Summary
Detta protokoll presenterar en analys för modellering av förstoppning i en alfa-synukleinbaserad Drosophila-modell av Parkinsons sjukdom.
Abstract
Icke-motoriska symtom vid Parkinsons sjukdom (PD) är vanliga, svårbehandlade och försämrar livskvaliteten avsevärt. Ett vanligt icke-motoriskt symptom är förstoppning, som kan föregå diagnosen PD med år eller till och med decennier. Förstoppning har varit underutforskat i djurmodeller av Parkinsons sjukdom och saknar specifika behandlingar. Denna analys använder en Drosophila-modell av PD där humant alfa-synuklein uttrycks under en pan-neuronal drivrutin. Flugor som uttrycker alfa-synuklein utvecklar de kännetecknande egenskaperna hos PD: förlust av dopaminerga neuroner, motorisk försämring och alfa-synukleininklusioner.
Detta protokoll beskriver en metod för att studera förstoppning hos dessa flugor. Flugor placeras på flugfoder med en blå färgtillsats över natten och överförs sedan till standardfoder dagen efter. De flyttas sedan till nya flaskor med vanligt flugfoder varje timme i 8 timmar. Före varje överföring beräknas procentandelen blåfärgade fekala fläckar jämfört med det totala antalet fekala fläckar på flaskans vägg. Kontrollflugor som saknar alfa-synuklein utsöndrar allt blått färgämne timmar före flugor som uttrycker alfa-synuklein. Dessutom kan passagen av blåfärgad mat från tarmen övervakas med enkel fotografering. Enkelheten i denna analys gör det möjligt att använda den i framåtriktade genetiska eller kemiska screeningar för att identifiera modifierare av förstoppning hos Drosophila.
Introduction
Parkinsons sjukdom (PD) är en progressiv neurodegenerativ sjukdom som kliniskt kännetecknas av förekomsten av motoriska symtom som bradykinesi, rigiditet och tremor, vilket resulterar i betydande morbiditet1. Patologiskt definieras PD av förlusten av dopaminerga neuroner i substantia nigra och felveckning av alfa-synuklein, vilket leder till bildandet av Lewykroppar och Lewyneuriter. Patogenesen för Parkinsons sjukdom är fortfarande dåligt förstådd och beror sannolikt på ett komplext samspel mellan genetiska och miljömässiga faktorer 2,3. För närvarande finns det inga sjukdomsmodifierande terapier tillgängliga, möjligen delvis på grund av det avancerade stadium av patologi som finns vid tidpunkten för diagnosen. Studier har visat att mer än 60 % av de dopaminerga nervcellerna i substantia nigra redan har förlorats vid uppkomsten av motoriska symtom, vilket understryker behovet av att utforska potentiella biomarkörer för tidig upptäckt av sjukdomen4. En sådan klinisk biomarkör är förstoppning, som är vanligt hos PD-patienter 5,6 och kan föregå motoriska symtom med år eller till och med decennier.
Trots PD:s kliniska definition baserad på motoriska symtom är förstoppning ett av flera icke-motoriska symtom som är mer utmanande att behandla symtomatiskt och orsakar betydande försämring av patienternas livskvalitet7. Förändringar i tarm-hjärna-axeln, som representerar dubbelriktad kommunikation mellan hjärnan och det enteriska nervsystemet, har varit inblandade i PD-patogenesen. Alfa-synukleinaggregat har hittats i vävnadsprover från mag-tarmkanalen hos PD-patienter8, och djurmodeller tyder på att alfa-synukleinaggregat i det enteriska nervsystemet sprider sig på ett prionliknande sätt till centrala nervsystemet9. Dessutom uppvisar PD-patienter avvikelser i tarmmikrobiomet10 och kan uppleva överdriven tarminflammation11. Förstoppning vid Parkinsons sjukdom har varit understuderad, med få rapporterade modeller av Parkinson-associerad förstoppning hos flugor12,13 eller gnagare14,15.
Denna analys använder en Drosophila-modell av PD där flugor uttrycker den mänskliga alfa-synuklein-genen under kontroll av en pan-neuronal drivrutin, n-synaptobrevin. Dessa flugor uppvisar alla kännetecken för PD, inklusive alfa-synukleinaggregation, motorisk dysfunktion och åldersrelaterad neurodegeneration, vilket resulterar i förlust av dopaminerga neuroner16,17. Tidigare studier har introducerat mätning av fekal produktion hos flugor för att bedöma tarmdysfunktion, kvantifiera flugavföring och jämföra avföringsmängder över olika genetiska linjer för att avslöja funktionella skillnader i matsmältningssystemet 18,19,20. Här demonstrerar vi förstoppningsanalysen med flugor som uttrycker humant alfa-synuklein. Detta enkla men värdefulla verktyg gör det möjligt att studera ett viktigt icke-motoriskt symtom på Parkinsons sjukdom.
Protocol
Flugor som används i denna analys: kontroll: nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+; alfa-synuklein flugor: nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alfa-synuklein/+; 1 och 10 dagar efter stängningen; han- och honflugor (parade och oparade) flugor (se materialförteckning).
1. Förbereda den färgade flugmaten
- Blanda blå mjuk gelpasta matfärg (se materialtabell) med destillerat vatten i förhållandet 1:1 (v/v).
OBS: Använd kommersiell livsmedelsfärg som endast innehåller icke-absorberbara färgämnen, eftersom vissa blå färgämnen har visat sig ha neuroprotektiva effekter21. - Mikrovågsugn flaskorna med flugfoder bestående av vanlig majsmjölsagar (se materialförteckning) i 10-15 s intervaller tills maten har smält till en vätska eller slurry. Låt inte maten koka över.
- Tillsätt färgblandningen till varje injektionsflaska med mat för att få en enhetlig färg mellan injektionsflaskorna. Blanda i färgblandningen tills maten är homogent blå (Figur 1). Tillsätt en mängd av den blå färgblandningen så att färgen på maten är mättad och det inte finns någon variation i färg mellan injektionsflaskorna.
OBS: Detta steg måste göras strax efter mikrovågsugn, eftersom maten stelnar snabbt. Om maten stelnar, mikrovågsugn injektionsflaskan igen. - Låt injektionsflaskorna med färgad mat lufttorka tills den stelnar. Placera en tunn pappershandduk över injektionsflaskans öppningar under torkning för att förhindra att herrelösa flugor landar i injektionsflaskan.
- När maten har svalnat och stelnat, överför flugorna som ska användas för testning till det blå fodret.
OBS: För smala injektionsflaskor (25 mm) rekommenderas att 9-14 flugor tillsätts till varje injektionsflaska. För breda injektionsflaskor (28,5 mm) rekommenderas att 10-20 flugor tillsätts till varje injektionsflaska. Flugor är inte åtskilda av kön eller parningserfarenhet och inkluderar en blandad population av han- och honflugor, med både parade och oparade honor. - Inkubera injektionsflaskorna med flugor över natten vid 25 °C i en inkubator.
2. Avbildning av flugorna
OBS: Det här steget är valfritt (bild 2).
- Följande morgon (tid 0), bedöva representantflugorna med koldioxid i 60 s. Placera flugan så att den ventrala sidan är vänd uppåt.
- Använd en kamera (se materialförteckning) för att ta bilder av flugorna varje timme för att visualisera mängden blå mat som finns kvar i matsmältningssystemet.
OBS: Dessa flugor bör inte användas för den kvantitativa delen av analysen (steg 3), eftersom anestesi kan påverka resultaten. - Bedöva och avbilda nya flugor varje timme.
3. Utföra förstoppningsanalysen
- Överför de återstående (icke-sövda) flugorna till injektionsflaskor med vanligt Drosophila-foder . Numrera varje injektionsflaska.
- Låt flugorna stå i kuvösen vid 25 °C i 60 min.
- Efter 60 minuter flyttar du över flugorna till nya injektionsflaskor med vanligt Drosophila-foder . Börja registrera data från den första uppsättningen injektionsflaskor.
- Rita en prickad linje längs injektionsflaskans längd för att markera den punkt från vilken räkningen ska börja.
- Räkna manuellt antalet små, runda prickar på väggen på varje injektionsflaska. Räkna inte prickar som finns på maten eller injektionsflaskans plugg.
- Börja med att räkna antalet blå prickar på väggen på varje injektionsflaska.
- Räkna antalet ogenomskinliga, färglösa prickar på väggen på varje injektionsflaska.
OBS: Varje prick är flugavföring, som är en kombination av urin och avföring22. Ibland kan en fluga gå över avföringen och lämna ett spår, och då ska man bara räkna den ursprungliga pricken, inte varje enskilt märke i spåret. - Anteckna förhållandet mellan blå prickar och det totala antalet prickar för varje injektionsflaska.
OBS: Det totala antalet prickar är antalet blå prickar på väggen på en injektionsflaska adderat till antalet färglösa prickar på väggen på samma injektionsflaska. Detta kommer att användas för att beräkna procentandelen blå avföring per timme. - Upprepa steg 3.2-3.8 sju gånger till och samla in data varje timme under totalt 8 timmar.
4. Analys av data
- Rita upp procentandelen blå avföring per timme för varje tillstånd.
- Jämför data mellan villkor.
OBS: Statistisk signifikans kan bestämmas på 3 sätt: genom att jämföra enskilda tidpunkter mellan förhållanden, genom att mäta linjens lutning över tid eller genom att jämföra arean under kurvan.
Representative Results
Eftersom Drosophila-buken är genomskinlig kan blå mat visualiseras inuti tarmen hos levande sövda flugor. Kvalitativa skillnader i tarmpassage kan bedömas genom att ta bilder av flugorna vid olika tidpunkter. Hos kontrollflugor stöts den blå födan snabbt ut, medan den blå födan hos alfa-synukleinflugor finns kvar i tarmen så länge som 8 timmar (Figur 2).
Alfa-synukleinflugorna uppvisar åldersrelaterad neurodegeneration, med en robust fenotyp som utvecklas 10 dagar efter stängning10. Vid denna tidpunkt ses skillnader i tarmens transittid jämfört med kontrollflugor genom att jämföra enskilda tidpunkter mellan förhållandena, genom att mäta linjens lutning över tid eller genom att jämföra arean under kurvan (figur 3). Inga skillnader observeras i tarmpassage mellan kontroll- och alfa-synukleinflugor vid en tidigare tidpunkt, dag 1 efter eklusion, när motorisk dysfunktion och neurodegeneration ännu inte heller är närvarande (Figur 4).
Figur 1: Blå injektionsflaskor och avföringsfläckar. (A) Alla injektionsflaskor innehåller blåfärgat foder. Vid denna tidpunkt har flugor precis introducerats till den blå maten, och ingen blå avföring är synlig. (B) En injektionsflaska efter w1118 flugor har överförts till färskt foder i 1 timme och sedan tagits bort. Den vänstra infällningen förstoras i (C) och den högra infällningen förstoras i (D). C) Ett område som uteslutits från analysen på grund av förekomsten av flugföda. (D) Förstorad bild av fekala fläckar, som indikerar blå (svarta pilar) och icke-blå fläckar (gula pilar). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Visualisering av tarmtransitering av det färgade fodret över tid. Kontrollflugor och flugor som uttrycker humant alfa-synuklein i nervceller lämnades på blåfärgad föda över natten och överfördes sedan till standardmedia nästa dag. Flugorna överfördes serievis till ny standardflugmat varje timme. Representativa bilder vid tid noll och 2, 4, 6 och 8 timmar efter överföring visas. Kontroll- och alfa-synukleinflugor visar liknande fläckar av blå föda i tarmen vid tidpunkt noll. Vid efterföljande tidpunkter har kontrollflugor mindre blå föda än alfa-synukleinflugor, och all blå föda är borta vid 8-timmarstidpunkten hos kontrollflugor. Genotyperna för varje fluglina är följande: kontroll (nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); alfa-synuklein flugor (nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha-synuklein/+). Honflugor används för avbildning på grund av deras lättare förmåga att visualisera buken på grund av deras större storlek. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Förstoppningsanalys hos dag 10 efter eklosionsflugor. Kontrollflugor och flugor som uttrycker humant alfa-synuklein i nervceller lämnades på blåfärgad föda över natten och överfördes sedan till vanlig flugföda nästa dag. Flugorna överfördes serievis till nya standardmedier varje timme. (A) Procent blå avföring per timme. Felstaplar representerar standardavvikelsen. N = 6 injektionsflaskor per genotyp. Varje injektionsflaska innehöll 9-14 flugor. Alla statistiska analyser utfördes i Graphpad Prism (se Materialförteckning). Statistisk signifikans vid varje tidpunkt beräknades med hjälp av tvåvägs ANOVA. Linjens lutning och skillnaden mellan lutningarna beräknades med hjälp av den linjära regressionsanalysen. (B) Arean under kurvan för varje genotyp beräknades. Felstaplar representerar standardavvikelsen. Genotyperna för varje fluglina är följande: kontroll (nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); alfa-synuklein flugor (nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha-synuklein/+). Både han- och honflugor ingår i ungefär lika antal. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Förstoppningsanalys hos dag 1 efter eklosionsflugor. Kontrollflugor och flugor som uttrycker humant alfa-synuklein i nervceller lämnades på blåfärgad föda över natten och överfördes sedan till standardmedia nästa dag. Flugorna överfördes serievis till ny standardflugmat varje timme. (A) Procent blå avföring per timme. Felstaplar representerar standardavvikelsen. N = minst 5 injektionsflaskor per genotyp. Varje injektionsflaska innehöll 9-14 flugor. Alla statistiska analyser utfördes i Graphpad Prism. Statistisk signifikans vid varje tidpunkt beräknades med hjälp av tvåvägs ANOVA. Linjens lutning och skillnaden mellan lutningarna beräknades med hjälp av den linjära regressionsanalysen. (B) Arean under kurvan för varje genotyp beräknades. Felstaplar representerar standardavvikelsen. Genotyperna för varje fluglina är följande: kontroll (nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); alfa-synuklein flugor (nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha-synuklein/+). Både han- och honflugor ingår i ungefär lika antal. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Det finns flera steg i detta protokoll som kommer att hjälpa till att framgångsrikt slutföra analysen. För det första är det viktigt att se till att tidsintervallen mellan varje omgång för varje injektionsflaska är konsekventa under hela experimentet. Att märka injektionsflaskorna med siffror hjälper till att undvika behovet av långa genotypbeskrivningar, vilket sparar tid. Dessutom är det viktigt att metoden för att räkna avföring22 förblir konsekvent under hela experimentet. Medan blå avföring är synlig på maten och injektionsflaskans plugg, är färglös avföring inte det. Räkna därför inte de blå prickarna på mat- eller injektionsflaskans propp.
Med beteendeanalyser finns det alltid en möjlighet till inkonsekvenser i resultaten på grund av fluktuationer i flugans beteende eller okända variabler som påverkar analysen. Vi rekommenderar att du använder samma Drosophila-media , samma färgämne och samma märke av injektionsflaskor för alla experiment. Intressant nog har man i flera försök observerat att flugor tenderar att bajsa mindre ofta tidigt på eftermiddagen, möjligen på grund av flugornas dygnsrytm23. Detta beteende är dock konsekvent hos både kontrollflugor och flugor som uttrycker alfa-synuklein, så det bör inte ge upphov till problem.
Om flugorna inte utsöndrar blå avföring i början av analysen är det möjligt att det använda färgämnet inte är tillräckligt pigmenterat. I det här fallet kan man öka förhållandet mellan färgämne och destillerat vatten i enlighet med detta. Det är också möjligt att när det bara finns en liten mängd blå mat kvar i flugans matsmältningskanal kan det vara svårt att avgöra om avföringen är ljusblå eller färglös. När detta inträffar kan du placera ett vitt pappersark bakom injektionsflaskan för att bestämma färgen på avföringspricken. Även om avföringen är mycket ljusblå är det bäst att registrera den som blå avföring snarare än färglös avföring.
En begränsning med denna analys är att den kräver manuell räkning av fekala fläckar. För att förbättra potentialen för screening med hög kapacitet kan detta protokoll komma att modifieras i framtiden för att möjliggöra automatisk kvantifiering av blå fekala fläckar som produceras av enskilda flugor i plattor med flera brunnar. En annan begränsning är att, även om alfa-synukleinmodellen har potential att utvecklas till en prodromalmodell av PD, har en optimal tidpunkt vid vilken förstoppning är närvarande utan neurodegeneration ännu inte identifierats.
Sammanfattningsvis erbjuder denna metod ett enkelt och okomplicerat tillvägagångssätt för att modellera förstoppning, ett understuderat icke-motoriskt PD-symtom, i en Drosophila-modell av PD.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Mel Feany vid Brigham and Women's Hospital och Harvard Medical School för den vänliga gåvan av kontroll och alfa-synuklein som uttrycker Drosophila-linjer . Vi erkänner följande källor till bidragsstöd till Dr. Olsen: NINDS K08, American Parkinson Disease Association George C. Cotzias Fellowship, Department of Defense Parkinson's Disease Early Investigator Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1400 g sucrose | MP Biomedicals | 904713 | |
| 1800 g dextrose | MP Biomedicals | 901521 | |
| 2884 g yeast | MP Biomedicals | 903312 | |
| 428 g agar | Fisher Scientific | 10253156 | |
| 4600 mL molasses | Grandma's Molasses | 7971942 | |
| 68 L water | N/A | N/A | |
| 680 mL tegosept mix (1200 g tegosept in 6 L ethanol) | |||
| 6864 g cornmeal | Pearl Milling | 125045 | |
| 800 mL acid mix (83 mL phosphoric acid in 1 L water + 836 mL propionic acid in 1 L water) | |||
| cellSens Standard software | Olympus | N/A | |
| Ethanol | Pharmco-Aper | 111ACS200 | |
| Flugs for wide plastic vials | Genesee Scientific | 49-101 | |
| Flystuff wide Drosophila vials, polystyrene | Genesee Scientific | 32-117 | |
| Graphpad Prism | GraphPad | N/A | Version 9.5.1 |
| Olympus DP23 camera | Olympus | N/A | |
| Olympus SZX12 Stereo Microscope | Olympus | N/A | |
| Phosphoric Acid | Fisher Scientific | S25470A | |
| Propionic Acid | Fisher Scientific | A258 - 500 | |
| Soft gel paste food color, Royal blue | AmeriColor | 202 | |
| Tegosept | Apex | 20-258 | |
| Drosophila Stocks | |||
| nSyb-QF2, nSyb-Gal4 | All lines provided by Dr. Mel Feany | N/A | Lines are available directly from Dr. Feany |
| nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha synuclein | N/A | ||
| w1118 | N/A |
References
- Kalia, L. V., Lang, A. E.
- Bloem, B. R., Okun, M. S., Klein, C.
- Ball, N., Teo, W. P., Chandra, S., Chapman, J.
- Zhou, J., Li, J., Papaneri, A. B., Kobzar, N. P., Cui, G. Dopamine neuron challenge test for early detection of Parkinson's disease. NPJ Parkinsons Dis. 7 (1), 116 (2021).
- Ueki, A., Otsuka, M. Life style risks of Parkinson's disease: association between decreased water intake and constipation. J Neurol. 251 (Suppl 7), vII18-vII23 (2004).
- Houser, M. C., Tansey, M. G. The gut-brain axis: is intestinal inflammation a silent driver of Parkinson's disease pathogenesis. NPJ Parkinsons Dis. 3, 3 (2017).
- Pfeiffer, R. F.
- Klann, E. M., et al. The Gut-brain axis and its relation to parkinson's disease: A review. Front Aging Neurosci. 13, 782082 (2021).
- Mukherjee, A., Biswas, A., Das, S. K.
- Yemula, N., Dietrich, C., Dostal, V., Hornberger, M. Parkinson's disease and the gut: symptoms, nutrition, and microbiota. J Parkinsons Dis. 11 (4), 1491-1505 (2021).
- Chen, S. J., Lin, C. H. Gut microenvironmental changes as a potential trigger in Parkinson's disease through the gut-brain axis. J Biomed Sci. 29 (1), 54 (2022).
- Hawrysh, P. J., et al. PRKN/parkin-mediated mitophagy is induced by the probiotics Saccharomyces boulardii and Lactococcus lactis. Autophagy. 19 (7), 2094-2110 (2023).
- Liu, W., Lim, K. L., Tan, E. K. Intestine-derived α-synuclein initiates and aggravates pathogenesis of Parkinson's disease in Drosophila. Transl Neurodegener. 11 (1), 44 (2022).
- Rota, L., et al. Constipation, deficit in colon contractions and alpha-synuclein inclusions within the colon precede motor abnormalities and neurodegeneration in the central nervous system in a mouse model of alpha-synucleinopathy. Transl Neurodegener. 8, 5 (2019).
- Diwakarla, S., et al. ATH434 reverses colorectal dysfunction in the A53T mouse model of Parkinson's disease. J Parkinsons Dis. 11 (4), 1821-1832 (2021).
- Ordonez, D. G., Lee, M. K., Feany, M. B. α-synuclein Induces mitochondrial dysfunction through spectrin and the actin cytoskeleton. Neuron. 97 (1), 108.e6-124.e6 (2018).
- Olsen, A. L., Feany, M. B. Glial α-synuclein promotes neurodegeneration characterized by a distinct transcriptional program in vivo. Glia. 67 (10), 1933-1957 (2019).
- Cognigni, P., Bailey, A. P., Miguel-Aliaga, I. Enteric neurons and systemic signals couple nutritional and reproductive status with intestinal homeostasis. Cell Metab. 13 (1), 92-104 (2011).
- Urquhart-Cronish, M., Sokolowski, M. B. Gene-environment interplay in Drosophila melanogaster: chronic nutritional deprivation in larval life affects adult fecal output. J Insect Physiol. 69, 95-100 (2014).
- Popovic, R., et al. Blocking dPerk in the intestine suppresses neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson's disease. Cell Death Dis. 14 (3), 206 (2023).
- Poteet, E., et al. Neuroprotective actions of methylene blue and its derivatives. PLoS One. 7 (10), e48279 (2012).
- Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster. Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).
- Schlichting, M., et al. A neural network underlying circadian entrainment and photoperiodic adjustment of sleep and activity in Drosophila. J Neurosci. 36 (35), 9084-9096 (2016).
