Summary
이 연구는 광수용체 세포체를 제거함으로써 면역조직화학, in situ hybridization 및 전기생리학 실험을 위해 더 빠른 항체 확산과 내부 망막 뉴런에 대한 패치 피펫 접근을 개선할 수 있는 대체 편평 장착 망막 제제를 제시합니다.
Abstract
척추동물 망막의 양극성 세포와 수평 세포는 광수용체에 의해 광자가 감지된 후 시각 정보를 처리하는 최초의 뉴런입니다. 그들은 빛 적응, 대비 감도, 공간 및 색상 할당과 같은 기본 작업을 수행합니다. 그들의 행동을 지배하는 정확한 회로와 생화학적 메커니즘에 대한 완전한 이해는 시각 신경 과학 연구와 안과 의학을 발전시킬 것입니다. 그러나 양극성 및 수평 세포(망막 전체 마운트 및 수직 절편)를 검사하기 위한 현재 준비는 이러한 세포의 해부학적 구조 및 생리학을 포착하는 능력에 한계가 있습니다. 이 연구에서는 살아있는 편평한 쥐 망막에서 광수용체 세포체를 제거하여 효율적인 패치 클램핑 및 신속한 면역 표지를 위해 양극성 및 수평 세포에 대한 접근성을 향상시키는 방법을 제시합니다. 쪼개진 망막은 두 개의 니트로셀룰로오스 조각 사이에 분리된 쥐 망막을 끼운 다음 부드럽게 벗겨서 준비합니다. 분리는 망막을 바깥쪽 망상층 바로 위로 분할하여 광수용체 세포체를 포함하는 니트로셀룰로오스 조각과 나머지 내부 망막을 포함하는 두 조각을 생성합니다. 수직 망막 절편과 달리 분할 망막 제제는 내부 망막 뉴런의 수지상 돌기를 절단하지 않으므로 간극 접합 결합 네트워크 및 광시야 무축삭 세포의 기여를 통합하는 양극성 및 수평 세포의 기록이 가능합니다. 이 연구는 전기생리학, 면역조직화학 및 제자리 교잡 실험에서 수평 및 양극성 세포 연구를 위한 이 준비의 다양성을 보여줍니다.
Introduction
망막은 눈 뒤쪽에 위치한 얇은 신경 조직으로, 빛을 가로채서 뇌가 해석할 수 있는 전기화학적 신호로 처리합니다. 망막의 뒤쪽에 있는 간상체와 원추세포 광수용체는 빛에 의해 자극되어 신경전달물질인 글루타메이트1의 긴장성 방출 속도를 감소시킵니다. 빛에 의해 유도된 글루타메이트 농도 변화를 경험하고 반응하는 첫 번째 뉴런은 양극성 세포(BC)와 수평 세포(HC)이며, 이들의 소마는 내부 핵층(INL)의 가장 바깥쪽 영역에 있습니다. 이 2차 뉴런은 망막에서 신호 처리의 첫 번째 단계를 수행하고 빛 적응, 대비 감도 및 공간/색 적응과 같은 시각의 중요한 특징을 형성합니다2. 이러한 기능은 BC와 HC에 기인하지만, 이러한 과정의 기초가 되는 회로 및 생화학적 메커니즘은 완전히 이해되지 않았습니다3. 따라서 BC 및 HC 생리학을 탐구하기 위한 도구와 방법의 발전이 가장 중요합니다.
수직(횡) 망막 절편은 BC와 HC를 연구하기 위한 가장 실용적인 모델임이 오랫동안 입증되었습니다. 그러나 BC 및 HC 생리학의 특정 측면은 이 모델에서 실험자가 접근할 수 없습니다. HC의 직접 기록 또는 BC에 대한 효과의 간접 측정은 이러한 세포의 측면 돌기가 절단되는 동안 절단되기 때문에 망막의 내인성 연결성을 반영하지 않습니다. 전체 망막 제제는 이러한 측면 돌기를 보존함으로써 이 문제를 피할 수 있지만, 주변 망막층은 이러한 세포에 접근하는 데 어려움을 초래합니다4. 전체 마운트 망막의 INL 뉴 런에서 면역염색 5,6,7,8 및 패치 클램프 기록9의 예가 풍부하지만, 이러한 데이터 수집을 촉진하고 단순화할 수 있는 기회가 있습니다. 따라서 횡단 단면의 고유한 한계와 전체 마운트 모델의 과제는 이 대체 플랫마운트 망막 제제의 개발에 영감을 주었습니다.
다음 연구에서는 살아있는 편평 망막에서 광수용체 층을 쉽게 제거하여 BC 및 HC에 대한 접근성을 향상시켜 패치 클램핑을 단순화하고 더 빠르고 효율적인 면역 표지를 수행하는 프로토콜을 설명합니다. 분리된 망막의 양쪽에 부착된 두 개의 니트로셀룰로오스 막을 떼어내면 광수용체 축삭돌기를 통해 조직이 찢어져 망막 바깥쪽 망상층(OPL)과 모든 안쪽 망막층을 유지하는 망막이 갈라집니다. 다른 사람들은 망막의 층을 기계적으로 분리하기 위한 프로토콜을 설명했지만, 이러한 방법은 패치 클램핑 및 현미경 검사 응용 분야에 적합하지 않거나 지루한 조직 조작이 필요합니다. 이러한 방법 중 일부는 층 분리를 위해 동결 또는 동결건조된 조직을 필요로 하므로 전기생리학 실험10,11,12와 호환되지 않습니다. 다른 것들은 살아있는 조직을 위해 설계되었지만 광수용체를 제거하기 위해 여과지 4,11로 5-15 번의 순차적 박리 또는 트립신 13으로 처리해야합니다. 여기에 설명된 기술은 광수용체 제거 절차를 단순화하고 다운스트림 응용 분야의 레퍼토리를 확장하여 이전 기술을 개선합니다.
Protocol
마우스에게 물과 음식을 제공하고 12시간 빛/어둠 주기로 유지했습니다. 마우스는 이소플루란에 노출된 후 자궁경부 탈구에 의해 안락사되었습니다. 모든 동물 시술은 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 지침에 따라 진행되었으며 오레곤 보건 과학 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Oregon Health and Science University Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.
알림: 눈 적출술, 망막 절제술, 망막 분할술은 생체 조직의 건강을 보존하기 위해 가능한 한 빨리 수행해야 합니다. 눈당 4분 안에 해부를 완료< 것을 목표로 합니다. 이 세 단계는 순차적으로 수행되어야 합니다. 야생형 마우스: 성체(>3개월) 수컷 및 암컷 C57BL/6J 마우스를 실험에 사용하였다. 시냅스 형태학을 위해, Pcp2 프로모터 (Pcp2-cre/GFP)14 하에서 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 마우스를 사용하였다. 형질전환 마우스: 면역조직화학 또는 전기생리학 실험 동안 GFP를 사용한 수평 세포 시각화를 위해, 삼중-형질전환 마우스를 사용하였다: vGATFLPo; vGlut2Cre입니다. Ai80d입니다. vGATFlpo 및 vGluT2Cre 균주는 각각의 프로모터의 다운스트림에서 Flpo 또는 Cre 재조합효소를 발현하는 knock-in 마우스이다. Ai80d 마우스는 교차 리포터 마우스(CatCh/EYFP)이며 Cre 및 Flpo 재조합 효소를 발현하는 세포에서 Ca2+ 투과성 채널 로돕신(ChR2)만 발현합니다. 따라서, 삼중 형질전환 마우스는 VGAT 및 vGluT2 발현 이력이 있는 세포에서만 ChR2를 발현합니다.
1. 망막 박리 및 망막 분할을 위한 재료 준비
- 니트로 셀룰로오스 멤브레인 조각을 준비하십시오.
참고: 니트로셀룰로오스 막에서 분할된 망막을 분리하면 현미경 검사에서 배경 형광이 감소하고 패치 클램프 기록이 간소화됩니다. 멤브레인 제거는 조직 고정 전후에 수행할 수 있습니다. 고정 분할 망막의 경우 니트로셀룰로오스 막 조각을 치료할 필요가 없습니다. 살아있는 분할 망막의 경우 1.1.3 - 1.1.5 단계에 따라 멤브레인을 처리하여 조직에서 부드럽게 분리되도록 합니다.- 니트로셀룰로오스 멤브레인 16개(또는 그 이상)를 5mm x 5mm 정사각형으로 자릅니다. 여분은 대량으로 준비하고 나중에 사용할 수 있도록 보관할 수 있습니다.
- 나중에 사용할 수 있도록 멤브레인 조각의 절반을 따로 보관하십시오. 이러한 조각은 차단 용액으로 처리되지 않습니다.
- 나머지 조각을 세제가 없는 IHC 차단 용액(예: 3% 말 혈청 + PBS에 희석된 0.025%NaN3 )에 실온에서 10분 동안 부드럽게 흔들면서 배양합니다.
주의 : NaN3는 강력한 독소이므로 취급 시 적절한 PPE를 사용하십시오. - 멤브레인 조각을 중탄산염 완충 Ames 배지에서 실온에서 10분 동안 부드럽게 흔들면서 배양하여 철저히 세척합니다.
- 막힌 멤브레인 조각을 완전히 자연 건조시킵니다(~20분). 멤브레인 조각에 라벨을 붙이고 실온에서 보관하여 처리되지 않은 멤브레인 조각과 분리하여 보관합니다.
- Ames 배지 준비
- 중탄산염 완충 Ames 배지를 준비하고 일정한 탄화 (95 % O 2 및 5 % CO2 ) 하에서 용액을 실온으로 유지하십시오.
2. 쥐 눈 적출
- 기관 IACUC 지침에 따라 사용 가능한 모든 방법으로 마우스를 안락사시킵니다.
- 마우스를 한쪽으로 뒤집고 두 손가락을 사용하여 눈구멍 주위를 부드럽게 누릅니다. 이로 인해 눈이 두개골에서 튀어나옵니다.
- 구부러진 해부 가위를 사용하여 불룩 튀어나온 눈 아래를 잘라 시신경을 절단하고 눈을 두개골에서 분리합니다.
- 가위로 눈을 떠서 얼음처럼 차가운 에임스 배지로 채워진 페트리 접시에 넣습니다.
알림: 쪼개진 후 조직이 고정되는 다운스트림 응용 분야의 경우 Ames 배지 대신 얼음처럼 차가운 PBS를 사용할 수 있습니다. - 나머지 눈에 대해 2.1 - 2.4단계를 반복합니다.
3. 망막 박리
- 맞춤형 유리 이송 피펫을 사용하여 한쪽 눈을 신선하고 얼음처럼 차가운 Ames 배지가 들어 있는 새 페트리 접시로 옮깁니다.
알림: 맞춤형 이송 피펫의 넓은 입구는 우발적인 조직 찌그러짐을 방지하고 유리를 사용하여 피펫 벽에 조직이 부착되는 것을 최소화합니다. 그러나 실험자가 이미 이 도구를 능숙하게 사용하는 경우 입이 넓은 플라스틱 이송 피펫도 허용됩니다. - 집게를 사용하여 여분의 결합 조직을 페트리 접시 바닥에 고정하여 눈을 안정시킵니다. 그런 다음 25G 바늘을 사용하여 ora serrata 라인을 따라 눈을 뚫어 Vannas 가위의 진입점을 만듭니다.
- Vannas 가위를 사용하여 각막이 눈의 나머지 부분에서 분리될 때까지 ora serrata 라인을 따라 자릅니다(보충 그림 1A). 집게를 사용하여 아이컵에서 렌즈를 제거합니다(보충 그림 1B).
- 맞춤형 유리 피펫을 사용하여 아이컵을 대용량(≥100mL)의 탄산화된 Ames로 옮기고 나머지 아이에 대해 3.1 - 3.3단계를 반복합니다.
참고: 다른 쪽 눈에서 절개가 수행되는 동안 조직 건강을 유지하기 위해 아이컵을 탄수화된 에임에 넣습니다. - 한쪽 아이컵을 갓 탄수화물로 채운 에임스로 채워진 페트리 접시에 옮깁니다.
- Vannas 가위를 사용하여 공막의 가장자리에서 안쪽으로 작게 싹둑싹둑 집게로 망막을 잡지 마십시오. 대신 가위 절단으로 생성된 공막의 덮개를 잡아당깁니다.
- Vannas 가위를 사용하여 공막과 망막을 연결하는 시신경을 잘라낸 다음(보충 그림 1D) 가위나 집게를 사용하여 공막에서 망막을 부드럽게 들어 올려 망막을 분리합니다. (그림 1A).
알림: RPE는 일반적으로 아이컵에 부착된 상태로 유지되지만 망막에 부착된 경우 RPE를 제거하기 위한 추가 단계가 필요하지 않습니다. 이 시점에서, 망막의 가장자리는 평탄화 단계 동안 말리는 것을 방지하기 위해 선택적으로 메스로 다듬어질 수 있습니다(그림 1B). - 메스를 사용하여 망막을 반으로 또는 4등분한 다음(그림 1C) 맞춤형 이송 피펫을 사용하여 조각을 대용량(≥ 100mL)의 연속 탄수 Ames 배지로 되돌립니다.
참고: 반쪽 또는 4분의 1의 선택은 주관적입니다. 원하는 응용 프로그램에 가장 적합한 옵션을 선택하십시오. - 망막 분할을 진행하기 전에 나머지 눈에 대해 3.5 - 3.8단계를 반복합니다.
4. 망막 분할
- 페트리 접시에서 Ames 배지를 버리고 갓 탄수화된 Ames로 교체하십시오.
알림: 망막 분할 절차의 나머지 기간 동안 탄수화물을 유지하려면 약 5분마다 페트리 접시의 배지를 갓 탄수화된 Ames로 교체하십시오. - 맞춤형 전사 피펫을 사용하여 망막 조각을 유리 슬라이드(7.5cm x 5cm)에 놓고 신경절 세포가 위로 향하게 한 다음 섬세한 작업 와이프로 주변 액체를 제거하여 평평하게 만듭니다(그림 1D). 필요한 경우 해부 현미경으로 끝이 가는 붓으로 망막 가장자리를 부드럽게 잡아당깁니다.
- 집게를 사용하여 건조한 5mm x 5mm 니트로셀룰로오스 막을 망막으로 내려 신경절 세포 쪽에 부착되도록 합니다(그림 1E).
알림: 살아있는 조직에서 막 제거가 필요한 경우(즉, 전기 생리학의 경우) 이 단계에서 혈청 처리된 건조한 멤브레인 조각을 사용하십시오(자세한 내용은 1.1.3 - 1.1.5단계 참조). 이렇게 하면 신경절 세포층에 대한 접착력이 감소하여 분열 후 니트로셀룰로오스에서 망막을 더 쉽게 제거할 수 있습니다. - 니트로셀룰로오스가 유리 슬라이드에 놓이도록 망막을 뒤집고 5mm x 5mm 멤브레인의 마른 조각을 망막의 광수용체 쪽에 놓습니다(그림 1F).
- 페인트브러시의 젖은 끝을 두 멤브레인 사이의 공간에 대고 모세관 작용이 에임스를 샌드위치로 빨아들이도록 합니다(그림 1G). 이것은 망막에 대한 막의 부착을 감소시키며 섬세한 작업 와이프로 망막이 과도하게 건조된 경우에만 필요합니다.
알림: 망막이 광택을 잃었다면 과도하게 건조된 것이므로 4.5단계가 필요합니다. - 균일한 접착력을 보장하려면 젖은 페인트브러시로 상부 멤브레인에 가벼운 하향 압력을 가합니다(그림 1H).
- 한 쌍의 집게로 하부 막을 유리에 고정하는 동안 느리고 꾸준한 동작을 사용하여 두 번째 집게로 상부 막을 부드럽게 벗겨냅니다. 이로 인해 망막이 OPL 바로 위에서 갈라집니다(그림 1I).
- 광수용체를 포함하는 상부 멤브레인을 폐기합니다(그림 1J, 왼쪽). 하부 막에는 내부 망막이 있으며, 이후 분할 망막이라고 합니다(그림 1J, 오른쪽).
- 즉시 갈라진 망막을 탄수화된 Ames 배지로 되돌립니다.
참고: 생체 조직에 대한 실험의 경우, 망막은 분열 후 탄수화된 에임에서 15-30분의 회복 기간을 통해 이점을 얻을 수 있습니다.
그림 1: 망막 분리 절차 . (A) 차가운 PBS 또는 Ames 배지에서 적출 및 아이컵을 준비한 후 아이컵에서 마우스 망막을 분리하고 PBS를 실온의 탄수화된 Ames 배지로 교체합니다. (B) 메스를 사용하여 안쪽으로 말린 부분이 없을 때까지 망막의 가장자리를 잘라냅니다(선택 사항). (C) 메스를 사용하여 망막을 4등분하거나 반으로 자릅니다. (D) 맞춤형 전사 피펫을 사용하여 유리 슬라이드(신경절 세포 쪽이 위로)에 망막 한 조각을 놓고 섬세한 작업 물티슈를 사용하여 여분의 Ames를 모두 제거합니다. 다음 단계로 진행하기 전에 반건조 망막이 유리 위에 평평하게 놓여 있는지 확인하십시오. Ames에 적신 붓 끝을 사용하여 평평하지 않은 망막 영역을 부드럽게 펼칩니다. (E) 겸자를 사용하여 미리 절단된 건조 니트로셀룰로오스 멤브레인 조각(5mm x 5mm)을 평평한 망막에 놓습니다. (F) 니트로셀룰로오스 조각을 뒤집어 망막의 광수용체 쪽이 위를 향하도록 합니다. 그런 다음 다른 마른 막을 망막에 놓습니다. (G) 브러시의 젖은 끝을 두 멤브레인 사이의 공간에 대고 모세관 작용으로 에임스를 샌드위치로 빨아들입니다. 이것은 망막에 대한 막의 부착을 감소시키며 섬세한 작업 와이프로 망막이 과도하게 건조된 경우에만 필요합니다. (H) 젖은 붓 끝을 사용하여 끼워진 망막의 중앙을 아래쪽으로 부드럽게 누릅니다. (I) 한 쌍의 집게를 사용하여 멤브레인의 하단 부분을 유리 슬라이드에 고정하고 다른 한 쌍의 집게를 사용하여 멤브레인의 상단 부분을 하단에서 부드럽게 벗겨냅니다. (J) 내망막(왼쪽)은 하부막에 남아 있고 광수용체(오른쪽)는 상부막과 함께 당겨져 있습니다. 패널 (A), (B), (C), (D) 및 (J)는 해부 현미경을 사용하여 획득되었습니다. 눈금 막대는 약 1mm를 나타냅니다. 패널(E-I)은 배율 없이 스마트폰 카메라로 획득했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
5. 면역형광 실험을 위한 분할 망막의 준비
알림: 분할 망막은 5.5단계까지 니트로셀룰로오스 막에 계속 부착됩니다. 5.1, 5.2, 5.3 또는 5.4 단계 중 하나를 완료하되, 이 네 단계 모두 다른 실험에 대한 것이므로 완료하지 마십시오.
주의: 적절한 PPE를 사용하고 파라포름알데히드(고정제)를 취급할 때는 주의해서 진행하십시오.
- flatmount immunofluorescence를 위한 준비
- 망막을 완전히 덮을 수 있을 만큼 충분한 용액을 사용하여 얼음 위의 4% 파라포름알데히드에 30분 동안 분할된 망막을 배양합니다.
- 쪼개진 망막을 실온 PBS 5-10mL에서 3회 세척합니다. 선택적 일시 중지: 갈라진 망막은 최대 24시간 동안 4°C의 PBS에 그대로 둘 수 있습니다.
- 분할 망막의 수직 절편을 사용한 면역형광 준비
- 망막을 완전히 덮을 수 있을 만큼 충분한 용액을 사용하여 얼음 위의 4% 파라포름알데히드에 30분 동안 분할된 망막을 배양합니다.
- 쪼개진 망막을 실온 PBS 5-10mL에서 3회 세척합니다. 선택적 일시 중지: 갈라진 망막은 최대 24시간 동안 4°C의 PBS에 그대로 둘 수 있습니다.
- 멤브레인이 부착된 상태에서 분할된 망막을 4°C에서 각각 1시간 동안 10%, 20% 및 30% 자당에 순차적으로 담가 조직을 동결 보호합니다.
- 최적 절단 온도(O.C.T.) 컴파운드에 동결 보호된 분할 망막을 삽입하고 동결 절제술까지 -80°C(최대 6개월)에서 보관합니다.
- -80°C에서 내장된 분할 망막을 제거하고 저온 유지 장치를 사용하여 20μm 두께의 절편을 절단합니다. 정전기로 충전된 유리 현미경 슬라이드에 섹션을 장착하고 자연 건조시킨 다음 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관합니다.
- 이중 형광 in situ hybridization 및 immunohistochemistry 준비
- 망막을 완전히 덮을 수 있을 만큼 충분한 용액을 사용하여 얼음 위의 4% 파라포름알데히드에 분할된 망막을 2시간 동안 배양합니다.
- 쪼개진 망막을 실온 PBS 5-10mL에서 3회 세척합니다. 선택적 일시 중지: 갈라진 망막은 최대 24시간 동안 4°C의 PBS에 그대로 둘 수 있습니다.
- 전기생리학 준비
- 마이크로피펫 풀러를 사용하여 필라멘트가 있는 두꺼운 벽의 붕규산 유리 피펫을 당겨 패치 피펫을 준비합니다. 측정된 저항이 6-10MΩ인 피펫만 사용하십시오.
- 풀링된 피펫을 125 K-글루코네이트, 8 KCl, 5 HEPES, 1 MgCl 2, 1 CaCl 2,0.2 EGTA, 3 ATP-Mg 및 0.5 GTP-Na를 함유한 내부 용액으로 다시 채웁니다.
- 니트로셀룰로오스 막에서 분리된 망막 제거
- 소수성 배리어 펜을 사용하여 현미경 슬라이드(직경 ~1cm)에 원형 웰을 준비하고 5-10분 동안 자연 건조시킵니다.
- 준비된 소수성 장벽 펜 웰 안에 분할된 망막을 놓고 완전히 덮을 수 있을 만큼 충분한 PBS를 추가합니다.
- 해부 현미경으로 미세한 붓의 강모를 조직 가장자리 아래로 밀어 넣고 부드럽게 위로 들어 올립니다. 이런 식으로 망막 주위를 원을 그리며 망막에서 들어 올립니다.
- 집게를 사용하여 떠 있는 망막 조각 아래에서 막을 제거합니다.
- 망막 조각이 신경절 세포 쪽이 아래로 향하게 하여 현미경 슬라이드에 놓이도록 나머지 PBS를 조심스럽게 흡인합니다.
참고: 다음 단계는 순차적으로 수행되지 않습니다. 원하는 응용 분야(예: 면역염색 또는 이중 형광 in situ hybridization[FISH] 및 면역조직화학[IHC] 또는 전기생리학)에 적합한 프로토콜을 선택하십시오.
6. 면역염색
- 아직 준비되지 않은 경우 소수성 배리어 펜을 사용하여 현미경 슬라이드(직경 ~1cm)에 원형 웰을 만들고 5-10분 동안 자연 건조시킵니다. 모든 배양 단계와 세척 단계는 이 펜 웰 내에서 수행됩니다.
- 항체 배양 용액(AIS: 3% 말 혈청, 0.5% Triton X-100, PBS의 0.025% NaN3)에서 분할 망막 또는 수직 분할 망막 절편을 실온에서 30분 동안 배양합니다.
- AIS에 희석된 1차 항체로 분할된 망막 또는 수직 분할 망막 절편을 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
참고: 1차 항체 배양 시간에는 다양한 단백질 표적 및 항체에 대한 최적화가 필요합니다. - 실온 PBS에서 티슈를 3번 씻습니다.
- AIS에 희석한 2차 항체로 조직을 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 실온 PBS에서 티슈를 3번 씻습니다.
- 핵 염색이 필요한 경우 PBS에 희석된 DAPI로 조직을 실온에서 30초 동안 배양합니다. 실온 PBS에서 티슈를 1회 세척합니다.
- 각 티슈 조각에 슬라이드 장착 미디어 한 방울을 바르고 유리 커버슬립을 장착합니다.
- 커버슬립의 가장자리에 매니큐어를 발라 샘플을 밀봉합니다. 슬라이드를 4°C에서 보관하십시오.
7. 듀얼 FISH 및 IHC
- 분할된 망막을 40°C에서 30분 동안 교잡 오븐에서 굽고 슬라이드에 대한 접착력을 높입니다.
- 다음과 같은 예외 및 변경 사항이 있는 제조업체의 프로토콜에 따라 RNAscope FISH 프로토콜을 완료하십시오.
- 항원 회수 단계가 필요하지 않습니다. 프로테아제 III를 실온에서 18분의 배양 시간으로 사용하십시오.
- 소수성 배리어 펜으로 만든 우물 내의 슬라이드에서 모든 세척 단계를 수행하십시오.
- PBS에서 희석된 1차 항체( 재료 표 참조)에 샘플을 혼성화 오븐에서 40°C에서 30분 동안 배양합니다. 실온 PBS에서 샘플을 3번 세척합니다.
- PBS에서 희석된 2차 항체( 재료 표 참조)에 샘플을 혼성화 오븐에서 40°C에서 30분 동안 배양합니다. 실온 PBS에서 샘플을 3번 세척합니다.
- 샘플을 실온에서 30초 동안 1x DAPI에서 배양합니다. 실온 PBS에서 샘플을 1회 세척합니다.
- 각 티슈 조각에 페이드 방지 장착 미디어 한 방울을 바르고 유리 커버슬립을 장착합니다.
- 커버슬립의 가장자리에 매니큐어를 발라 샘플을 밀봉합니다. 슬라이드를 4°C에서 보관하십시오.
8. 전기생리학
- 니트로셀룰로오스 멤브레인을 제거한 후 분할된 망막을 패치 클램프 기록 챔버로 옮기고 백금 하프로 제자리에 부드럽게 고정합니다.
- 실험 전반에 걸쳐 95 % O 2 및 5 % CO2 로 탄화 된 Ames 용액으로 분할 망막을 지속적으로 관류합니다. 용액을 32-34 °C 사이로 유지하십시오.
참고: 실험 중에 Dodt 그래디언트 대비 현미경을 사용하여 조직을 시각화할 수 있습니다. - 실내 조명 아래에서 전체 셀 전압 클램핑을 수행하여 INL 뉴런에서 기록합니다.
- 기록하는 동안 미세세포 주입 장치를 사용하여 제약 화합물을 적용하거나 470nm LED를 사용하여 채널로돕신(ChR2)을 자극하여 광 반응을 시뮬레이션합니다.
알림: 광도는 디지털 광 파워 미터를 사용하여 측정할 수 있습니다.
- 기록하는 동안 미세세포 주입 장치를 사용하여 제약 화합물을 적용하거나 470nm LED를 사용하여 채널로돕신(ChR2)을 자극하여 광 반응을 시뮬레이션합니다.
9. 공초점 현미경 검사
- 컨포칼 면역형광의 경우 40x/1.3 또는 63x/1.40 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 컨포칼 현미경으로 이미지를 촬영합니다. FIJI를 사용하여 밝기와 대비를 조정하고 이미지 스택에서 Z 투영을 생성할 수 있습니다.
Representative Results
망막 분할은 광수용체 말단을 보존합니다.
망막 분할이 OPL에서 2차 뉴런의 수상돌기를 손상시키지 않는다는 것을 확인하기 위해 분할된 망막의 수직 섹션을 시냅스 소포 단백질 synaptophysin(녹색) 및 단백질 키나아제 C 알파(PKCα, 빨간색)에 대한 항체로 염색했습니다. 쪼개진 망막의 상단을 가로지르는 강렬한 시냅토피신 표지 밴드는 광수용체 시냅스 말단이 유지됨을 나타냅니다(그림 2). 또한 PKCα 염색은 간상 양극성 세포(RBC)의 정상적인 형태를 보여줍니다. 광수용체 핵이 보이지 않으며, 이는 망막이 OPL과 광수용체 세포체의 가장 안쪽 열 사이에 분할되어 있음을 나타냅니다(그림 2).
그림 2: 분할된 망막은 광수용체 말단을 유지합니다. 분할 절차에 따라 동결 절개된(20μm 두께) 침 망막의 수직 단면을 보여주는 형광 공초점 현미경 사진. 각 이미지는 공초점 z 스택의 최대 투영입니다. 이 절편은 각각 적혈구와 시냅스 소포를 시각화하기 위해 PKCα(상단 중앙) 및 synaptophysin(오른쪽 상단)에 대한 항체로 면역 표지되었습니다. 병합된 이미지(아래)는 OPL에서 적혈구의 정점 돌기(빨간색) 바로 위에 있는 광수용체 말단에 있는 시냅스 소포(녹색)를 보여줍니다. 세포핵은 DAPI(파란색)로 표지되어 있습니다. ONL 내에서는 광수용체 핵이 보이지 않습니다. 약어: ONL = 외부 핵층; OPL = 외부 망상 층; INL = 내부 핵층; IPL = 내부 망상층; GC = 신경절 세포. 스케일 바 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
OPL의 시냅스 형태는 망막 분할 후에도 보존됩니다.
pcp2 프로모터14 하에서 적혈구에서 GFP를 발현하는 마우스를 사용하여 OPL의 시냅스 전 및 시냅스 후 단백질을 면역표지하여 분할14 후 이 시냅스층의 무결성을 평가했습니다. 광수용체의 축삭돌기를 통해 발생하는 전단력에도 불구하고, RGS11에 대해 표지된 적혈구 수상돌기와 CtBP215에 대해 표지된 광수용체 시냅스 리본의 정상적인 위치가 관찰되기 때문에 분할은 OPL에서 광수용체-BC 시냅스의 형태를 교란하지 않습니다(그림 3). 간상체와 적혈구 사이의 각 시냅스 접촉에 대해 RGS11은 시냅스 리본의 말굽 모양(녹색) 내에 있는 빨간색 반점으로 볼 수 있습니다. 후속 실험에서 항-GPR179 항체(16)를 사용하여 시냅스 후 ON-BC 수지상 팁(16)을 표지하고, 항-PSD-95 항체를 사용하여 시냅스전 간상 광수용체 말단을 표지했습니다(보충 그림 2). 이러한 결과는 RBC 수상돌기가 시냅스 전 파트너인 막대 말단과 밀접하게 연관되어 있는 것으로 나타남에 따라 분할 망막 준비에서 OPL의 안정성을 다시 한 번 확인합니다.
그림 3: OPL의 시냅스 형태는 망막 분할 후에도 보존됩니다. Pcp2 promoter에서 적혈구에서 GFP를 발현하는 형질전환 마우스의 분할 망막의 컨포칼 면역형광 이미지. GFP 발현 수준(파란색)은 망막의 적혈구에 따라 다릅니다. 분할 후 망막을 고정한 다음 CtBP2(녹색) 및 RGS11(빨간색)에 대한 항체로 배양하여 각각 광수용체 시냅스 리본 및 ON-BC 수지상 팁을 표지했습니다. 각 적록색 쌍은 막대와 ON-BC 사이의 시냅스 접촉을 나타냅니다. 스케일 바 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
망막 분할은 적혈구 생존력을 유지합니다.
분열 후 망막 내부 뉴런의 생존력을 평가하기 위해 죽은 세포를 식별할 수 있는 막불투과성 근적외선 핵 염료(MI-NIR)를 사용했습니다. MI-NIR로 배양한 후 분할된 망막을 고정한 다음 항-PKCα로 표지하여 적혈구를 식별했습니다. 분할 망막의 컨포칼 현미경 사진은 조직 전반에 걸쳐 세포 생존력의 지역적 변동성을 보여주며, 일부 영역은 다른 영역보다 세포 사멸률이 더 높습니다. 이러한 가변성은 절개, 분할 또는 취급 절차 중에 망막의 특정 영역에 가해지는 손상으로 인해 발생할 수 있습니다(그림 4). 적혈구의 세포체가 분열 부위에 가까운 INL의 가장 바깥쪽 영역에 존재한다는 점을 감안할 때, 적혈구의 생존력에 대한 신중한 평가가 필요했습니다. PKCα와 MI-NIR의 희소한 공동 국소화는 대부분의 RBC가 망막 분할 후에도 생존 가능한 상태로 유지됨을 확인했습니다(그림 4).
그림 4: 간상 양극성 세포는 망막 분할 후 생존 가능합니다. 편평한 마운트 관점에서 분할된 망막의 영역을 보여주는 형광 컨포칼 현미경 사진. 분할 후, 살아있는 망막을 37°C에서 30분 동안 MI-NIR 염료(빨간색)로 배양했습니다. 그런 다음 망막을 고정하고 PKCα에 대한 항체로 면역 표지하여 적혈구를 시각화했습니다. 망막의 이 영역에서는 PKCα와 MI-NIR의 공동 국소화가 드뭅니다. MI-NIR은 적혈구에 속하지 않는 핵(파란색)과 함께 국소화됩니다. 약어: MI-NIR = 멤브레인 불투과성 NIR 살아있는/죽은 염색. 스케일 바 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
분할된 망막은 이중 FISH 및 IHC에 적응할 수 있습니다.
표준 IHC에 대한 고정 시간을 연장함으로써 FISH와 IHC에서 분할 망막을 순차적으로 처리하여 mRNA와 단백질을 동시에 표지할 수 있습니다17,18. 실험 결과 4% 파라포름알데히드에 2시간 동안 고정하면 항체 결합을 위한 단백질 에피토프를 보존하면서 강력한 mRNA 라벨링이 생성되는 것으로 확인되었습니다. FISH는 외부 INL에서 RBC(항-PKCα 항체)의 위치와 관련하여 GABAA 수용체 서브유닛 δ(GABRD; 안티센스 mRNA 프로브)의 발현을 시각화하기 위해 IHC에 이어 분할된 망막에서 수행되었습니다(그림 5A). GABRD mRNA 발현은 RBC에서 드물게 나타납니다(그림 5A). 그러나 전사체는 무축삭 세포와 신경절 세포에 의해 풍부하게 발현되며, 이는 온전한 망막의 횡단 절편에 대한 표지 패턴에 의해 입증됩니다(그림 5B). 외부 INL(그림 5A)에서 GABRD mRNA는 별개의 세포에 집중되어 있는 내부 INL(그림 5C)에 비해 더 고르게 분포되어 있습니다. 다른 GABA 수용체 서브유닛을 표적으로 하는 안티센스 프로브는 뚜렷한 라벨링 패턴을 생성하여 프로브의 특이성을 입증합니다(데이터는 표시되지 않음).
그림 5: 분할된 망막과 온전한 망막의 이중 FISH 및 IHC. (A, C) 편평한 분리 망막의 컨포칼 현미경 사진 및 (B) 온전한 망막의 수직 단면. (A)와 (C)의 이미지는 각각 INL의 상부 및 하부 영역에 있는 광학 단면의 최대 투영입니다. (B)의 점선 사각형은 (A)와 (C)에 표시된 투영을 만드는 데 사용되는 대략적인 경계를 나타냅니다. 분할 망막(A, C)을 2시간 동안 고정한 후 GABRD(빨간색)에 대한 안티센스 mRNA 프로브로 표지했습니다. 그 후, 갈라진 망막에 PKCα에 대한 항체를 염색하여 적혈구(녹색)를 표지했습니다. PKCα 채널은 명확성을 위해 더 낮은 INL의 투영에서 생략되었습니다. (B)의 온전한 망막은 절개하기 전에 24시간 동안 고정되었습니다. 그 후, 고정된 망막에 GABRD(빨간색)에 대한 안티센스 mRNA 프로브로 표지했습니다. 모든 샘플은 커버슬립 장착 전에 20초 동안 DAPI(파란색)로 염색되었습니다. 약어: INL = 내부 핵층. 스케일 바= 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
분할 망막은 BC 및 HC의 패치 클램프 전기생리학 기록에 매우 적합합니다.
기존의 전체 마운트 망막에서 BC 또는 HC soma를 패치하려면 피펫이 신경절 세포 측 또는 광수용체 측에서 접근해야 합니다. 두 접근법 모두 INL에 도달하기 위해 여러 망막층을 통과해야 하며, 이 과정에서 피펫 팁이 종종 이물질로 막히게 됩니다. 비브라톰 절편 제제에서 BC 및 HC 소마는 쉽게 접근할 수 있지만 수지상 돌기가 절단되어 측면 연결이 중단될 수 있습니다. 그러나 분할 망막에서는 적혈구와 HC의 세포체가 조직 표면에 위치하여 OPL의 측면 회로를 보존하면서 패치 피펫에 대한 접근성을 크게 향상시킵니다.
그림 6은 분열된 망막의 BC에서 기록된 화학적으로 시뮬레이션된 빛 반응을 보여줍니다. 관류된 Ames 배지에 III 그룹 mGluR 작용제인 L-AP4(4μM)를 보충하여 어둠 속에서 광수용체에서 글루타메이트 방출을 시뮬레이션했습니다. mGluR6 길항제인 CPPG(Ames에서 600μM)를 패치된 세포(-60mV에서 유지)의 수상돌기에 부풀어 올려 mGluR6 억제를 통해 광 섬광을 시뮬레이션했습니다. 세포는 두 가지 유형의 내부 전류로 CPPG 퍼프에 반응했습니다. 한 가지 유형은 망막 절편(19)의 적혈구로부터 기록된 표준 빛-유발 전류와 유사한 정체기에 뒤따르는 과도 전류를 나타낸다(그림 6A). 다른 유형은 퍼프 지속 시간 동안 지속되며(그림 6B), ON 원뿔 양극성 세포(ON-CBC)에서 기록된 전류와 유사합니다(19).
슬라이스 제제에서 보존하기 어려운 수지상장이 넓은 세포 유형인 HC를 표적으로 하기 위해 별도의 실험을 수행했습니다. HC에서 채널 로돕신(ChR2)과 GFP를 발현하는 마우스 라인을 사용하여 형광 현미경으로 쉽게 식별할 수 있도록 했습니다. 먼저, HC의 전류는 일련의 탈분극 단계(-100mV - 50mV, 스텝 크기 = 15mV)에 대한 응답으로 기록되었으며, 이에 대해 내부 전류와 외부 전류로 응답했습니다(그림 6C). 그런 다음 이 세포를 짧은 청색광 펄스(200ms, 470nm)로 자극하여 두 세포에서 큰 ChR2 구동 내부 전류를 생성했습니다(그림 6D).
그림 6: 분할된 망막의 INL 뉴런에서 패치 클램프 기록 . (A) 추정 적혈구 및 (B) CBC는 L-AP4(4μM)를 함유하는 관류된 Ames 배지에서 -60mV로 전압 클램핑되었습니다. CPPG(600μM)를 클램핑된 세포의 수상돌기에 퍼핑하면 적혈구에서는 일시적이지만 CBC에서는 유지되는 내부 전류가 발생합니다. (A)의 RBC 기록은 단일 트레이스인 반면 (B)의 CBC 기록은 3개 트레이스의 평균을 나타냅니다. (C) vGATFLPo에서 HC로부터의 패치 클램프 기록; vGlut2Cre입니다. Ai80d 마우스. 빨간색 선은 ChR2를 통해 큰 내부 전류를 호출하는 데 사용되는 200ms, 470nm 광 펄스의 지속 시간을 나타냅니다. (D) -60mV에서 전압 클램핑된 HC에서 주입된 전류 응답은 15mV 간격으로 -70mV와 +35mV 사이를 밟고 -60mV로 반환되었습니다. 삽입은 전압 단계의 시작을 둘러싼 6ms 창에서 동일한 트레이스를 보여줍니다. (E) vGATFLPo에서 GFP를 발현하는 수평 세포를 보여주는 편평한 분리 망막의 면역형광 현미경 사진; vGlut2Cre입니다. Ai80d 마우스. 눈금 막대 = 20μm. 전기생리학 데이터는 20kHz 샘플링 속도로 수집되고 5kHz에서 저역 통과 베셀 필터로 필터링되었습니다. 그런 다음 데이터를 내보내고 Python 3을 사용하여 오프라인 시각화 및 분석을 수행했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
망막 분할을 통해 INL 및 OPL 해부학적 구조를 신속하게 조사할 수 있습니다.
망막의 외부 제한막(ELM)과 ONL은 ~90μm 두께의 장벽을 구성하며, 이는 내부 망막으로의 항체 확산을 방해하고 차선의 면역염색 조건을 만듭니다20,21,22. 따라서 기존의 평판형 망막을 사용하여 OPL 또는 INL에서 면역 표지 표적을 지정하려면 종종 48-96시간의 항체 배양이 필요한 시간 집약적인 염색 프로토콜이 필요합니다 5,6,7,8,20,22.
광수용체를 제거하면 내부 망막 뉴런에 항체가 빠르게 침투할 수 있습니다. 그 결과, 내부 망막 단백질 표적의 라벨링은 염료 접합 1차 항체를 사용하여 1시간 이내에 달성할 수 있습니다. PKCα 및 Calbindin-D에 대한 항체를 사용하여 각각 INL의 적혈구 및 HC를 표지했습니다(그림 7). 광시야 뉴런의 측면 돌기를 절단하는 기존의 수직 망막 절편과 달리, 분할 망막 제제는 HC와 같은 광시야 세포의 전체 수지상 정자를 시각화할 수 있습니다(그림 6E, 그림 7).
그림 7: 분할된 망막에서 내부 망막 단백질의 신속한 면역 표지. 플랫마운트 관점에서 분할된 망막의 컨포칼 면역형광 이미지. 분할 망막에 PKCα(노란색) 및 Calbindin-D(녹색)에 대한 항체를 실온에서 1시간 동안 배양하여 각각 ON-BC 및 HC를 표지했습니다. (A) 각 단일 채널 이미지는 4개의 광학 섹션으로 구성된 평균 Z-투영입니다: DAPI, 평균 z10-13; 칼빈딘-D, 평균 z11-14; PKCα, 평균 z11-14. (B) 병합된 이미지에서 동일한 투영이 중첩됩니다. 스케일 바 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 망막 박리의 주요 단계. 모든 이미지는 해부 현미경의 접안 렌즈에 장착된 스마트폰 카메라로 촬영되었습니다. (A) 각막 제거 후 쥐 눈의 하향식 이미지. (B) 렌즈를 제거한 후 마우스 아이컵의 하향식 이미지. (C) 마우스 아이컵의 공막에 작은 절개가 이루어집니다. 화살표는 공막의 두 플랩을 나타내며, 집게에 의해 반대 방향으로 당겨져 공막에서 망막을 분리하기 시작합니다. (D) 공막이 망막에서 부분적으로 제거된 후 공막과 망막 사이에 반나스 가위를 삽입하고 시신경을 절단하여 망막을 해방시킵니다. 빨간색 점선 원은 시신경 머리를 나타내고 가위는 올바른 절단 궤적을 보여줍니다(공막과 망막 사이에 가위 삽입). 공막 후 고립된 망막은 제거됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 분할 망막에서 OPL의 시냅스 전 및 시냅스 후 구성 요소의 특성화. 분할 망막의 OPL에서 얻은 공초점 면역형광 이미지. 분할 망막을 GPR179 및 PSD95에 대한 항체로 실온에서 1시간 동안 배양하여 ON-BC의 수지상 팁과 막대 광수용체의 말단에 각각 라벨링했습니다. 왼쪽 및 중앙 이미지는 여러 광학 섹션의 최대 투영입니다. 동일한 투영이 맨 오른쪽 이미지에 겹쳐집니다. ON-BC 수지상 팁의 GPR179 반점은 막대 광수용체 말단과 밀접하게 연관되어 OPL 내에서 온전한 시냅스 접촉을 보여줍니다. 스케일 바 = 10 μm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 3: 문제 해결: 분할된 망막의 품질 평가. 세포핵을 시각화하기 위해 DAPI로 염색된 분할 망막의 형광 현미경 사진. 세포는 핵의 직경과 조직 깊이에 따라 식별될 수 있습니다. (A) 광수용체 핵은 더 작고, 더 밝고, 더 표면적인 반면, (B) BC 핵은 더 크고, 더 어둡고, 더 깊습니다. (C) 광수용체가 불완전하게 제거된 영역의 저배율 이미지. 초점이 맞춰진 것처럼 보이는 핵은 초점이 맞지 않는 이미지 가장자리의 광수용체 핵보다 더 깊은 BC에서 나온 것입니다. (A) 및 (B)에 대한 스케일 바 = 20μm. (C)에 대한 스케일 바 = 50 μm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
광수용체가 광자 흡수를 신경전달물질 방출로 변환한 후, BC와 HC는 시각 신호를 처리하는 최초의 망막 뉴런이다23. 이러한 뉴런의 중요성은 잘 알려져 있지만, 뉴런의 기능 중 많은 부분이 불완전하게 이해되거나 완전히 탐구되지 않았습니다. 많은 BC 및 HC 생리학 연구는 측면 연결성을 유지하면서 INL 뉴런에 대한 접근을 개선하는 플랫마운트 망막 제제의 이점을 누릴 수 있습니다. 분할 망막 분석법의 개발은 플랫마운트 방향에서 BC 및 HC로부터 고품질 전기생리학적 기록 및 현미경 데이터를 수집하기 위한 간편한 프로토콜을 제공하기 위한 노력의 일환입니다. 여기에 설명된 분할 망막 제제는 특수 장비를 사용하지 않고 망막 분리 후 마우스당 약 20분(망막당 10분)에 수행할 수 있습니다. 이 방법은 기존의 광수용체 제거 절차에서 영감을 얻었지만 단순성, 속도 및 다양성 면에서 상당한 개선을 제공합니다 4,10,11,12,13. 망막층을 분리하는 이전 방법과 달리 망막 분할은 동결, 동결건조 또는 망막에 접착제를 반복적으로 도포할 필요가 없습니다. 실제로 거의 모든 광수용체는 니트로셀룰로오스 막으로 한 번의 찢어짐으로 제거할 수 있습니다. 이 접근법의 속도와 용이성은 망막이 탄화된 에임에서 소비하는 시간을 최소화하여 장기간 높은 세포 생존력을 가능하게 합니다. 쪼개진 망막은 쪼개진 후 몇 시간 동안 탄수화된 Ames 배지에서 유지될 수 있습니다. 이 제제에서 INL 뉴런의 건강에 대한 증거로, 살아있는/죽은 세포 염색(그림 4)과 패치 클램프 전기생리학(그림 6)을 통해 분할 후 적혈구 및 HC의 생존력을 확인할 수 있습니다.
분할된 망막에서 광수용체층을 제거하면 항체가 INL로 확산되는 시간을 크게 줄임으로써 면역 표지 중에 상당한 이점을 얻을 수 있습니다. 1차 및 2차 항체 라벨링은 2시간 이내에 완료할 수 있으며, 이는 표적 5,6,7,8,20,22 에 따라 72시간 이상 소요될 수 있는 기존 플랫마운트 염색에 비해 크게 개선된 것입니다. 그 결과, 조직 준비와 같은 날에 현미경 데이터를 획득할 수 있어 면역형광 실험의 속도를 크게 높일 수 있습니다. mRNA 프로브 어닐링을 용이하게 하기 위해 FISH 실험은 일반적으로 면역 표지보다 훨씬 더 긴 고정 시간(~24시간)을 권장합니다18. 그러나 여기에 제시된 실험은 2시간 고정이 여전히 예외적인 FISH 라벨링을 생성한다는 것을 보여줍니다(그림 5). 고정 시간을 30분에서 2시간으로 연장했음에도 불구하고 우수한 면역 표지를 얻기 위해 항원 회수 단계를 수행할 필요가 없었지만 이는 항체 또는 항원에 따라 다를 수 있습니다. FISH 프로토콜의 프로테아제 처리는 표적 항원결정기(epitope)의 파괴로 인해 항체 표지를 방해할 수 있습니다. 이 문제는 여러 에피토프를 표적으로 하는 다클론 항체를 사용하여 에피토프 파괴가 면역 표지를 방해할 가능성을 줄임으로써 우회되었습니다. 또한, 충분한 조직 침투를 제공하면서 과도한 에피토프 변경을 방지하기 위해 중등도 프로테아제 처리(ACD 프로테아제 III)를 사용했습니다.
때때로, 망막은 대신 외부 핵층(ONL)을 통해 분열되어 INL 세포가 보이지 않는 광수용체 층을 남깁니다. 이를 방지하려면 망막이 유리 위에 완전히 평평하게 놓여 있는지 확인하고 망막 주변의 잔류 액체를 제거해야 합니다. 붓으로 니트로셀룰로오스를 더 세게 누르면 ONL이 쪼개지는 것을 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 막이 너무 젖거나 망막이 접히면 성공적인 분할의 가능성이 크게 줄어 듭니다. DAPI를 사용하여 세포핵을 염색하는 것은 분할의 품질을 평가하고 나머지 광수용체의 커버리지를 결정하는 데 유용합니다. 광수용체 핵은 더 작고, 더 밝고, 더 표면적인 반면(보충 그림 3A), BC 핵은 더 크고, 더 어둡고, 더 깊습니다(보충 그림 3B). 어떤 경우에는 망막 조각에 따라 찢어진 면이 약간 달라져 광수용체 세포체가 완전히 제거되지 않은 패치가 생깁니다(보충 그림 3C). 현미경 검사 및 전기 생리학 응용 분야의 경우, 이는 광수용체가 적절하게 제거된 영역에서 고품질 데이터를 수집하는 능력을 방해하지 않습니다. 노출된 내부 망막의 넓은 필드는 패치 피펫으로 이미징하거나 기록할 때 쉽게 찾을 수 있습니다. 보다 완전한 광수용체 제거가 필요한 경우 100% 광수용체 제거가 보장되지는 않지만 니트로셀룰로오스 막을 추가로 사용하여 두 번째 절단을 수행할 수 있습니다. 따라서 잔류 광수용체 물질이 결과에 영향을 미칠 수 있는 유전자 발현 또는 단백질체학 연구에서 분할 망막을 사용할 때는 주의가 필요합니다. 단일 세포 응용 분야의 경우 광수용체의 데이터가 분석에서 제외될 수 있으므로 이러한 우려는 부당합니다.
분할 망막 준비의 장점은 아마도 광시야 인터뉴런의 전기생리학적 기록에서 가장 두드러질 것입니다. 전통적인 수직 슬라이스가 광시야 세포의 광범위한 과정을 절단하는 반면, 분할 망막 준비는 OPL 및 IPL을 그대로 두어 수직 슬라이스에서 간과될 수 있는 HC(24), A17s(25), TH ACs(26) 및 NOS-1 ACs(27)와 같은 광시야 세포의 입력을 캡처할 수 있습니다. 따라서 결과를 해석하고 망막 절편에서 수집된 이전 데이터와의 비교는 신중한 생각이 필요합니다. 그럼에도 불구하고, 빛 자극의 약리학적 모방을 이용한 실험에서, 이러한 결과는 망막 절편으로부터 기록된 데이터와 유사하다19. 세포 특이적 프로모터 하에서 ChR2를 발현시킴으로써, 원하는 세포 집단을 자극하는 동시에 INL의 BC에서 기록하여 원하는 세포가 수직 정보 경로에 미치는 영향을 조사할 수 있습니다. 무축삭 세포와 같은 더 깊은 INL 뉴런에서 직접 기록하는 것도 분할 망막에서 가능합니다. 이 경우 패치 전극은 먼저 더 피상적인 INL 뉴런을 통과해야 하지만, 기존의 전체 마운트 준비와 비교할 때 경로를 방해하는 조직이 상당히 적습니다.
다른 뉴런에 대한 광시야 세포의 영향을 측정하는 것 외에도, 이 방법은 수상돌기가 OPL28에서 광범위한 갭-접합 결합 네트워크를 형성하는 HC로부터 직접 단일 세포 패치 클램핑을 가능하게 합니다. 수평 세포는 망막을 통한 수직 정보 전달을 형성하는 광수용체에 중요한 피드백을 보냅니다. 그러나 HC의 수지상 필드는 수직 슬라이스에서 잘리기 때문에 단일 세포 기록 데이터가 부족합니다. 이 연구는 해부학적으로나 생리학적으로 온전한 HC를 보여주며, 여기서 ChR2 유발 전류가 삼중 형질전환 마우스 라인에 기록됩니다(그림 6 CE). ChR2 자극 외에, 분할 망막은 내인성 HC 전류 및 간극 접합 커플링(28)을 연구하는데 사용될 수 있다. 분할 망막은 화학적 적용 또는 ChR2 자극에 의해 유도된 시냅스 연결성 및 신경 활동을 연구하기 위한 편리한 모델을 제공하지만, 광수용체가 없기 때문에 자연광 반응 또는 빛 적응 메커니즘에 대한 직접적인 탐구는 불가능합니다.
망막의 현장 이미징은 최근 몇 년 동안 놀라운 발전을 이루었습니다. 그러나, 대부분의 이미징 연구는 전체 마운트 망막 제제의 신경절 세포층에 국한되어있다 29. 저자들은 분할 망막에 광수용체가 없기 때문에 OPL 및 INL에서 살아있는 칼슘 이미징에 이상적인 모델이 될 것으로 예상합니다. 칼슘 이미징 외에도 이 모델은 iGluSnFR30,31, iGABASnFR32 및 pHluorin 33과 같은 유전적으로 인코딩된 바이오센서와 함께 사용할 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 분할 망막 제제와 결합된 이 강력한 도구는 망막의 광 처리에 기여하는 BC 및 HC의 시냅스 상호 작용 및 생물물리학적 특성을 탐구하는 효율적인 접근 방식을 제공할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 재정적 이익이 상충되지 않는다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 다음과 같은 NIH 보조금의 지원을 받았습니다: NIH 보조금 R01EY031596(C.M.에게); NIH 보조금 R01EY029985(CM에게); NIH 보조금 P30EY010572(CM에게); NIH 보조금 R01EY032564(학사에게). 망막 절편 준비에 대한 기술적 지원을 아끼지 않은 Tammie Haley와 이 작업에 사용된 mRNA FISH 프로브를 아낌없이 제공한 Charles Allen 박사에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1.5 glass coverslips | Fisherbrand | 12544E | |
| 2 pairs of Dumont #5 forceps | Ted Pella | 38125 | |
| 25 gauge needle | Becton Dickenson | 305122 | |
| 470 nm LED | THORLABS | M470L2 | |
| 5-306 curved scissors | Miltex | 5-306 | |
| 9" disposable pasteur pipetes | Fisherbrand | 13-678-20D | for constructing custom transfer pipette |
| Ai80d mouse | Jackson Laboratories | 25109 | RRID: IMSR_JAX:025109 |
| Ames Medium w/L-Glutamate | US Biological | A1372-25 | |
| amplifier control software | Molecular Devices | Clampex 10.3 software | |
| anti-calbindin D28K antibody | Invitrogen | PA-5 85669 | RRID: AB_2792808, host species = rabbit; 1:100 dilution |
| anti-CtBP2 antibody | BD Biosciences | 612044 | RRID: AB_399431, host species = mouse; 1:5000 dilution |
| anti-GPR179 antibody | NA | NA | gift from Kirill Martemyanov; Scripps Research Institute, Jupiter, FL; host species = sheep; 1:1000 dilution |
| anti-PKC alpha antibody | Sigma-Aldrich | P4334 | RRID: AB_477345, host species = rabbit; 1:5000 dilution |
| anti-PKC alpha antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc8393 AF594 | RRID: AB_628142, host species = mouse; 1:1000 dilution |
| anti-PSD95 antibody | BD Transduction Laboratories | 610495 | RRID: AB_397862, host species = mouse; 1:1000 dilution |
| anti-RGS11 antibody | NA | NA | gift from Ted Wensel; Baylor College of Medicine, Houston, TX; host species = rabbit; between 1:1000 and 1:5000 dilution |
| anti-Synaptophysin P38 antibody | Sigma | S-S5768 | RRID: AB_477523, host species = mouse; 1:1000 dilution |
| Aquamount mounting media | Epredia | 13800 | slide mounting media |
| C57BL/6J mouse | Jackson Laboratories | 000664 | RRID: IMSR_JAX:000664 |
| carbogen tank | Matheson | NA | 95% O2 and 5% CO2 |
| custom transfer pipette | custom build | NA | Instructions: use scissors to cut off the tip of a plasitc transfer pipette at the point it begins to taper. Use pliers to safely break off the last 2-3 inches of a glass pasteur pipette. Fit the narrow end of the glass pasteur pipette into the wide tip of the plastic transfer pipete. Wrap parafilm around the joint of the two pieces to enhance the seal. |
| Digitical optical power meter | THORLABS | PM100D | |
| dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| electrophysiology amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
| electrophysiology microscope | Olympus | OLYMPUS, BX50WI | Dodt gradient contrast microscopy |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| HC PL APO CS2 40x/1.3 | Leica | 506358 | |
| HC PL APO CS2 63x/1.40 | Leica | 15506350 | |
| Hybridization oven | Robbins Scientific | Model 1000 | for RNAscope protocol only |
| Immedge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| isoflurane | Piramal Critical Care | 66794-017-25 | |
| Kimwipe (delicate task wipe) | Kimtech Science | 34155 | |
| Leica HC PL APO CS2 40x/1.3 oil immersion objective | Leica | 506358 | |
| Leica HC PL APO CS2 63x/1.40 oil immersion objective | Leica | 15506350 | |
| Leica TCS SP8 X confocal microscope | Leica | discontinued | |
| medium 15 mm petri dish | Corning | 25060-60 | eyes are kept here during retina dissection |
| Merit 97-275 steel scissors | Merit | 97-275 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | p-97 | |
| Mm-Gabrd-C2 mRNA probe | ACD | 459481-C2 | |
| mouse euthanasia chamber | NA | NA | custom build; glass petri dish covering a small glass jar. |
| nitrocellulose membrane filters | GE Healthcare Life Sciences; Whatman | 7184-005 | 0.45 µm pore size |
| Picospritzer | General Valve Corporation | Picospritzer II | referred to in the text as microcellular injection unit |
| plastic transfer pipets | Fisherbrand | 13-711-7M | for constructing custom transfer pipette |
| Plastic tubing | Tygon | R-603 | for connection to carbogen tank |
| platinum harp | custom build | NA | for anchoring split retinas within the electrophysiology recording chamber. |
| size 0 paint brush | generic | NA | for flattening retina during splitting. |
| SlowFade Gold antifade reagent | Molecular Probes | S36937 | referred to in the text as anti-fade mounting media |
| small 10 mm petri dish | Falcon | 353001 | eyes are placed here following enucleation |
| small glass pane (7.5 cm x 5 cm) | generic | NA | isolatd retina pieces are placed onto this for the splitting procedure |
| Superfrost plus microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | electrostatically-charged glass microscope slides |
| Thick-walled borosilicate glass pipettes with filament | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | |
| Vannas Scissors; straight | Titan Medical | TMS121 | not brand specific; any comparable scissors will work |
| vGATFLPo mouse | Jackson Laboratories | 29591 | RRID: IMSR_JAX:029591 |
| vGlut2Cre mouse | Jackson Laboratories | 28863, 016963 | RRID: IMSR_JAX:028863, RRID: IMSR_JAX:016963 |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | BioLegend | 423105 | referred to in the text as MI-NIR |
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