes: control (nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); moscas de alfa-sinucleína (nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alfa-sinucleína/+). Tanto las moscas macho como las hembras se incluyen en números aproximadamente iguales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Ensayo de estreñimiento en moscas post-eclosión del día 1. Las moscas de control y las moscas que expresaban alfa-sinucleína humana en las neuronas se dejaron en alimentos teñidos de azul durante la noche y luego se transfirieron a medios estándar al día siguiente. Las moscas se transfirieron en serie a un nuevo alimento estándar para moscas cada hora. (A) Porcentaje de materia fecal azul por hora. Las barras de error representan la desviación estándar. N = mínimo 5 viales por genotipo; Cada frasco contenía entre 9 y 14 moscas. Todos los análisis estadísticos se realizaron en Graphpad Prism. La significación estadística en cada punto de tiempo se calculó mediante ANOVA de dos vías. La pendiente de la recta y la diferencia entre pendientes se calcularon mediante el análisis de regresión lineal. (B) Se calculó el área bajo la curva para cada genotipo. Las barras de error representan la desviación estándar. Los genotipos para cada línea de mosca son los siguientes: control (nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); moscas de alfa-sinucleína (nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alfa-sinucleína/+). Tanto las moscas macho como las hembras se incluyen en números aproximadamente iguales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Hay varios pasos en este protocolo que ayudarán a completar con éxito el ensayo. En primer lugar, es importante asegurarse de que los intervalos de tiempo entre cada ronda para cada vial sean consistentes a lo largo del experimento. Etiquetar los viales con números ayudará a evitar la necesidad de largas descripciones de genotipos, ahorrando tiempo. Además, es crucial que el método para contar la materia fecal22 permanezca consistente a lo largo del experimento. Mientras que la materia fecal azul es visible en el tapón de los alimentos y del vial, la materia fecal incolora no lo es. Por lo tanto, no cuente los puntos azules en el tapón de alimentos o viales.
Con los ensayos de comportamiento, siempre existe la posibilidad de que se produzcan inconsistencias en los resultados debido a fluctuaciones en el comportamiento de las moscas o a variables desconocidas que afectan al ensayo. Recomendamos utilizar el mismo medio de Drosophila , el mismo colorante alimentario y la misma marca de viales para todos los experimentos. Curiosamente, en varios ensayos, se observó que las moscas tienden a defecar con menos frecuencia a primera hora de la tarde, posiblemente debido al ritmo circadiano de las moscas23. Sin embargo, este comportamiento es consistente tanto en las moscas de control como en las moscas que expresan alfa-sinucleína, por lo que no debería plantear preocupaciones.
Si las moscas no excretan materia fecal azul al comienzo del ensayo, es posible que el colorante utilizado no esté lo suficientemente pigmentado. En este caso, se puede aumentar la proporción de colorante y agua destilada en consecuencia. También es posible que cuando solo queda una pequeña cantidad de comida azul en el tracto digestivo de la mosca, puede ser difícil determinar si la materia fecal es azul pálido o incolora. Cuando esto ocurre, colocar una hoja de papel blanca detrás del frasco ayudará a determinar el color del punto fecal. Incluso si la materia fecal es de color azul muy claro, es mejor registrarla como materia fecal azul en lugar de materia fecal incolora.
Una limitación de este ensayo es que requiere el recuento manual de las manchas fecales. Con el fin de mejorar el potencial de la detección de alto rendimiento, este protocolo puede modificarse en el futuro para permitir la cuantificación automatizada de las manchas fecales azules producidas por moscas individuales en placas de pocillos múltiples. Otra limitación es que, aunque el modelo de alfa-sinucleína tiene el potencial de convertirse en un modelo prodrómico de EP, aún no se ha identificado un punto de tiempo óptimo en el que el estreñimiento esté presente sin neurodegeneración.
En resumen, este método ofrece un enfoque simple y directo para modelar el estreñimiento, un síntoma no motor de la EP poco estudiado, en un modelo de Drosophila de la EP.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos al Dr. Mel Feany del Hospital Brigham and Women's y de la Facultad de Medicina de Harvard por el amable regalo de las líneas de control y alfa-sinucleína que expresan Drosophila . Reconocemos las siguientes fuentes de apoyo de subvenciones para el Dr. Olsen: NINDS K08, Beca George C. Cotzias de la Asociación Americana de la Enfermedad de Parkinson, Premio al Investigador Temprano de la Enfermedad de Parkinson del Departamento de Defensa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1400 g sucrose | MP Biomedicals | 904713 | |
| 1800 g dextrose | MP Biomedicals | 901521 | |
| 2884 g yeast | MP Biomedicals | 903312 | |
| 428 g agar | Fisher Scientific | 10253156 | |
| 4600 mL molasses | Grandma's Molasses | 7971942 | |
| 68 L water | N/A | N/A | |
| 680 mL tegosept mix (1200 g tegosept in 6 L ethanol) | |||
| 6864 g cornmeal | Pearl Milling | 125045 | |
| 800 mL acid mix (83 mL phosphoric acid in 1 L water + 836 mL propionic acid in 1 L water) | |||
| cellSens Standard software | Olympus | N/A | |
| Ethanol | Pharmco-Aper | 111ACS200 | |
| Flugs for wide plastic vials | Genesee Scientific | 49-101 | |
| Flystuff wide Drosophila vials, polystyrene | Genesee Scientific | 32-117 | |
| Graphpad Prism | GraphPad | N/A | Version 9.5.1 |
| Olympus DP23 camera | Olympus | N/A | |
| Olympus SZX12 Stereo Microscope | Olympus | N/A | |
| Phosphoric Acid | Fisher Scientific | S25470A | |
| Propionic Acid | Fisher Scientific | A258 - 500 | |
| Soft gel paste food color, Royal blue | AmeriColor | 202 | |
| Tegosept | Apex | 20-258 | |
| Drosophila Stocks | |||
| nSyb-QF2, nSyb-Gal4 | All lines provided by Dr. Mel Feany | N/A | Lines are available directly from Dr. Feany |
| nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha synuclein | N/A | ||
| w1118 | N/A |
References
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