Summary
Dit werk presenteert een alternatief flatmount retina-preparaat waarbij de verwijdering van fotoreceptorcellichamen een snellere verspreiding van antilichamen en verbeterde patchpipettoegang tot binnenste retinale neuronen mogelijk maakt voor immunohistochemie, in situ hybridisatie en elektrofysiologische experimenten.
Abstract
Bipolaire cellen en horizontale cellen van het netvlies van gewervelde dieren zijn de eerste neuronen die visuele informatie verwerken nadat fotonen zijn gedetecteerd door fotoreceptoren. Ze voeren fundamentele bewerkingen uit, zoals lichtaanpassing, contrastgevoeligheid en ruimtelijke en kleuropponentie. Een volledig begrip van de precieze circuits en biochemische mechanismen die hun gedrag bepalen, zal visueel neurowetenschappelijk onderzoek en oogheelkundige geneeskunde bevorderen. De huidige voorbereidingen voor het onderzoeken van bipolaire en horizontale cellen (netvlies hele mounts en verticale plakjes) zijn echter beperkt in hun vermogen om de anatomie en fysiologie van deze cellen vast te leggen. In dit werk presenteren we een methode voor het verwijderen van fotoreceptorcellichamen uit levende, flatmount muizennetvliezen, waardoor verbeterde toegang tot bipolaire en horizontale cellen wordt geboden voor efficiënte patchklemming en snelle immunolabeling. Gespleten netvliezen worden bereid door een geïsoleerd muizennetvlies tussen twee stukken nitrocellulose te klemmen en ze vervolgens voorzichtig uit elkaar te halen. De scheiding splitst het netvlies net boven de buitenste plexiforme laag om twee stukken nitrocellulose op te leveren, één met de fotoreceptorcellichamen en een andere met het resterende binnenste netvlies. In tegenstelling tot verticale netvliesplakjes, verbreekt het gespleten netvliespreparaat de dendritische processen van de binnenste retinale neuronen niet, waardoor opnames van bipolaire en horizontale cellen mogelijk zijn die de bijdragen van gap junction-gekoppelde netwerken en wide-field amacriene cellen integreren. Dit werk demonstreert de veelzijdigheid van dit preparaat voor de studie van horizontale en bipolaire cellen in elektrofysiologie, immunohistochemie en in situ hybridisatie-experimenten.
Introduction
Het netvlies is een dun neuraal weefsel in het achterste oog waar licht wordt onderschept en verwerkt tot een elektrochemisch signaal dat door de hersenen kan worden geïnterpreteerd. Aan de achterkant van het netvlies worden staaf- en kegelfotoreceptoren gestimuleerd door licht, waardoor de tonische afgiftesnelheid van de neurotransmitter glutamaat1 wordt verminderd. De eerste neuronen die deze door licht geïnduceerde verandering in glutamaatconcentratie ervaren en erop reageren, zijn de bipolaire cellen (BC's) en horizontale cellen (HC's), waarvan de somas zich in het buitenste gebied van de binnenste kernlaag (INL) bevinden. Deze neuronen van de tweede orde voeren de eerste fase van signaalverwerking in het netvlies uit en vormen kritieke kenmerken van het gezichtsvermogen, zoals lichtaanpassing, contrastgevoeligheid en ruimtelijke/kleuropponentie2. Hoewel deze functies zijn toegeschreven aan BC's en HC's, worden de circuits en biochemische mechanismen die aan deze processen ten grondslag liggen niet volledigbegrepen3. Daarom is de vooruitgang van hulpmiddelen en methoden voor het onderzoeken van de fysiologie van BC en HC van het grootste belang.
Verticale (transversale) netvliesdoorsneden hebben lange tijd bewezen het meest praktische model te zijn voor het bestuderen van BC's en HC's; bepaalde aspecten van de fysiologie van BC en HC zijn echter ontoegankelijk voor de onderzoeker onder dit model. Directe opnames van HC's of indirecte metingen van hun effecten op BC's weerspiegelen niet de endogene connectiviteit van het netvlies, aangezien de laterale processen van deze cellen tijdens het snijden worden doorgesneden. Voorbereidingen voor het hele netvlies omzeilen dit probleem door deze laterale processen te behouden, maar de omliggende retinale lagen vormen een uitdaging om toegang te krijgen tot deze cellen4. Hoewel er overvloedige voorbeelden zijn van immunokleuring 5,6,7,8 en patch clamp opnames 9 van INL-neuronen in het netvlies van de hele berg, is er een mogelijkheid om het verzamelen van deze gegevens te versnellen en te vereenvoudigen. De inherente beperkingen van dwarsdoorsneden en de uitdagingen van het hele montuurmodel inspireerden dus tot de ontwikkeling van dit alternatieve flatmount-netvliespreparaat.
Het volgende werk beschrijft een protocol voor het eenvoudig verwijderen van de fotoreceptorlaag van levende, flatmount netvliezen om de toegang tot BC's en HC's te verbeteren voor vereenvoudigde patchklemming en snellere, efficiëntere immunolabeling. Door twee stukken nitrocellulosemembraan aan weerszijden van een geïsoleerd netvlies uit elkaar te halen, scheurt het weefsel door de fotoreceptoraxonen, waardoor een gespleten netvlies overblijft dat de buitenste plexiforme laag (OPL) en alle binnenste retinale lagen behoudt. Terwijl anderen protocollen hebben beschreven voor het mechanisch scheiden van lagen van het netvlies, zijn deze methoden ofwel slecht geschikt voor het klemmen van pleisters en microscopietoepassingen of vereisen ze vervelende manipulatie van het weefsel. Verschillende van deze methoden vereisen bevroren of gevriesdroogd weefsel voor het scheiden van lagen, waardoor ze onverenigbaar zijn met elektrofysiologische experimenten10,11,12. Anderen zijn ontworpen voor levend weefsel, maar vereisen 5-15 opeenvolgende peelings met filtreerpapier 4,11 of behandeling met trypsine 13 om de fotoreceptoren te verwijderen. De hier beschreven techniek is een verbetering ten opzichte van zijn voorgangers door de procedure voor het verwijderen van fotoreceptoren te vereenvoudigen en het repertoire van stroomafwaartse toepassingen uit te breiden.
Protocol
Muizen werden ad libitum voorzien van water en voedsel en werden op een licht/donker-cyclus van 12 uur gehouden. Muizen werden geëuthanaseerd door blootstelling aan isofluraan, gevolgd door cervicale dislocatie. Alle dierproeven waren in overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health en goedgekeurd door de Oregon Health and Science University Institutional Animal Care and Use Committee.
OPMERKING: Oogenucleatie, netvliesdissectie en netvliessplitsing moeten zo snel mogelijk worden uitgevoerd om de gezondheid van het levende weefsel te behouden. Streef ernaar om de dissectie in < 4 minuten per oog te voltooien. Deze drie stappen moeten achtereenvolgens worden uitgevoerd. Wildtype muizen: Volwassen (>3 maanden) mannelijke en vrouwelijke C57BL/6J-muizen werden gebruikt voor experimenten. Voor synapsmorfologie werden muizen gebruikt die groen fluorescerend eiwit (GFP) tot expressie brengen onder de Pcp2-promotor (Pcp2-cre/GFP)14 . Transgene muizen: Voor horizontale celvisualisatie met GFP tijdens immunohistochemie of elektrofysiologische experimenten werd een drievoudige transgene muis gebruikt: vGATFLPo; vGlut2Cre; Ai80d. De vGATFlpo- en vGluT2Cre-stammen zijn knock-in-muizen die Flpo- of Cre-recombinase stroomafwaarts van hun respectievelijke promotors tot expressie brengen. De Ai80d-muis is een intersectionele reportermuis (CatCh/EYFP) en zal alleen Ca2+ permeabel kanaal rodopsine (ChR2) tot expressie brengen in cellen die Cre- en Flpo-recombinasen tot expressie brengen. De drievoudige transgene muis brengt ChR2 dus alleen tot expressie in cellen met een voorgeschiedenis van zowel VGAT- als vGluT2-expressie.
1. Materiaalvoorbereiding voor netvliesdissectie en netvliessplitsing
- Bereid stukjes nitrocellulosemembraan voor
OPMERKING: Het losmaken van het gespleten netvlies van het nitrocellulosemembraan vermindert de achtergrondfluorescentie in microscopie en vereenvoudigt de opname van de patchklem. Membraanverwijdering kan voor of na weefselfixatie worden uitgevoerd. Voor vaste gespleten netvliezen is het niet nodig om de stukjes nitrocellulosemembraan te behandelen. Behandel het membraan bij levende gespleten netvliezen volgens de stappen 1.1.3 - 1.1.5 om een zachte onthechting van het weefsel te vergemakkelijken.- Snijd 16 stukken (of meer) nitrocellulosemembraan in vierkanten van 5 mm x 5 mm. Extra kan in bulk worden bereid en opgeslagen voor toekomstig gebruik.
- Houd de helft van de stukjes membraan opzij voor later gebruik. Deze stukken worden niet behandeld met een blokkerende oplossing.
- Incubeer de resterende stukjes in een wasmiddelvrije IHC-blokkeringsoplossing (zoals 3% paardenserum + 0,025% NaN3 verdund in PBS) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, onder voorzichtig schudden.
LET OP: Gebruik geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren van NaN3, aangezien het een krachtig toxine is. - Was de membraanstukken grondig door ze gedurende 10 minuten op kamertemperatuur te incuberen in met bicarbonaat gebufferde Ames-media en voorzichtig schudden.
- Laat de geblokkeerde stukjes membraan volledig aan de lucht drogen (~20 min). Label en bewaar de membraanstukken bij kamertemperatuur, waarbij u ze gescheiden houdt van de onbehandelde stukjes membraan.
- Bereid Ames-media voor
- Bereid bicarbonaatgebufferde Ames-media en houd de oplossing op kamertemperatuur onder constante carbogenatie (95% O 2 en 5 % CO2).
2. Enucleatie van muizenoog
- Euthanaseer de muis met elke beschikbare methode volgens de IACUC-richtlijnen van de instelling.
- Draai de muis opzij en gebruik twee vingers om voorzichtig rond de oogkas naar beneden te drukken. Hierdoor zal het oog uit de schedel puilen.
- Knip met een gebogen dissectieschaar onder het uitpuilende oog om de oogzenuw door te snijden en het oog van de schedel te scheiden.
- Schep het oog met een schaar en plaats het in een petrischaal gevuld met ijskoude Ames-media.
OPMERKING: Voor stroomafwaartse toepassingen waarbij het weefsel na splitsing wordt gefixeerd, kan ijskoud PBS worden gebruikt in plaats van Ames-media. - Herhaal stap 2.1 - 2.4 voor het resterende oog.
3. Netvlies dissectie
- Gebruik de op maat gemaakte glazen transferpipet om één oog over te brengen op een nieuwe petrischaal met verse, ijskoude Ames-media.
OPMERKING: De brede opening van de aangepaste transferpipet voorkomt dat het weefsel per ongeluk wordt samengedrukt en het gebruik van glas minimaliseert de hechting van het weefsel aan de wanden van de pipet. Een plastic transferpipet met wijde opening is echter ook acceptabel als de onderzoeker al bedreven is in het gebruik van dit gereedschap. - Gebruik een pincet om het oog te stabiliseren door het extra bindweefsel op de bodem van de petrischaal te spelden. Prik vervolgens het oog langs de ora serrata-lijn met een naald van 25 G om een toegangspunt voor de Vannas-schaar te creëren.
- Gebruik een Vannas-schaar om langs de ora serrata-lijn te knippen totdat het hoornvlies loskomt van de rest van het oog (aanvullende figuur 1A). Verwijder de lens met een pincet van de oogschelp (aanvullende afbeelding 1B).
- Gebruik de op maat gemaakte glazen pipet om de oogschelp over te brengen naar een groot volume (≥100 ml) gecarbogeneerde Ames en herhaal stap 3.1 - 3.3 met het resterende oog.
OPMERKING: Oogschelpen worden in gecarbogeneerde Ames geplaatst om de weefselgezondheid te behouden terwijl de dissectie aan het andere oog wordt uitgevoerd. - Breng een oogschelp over naar een petrischaal gevuld met vers gecarbogeneerde Ames.
- Maak met een Vannas-schaar een klein knipje naar binnen vanaf de rand van de sclera en gebruik vervolgens twee pincetten om de sclera van het netvlies af te pellen (aanvullende figuur 1C). Vermijd het vastpakken van het netvlies met de pincet. Trek in plaats daarvan de flappen van de sclera die door de schaarknip zijn gemaakt, uit elkaar.
- Gebruik de Vannas-schaar om de oogzenuw door te knippen die de sclera en het netvlies verbindt (aanvullende figuur 1D) en wrik vervolgens voorzichtig het netvlies van de sclera los met de schaar of pincet om het netvlies te isoleren. (Figuur 1A).
NOTITIE: Hoewel de RPE meestal aan de oogschelp bevestigd blijft, zijn er geen extra stappen nodig om de RPE te verwijderen in het geval dat deze aan het netvlies is bevestigd. Op dit punt kunnen de randen van het netvlies optioneel worden bijgesneden met een scalpel om krullen tijdens de afvlakkingsstap te voorkomen (Figuur 1B). - Gebruik een scalpel om het netvlies in tweeën of vieren te snijden (Figuur 1C) en gebruik vervolgens de aangepaste transferpipet om de stukjes terug te brengen naar een groot volume (≥ 100 ml) continu gecarbogeneerde Ames-media.
OPMERKING: De keuze van helften of kwarten is subjectief. Kies de beste optie voor de gewenste toepassing. - Herhaal stap 3.5 - 3.8 voor het resterende oog voordat u overgaat tot het splitsen van het netvlies.
4. Netvlies splitsen
- Gooi de Ames-media uit de petrischaaltjes en vervang deze door vers gecarbogeneerde Ames.
OPMERKING: Om de carbogenatie gedurende de rest van de netvliessplitsingsprocedure te behouden, vervangt u de media in de petrischaal ongeveer elke 5 minuten door vers gecarbogeneerde Ames. - Plaats met behulp van de aangepaste transferpipet een stuk netvlies op een glasplaatje (7.5 cm x 5 cm), met de ganglioncelzijde naar boven, en druk het vervolgens plat door de omringende vloeistof te verwijderen met een delicaat doekje (Figuur 1D). Trek indien nodig voorzichtig aan de randen van het netvlies met een penseel met fijne punt onder een dissectiemicroscoop.
- Gebruik een pincet om een droog stuk nitrocellulosemembraan van 5 mm x 5 mm op het netvlies te laten zakken, zodat het zich aan de ganglioncelzijde hecht (Figuur 1E).
OPMERKING: Als membraanverwijdering uit levend weefsel nodig is (d.w.z. voor elektrofysiologie), gebruik dan een droog stuk met serum behandeld membraan voor deze stap (zie stappen 1.1.3 - 1.1.5 voor details). Dit vermindert de sterkte van de hechting aan de ganglioncellaag, waardoor het gemakkelijker wordt om het netvlies na splitsing uit de nitrocellulose te verwijderen. - Draai het netvlies om zodat de nitrocellulose op het glasplaatje rust en plaats een droog stuk membraan van 5 mm x 5 mm op de fotoreceptorzijde van het netvlies (Figuur 1F).
- Raak de bevochtigde punt van het penseel aan op de ruimte tussen de twee membranen en laat de capillaire werking de Ames in de sandwich zuigen (Figuur 1G). Dit vermindert de hechting van de vliezen aan het netvlies en is alleen nodig als het netvlies te droog is met het delicate taakdoekje.
OPMERKING: Als het netvlies zijn glanzende uiterlijk heeft verloren, is het te droog en is stap 4.5 noodzakelijk. - Om een gelijkmatige hechting te garanderen, oefent u met een natte kwast lichte neerwaartse druk uit op het bovenste membraan (Figuur 1H).
- Terwijl u het onderste membraan met één pincet op het glas speldt, gebruikt u een langzame, gestage beweging om het bovenste membraan voorzichtig weg te trekken met een tweede pincet. Hierdoor zal het netvlies net boven de OPL splijten (Figuur 1I).
- Gooi het bovenste membraan met de fotoreceptoren weg (Figuur 1J, links). Het onderste membraan bevat het binnenste netvlies, voortaan een gespleten netvlies genoemd (Figuur 1J, rechts).
- Breng het gespleten netvlies onmiddellijk terug naar gecarbogeneerde Ames-media.
OPMERKING: Voor experimenten met levend weefsel kunnen netvliezen baat hebben bij een herstelperiode van 15-30 minuten in gecarbogeneerde Ames na splitsing.
Figuur 1: Procedure voor het splitsen van het netvlies. (A) Isoleer na enucleatie en bereiding van de oogschelp in koude PBS- of Ames-media het netvlies van de muis van de oogschelp en vervang de PBS door gecarbogeneerde Ames-media op kamertemperatuur. (B) Knip met een scalpel de randen van het netvlies weg totdat er geen gebieden meer zijn met een naar binnen gekruld (optioneel). (C) Snijd het netvlies met een scalpel in vieren of helften. (D) Plaats een stuk netvlies op een glasplaatje (ganglioncelzijde naar boven) met behulp van de aangepaste transferpipet en verwijder alle overtollige Ames met een delicaat doekje. Zorg ervoor dat het halfdroge netvlies plat op het glas ligt voordat u doorgaat naar de volgende stap. Gebruik een penseelpunt dat met Ames-bevochtiging is bevochtigd om voorzichtig delen van het netvlies te ontvouwen die niet plat zijn. (E) Plaats met een pincet een voorgesneden stuk droog nitrocellulosemembraan (5 mm x 5 mm) op het afgeplatte netvlies. (F) Draai het stuk nitrocellulose om zodat de fotoreceptorzijde van het netvlies nu naar boven wijst. Plaats vervolgens nog een droog stuk membraan op het netvlies. (G) Raak de natte punt van de borstel aan op de ruimte tussen de twee membranen en laat de capillaire werking de Ames in de sandwich zuigen. Dit vermindert de hechting van de vliezen aan het netvlies en is alleen nodig als het netvlies te droog is met het delicate taakdoekje. (H) Gebruik een natte penseelpunt om voorzichtig naar beneden te drukken op het midden van het ingeklemde netvlies. (I) Gebruik een pincet om het onderste stuk membraan op het glasplaatje vast te pinnen, terwijl u met een andere pincet het bovenste stuk membraan voorzichtig van het onderste aftrekt. (J) Het binnenste netvlies (links) blijft op het onderste membraan terwijl de fotoreceptoren (rechts) met het bovenste membraan worden weggetrokken. Panelen (A), (B), (C), (D) en (J) werden verkregen met behulp van een dissectiemicroscoop; de schaalbalk vertegenwoordigt ongeveer 1 mm; panelen (E-I) werden verkregen met een smartphonecamera zonder vergroting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
5. Voorbereiding van gespleten netvliezen voor immunofluorescentie-experimenten
NOTITIE: Het gespleten netvlies blijft tot stap 5.5 aan het nitrocellulosemembraan bevestigd. Voltooi stap 5.1, 5.2, 5.3 of 5.4, niet alle vier, want deze zijn voor verschillende experimenten.
LET OP: Gebruik geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en ga voorzichtig te werk bij het hanteren van paraformaldehyde (fixeermiddel).
- Voorbereiding voor flatmount immunofluorescentie
- Incubeer het gespleten netvlies in 4% paraformaldehyde op ijs gedurende 30 minuten met voldoende oplossing om het netvlies volledig te bedekken.
- Was het gespleten netvlies 3x in 5-10 ml PBS op kamertemperatuur. Optionele pauze: Gespleten netvliezen kunnen maximaal 24 uur in PBS bij 4 °C worden gelaten.
- Voorbereiding op immunofluorescentie met verticale doorsneden van gespleten netvlies
- Incubeer het gespleten netvlies in 4% paraformaldehyde op ijs gedurende 30 minuten met voldoende oplossing om het netvlies volledig te bedekken.
- Was het gespleten netvlies 3x in 5-10 ml PBS op kamertemperatuur. Optionele pauze: Gespleten netvliezen kunnen maximaal 24 uur in PBS bij 4 °C worden gelaten.
- Terwijl het membraan nog steeds vastzit, dompelt u het gespleten netvlies achtereenvolgens onder in 10%, 20% en 30% sucrose bij 4 °C gedurende elk 1 uur om het weefsel te cryoprotecteren.
- Veranker de cryobeschermde gespleten netvliezen in een optimale snijtemperatuur (O.C.T.) compound en bewaar ze bij -80 °C (tot 6 maanden) tot cryosectie.
- Verwijder de ingebedde gespleten netvliezen van -80 °C en gebruik een cryostaat om secties van 20 μm dik te snijden. Monteer de secties op elektrostatisch geladen glazen microscoopglaasjes, laat ze aan de lucht drogen en bewaar ze vervolgens maximaal 6 maanden bij -20 °C.
- Voorbereiding voor dubbele fluorescentie in situ hybridisatie en immunohistochemie
- Incubeer het gespleten netvlies in 4% paraformaldehyde op ijs gedurende 2 uur met voldoende oplossing om het netvlies volledig te bedekken.
- Was het gespleten netvlies 3x in 5-10 ml PBS op kamertemperatuur. Optionele pauze: Gespleten netvliezen kunnen maximaal 24 uur in PBS bij 4 °C worden gelaten.
- Voorbereiding op elektrofysiologie
- Bereid patchpipetten voor door dikwandige borosilicaatglazen pipetten met filament te trekken met behulp van een micropipettrekker. Gebruik alleen pipetten met een gemeten weerstand tussen 6-10 MΩ.
- Vul de getrokken pipetten met een inwendige oplossing die (in mM) bevat: 125 K-gluconaat, 8 KCl, 5 HEPES, 1 MgCl 2, 1 CaCl 2,0,2 EGTA, 3 ATP-Mg en 0,5 GTP-Na.
- Verwijdering van het gespleten netvlies van het nitrocellulosemembraan
- Gebruik een hydrofobe barrièrepen om cirkelvormige putjes te maken op een microscoopglaasje (~1 cm in diameter) en laat ze 5-10 minuten aan de lucht drogen.
- Plaats de gespleten netvliezen in de voorbereide hydrofobe barrièrepenputjes en voeg voldoende PBS toe om ze volledig te bedekken.
- Duw onder een dissectiemicroscoop de haren van een fijn penseel onder de randen van het weefsel en til ze voorzichtig omhoog. Werk op deze manier in een cirkel rond het netvlies om het van het membraan weg te tillen.
- Gebruik een pincet om het vlies onder het zwevende stukje netvlies vandaan te halen.
- Zuig de resterende PBS voorzichtig weg zodat het stukje netvlies op het microscoopglaasje komt te rusten, met de ganglion naar beneden naar beneden.
OPMERKING: De volgende stappen mogen niet opeenvolgend worden uitgevoerd. Kies het juiste protocol voor de gewenste toepassing (d.w.z. immunokleuring of dubbele fluorescentie in situ hybridisatie [FISH] en immunohistochemie [IHC] of elektrofysiologie).
6. Immunokleuring
- Als ze nog niet voorbereid zijn, gebruik dan een hydrofobe barrièrepen om cirkelvormige putjes te maken op een microscoopglaasje (~1 cm in diameter) en laat ze 5-10 minuten aan de lucht drogen. Alle incubatie- en wasstappen worden uitgevoerd in deze hokken.
- Incubeer de gespleten netvliezen of verticale gespleten netvliessecties in antilichaamincubatieoplossing (AIS: 3% paardenserum, 0,5% Triton X-100, 0,025% NaN3 in PBS) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Incubeer de gespleten netvliezen of verticale gespleten netvliescoupes met primaire antilichamen verdund in AIS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
OPMERKING: De incubatietijd van primaire antilichamen vereist optimalisatie voor verschillende eiwitdoelen en antilichamen. - Was de tissue 3x in PBS op kamertemperatuur.
- Incubeer het weefsel met secundaire antilichamen verdund in AIS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Was de tissue 3x in PBS op kamertemperatuur.
- Als nucleaire kleuring gewenst is, incubeer het weefsel dan met DAPI verdund in PBS gedurende 30 s bij kamertemperatuur. Was de tissue 1x in kamertemperatuur PBS.
- Breng een druppel dia-montagemedia aan op elk stuk tissue en monteer een glazen dekglaasje.
- Breng nagellak aan rond de randen van het dekglaasje om het monster te verzegelen. Bewaar het glaasje bij 4 °C.
7. Dubbele FISH en IHC
- Bak de gespleten netvliezen 30 minuten op 40 °C in een hybridisatieoven om de hechting aan het glaasje te vergroten.
- Voltooi het RNAscope FISH-protocol volgens het protocol van de fabrikant met de volgende uitzonderingen en wijzigingen:
- Er is geen stap nodig om het antigeen op te halen. Gebruik protease III met een incubatietijd van 18 min bij kamertemperatuur.
- Voer alle wasstappen uit op de glijbaan in de putjes gemaakt door een hydrofobe barrièrepen.
- Incubeer de monsters in primair antilichaam verdund (zie Materiaaltabel) in PBS gedurende 30 minuten bij 40 °C in de hybridisatieoven. Was de monsters 3x in PBS op kamertemperatuur.
- Incubeer de monsters in secundair antilichaam verdund (zie materiaaltabel) in PBS gedurende 30 minuten bij 40 °C in de hybridisatieoven. Was de monsters 3x in PBS op kamertemperatuur.
- Incubeer de monsters in 1x DAPI gedurende 30 s bij kamertemperatuur. Was de monsters 1x in kamertemperatuur PBS.
- Breng een druppel anti-fade montagemedia aan op elk stuk weefsel en monteer een glazen dekglaasje.
- Breng nagellak aan rond de randen van het dekglaasje om het monster te verzegelen. Bewaar het glaasje bij 4 °C.
8. Elektrofysiologie
- Breng na het verwijderen van het nitrocellulosemembraan een gespleten netvlies over in de opnamekamer van de patch-clamp en veranker het voorzichtig op zijn plaats met een platina harp.
- Doordrenk het gespleten netvlies tijdens het experiment continu met Ames-oplossing gecarbogeneerd met 95%O2 en 5% CO2. Houd de oplossing tussen 32-34 °C.
OPMERKING: Tijdens het experiment kan het weefsel worden gevisualiseerd met behulp van Dodt-gradiëntcontrastmicroscopie. - Voer onder kamerverlichting een spanningsklemming van de hele cel uit om op te nemen van INL-neuronen.
- Simuleer tijdens het opnemen lichtreacties met behulp van een microcellulaire injectie-eenheid om farmaceutische verbindingen toe te passen, of een 470 nm LED om kanaalrhodopsine (ChR2) te stimuleren.
NOTITIE: De lichtintensiteit kan worden gemeten met behulp van een digitale optische vermogensmeter.
- Simuleer tijdens het opnemen lichtreacties met behulp van een microcellulaire injectie-eenheid om farmaceutische verbindingen toe te passen, of een 470 nm LED om kanaalrhodopsine (ChR2) te stimuleren.
9. Confocale microscopie
- Voor confocale immunofluorescentie maakt u foto's met een confocale microscoop met behulp van een 40x/1.3 of 63x/1.40 olie-immersieobjectief. Gebruik FIJI om de helderheid en het contrast aan te passen en om Z-projecties te genereren op basis van beeldstapels.
Representative Results
Retina-splitsing behoudt fotoreceptorterminals
Om te bevestigen dat het splitsen van het netvlies de dendrieten van neuronen van de tweede orde in de OPL niet beschadigt, werden verticale secties van gespleten netvliezen gekleurd met antilichamen tegen het synaptische blaasjeseiwit synaptofysine (groen) en eiwitkinase C-alfa (PKCα; rood). De intense band van synaptofyse-etikettering over de bovenkant van het gespleten netvlies geeft aan dat de synaptische uiteinden van de fotoreceptor behouden blijven (Figuur 2). Bovendien onthult PKCα-kleuring de normale morfologie van staafbipolaire cellen (RBC's). Er zijn geen fotoreceptorkernen zichtbaar, wat aangeeft dat het netvlies is gesplitst tussen de OPL en de binnenste rij fotoreceptorcellichamen (Figuur 2).
Figuur 2: Gespleten netvliezen behouden fotoreceptorterminals. Fluorescerende confocale microfoto's die een verticale dwarsdoorsnede tonen van een spuugnetvlies dat werd gecryosectie (20 μm dikte) na de splitsingsprocedure. Elk beeld is een maximale projectie van een confocale z-stack. De sectie werd immunogelabeld met antilichamen tegen PKCα (midden boven) en synaptofysine (rechtsboven) om respectievelijk RBC's en synaptische blaasjes te visualiseren. De samengevoegde afbeelding (onder) toont synaptische blaasjes (groen), die zich in de fotoreceptorterminals bevinden, net boven de apicale processen van de RBC's (rood) in de OPL. Celkernen zijn gelabeld met DAPI (blauw). Binnen de ONL zijn geen fotoreceptorkernen zichtbaar. Afkortingen: ONL = buitenste kernlaag; OPL = buitenste plexiforme laag; INL = binnenste kernlaag; IPL = binnenste plexiforme laag; GC = ganglioncellen. Schaalbalken = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Synapsmorfologie in de OPL blijft behouden na splitsing van het netvlies
Met behulp van een muis die GFP tot expressie brengt in RBC's onder de pcp2-promotor 14, werden pre- en postsynaptische eiwitten in de OPL immunogelabeld om de integriteit van deze synaptische laag te beoordelen na een splitsing14. Ondanks de schuifkrachten die optreden door de axonen van de fotoreceptoren, verstoort splitsing de morfologie van fotoreceptor-BC-synapsen in de OPL niet, aangezien de normale positionering van RBC-dendrieten, gelabeld voor RGS11, en fotoreceptorsynaptische linten, gelabeld voor CtBP215, wordt waargenomen (Figuur 3). Voor elk synaptisch contact tussen staafjes en RBC's kan RGS11 worden gezien als rode puncta die binnen de hoefijzervorm van de synaptische linten liggen (groen). In een volgend experiment werd een anti-GPR179-antilichaam 16 gebruikt om de postsynaptische ON-BC dendritische tips16 te labelen, en een anti-PSD-95-antilichaam werd gebruikt om pre-synaptische staaffotoreceptorterminals te labelen (aanvullende figuur 2). Deze resultaten bevestigen opnieuw de stabiliteit van de OPL in het gespleten netvliespreparaat, aangezien wordt aangetoond dat RBC-dendrieten nauw associëren met hun pre-synaptische partner, de staafterminals.
Figuur 3: De morfologie van de synaps in de OPL blijft behouden na splitsing van het netvlies. Confocale immunofluorescentiebeelden van een gespleten netvlies van een transgene muis die GFP tot expressie brengt in RBC's onder de Pcp2-promotor. Niveaus van GFP-expressie (blauw) variëren tussen rode bloedcellen in het netvlies. Na splitsing werd het netvlies gefixeerd en vervolgens geïncubeerd met antilichamen tegen CtBP2 (groen) en RGS11 (rood) om respectievelijk fotoreceptorsynaptische linten en ON-BC dendritische uiteinden te labelen. Elk rood-groen paar vertegenwoordigt een synaptisch contact tussen een staaf en een ON-BC. Schaalbalken = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Netvliessplitsing handhaaft de levensvatbaarheid van RBC
Om de levensvatbaarheid van de binnenste retinale neuronen na een splitsing te beoordelen, werd een membraanondoordringbare, nabij-infrarood nucleaire kleurstof (MI-NIR) gebruikt, die de identificatie van dode cellen mogelijk maakt. Na incubatie met MI-NIR werden gespleten netvliezen gefixeerd en vervolgens gelabeld met anti-PKCα om RBC's te identificeren. Confocale microfoto's van het gespleten netvlies onthullen regionale variabiliteit in de levensvatbaarheid van cellen in het weefsel, waarbij sommige regio's hogere percentages celdood ervaren dan andere. Deze variabiliteit kan het gevolg zijn van schade aan bepaalde delen van het netvlies tijdens de dissectie-, splitsings- of behandelingsprocedures (Figuur 4). Aangezien de cellichamen van RBC's zich in het ultraperifere gebied van de INL bevinden, dicht bij de plaats van de splitsing, was een zorgvuldige evaluatie van hun levensvatbaarheid gerechtvaardigd. Schaarse colokalisatie van PKCα en MI-NIR bevestigde dat de meeste rode bloedcellen levensvatbaar blijven na netvliessplitsing (Figuur 4).
Figuur 4: Rod bipolaire cellen zijn levensvatbaar na netvliessplitsing. Fluorescerende confocale microfoto's die een gebied van een gespleten netvlies tonen in een flatmount-perspectief. Na het splijten werd het levende netvlies gedurende 30 minuten bij 37 °C geïncubeerd met MI-NIR-kleurstof (rood). Het netvlies werd vervolgens gefixeerd en immunogelabeld met antilichamen tegen PKCα om rode bloedcellen te visualiseren. In dit deel van het netvlies komt colokalisatie van PKCα en MI-NIR niet vaak voor. MI-NIR colokaliseert met kernen (blauw) die niet tot RBC's behoren. Afkortingen: MI-NIR = membraan ondoordringbare NIR levende/dode vlek. Schaalbalken = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Gespleten netvliezen zijn vatbaar voor dubbele FISH en IHC
Door de fixatietijd voor standaard IHC te verlengen, kunnen gespleten netvliezen achtereenvolgens worden verwerkt door FISH en IHC om mRNA's en eiwitten tegelijkertijd te labelen17,18. Experimenten bevestigden dat een fixatie van 2 uur in 4% paraformaldehyde robuuste mRNA-etikettering oplevert met behoud van eiwitepitopen voor antilichaambinding. FISH werd uitgevoerd op gespleten netvliezen gevolgd door IHC om de expressie van de GABA A-receptorsubeenheid δ (GABRD; anti-sense mRNA-sondes) te visualiseren in relatie tot de positie van RBC's (anti-PKCα-antilichaam) in de buitenste INL (Figuur 5A). GABRD-mRNA-expressie lijkt zeldzaam in RBC's (Figuur 5A); het transcript wordt echter overvloedig tot expressie gebracht door amacriene cellen en ganglioncellen, zoals blijkt uit het etiketteringspatroon op dwarsdoorsneden van een intact netvlies (Figuur 5B). In de buitenste INL (Figuur 5A) is GABRD-mRNA gelijkmatiger verdeeld in vergelijking met de binnenste INL (Figuur 5C), waar het geconcentreerd is in verschillende cellen. Antisense-sondes die zich richten op andere GABA-receptorsubeenheden produceren verschillende etiketteringspatronen, die de specificiteit van de sondes aantonen (gegevens niet getoond).
Figuur 5: Dual FISH en IHC in een gespleten netvlies en een intact netvlies. (A, C) Confocale microfoto's van een flatmount gespleten netvlies en (B) een verticale doorsnede van een intact netvlies. Beelden in (A) en (C) zijn maximale projecties van optische secties in respectievelijk de bovenste en onderste regionen van de INL. De gestippelde rechthoeken in (B) vertegenwoordigen bij benadering de grenzen die worden gebruikt om de projecties in (A) en (C) te maken. Het gespleten netvlies (A, C) werd gedurende 2 uur gefixeerd en vervolgens gelabeld met antisense mRNA-sondes tegen GABRD (rood). Daarna werd het gespleten netvlies gekleurd met antilichamen tegen PKCα om RBC's (groen) te labelen. Het PKCα-kanaal werd voor de duidelijkheid weggelaten uit projecties van de lagere INL. Het intacte netvlies in (B) werd gedurende 24 uur gefixeerd voordat het werd doorgesneden. Daarna werd het vaste netvlies gelabeld met antisense mRNA-sondes tegen GABRD (rood). Alle monsters werden gedurende 20 seconden gekleurd met DAPI (blauw) voordat ze op het dekglaasje werden gemonteerd. Afkortingen: INL = binnenste kernlaag. Schaalbalken = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Gespleten netvliezen zijn zeer geschikt voor patch-clamp elektrofysiologische opname van BC's en HC's
Om een BC- of HC-soma in een traditioneel netvlies van de hele berg te patchen, moet de pipet benaderen vanaf de kant van de ganglioncellen of de fotoreceptoren. Beide benaderingen vereisen het doorkruisen van verschillende retinale lagen om de INL te bereiken, waarbij de pipetpunt vaak wordt geblokkeerd door vuil. Bij een vibratome slice-bereiding zijn de BC- en HC-soma's gemakkelijk toegankelijk, maar hun dendritische processen kunnen worden verbroken, waardoor hun laterale verbindingen worden verstoord. In gespleten netvliezen zitten de cellichamen van RBC's en HC's echter aan het oppervlak van het weefsel, waardoor de toegang tot patchpipetten sterk wordt verbeterd terwijl de laterale circuits van de OPL behouden blijven.
Figuur 6 toont chemisch gesimuleerde lichtreacties van BC's in een gespleten netvlies. Geperfundeerd Ames-medium werd aangevuld met L-AP4 (4 μM), een groep III mGluR-agonist, om de afgifte van glutamaat uit fotoreceptoren in het donker te simuleren. De mGluR6-antagonist, CPPG (600 μM, in Ames), werd op de dendrieten van de gepatchte cel (gehouden op -60 mV) geblazen om een lichtflits te simuleren via remming van mGluR6. Cellen reageerden op CPPG-pufjes met twee soorten inwaartse stromen. Eén type vertoont een voorbijgaande stroom gevolgd door een plateau (Figuur 6A), vergelijkbaar met de canonieke lichtopgewekte stromen die worden geregistreerd door RBC's in plakjes van het netvlies19. Het andere type blijft gedurende de hele trekduur in stand (Figuur 6B) en lijkt op stromen die worden geregistreerd door bipolaire cellen met ON-kegels (ON-CBC)19.
Een apart experiment werd uitgevoerd om HC's aan te pakken, een celtype met een breed dendritisch veld dat vaak moeilijk te behouden is in plakpreparaten. Een muislijn die kanaal rodopsine (ChR2) en GFP in HC's tot expressie brengt, werd gebruikt om gemakkelijke identificatie onder een fluorescentiemicroscoop te vergemakkelijken. Eerst werden stromen van HC's geregistreerd als reactie op een reeks depolarisatiestappen (-100 mV tot 50 mV, stapgrootte = 15 mV) waarop ze reageerden met inwaartse stromen gevolgd door uitwaartse stromen (Figuur 6C). Deze cellen werden vervolgens gestimuleerd met een korte blauwlichtpuls (200 ms, 470 nm) die grote, ChR2-aangedreven inwaartse stromen in twee cellen produceerde (Figuur 6D).
Figuur 6: Patch clamp opnames van INL neuronen in gespleten netvliezen . (A) A vermeend RBC en (B) CBC werden spanningsgeklemd bij -60 mV in geperfuseerde Ames-media die L-AP4 (4 μM) bevatten. Het puffen van CPPG (600 μM) op de dendrieten van de vastgeklemde cellen wekte een inwaartse stroom op die van voorbijgaande aard was in de RBC maar in stand werd gehouden in de CBC. De RBC-registratie in (A) is een enkel spoor, terwijl de CBC-registratie in (B) het gemiddelde van 3 sporen vertegenwoordigt. (C) Een patchklemopname van een HC in een vGATFLPo; vGlut2Cre; Ai80d muis. De rode lijn toont de duur van een lichtpuls van 200 ms en 470 nm die wordt gebruikt om de grote, inkomende stroom door ChR2 op te roepen. (D) Geïnjecteerde stroomresponsen van een HC die onder spanning werd geklemd op -60 mV, vervolgens tussen -70 mV en +35 mV stapte in intervallen van 15 mV en terugkeerde naar -60 mV. De inzet toont dezelfde sporen in een venster van 6 ms rond het begin van de spanningsstap. (E) Immunofluorescerende microfoto van een flatmount gespleten netvlies waarop horizontale cellen te zien zijn die GFP tot expressie brengen in een vGATFLPo; vGlut2Cre; Ai80d muis. Schaalbalk = 20 μm. Elektrofysiologische gegevens werden verzameld met een bemonsteringsfrequentie van 20 kHz en gefilterd met een laagdoorlaatfilter van Bessel op 5 kHz. Gegevens werden vervolgens geëxporteerd en offline visualisatie en analyse werden uitgevoerd met behulp van Python 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Netvliessplitsing maakt snelle ondervraging van INL- en OPL-anatomie mogelijk
Het externe beperkende membraan (ELM) en ONL van het netvlies vormen een barrière van ~90 μm dik, die de diffusie van antilichamen in het binnenste netvlies belemmert en suboptimale immunokleuringsomstandigheden creëert20,21,22. Daarom vereist het immunolabelen van doelen in de OPL of INL met behulp van een conventioneel flatmount netvlies tijdrovende kleuringsprotocollen die vaak 48-96 uur antilichaamincubaties vereisen 5,6,7,8,20,22.
Het verwijderen van de fotoreceptoren zorgt voor een snelle penetratie van antilichamen in de binnenste retinale neuronen. Als gevolg hiervan kan labeling van eiwitdoelen in het netvlies in slechts 1 uur worden bereikt met behulp van kleurstofgeconjugeerde primaire antilichamen. Antilichamen tegen PKCα en Calbindin-D werden gebruikt om respectievelijk RBC's en HC's van de INL te labelen (Figuur 7). In tegenstelling tot traditionele verticale netvliessecties die de laterale processen van breedveldneuronen afkappen, maakt de gespleten netvliesvoorbereiding visualisatie mogelijk van het volledige dendritische prieel van breedveldcellen zoals HC's (Figuur 6E, Figuur 7).
Figuur 7: Snelle immunolabeling van eiwitten in het binnenste van het netvlies in een gespleten netvlies. Confocale immunofluorescentiebeelden van een gespleten netvlies vanuit een flatmount-perspectief. Het gespleten netvlies werd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met antilichamen tegen PKCα (geel) en Calbindin-D (groen) om respectievelijk ON-BC's en HC's te labelen. (A) Elk enkelkanaals beeld is een gemiddelde Z-projectie die bestaat uit vier optische secties: DAPI, Gemiddeld z10-13; Calbindin-D, Gemiddeld z11-14; PKCα, Gemiddeld z11-14. (B) In het samengevoegde beeld worden dezelfde projecties over elkaar heen gelegd. Schaalbalken = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Belangrijkste stadia van de netvliesdissectie. Alle foto's zijn gemaakt met een smartphonecamera die op de oculaire lenzen van een dissectiemicroscoop is gemonteerd. (A) Een top-down afbeelding van een muizenoog na verwijdering van het hoornvlies. (B) Een afbeelding van bovenaf van de oogschelp van de muis nadat de lens is verwijderd. (C) Er wordt een kleine incisie gemaakt in de sclera op de oogschelp van de muis. Pijlen geven de twee flappen van de sclera aan die met een tang in tegengestelde richting worden getrokken om het netvlies van de sclera te scheiden. (D) Nadat de sclera gedeeltelijk van het netvlies is weggetrokken, wordt een Vannas-schaar tussen de sclera en het netvlies ingebracht en wordt de oogzenuw doorgesneden, waardoor het netvlies vrijkomt. De rode gestippelde cirkel toont de oogzenuwkop en de schaar demonstreert het juiste snijtraject (steek een schaar tussen de sclera en het netvlies). Het geïsoleerde netvlies na de sclera wordt weggewrikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Karakterisering van pre- en postsynaptische componenten van de OPL in het gespleten netvlies. Confocale immunofluorescentiebeelden van de OPL in een gespleten netvlies. Het gespleten netvlies werd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met antilichamen tegen GPR179 en PSD95 om te labelen op respectievelijk de dendritische uiteinden van ON-BC's en de uiteinden van staaffotoreceptoren. De linker- en middenbeelden zijn maximale projecties van verschillende optische secties; Dezelfde projecties worden over elkaar heen gelegd in het meest rechtse beeld. GPR179 puncta in de ON-BC dendritische uiteinden worden gezien als nauw geassocieerd met de staaffotoreceptorterminals, wat intacte synaptische contacten binnen de OPL aantoont. Schaalbalken = 10 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3: Probleemoplossing: beoordeling van de kwaliteit van een gespleten netvlies. Fluorescerende microfoto's van een gespleten netvlies gekleurd met DAPI om celkernen te visualiseren. Cellen kunnen worden geïdentificeerd op basis van de diameter en weefseldiepte van de kern. (A) Fotoreceptorkernen zijn kleiner, helderder en oppervlakkiger, terwijl (B) BC-kernen groter, zwakker en dieper zijn. (C) Een beeld met een lage vergroting van een gebied waar fotoreceptoren onvolledig zijn verwijderd. De kernen die scherp verschijnen, zijn afkomstig van BC's, die dieper zijn dan de fotoreceptorkernen aan de randen van het beeld die onscherp lijken. Schaalbalken voor (A) en (B) = 20 μm. Schaalbalk voor (C) = 50 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Nadat fotoreceptoren de absorptie van fotonen hebben omgezet in de afgifte van neurotransmitters, zijn BC's en HC's de eerste retinale neuronen die het visuele signaal verwerken23. Hoewel het belang van deze neuronen goed wordt gewaardeerd, worden veel van hun functies niet volledig begrepen of helemaal niet onderzocht. Veel BC- en HC-fysiologiestudies zouden waarschijnlijk baat hebben bij een flatmount retina-preparaat dat de toegang tot INL-neuronen verbetert met behoud van laterale connectiviteit. De ontwikkeling van de gesplitste netvliesmethode is een poging om een eenvoudig protocol te bieden voor het verkrijgen van elektrofysiologische opnames en microscopiegegevens van hoge kwaliteit van BC's en HC's in een flatmount-oriëntatie. De hier beschreven voorbereiding van het gespleten netvlies kan worden uitgevoerd in ongeveer 20 minuten per muis (10 minuten per netvlies) na netvliesisolatie, zonder het gebruik van gespecialiseerde apparatuur. De methode is geïnspireerd op bestaande procedures voor het verwijderen van fotoreceptoren, maar biedt aanzienlijke verbeteringen in eenvoud, snelheid en veelzijdigheid 4,10,11,12,13. In tegenstelling tot eerdere methoden voor het scheiden van retinale lagen, vereist het splitsen van het netvlies geen bevriezing, vriesdrogen of herhaalde toepassing van kleefstoffen op het netvlies. Met wat oefening kunnen bijna alle fotoreceptoren in één scheur met het nitrocellulosemembraan worden verwijderd. De snelheid en het gemak van deze aanpak stelt iemand in staat om de tijd die het netvlies doorbrengt buiten gecarbogeneerde Ames te minimaliseren, waardoor een hoge cellevensvatbaarheid gedurende lange perioden mogelijk is; gespleten netvliezen kunnen gedurende enkele uren na de splitsing in gecarbogeneerde Ames-media worden gehandhaafd. Als bewijs van de gezondheid van INL-neuronen in dit preparaat, bevestigen een levende/dode celkleuring (Figuur 4) en patch-clamp elektrofysiologie (Figuur 6) de levensvatbaarheid van RBC's en HC's na een splitsing.
Het verwijderen van de fotoreceptorlaag in gespleten netvliezen levert een aanzienlijk voordeel op tijdens immunolabeling door de diffusietijd voor antilichamen in de INL drastisch te verkorten. Primaire en secundaire antilichaametikettering kan binnen 2 uur worden voltooid, een aanzienlijke verbetering ten opzichte van conventionele flatmount-kleuring die 72 uur of langer kan duren, afhankelijk van het doel 5,6,7,8,20,22. Als gevolg hiervan kunnen microscopiegegevens op dezelfde dag als weefselvoorbereiding worden verkregen, waardoor het tempo van immunofluorescentie-experimenten drastisch wordt versneld. Om het gloeien van mRNA-sondes te vergemakkelijken, bevelen FISH-experimenten doorgaans veel langere fixatietijden (~24 uur) aan dan immunolabeling18. De hier gepresenteerde experimenten tonen echter aan dat een fixatie van 2 uur nog steeds een uitzonderlijke FISH-etikettering oplevert (Figuur 5). Ondanks het verlengen van de fixatietijd van 30 minuten tot 2 uur, was het niet nodig om stappen voor het ophalen van antigeen uit te voeren om een uitstekende immunolabeling te verkrijgen, maar dit kan variëren met het antilichaam of antigeen. De proteasebehandeling in het FISH-protocol kan interfereren met de etikettering van antilichamen, waarschijnlijk als gevolg van de vernietiging van doelepitopen. Dit probleem werd omzeild door polyklonale antilichamen te gebruiken die zich richten op meerdere epitopen, waardoor de kans kleiner werd dat epitoopvernietiging de immunolabeling zou belemmeren. Daarnaast werd een matige proteasebehandeling (ACD-protease III) gebruikt om overmatige epitoopverandering te voorkomen en toch voldoende weefselpenetratie te bieden.
Af en toe zal het netvlies in plaats daarvan door de buitenste nucleaire laag (ONL) splijten, waardoor lagen fotoreceptorsomas achterblijven zonder zichtbare INL-cellen. Om dit te voorkomen, moet men ervoor zorgen dat het netvlies volledig plat op het glas ligt en dat eventuele resterende vloeistof rond het netvlies is verwijderd. Door met het penseel steviger op de nitrocellulose te drukken, kan ook worden voorkomen dat de ONL doorsplijt. Als het vlies te nat wordt of het netvlies over zichzelf wordt gevouwen, wordt de kans op een succesvolle splitsing sterk verkleind. Het gebruik van DAPI om celkernen te kleuren is nuttig voor het beoordelen van de kwaliteit van de splitsing en voor het bepalen van de dekking van resterende fotoreceptoren. Fotoreceptorkernen zijn kleiner, helderder en oppervlakkiger (aanvullende figuur 3A), terwijl BC-kernen groter, zwakker en dieper zijn (aanvullende figuur 3B). In sommige gevallen zal het vlak van de scheur enigszins variëren over het stuk netvlies, wat resulteert in plekken waar de cellichamen van fotoreceptoren niet volledig zijn verwijderd (aanvullende figuur 3C). Voor toepassingen in de microscopie en elektrofysiologie belemmert dit niet de mogelijkheid om kwaliteitsgegevens te verzamelen uit regio's waar fotoreceptoren op de juiste manier zijn verwijderd; Grote velden van blootliggend binnenste netvlies kunnen gemakkelijk worden gevonden bij beeldvorming of opname met een patchpipet. Als een volledigere verwijdering van de fotoreceptor gewenst is, kan een tweede scheur worden uitgevoerd met een extra stuk nitrocellulosemembraan, hoewel 100% verwijdering van de fotoreceptor niet gegarandeerd is. Voorzichtigheid is daarom geboden bij het gebruik van gespleten netvliezen in genexpressie- of proteomics-onderzoeken waarbij resterend fotoreceptormateriaal de resultaten kan beïnvloeden. Voor toepassingen met één cel is deze zorg ongegrond, omdat gegevens van fotoreceptoren kunnen worden uitgesloten van analyse.
De voordelen van het gespleten netvliespreparaat zijn misschien wel het meest in het oog springend bij elektrofysiologische opnames van breedveldinterneuronen. Terwijl traditionele verticale plakjes de uitgebreide processen van breedveldcellen verbreken, laat de gespleten netvliesbereiding de OPL en IPL intact, waardoor men input kan opvangen van breedveldcellen zoals HC's 24, A17s 25, TH AC's26 en NOS-1 AC's27 die anders over het hoofd zouden worden gezien in verticale plakjes. Daarom moet zorgvuldig worden nagedacht over de interpretatie van de resultaten en de vergelijking met eerdere gegevens die zijn verzameld uit plakjes van het netvlies. Niettemin, in experimenten met farmacologische nabootsingen van lichtstimulatie, lijken deze resultaten op gegevens die zijn vastgelegd uit plakjes netvlies19. Door ChR2 tot expressie te brengen onder celspecifieke promotoren, kan men een gewenste celpopulatie stimuleren tijdens het opnemen van BC's in de INL om de impact van de gewenste cel op de verticale informatieroute te onderzoeken. Directe opname van diepere INL-neuronen, zoals amacriene cellen, is ook mogelijk in het gespleten netvlies. Hoewel in dit geval de patch-elektrode eerst door de meer oppervlakkige INL-neuronen moet reizen, is er aanzienlijk minder weefsel dat zijn pad blokkeert in vergelijking met een traditioneel preparaat voor de hele montage.
Naast het meten van de invloed van breedveldcellen op andere neuronen, maakt deze methode het mogelijk om direct eencellige patchklemmen te plaatsen van HC's, waarvan de dendrieten een uitgebreid gap-junction gekoppeld netwerk vormen in de OPL28. Horizontale cellen sturen kritische feedback naar fotoreceptoren die de overdracht van verticale informatie door het netvlies vormgeven. Omdat de dendritische velden van HC's echter in verticale plakjes zijn afgekapt, ontbreken opnamegegevens van één cel. Dit werk presenteert anatomisch en fysiologisch intacte HC's van waaruit ChR2-opgewekte stromen worden geregistreerd in een drievoudige transgene muislijn (Figuur 6 C-E). Buiten ChR2-stimulatie kan het gespleten netvlies worden gebruikt om endogene HC-stromen en gap junction coupling28 te bestuderen. Hoewel het gespleten netvlies een handig model biedt voor het bestuderen van synaptische connectiviteit en neuronale activiteit geïnduceerd door chemische toepassing of ChR2-stimulatie, sluit het ontbreken van fotoreceptoren elke directe verkenning van natuurlijke lichtreacties of lichtaanpassingsmechanismen uit.
In situ beeldvorming in het netvlies heeft de afgelopen jaren bewonderenswaardige vooruitgang geboekt. De meeste beeldvormende onderzoeken zijn echter beperkt tot de ganglioncellaag in netvliespreparaten van de hele berg29. De auteurs stellen zich voor dat de afwezigheid van fotoreceptoren in het gespleten netvlies het een ideaal model zal maken voor live calciumbeeldvorming in de OPL en INL. Naast calciumbeeldvorming heeft dit model een groot potentieel voor gebruik met genetisch gecodeerde biosensoren zoals iGluSnFR 30,31, iGABASnFR32 en pHluorin33. In combinatie met de voorbereiding van het gespleten netvlies kunnen deze krachtige hulpmiddelen een efficiënte benadering bieden voor het onderzoeken van de synaptische interacties en biofysische eigenschappen van BC's en HC's die bijdragen aan de lichtverwerking in het netvlies.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige financiële belangen zijn.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de volgende NIH-subsidies: NIH-subsidie R01EY031596 (aan C.M.); NIH-subsidie R01EY029985 (aan C.M.); NIH-subsidie P30EY010572 (aan C.M.); NIH-subsidie R01EY032564 (aan BS). We danken Tammie Haley voor haar technische ondersteuning bij het voorbereiden van netvliessecties, en Dr. Charles Allen voor het genereus bijdragen van de mRNA FISH-sondes die in dit werk worden gebruikt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1.5 glass coverslips | Fisherbrand | 12544E | |
| 2 pairs of Dumont #5 forceps | Ted Pella | 38125 | |
| 25 gauge needle | Becton Dickenson | 305122 | |
| 470 nm LED | THORLABS | M470L2 | |
| 5-306 curved scissors | Miltex | 5-306 | |
| 9" disposable pasteur pipetes | Fisherbrand | 13-678-20D | for constructing custom transfer pipette |
| Ai80d mouse | Jackson Laboratories | 25109 | RRID: IMSR_JAX:025109 |
| Ames Medium w/L-Glutamate | US Biological | A1372-25 | |
| amplifier control software | Molecular Devices | Clampex 10.3 software | |
| anti-calbindin D28K antibody | Invitrogen | PA-5 85669 | RRID: AB_2792808, host species = rabbit; 1:100 dilution |
| anti-CtBP2 antibody | BD Biosciences | 612044 | RRID: AB_399431, host species = mouse; 1:5000 dilution |
| anti-GPR179 antibody | NA | NA | gift from Kirill Martemyanov; Scripps Research Institute, Jupiter, FL; host species = sheep; 1:1000 dilution |
| anti-PKC alpha antibody | Sigma-Aldrich | P4334 | RRID: AB_477345, host species = rabbit; 1:5000 dilution |
| anti-PKC alpha antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc8393 AF594 | RRID: AB_628142, host species = mouse; 1:1000 dilution |
| anti-PSD95 antibody | BD Transduction Laboratories | 610495 | RRID: AB_397862, host species = mouse; 1:1000 dilution |
| anti-RGS11 antibody | NA | NA | gift from Ted Wensel; Baylor College of Medicine, Houston, TX; host species = rabbit; between 1:1000 and 1:5000 dilution |
| anti-Synaptophysin P38 antibody | Sigma | S-S5768 | RRID: AB_477523, host species = mouse; 1:1000 dilution |
| Aquamount mounting media | Epredia | 13800 | slide mounting media |
| C57BL/6J mouse | Jackson Laboratories | 000664 | RRID: IMSR_JAX:000664 |
| carbogen tank | Matheson | NA | 95% O2 and 5% CO2 |
| custom transfer pipette | custom build | NA | Instructions: use scissors to cut off the tip of a plasitc transfer pipette at the point it begins to taper. Use pliers to safely break off the last 2-3 inches of a glass pasteur pipette. Fit the narrow end of the glass pasteur pipette into the wide tip of the plastic transfer pipete. Wrap parafilm around the joint of the two pieces to enhance the seal. |
| Digitical optical power meter | THORLABS | PM100D | |
| dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| electrophysiology amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
| electrophysiology microscope | Olympus | OLYMPUS, BX50WI | Dodt gradient contrast microscopy |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| HC PL APO CS2 40x/1.3 | Leica | 506358 | |
| HC PL APO CS2 63x/1.40 | Leica | 15506350 | |
| Hybridization oven | Robbins Scientific | Model 1000 | for RNAscope protocol only |
| Immedge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| isoflurane | Piramal Critical Care | 66794-017-25 | |
| Kimwipe (delicate task wipe) | Kimtech Science | 34155 | |
| Leica HC PL APO CS2 40x/1.3 oil immersion objective | Leica | 506358 | |
| Leica HC PL APO CS2 63x/1.40 oil immersion objective | Leica | 15506350 | |
| Leica TCS SP8 X confocal microscope | Leica | discontinued | |
| medium 15 mm petri dish | Corning | 25060-60 | eyes are kept here during retina dissection |
| Merit 97-275 steel scissors | Merit | 97-275 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | p-97 | |
| Mm-Gabrd-C2 mRNA probe | ACD | 459481-C2 | |
| mouse euthanasia chamber | NA | NA | custom build; glass petri dish covering a small glass jar. |
| nitrocellulose membrane filters | GE Healthcare Life Sciences; Whatman | 7184-005 | 0.45 µm pore size |
| Picospritzer | General Valve Corporation | Picospritzer II | referred to in the text as microcellular injection unit |
| plastic transfer pipets | Fisherbrand | 13-711-7M | for constructing custom transfer pipette |
| Plastic tubing | Tygon | R-603 | for connection to carbogen tank |
| platinum harp | custom build | NA | for anchoring split retinas within the electrophysiology recording chamber. |
| size 0 paint brush | generic | NA | for flattening retina during splitting. |
| SlowFade Gold antifade reagent | Molecular Probes | S36937 | referred to in the text as anti-fade mounting media |
| small 10 mm petri dish | Falcon | 353001 | eyes are placed here following enucleation |
| small glass pane (7.5 cm x 5 cm) | generic | NA | isolatd retina pieces are placed onto this for the splitting procedure |
| Superfrost plus microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | electrostatically-charged glass microscope slides |
| Thick-walled borosilicate glass pipettes with filament | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | |
| Vannas Scissors; straight | Titan Medical | TMS121 | not brand specific; any comparable scissors will work |
| vGATFLPo mouse | Jackson Laboratories | 29591 | RRID: IMSR_JAX:029591 |
| vGlut2Cre mouse | Jackson Laboratories | 28863, 016963 | RRID: IMSR_JAX:028863, RRID: IMSR_JAX:016963 |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | BioLegend | 423105 | referred to in the text as MI-NIR |
References
- Morgans, C. W. Neurotransmitter release at ribbon synapses in the retina. Immunology & Cell Biology. 78 (4), 442-446 (2000).
- Euler, T., Haverkamp, S., Schubert, T., Baden, T. Retinal bipolar cells: elementary building blocks of vision. Nature Reviews Neuroscience. 15 (8), 507-519 (2014).
- Barnes, S., Grove, J. C. R., McHugh, C. F., Hirano, A. A., Brecha, N. C. Horizontal Cell Feedback to Cone Photoreceptors in Mammalian Retina: Novel Insights From the GABA-pH Hybrid Model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, (2020).
- Walston, S. T., Chang, Y. C., Weiland, J. D., Chow, R. H. Method to remove photoreceptors from whole mount retina in vitro. Journal of Neurophysiology. 118 (5), 2763-2769 (2017).
- Stefanov, A., Novelli, E., Strettoi, E. Inner retinal preservation in the photoinducible I307N rhodopsin mutant mouse, a model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. Journal of Comparative Neurology. 528 (9), 1502-1522 (2020).
- Matsuoka, R. L., Nguyen-Ba-Charvet, K. T., Parray, A., Badea, T. C., Chédotal, A., Kolodkin, A. L. Transmembrane semaphorin signaling controls laminar stratification in the mammalian retina. Nature. 470 (7333), 259-263 (2011).
- Matsuoka, R. L., et al. Guidance-Cue Control of Horizontal Cell Morphology, Lamination, and Synapse Formation in the Mammalian Outer Retina. Journal of Neuroscience. 32 (20), 6859-6868 (2012).
- Wässle, H., Puller, C., Müller, F., Haverkamp, S. Cone Contacts, Mosaics, and Territories of Bipolar Cells in the Mouse Retina. Journal of Neuroscience. 29 (1), 106-117 (2009).
- Thoreson, W. B., Dacey, D. M. Diverse Cell Types, Circuits, and Mechanisms for Color Vision in the Vertebrate Retina. Physiological Reviews. 99 (3), 1527-1573 (2019).
- Guido, M. E., et al. A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).
- Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis. Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28 (2017).
- Todorova, V., et al. Retinal Layer Separation (ReLayS) method enables the molecular analysis of photoreceptor segments and cell bodies, as well as the inner retina. Scientific Reports. 12 (1), 20195 (2022).
- Shiosaka, S., Kiyama, H., Tohyama, M. A simple method for the separation of retinal sublayers from the entire retina with special reference to application for cell culture. Journal of Neuroscience Methods. 10 (3), 229-235 (1984).
- Ivanova, E., Hwang, G. S., Pan, Z. H. Characterization of transgenic mouse lines expressing Cre-recombinase in the retina. Neuroscience. 165 (1), 233-243 (2010).
- Sarria, I., Orlandi, C., McCall, M. A., Gregg, R. G., Martemyanov, K. A. Intermolecular Interaction between Anchoring Subunits Specify Subcellular Targeting and Function of RGS Proteins in Retina ON-Bipolar Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (10), 2915-2925 (2016).
- Orlandi, C., Cao, Y., Martemyanov, K. A. Orphan Receptor GPR179 Forms Macromolecular Complexes With Components of Metabotropic Signaling Cascade in Retina ON-Bipolar Neurons. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 7153-7161 (2013).
- Dikshit, A., Zong, H., Anderson, C., Zhang, B., Ma, X. -J. Simultaneous Visualization of RNA and Protein Expression in Tissue Using a Combined RNAscopeTM In Situ Hybridization and Immunofluorescence Protocol. Methods in Molecular Biology. 2148, Clifton, N.J. 301-312 (2020).
- Wang, F., et al.
- Morgans, C. W., et al. TRPM1 is required for the depolarizing light response in retinal ON-bipolar cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19174-19178 (2009).
- Alessio, E., Zhang, D. Q. Immunostaining of whole-mount retinas with the CLARITY tissue clearing method. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (7), 5054 (2020).
- Ferguson, L. R., Dominguez, J. M., Balaiya, S., Grover, S., Chalam, K. V. Retinal Thickness Normative Data in Wild-Type Mice Using Customized Miniature SD-OCT. PLoS ONE. 8 (6), e67265 (2013).
- Ivanova, E., Toychiev, A. H., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments JoVE. (82), e51018 (2013).
- Kolb, H.
- Chaya, T., et al. Versatile functional roles of horizontal cells in the retinal circuit. Scientific Reports. 7 (1), 5540 (2017).
- Egger, V., Diamond, J. S. A17 Amacrine Cells and Olfactory Granule Cells: Parallel Processors of Early Sensory Information. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 600537 (2020).
- Dacey, D. M.
- Park, S. J., et al. Connectomic analysis reveals an interneuron with an integral role in the retinal circuit for night vision. eLife. 9, 56077 (2020).
- Janssen-Bienhold, U., et al. Connexin57 is expressed in dendro-dendritic and axo-axonal gap junctions of mouse horizontal cells and its distribution is modulated by light. The Journal of Comparative Neurology. 513 (4), 363-374 (2009).
- Jain, V., et al. The functional organization of excitation and inhibition in the dendrites of mouse direction-selective ganglion cells. eLife. 9, 52949 (2020).
- Marvin, J. S., et al. Stability, affinity, and chromatic variants of the glutamate sensor iGluSnFR. Nature Methods. 15 (11), 936-939 (2018).
- Strauss, S., et al. Center-surround interactions underlie bipolar cell motion sensitivity in the mouse retina. Nature Communications. 13 (1), 5574 (2022).
- Marvin, J. S., et al. A genetically encoded fluorescent sensor for in vivo imaging of GABA. Nature Methods. 16 (8), 763-770 (2019).
- Beckwith-Cohen, B., Holzhausen, L. C., Wang, T. M., Rajappa, R., Kramer, R. H. Localizing Proton-Mediated Inhibitory Feedback at the Retinal Horizontal Cell-Cone Synapse with Genetically-Encoded pH Probes. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 39 (4), 651-662 (2019).
