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Neuroscience

कशेरुक रेटिना में आंतरिक परमाणु परत न्यूरॉन्स का अध्ययन करने के लिए एक बेहतर फ्लैटमाउंट तैयारी के रूप में रेटिना को विभाजित करें

Published: January 16, 2024 doi: 10.3791/65757
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1Department of Chemical Physiology and Biochemistry, Oregon Health and Science University, 2Casey Eye Institute, Oregon Health and Science University

Summary

यह काम एक वैकल्पिक फ्लैटमाउंट रेटिना तैयारी प्रस्तुत करता है जिसमें फोटोरिसेप्टर सेल निकायों को हटाने से इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, सीटू संकरण और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगों के लिए आंतरिक रेटिना न्यूरॉन्स तक तेजी से एंटीबॉडी प्रसार और बेहतर पैच पिपेट पहुंच सक्षम होती है।

Abstract

द्विध्रुवी कोशिकाएं और कशेरुक रेटिना की क्षैतिज कोशिकाएं फोटोरिसेप्टर द्वारा फोटॉन का पता लगाने के बाद दृश्य जानकारी को संसाधित करने वाले पहले न्यूरॉन्स हैं। वे प्रकाश अनुकूलन, विपरीत संवेदनशीलता, और स्थानिक और रंग प्रतिरोध जैसे मौलिक संचालन करते हैं। सटीक सर्किटरी और जैव रासायनिक तंत्र की पूरी समझ जो उनके व्यवहार को नियंत्रित करती है, दृश्य तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान और नेत्र विज्ञान चिकित्सा को आगे बढ़ाएगी। हालांकि, द्विध्रुवी और क्षैतिज कोशिकाओं (रेटिना पूरे माउंट और ऊर्ध्वाधर स्लाइस) की जांच के लिए वर्तमान तैयारी इन कोशिकाओं की शारीरिक रचना और शरीर विज्ञान को पकड़ने की उनकी क्षमता में सीमित है। इस काम में, हम जीवित, फ्लैटमाउंट माउस रेटिना से फोटोरिसेप्टर सेल निकायों को हटाने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं, कुशल पैच क्लैंपिंग और तेजी से इम्यूनोलेबलिंग के लिए द्विध्रुवी और क्षैतिज कोशिकाओं तक बढ़ी हुई पहुंच प्रदान करते हैं। विभाजित रेटिना नाइट्रोसेल्यूलोज के दो टुकड़ों के बीच एक पृथक माउस रेटिना को सैंडविच करके तैयार किए जाते हैं, फिर धीरे से उन्हें अलग कर देते हैं। पृथक्करण नाइट्रोसेल्यूलोज के दो टुकड़े उत्पन्न करने के लिए बाहरी प्लेक्सीफॉर्म परत के ठीक ऊपर रेटिना को विभाजित करता है, एक में फोटोरिसेप्टर सेल बॉडी होती है और दूसरे में शेष आंतरिक रेटिना होता है। ऊर्ध्वाधर रेटिना स्लाइस के विपरीत, विभाजित रेटिना तैयारी आंतरिक रेटिना न्यूरॉन्स की डेंड्राइटिक प्रक्रियाओं को अलग नहीं करती है, जिससे द्विध्रुवी और क्षैतिज कोशिकाओं से रिकॉर्डिंग की अनुमति मिलती है जो गैप जंक्शन-युग्मित नेटवर्क और वाइड-फील्ड एमोक्राइन कोशिकाओं के योगदान को एकीकृत करते हैं। यह काम इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और सीटू संकरण प्रयोगों में क्षैतिज और द्विध्रुवी कोशिकाओं के अध्ययन के लिए इस तैयारी की बहुमुखी प्रतिभा को प्रदर्शित करता है।

Introduction

रेटिना पीछे की आंख में स्थित एक पतली तंत्रिका ऊतक है जहां प्रकाश को अवरुद्ध किया जाता है और एक विद्युत रासायनिक संकेत में संसाधित किया जाता है जिसे मस्तिष्क द्वारा व्याख्या किया जा सकता है। रेटिना के पीछे, रॉड और शंकु फोटोरिसेप्टर प्रकाश द्वारा उत्तेजित होते हैं, जो न्यूरोट्रांसमीटर, ग्लूटामेट1 की टॉनिक रिलीज दर को कम करता है। ग्लूटामेट एकाग्रता में इस प्रकाश-प्रेरित परिवर्तन का अनुभव करने और प्रतिक्रिया करने वाले पहले न्यूरॉन्स द्विध्रुवी य कोशिकाएं (बीसी) और क्षैतिज कोशिकाएं (एचसी) हैं, जिनके सोम आंतरिक परमाणु परत (आईएनएल) के सबसे बाहरी क्षेत्र में रहते हैं। ये दूसरे क्रम के न्यूरॉन्स रेटिना में सिग्नल प्रोसेसिंग के पहले चरण का प्रदर्शन करते हैं और दृष्टि की महत्वपूर्ण विशेषताओं जैसे प्रकाश अनुकूलन, कंट्रास्ट संवेदनशीलता और स्थानिक / जबकि इन कार्यों को बीसी और एचसी के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है, इन प्रक्रियाओं के अंतर्निहित सर्किटरी और जैव रासायनिक तंत्र पूरी तरहसे समझ में नहीं आते हैं। इसलिए, बीसी और एचसी फिजियोलॉजी की खोज के लिए उपकरणों और विधियों की उन्नति सर्वोपरि महत्व की है।

ऊर्ध्वाधर (अनुप्रस्थ) रेटिना अनुभाग ों ने लंबे समय से बीसी और एचसी का अध्ययन करने के लिए सबसे व्यावहारिक मॉडल साबित किया है; हालांकि, बीसी और एचसी फिजियोलॉजी के कुछ पहलू इस मॉडल के तहत प्रयोगकर्ता के लिए दुर्गम हैं। एचसी से प्रत्यक्ष रिकॉर्डिंग या बीसी पर उनके प्रभावों के अप्रत्यक्ष माप रेटिना की अंतर्जात कनेक्टिविटी को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं क्योंकि इन कोशिकाओं की पार्श्व प्रक्रियाएं टुकड़े करने के दौरान अलग हो जाती हैं। पूरे माउंट रेटिना की तैयारी इन पार्श्व प्रक्रियाओं को संरक्षित करके इस मुद्दे को दरकिनार करती है, लेकिन आसपास की रेटिना परतेंइन कोशिकाओं तक पहुंचने के लिए एक चुनौती पैदा करती हैं। जबकि पूरे माउंट रेटिना में आईएनएल न्यूरॉन्स से इम्यूनोस्टेनिंग 5,6,7,8 और पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग 9 के प्रचुर उदाहरण हैं, इन आंकड़ों के संग्रह को तेज और सरल बनाने का अवसर है। अनुप्रस्थ वर्गों की अंतर्निहित सीमाओं और पूरे माउंट मॉडल की चुनौतियों ने इस वैकल्पिक फ्लैटमाउंट रेटिना तैयारी के विकास को प्रेरित किया।

निम्नलिखित कार्य सरलीकृत पैच क्लैंपिंग और तेज, अधिक कुशल इम्यूनोलेबलिंग के लिए बीसी और एचसी तक पहुंच बढ़ाने के लिए लाइव, फ्लैटमाउंट रेटिना से फोटोरिसेप्टर परत को आसानी से हटाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। एक पृथक रेटिना के दोनों ओर जुड़े नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली के दो टुकड़ों को छीलने से फोटोरिसेप्टर अक्षतंतु के माध्यम से ऊतक को आँसू आते हैं, जिससे एक विभाजित रेटिना निकलता है जो बाहरी प्लेक्सीफॉर्म परत (ओपीएल) और सभी आंतरिक रेटिना परतों को बरकरार रखता है। जबकि अन्य लोगों ने रेटिना की परतों को यांत्रिक रूप से अलग करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया है, ये विधियां या तो पैच क्लैंपिंग और माइक्रोस्कोपी अनुप्रयोगों के लिए खराब अनुकूल हैं या ऊतक के थकाऊ हेरफेर की आवश्यकता होती है। इनमें से कई विधियों को परत पृथक्करण के लिए जमे हुए या लियोफिलाइज्ड ऊतक की आवश्यकता होती है, जिससे उन्हें इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगों10,11,12 के साथ असंगत बना दिया जाता है। अन्य जीवित ऊतक के लिए डिज़ाइन किए गए हैं, लेकिन फोटोरिसेप्टर को हटाने के लिए फ़िल्टर पेपर 4,11 या ट्रिप्सिन 13 के साथ उपचार के साथ 5-15 अनुक्रमिक छिलके की आवश्यकता होती है। यहां वर्णित तकनीक फोटोरिसेप्टर हटाने की प्रक्रिया को सरल बनाकर और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के प्रदर्शनों का विस्तार करके अपने पूर्ववर्तियों पर सुधार करती है।

Protocol

चूहों को पानी और भोजन एड लिबिटम प्रदान किया गया था और उन्हें 12 घंटे के प्रकाश / अंधेरे चक्र पर बनाए रखा गया था। चूहों को आइसोफ्लुरेन के संपर्क में आने से इच्छामृत्यु दी गई थी, जिसके बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था हुई थी। सभी पशु प्रक्रियाएं राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के दिशानिर्देशों के अनुसार थीं और ओरेगन हेल्थ एंड साइंस यूनिवर्सिटी संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित थीं।

नोट: जीवित ऊतक के स्वास्थ्य को संरक्षित करने के लिए आंख न्यूक्लियेशन, रेटिना विच्छेदन और रेटिना विभाजन जितनी जल्दी हो सके किया जाना चाहिए। प्रति आंख < 4 मिनट में विच्छेदन पूरा करने का लक्ष्य रखें। इन तीन चरणों को क्रमिक रूप से किया जाना है। जंगली प्रकार के चूहे: प्रयोगों के लिए वयस्क (>3 महीने) नर और मादा C57BL/6J चूहों का उपयोग किया गया था। सिनैप्स आकृति विज्ञान के लिए, पीसीपी 2 प्रमोटर (पीसीपी 2-सीआरई / जीएफपी) 14 के तहत हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) को व्यक्त करने वाले चूहों का उपयोग किया गया था। ट्रांसजेनिक चूहों: इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री या इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगों के दौरान जीएफपी के साथ क्षैतिज सेल विज़ुअलाइज़ेशन के लिए, एक ट्रिपल-ट्रांसजेनिक माउस का उपयोग किया गया था: vGATFLPo; vGlut2Cre; Ai80d. vGATFlpo और vGluT2Cre उपभेद नॉक-इन चूहे हैं जो अपने संबंधित प्रमोटरों के डाउनस्ट्रीम में Flpo या Cre recombinase व्यक्त करते हैं। एआई 80 डी माउस एक इंटरसेक्शनल रिपोर्टर माउस (कैटच / ईवाईएफपी) है और केवल क्रे और एफएलपीओ रिकॉम्बिनेस को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं में सीए 2 + पारगम्य चैनल रोडोप्सिन (सीएचआर2 ) व्यक्त करेगा। इस प्रकार, ट्रिपल ट्रांसजेनिक माउस केवल वीजीएटी और वीग्लूटी 2 अभिव्यक्ति दोनों के इतिहास के साथ कोशिकाओं में सीएचआर 2 व्यक्त करता है।

1. रेटिना विच्छेदन और रेटिना विभाजन के लिए सामग्री की तैयारी

  1. नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली के टुकड़े तैयार करें
    नोट: नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली से विभाजित रेटिना को अलग करने से माइक्रोस्कोपी में पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति कम हो जाती है और पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग सरल हो जाती है। ऊतक निर्धारण से पहले या बाद में झिल्ली हटाने का काम किया जा सकता है। निश्चित विभाजित रेटिना के लिए, नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली के टुकड़ों का इलाज करना आवश्यक नहीं है। जीवित विभाजित रेटिना के लिए, ऊतक से कोमल अलगाव की सुविधा के लिए चरण 1.1.3 - 1.1.5 के अनुसार झिल्ली का इलाज करें।
    1. नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली के 16 टुकड़े (या अधिक) 5 मिमी x 5 मिमी वर्गों में काटें। अतिरिक्त थोक में तैयार किया जा सकता है और भविष्य के उपयोग के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।
    2. बाद में उपयोग के लिए झिल्ली के आधे टुकड़ों को अलग रखें। इन टुकड़ों को ब्लॉकिंग समाधान के साथ इलाज नहीं किया जाएगा।
    3. शेष टुकड़ों को डिटर्जेंट मुक्त आईएचसी ब्लॉकिंग समाधान (जैसे 3% घोड़े का सीरम + 0.025% एनएएन3 पीबीएस में पतला) में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए धीरे से हिलाते हुए इनक्यूबेट करें।
      सावधानी: एनएएन3 को संभालते समय उचित पीपीई का उपयोग करें, क्योंकि यह एक शक्तिशाली विष है।
    4. झिल्ली के टुकड़ों को कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए बाइकार्बोनेट-बफर्ड एम्स मीडिया में इनक्यूबेशन करके अच्छी तरह से धोएं, धीरे से हिलाएं।
    5. झिल्ली के अवरुद्ध टुकड़ों को पूरी तरह से हवा में सुखाएं (~ 20 मिनट)। झिल्ली के टुकड़ों को कमरे के तापमान पर लेबल और स्टोर करें, उन्हें झिल्ली के अनुपचारित टुकड़ों से अलग रखें।
  2. एम्स मीडिया तैयार करें
    1. बाइकार्बोनेट-बफर्ड एम्स मीडिया तैयार करें और निरंतर कार्बोजेनेशन (95% ओ 2 और 5% सीओ2) के तहत कमरे के तापमान पर समाधान बनाए रखें।

2. माउस आंख न्यूक्लियेशन

  1. संस्थागत IACUC दिशानिर्देशों के अनुसार किसी भी उपलब्ध विधि द्वारा माउस को इच्छामृत्यु करें।
  2. माउस को एक तरफ पलटें और आंख सॉकेट के चारों ओर धीरे से दबाने के लिए दो उंगलियों का उपयोग करें। इससे आंख खोपड़ी से बाहर निकल जाएगी।
  3. घुमावदार विच्छेदन कैंची का उपयोग करके, ऑप्टिक तंत्रिका को अलग करने और खोपड़ी से आंख को अलग करने के लिए उभरी हुई आंख के नीचे स्निप करें।
  4. कैंची के साथ आंख को स्कूप करें और इसे बर्फ-ठंडे एम्स मीडिया से भरे पेट्री डिश में रखें।
    नोट: डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए जिसमें ऊतक को विभाजित करने के बाद तय किया जाएगा, एम्स मीडिया के बजाय बर्फ-ठंडा पीबीएस का उपयोग किया जा सकता है।
  5. शेष आंख के लिए चरण 2.1 - 2.4 दोहराएं।

3. रेटिना विच्छेदन

  1. ताजा, बर्फ-ठंडे एम्स मीडिया वाले एक नए पेट्री डिश में एक आंख को स्थानांतरित करने के लिए कस्टम ग्लास ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करें।
    नोट: कस्टम ट्रांसफर पिपेट का व्यापक उद्घाटन ऊतक के आकस्मिक झुकाव को रोकता है, और ग्लास का उपयोग पिपेट की दीवारों पर ऊतक के आसंजन को कम करता है। हालांकि, एक चौड़े मुंह वाला प्लास्टिक ट्रांसफर पिपेट भी स्वीकार्य है यदि प्रयोगकर्ता पहले से ही इस उपकरण का उपयोग करने में कुशल है।
  2. पेट्री डिश के तल पर अपने अतिरिक्त संयोजी ऊतक को पिन करके आंख को स्थिर करने के लिए बल का उपयोग करें। फिर, वन्नास कैंची के लिए प्रवेश बिंदु बनाने के लिए 25 जी सुई का उपयोग करके ओरा सेराटा लाइन के साथ आंख को पंचर करें।
  3. ओरा सेराटा लाइन को काटने के लिए वन्नास कैंची का उपयोग करें जब तक कि कॉर्निया आंख के बाकी हिस्सों से मुक्त न हो जाए (पूरक चित्र 1 ए)। बल का उपयोग करके आईकप से लेंस निकालें (पूरक चित्रा 1 बी)।
  4. आईकप को कार्बोजेनेटेड एम्स की एक बड़ी मात्रा (≥100 एमएल) में स्थानांतरित करने के लिए कस्टम ग्लास पिपेट का उपयोग करें और शेष आंख के साथ चरण 3.1 - 3.3 दोहराएं।
    नोट: ऊतक स्वास्थ्य को बनाए रखने के लिए आईकप को कार्बोजेनेटेड एम्स में रखा जाता है, जबकि विच्छेदन दूसरी आंख पर किया जाता है।
  5. एक आईकप को ताजा कार्बोजेनेटेड एम्स से भरे पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
  6. वन्नास कैंची का उपयोग करके, श्वेतपटल के किनारे से अंदर की ओर एक छोटा स्निप बनाएं, फिर रेटिना से श्वेतपटल को छीलने के लिए दो जोड़े बल का उपयोग करें (पूरक चित्र 1 सी)। बल के साथ रेटिना को पकड़ने से बचें। इसके बजाय, कैंची स्निप द्वारा बनाए गए श्वेतपटल के फ्लैप को अलग करें।
  7. श्वेतपटल और रेटिना को जोड़ने वाली ऑप्टिक तंत्रिका को स्निप करने के लिए वन्नास कैंची का उपयोग करें (पूरक चित्र 1 डी), फिर रेटिना को अलग करने के लिए कैंची या बल का उपयोग करके धीरे से स्क्लेरा से रेटिना को देखें। (चित्र 1ए)।
    नोट: जबकि आरपीई आमतौर पर आईकप से जुड़ा रहेगा, रेटिना से जुड़े होने की स्थिति में आरपीई को हटाने के लिए कोई अतिरिक्त कदम उठाने की आवश्यकता नहीं है। इस बिंदु पर, चपटे चरण के दौरान कर्लिंग को रोकने के लिए रेटिना के किनारों को वैकल्पिक रूप से स्केलपेल के साथ ट्रिम किया जा सकता है (चित्रा 1 बी)।
  8. रेटिना को आधे या चौथाई (चित्रा 1 सी) में काटने के लिए स्केलपेल का उपयोग करें, फिर टुकड़ों को लगातार कार्बोजेनेटेड एम्स मीडिया की एक बड़ी मात्रा (≥ 100 एमएल) में वापस करने के लिए कस्टम ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करें।
    नोट: आधे या क्वार्टर का विकल्प व्यक्तिपरक है। वांछित आवेदन के लिए सबसे अच्छा विकल्प चुनें।
  9. रेटिना विभाजन के लिए आगे बढ़ने से पहले शेष आंख के लिए चरण 3.5 - 3.8 दोहराएं।

4. रेटिना विभाजन

  1. पेट्री व्यंजनों से एम्स मीडिया को त्याग दें और इसे ताजा कार्बोजेनेटेड एम्स के साथ बदलें।
    नोट: रेटिना विभाजन प्रक्रिया के शेष भाग में कार्बोजेनेशन बनाए रखने के लिए, पेट्री डिश में मीडिया को लगभग हर 5 मिनट में ताजा कार्बोजेनेटेड एम्स के साथ बदलें।
  2. कस्टम ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके, रेटिना के एक टुकड़े को ग्लास स्लाइड (7.5 सेमी x 5 सेमी), गैंग्लियन सेल साइड पर रखें, फिर एक नाजुक टास्क वाइप (चित्रा 1 डी) के साथ आसपास के तरल को हटाकर इसे समतल करें। यदि आवश्यक हो, तो धीरे-धीरे एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत एक ठीक टिप पेंटब्रश के साथ रेटिना किनारों को खींचें।
  3. रेटिना पर नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली के सूखे 5 मिमी x 5 मिमी टुकड़े को कम करने के लिए बल का उपयोग करें, जिससे यह नाड़ीग्रन्थि कोशिका पक्ष (चित्रा 1 ई) का पालन करता है।
    नोट: यदि जीवित ऊतक से झिल्ली हटाने की आवश्यकता है (यानी, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए), इस चरण के लिए सीरम-उपचारित झिल्ली के एक सूखे टुकड़े का उपयोग करें (विवरण के लिए चरण 1.1.3 - 1.1.5 देखें)। यह गैंग्लियन सेल परत के आसंजन की ताकत को कम करता है, जिससे नाइट्रोसेल्यूलोज पोस्ट-स्प्लिट से रेटिना को निकालना आसान हो जाता है।
  4. रेटिना को पलटें ताकि नाइट्रोसेल्यूलोज ग्लास स्लाइड पर आराम कर रहा हो और रेटिना के फोटोरिसेप्टर पक्ष पर 5 मिमी x 5 मिमी झिल्ली का एक सूखा टुकड़ा रखें (चित्रा 1 एफ)।
  5. पेंटब्रश की गीली नोक को दो झिल्ली के बीच की जगह पर स्पर्श करें और केशिका क्रिया को एम्स को सैंडविच में चूसने की अनुमति दें (चित्रा 1 जी)। यह रेटिना के लिए झिल्ली के पालन को कम करता है और केवल तभी आवश्यक होता है जब रेटिना नाजुक कार्य पोंछे के साथ अत्यधिक सूख गया हो।
    नोट: यदि रेटिना ने अपनी चमकदार उपस्थिति खो दी है, तो इसे अत्यधिक सूखा दिया गया है, और चरण 4.5 आवश्यक है।
  6. समान पालन सुनिश्चित करने के लिए, गीले पेंटब्रश (चित्रा 1 एच) के साथ ऊपरी झिल्ली पर हल्का नीचे की ओर दबाव लागू करें।
  7. निचली झिल्ली को एक जोड़ी बल के साथ कांच में पिन करते समय, ऊपरी झिल्ली को धीरे से छीलने के लिए एक धीमी, स्थिर गति का उपयोग करें। इससे रेटिना ओपीएल (चित्रा 1 आई) के ठीक ऊपर विभाजित हो जाएगा।
  8. फोटोरिसेप्टर युक्त ऊपरी झिल्ली को छोड़ दें (चित्रा 1 जे, बाएं)। निचली झिल्ली में आंतरिक रेटिना होता है, जिसे अब से विभाजित रेटिना (चित्रा 1 जे, दाएं) के रूप में जाना जाता है।
  9. विभाजित रेटिना को तुरंत कार्बोजेनेटेड एम्स मीडिया में वापस करें।
    नोट: जीवित ऊतक पर प्रयोगों के लिए, रेटिना को विभाजित होने के बाद कार्बोजेनेटेड एम्स में 15-30 मिनट की वसूली अवधि से लाभ हो सकता है।

Figure 1
चित्र 1: विभाजित रेटिना प्रक्रिया । (ए) ठंडे पीबीएस या एम्स मीडिया में न्यूक्लियेशन और आईकप तैयारी के बाद, माउस रेटिना को आईकप से अलग करें और पीबीएस को कमरे के तापमान, कार्बोजेनेटेड एम्स मीडिया से बदलें। (बी) स्केलपेल का उपयोग करके, रेटिना के किनारों को तब तक ट्रिम करें जब तक कि आंतरिक कर्ल (वैकल्पिक) वाले क्षेत्र न हों। (सी) स्केलपेल का उपयोग करके रेटिना को क्वार्टर या आधे में काट लें। (डी) कस्टम ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके एक ग्लास स्लाइड (गैंग्लियन सेल साइड अप) पर रेटिना का एक टुकड़ा रखें और एक नाजुक टास्क वाइप का उपयोग करके सभी अतिरिक्त एम्स को हटा दें। सुनिश्चित करें कि अगले चरण में जाने से पहले अर्ध-शुष्क रेटिना ग्लास पर सपाट पड़ा है। रेटिना के उन क्षेत्रों को धीरे से खोलने के लिए एम्स-गीला पेंटब्रश टिप का उपयोग करें जो सपाट नहीं हैं। (ई) बल का उपयोग करके, चपटे रेटिना पर सूखे नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली (5 मिमी x 5 मिमी) का एक पूर्व-कटा हुआ टुकड़ा रखें। (एफ) नाइट्रोसेल्यूलोज के टुकड़े को पलटें ताकि रेटिना का फोटोरिसेप्टर पक्ष अब सामने आ रहा है। फिर रेटिना पर झिल्ली का एक और सूखा टुकड़ा रखें। (जी) ब्रश की गीली नोक को दो झिल्ली के बीच की जगह पर स्पर्श करें और केशिका क्रिया को एम्स को सैंडविच में चूसने की अनुमति दें। यह रेटिना के लिए झिल्ली के पालन को कम करता है और केवल तभी आवश्यक होता है जब रेटिना नाजुक कार्य पोंछे के साथ अत्यधिक सूख गया हो। (एच) सैंडविच रेटिना के केंद्र पर धीरे से नीचे की ओर दबाने के लिए एक गीले पेंटब्रश टिप का उपयोग करें। (I) झिल्ली के निचले टुकड़े को कांच की स्लाइड पर पिन करने के लिए एक जोड़ी बल का उपयोग करें, जबकि झिल्ली के शीर्ष टुकड़े को धीरे से नीचे से छीलने के लिए बल की एक और जोड़ी का उपयोग करें। (जे) आंतरिक रेटिना (बाएं) नीचे की झिल्ली पर रहता है जबकि फोटोरिसेप्टर (दाएं) को शीर्ष झिल्ली के साथ दूर खींचा जाता है। पैनल (ए), (बी), (सी), (डी), और (जे) को विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अधिग्रहित किया गया था; स्केल बार लगभग 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है; पैनलों (ई-आई) को बिना आवर्धन के स्मार्टफोन कैमरे के साथ अधिग्रहित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

5. इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रयोगों के लिए विभाजित रेटिना की तैयारी

नोट: विभाजित रेटिना अभी भी चरण 5.5 तक नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली से जुड़ा होगा। चरण 5.1, 5.2, 5.3, या 5.4 को पूरा करें, सभी चार नहीं क्योंकि ये विभिन्न प्रयोगों के लिए हैं।

सावधानी: उचित पीपीई का उपयोग करें और पैराफॉर्मलडिहाइड (फिक्सेटिव) को संभालते समय सावधानी से आगे बढ़ें।

  1. फ्लैटमाउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस की तैयारी
    1. रेटिना को पूरी तरह से कवर करने के लिए पर्याप्त समाधान का उपयोग करके 30 मिनट के लिए बर्फ पर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में विभाजित रेटिना को इनक्यूबेट करें।
    2. कमरे के तापमान पीबीएस के 5-10 एमएल में विभाजित रेटिना 3x धोएं। वैकल्पिक विराम: विभाजित रेटिना को पीबीएस में 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे तक छोड़ा जा सकता है।
  2. विभाजित रेटिना के ऊर्ध्वाधर वर्गों के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस की तैयारी।
    1. रेटिना को पूरी तरह से कवर करने के लिए पर्याप्त समाधान का उपयोग करके 30 मिनट के लिए बर्फ पर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में विभाजित रेटिना को इनक्यूबेट करें।
    2. कमरे के तापमान पीबीएस के 5-10 एमएल में विभाजित रेटिना 3x धोएं। वैकल्पिक विराम: विभाजित रेटिना को पीबीएस में 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे तक छोड़ा जा सकता है।
    3. झिल्ली अभी भी जुड़ी हुई है, क्रमिक रूप से ऊतक की क्रायोप्रोटेक्ट के लिए 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर विभाजित रेटिना को 10%, 20%, और 30% सुक्रोज में डुबोएं।
    4. क्रायोप्रोटेक्टेड स्प्लिट रेटिना को इष्टतम काटने के तापमान (ओ.सी.टी.) यौगिक में एम्बेड करें और क्रायोसेक्शनिंग तक उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस (6 महीने तक) पर स्टोर करें।
    5. एम्बेडेड स्प्लिट रेटिना को -80 डिग्री सेल्सियस से हटा दें और सेक्शन 20 μm मोटी काटने के लिए क्रायोस्टैट का उपयोग करें। इलेक्ट्रोस्टैटिक रूप से चार्ज किए गए ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर अनुभागों को माउंट करें, उन्हें हवा में सूखने दें, फिर उन्हें 6 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. सीटू संकरण और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री में दोहरी प्रतिदीप्ति की तैयारी
    1. रेटिना को पूरी तरह से कवर करने के लिए पर्याप्त समाधान का उपयोग करके 2 घंटे के लिए बर्फ पर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में विभाजित रेटिना को इनक्यूबेट करें।
    2. कमरे के तापमान पीबीएस के 5-10 एमएल में विभाजित रेटिना 3x धोएं। वैकल्पिक विराम: विभाजित रेटिना को पीबीएस में 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे तक छोड़ा जा सकता है।
  4. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए तैयारी
    1. माइक्रोपिपेट पुलर का उपयोग करके फिलामेंट के साथ मोटी दीवार वाले बोरोसिलिकेट ग्लास पिपेट खींचकर पैच पिपेट तैयार करें। केवल 6-10 मीटर के बीच मापा प्रतिरोध के साथ पिपेट का उपयोग करें।
    2. खींचे गए पिपेट को आंतरिक समाधान के साथ वापस भरें जिसमें (mM में): 125 K-ग्लूकोनेट, 8 KCl, 5 HEPES, 1 MgCl 2, 1 CaCl 2,0.2 EGTA, 3 ATP-Mg, और 0.5 GTP-Na शामिल हैं।
  5. नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली से विभाजित रेटिना को हटाना
    1. हाइड्रोफोबिक बैरियर पेन का उपयोग करके, माइक्रोस्कोप स्लाइड (~ 1 सेमी व्यास) पर गोलाकार कुएं तैयार करें और उन्हें 5-10 मिनट तक हवा में सूखने दें।
    2. तैयार हाइड्रोफोबिक बैरियर पेन कुओं के भीतर विभाजित रेटिना रखें और उन्हें पूरी तरह से कवर करने के लिए पर्याप्त पीबीएस जोड़ें।
    3. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, ऊतक के किनारों के नीचे एक महीन पेंटब्रश के ब्रिसल्स को धक्का दें और धीरे से ऊपर की ओर उठाएं। इस तरीके से, रेटिना को झिल्ली से दूर उठाने के लिए एक सर्कल में काम करें।
    4. रेटिना के तैरते हुए टुकड़े के नीचे से झिल्ली को हटाने के लिए बल का उपयोग करें।
    5. शेष पीबीएस को ध्यान से हटा दें ताकि रेटिना का टुकड़ा माइक्रोस्कोप स्लाइड, गैंग्लियन सेल-साइड डाउन पर आराम करने के लिए आ जाए।
      नोट: निम्न चरणों को क्रमिक रूप से निष्पादित नहीं किया जाना है। वांछित अनुप्रयोग के लिए उपयुक्त प्रोटोकॉल चुनें (यानी, इम्यूनोस्टेनिंग या सीटू संकरण में दोहरी प्रतिदीप्ति [फिश] और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री [आईएचसी] या इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी)।

6. इम्यूनोस्टेनिंग

  1. यदि अभी तक तैयार नहीं किया गया है, तो माइक्रोस्कोप स्लाइड (~ 1 सेमी व्यास) पर गोलाकार कुएं बनाने के लिए हाइड्रोफोबिक बैरियर पेन का उपयोग करें और उन्हें 5-10 मिनट तक हवा में सूखने दें। इन पेन वेलों के भीतर सभी इनक्यूबेशन चरण और धोने के चरण किए जाएंगे।
  2. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए एंटीबॉडी इनक्यूबेशन समाधान (एआईएस: 3% घोड़े का सीरम, 0.5% ट्राइटन एक्स -100, पीबीएस में 0.025% एनएन 3) में विभाजित रेटिना या ऊर्ध्वाधर विभाजित रेटिना वर्गों को इनक्यूबेट करें।
  3. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए एआईएस में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ विभाजित रेटिना या ऊर्ध्वाधर विभाजित रेटिना वर्गों को इनक्यूबेट करें।
    नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन समय को विभिन्न प्रोटीन लक्ष्यों और एंटीबॉडी के लिए अनुकूलन की आवश्यकता होगी।
  4. कमरे के तापमान पीबीएस में ऊतक 3 x धोएं।
  5. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए एआईएस में पतला द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ ऊतक को इनक्यूबेट करें। कमरे के तापमान पीबीएस में ऊतक 3 x धोएं।
  6. यदि परमाणु धुंधलापन वांछित है, तो कमरे के तापमान पर 30 सेकंड के लिए पीबीएस में पतला डीएपीआई के साथ ऊतक को इनक्यूबेट करें। कमरे के तापमान पीबीएस में ऊतक 1x धोएं।
  7. ऊतक के प्रत्येक टुकड़े पर स्लाइड माउंटिंग मीडिया की एक बूंद लागू करें और एक ग्लास कवरस्लिप माउंट करें।
  8. नमूने को सील करने के लिए कवरस्लिप के किनारों के चारों ओर नेल पॉलिश लागू करें। स्लाइड को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

7. दोहरी मछली और आईएचसी

  1. स्लाइड के पालन को बढ़ाने के लिए संकरण ओवन में 30 मिनट के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर विभाजित रेटिना को बेक करें।
  2. निम्नलिखित अपवादों और परिवर्तनों के साथ निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार आरएनएस्कोप फिश प्रोटोकॉल को पूरा करें:
    1. कोई एंटीजन पुनर्प्राप्ति चरण की आवश्यकता नहीं है। कमरे के तापमान पर 18 मिनट के इनक्यूबेशन समय के साथ प्रोटीज III का उपयोग करें।
    2. हाइड्रोफोबिक बैरियर पेन द्वारा बनाए गए कुओं के भीतर स्लाइड पर सभी धोने के चरणों का पालन करें।
  3. संकरण ओवन में 40 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए पीबीएस में प्राथमिक एंटीबॉडी पतला ( सामग्री की तालिका देखें) में नमूनों को इनक्यूबेट करें। कमरे के तापमान पीबीएस में नमूने 3x धोएं।
  4. संकरण ओवन में 40 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए पीबीएस में द्वितीयक एंटीबॉडी पतला ( सामग्री की तालिका देखें) में नमूनों को इनक्यूबेट करें। कमरे के तापमान पीबीएस में नमूने 3x धोएं।
  5. कमरे के तापमान पर 30 सेकंड के लिए 1x DAPI में नमूने को इनक्यूबेट करें। कमरे के तापमान पीबीएस में नमूने 1x धोएं।
  6. ऊतक के प्रत्येक टुकड़े पर एंटी-फीके बढ़ते मीडिया की एक बूंद लागू करें और एक ग्लास कवरस्लिप माउंट करें।
  7. नमूने को सील करने के लिए कवरस्लिप के किनारों के चारों ओर नेल पॉलिश लागू करें। स्लाइड को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

8. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी

  1. नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली को हटाने के बाद, एक विभाजित रेटिना को पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग कक्ष में स्थानांतरित करें और धीरे से इसे प्लैटिनम वीणा के साथ लंगर डालें।
  2. प्रयोग के दौरान, लगातार 95% ओ2 और 5% सीओ2 के साथ एम्स समाधान कार्बोजेनेटेड के साथ विभाजित रेटिना को प्रत्यारोपित करें। घोल को 32-34 डिग्री सेल्सियस के बीच बनाए रखें।
    नोट: प्रयोग के दौरान, ऊतक को डोड ग्रेडिएंट कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके देखा जा सकता है।
  3. कमरे की रोशनी के तहत, आईएनएल न्यूरॉन्स से रिकॉर्ड करने के लिए पूरे सेल वोल्टेज-क्लैंपिंग का प्रदर्शन करें।
    1. रिकॉर्डिंग करते समय, फार्मास्युटिकल यौगिकों को लागू करने के लिए एक माइक्रोसेलुलर इंजेक्शन यूनिट का उपयोग करके प्रकाश प्रतिक्रियाओं का अनुकरण करें, या चैनलरोडोप्सिन (सीएचआर 2) को उत्तेजित करने के लिए 470 एनएम एलईडी।
      नोट: प्रकाश तीव्रता को डिजिटल ऑप्टिकल पावर मीटर का उपयोग करके मापा जा सकता है।

9. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी

  1. कॉन्फोकल इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए, 40x/1.3 या 63x/1.40 तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करके कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ चित्र लें। चमक और कंट्रास्ट को समायोजित करने और छवि ढेर से जेड-अनुमान उत्पन्न करने के लिए फिजी का उपयोग करें।

  

Representative Results

रेटिना विभाजन फोटोरिसेप्टर टर्मिनलों को संरक्षित करता है

यह पुष्टि करने के लिए कि रेटिना विभाजन ओपीएल में दूसरे क्रम के न्यूरॉन्स के डेंड्राइट को नुकसान नहीं पहुंचाता है, विभाजित रेटिना के ऊर्ध्वाधर वर्गों को सिनैप्टिक पुटिका प्रोटीन सिनैप्टोफिसिन (हरा), और प्रोटीन काइनेज सी अल्फा (पीकेसी; लाल) के खिलाफ एंटीबॉडी से दाग दिया गया था। विभाजित रेटिना के शीर्ष पर सिनैप्टोफिसिन लेबलिंग का तीव्र बैंड इंगित करता है कि फोटोरिसेप्टर सिनैप्टिक टर्मिनल ों को बरकरार रखा जाता है (चित्रा 2)। इसके अलावा, पीकेसी धुंधला होने से रॉड द्विध्रुवी कोशिकाओं (आरबीसी) की सामान्य आकृति विज्ञान का पता चलता है। कोई फोटोरिसेप्टर नाभिक दिखाई नहीं दे रहा है, यह दर्शाता है कि रेटिना ओपीएल और फोटोरिसेप्टर सेल निकायों की सबसे भीतरी पंक्ति के बीच विभाजित है (चित्रा 2)।

Figure 2
चित्रा 2: विभाजित रेटिना फोटोरिसेप्टर टर्मिनलों को बनाए रखते हैं। फ्लोरोसेंट कॉन्फोकल माइक्रोग्राफ एक थूक रेटिना के ऊर्ध्वाधर क्रॉस-सेक्शन को दर्शाता है जिसे विभाजन प्रक्रिया के बाद क्रायोसेक्शनेड (20 μm मोटाई) किया गया था। प्रत्येक छवि एक कॉन्फोकल जेड-स्टैक का अधिकतम प्रक्षेपण है। आरबीसी और सिनैप्टिक पुटिकाओं की कल्पना करने के लिए क्रमशः पीकेसी (शीर्ष केंद्र) और सिनैप्टोफिसिन (शीर्ष दाएं) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ खंड को इम्यूनोलेबल किया गया था। विलय की गई छवि (नीचे) सिनैप्टिक पुटिकाओं (हरे) को दिखाती है, जो फोटोरिसेप्टर टर्मिनलों में रहते हैं, ओपीएल में आरबीसी (लाल) की एपिकल प्रक्रियाओं के ठीक ऊपर। सेल नाभिक को DAPI (नीला) के साथ लेबल किया जाता है। ओएनएल के भीतर कोई फोटोरिसेप्टर नाभिक दिखाई नहीं दे रहा है। संक्षेप: ओएनएल = बाहरी परमाणु परत; ओपीएल = बाहरी प्लेक्सीफॉर्म परत; आईएनएल = आंतरिक परमाणु परत; आईपीएल = आंतरिक प्लेक्सीफॉर्म परत; जीसी = गैंग्लियन कोशिकाएं। स्केल सलाखों = 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  

रेटिना विभाजन के बाद ओपीएल में सिनैप्स आकृति विज्ञान संरक्षित है।

पीसीपी 2 प्रमोटर के तहत आरबीसी में जीएफपी को व्यक्त करने वाले माउस का उपयोग करते हुए ओपीएल में 14 प्री-और पोस्ट-सिनैप्टिक प्रोटीन को विभाजित14 के बाद इस सिनैप्टिक परत की अखंडता का आकलन करने के लिए इम्यूनोलेबल किया गया था। फोटोरिसेप्टर के अक्षतंतु के माध्यम से होने वाले कतरनी बलों के बावजूद, विभाजन ओपीएल में फोटोरिसेप्टर-बीसी सिनैप्स की आकृति विज्ञान को परेशान नहीं करता है, क्योंकि आरबीसी डेंड्राइट की सामान्य स्थिति, जिसे आरजीएस 11 के लिए लेबल किया गया है, और फोटोरिसेप्टर सिनैप्टिक रिबन, जिसे सीटीबीपी 215 के लिए लेबल किया गया है (चित्रा 3)। छड़ और आरबीसी के बीच प्रत्येक सिनैप्टिक संपर्क के लिए, आरजीएस 11 को लाल पंक्टा के रूप में देखा जा सकता है जो सिनैप्टिक रिबन (हरे) के घोड़े की नाल के आकार के भीतर स्थित है। बाद के एक प्रयोग में, एक एंटी-जीपीआर 179 एंटीबॉडी 16 का उपयोग पोस्ट-सिनैप्टिक ओएन-बीसी डेंड्राइटिक टिप्स16 को लेबल करने के लिए किया गया था, और एक एंटी-पीएसडी -95 एंटीबॉडी का उपयोग प्री-सिनैप्टिक रॉड फोटोरिसेप्टर टर्मिनलों (पूरक चित्रा 2) को लेबल करने के लिए किया गया था। ये परिणाम फिर से विभाजित रेटिना तैयारी में ओपीएल की स्थिरता की पुष्टि करते हैं, क्योंकि आरबीसी डेंड्राइट को उनके पूर्व-सिनैप्टिक पार्टनर, रॉड टर्मिनलों के साथ निकटता से जुड़ने के लिए दिखाया गया है।

Figure 3
चित्रा 3: रेटिना विभाजन के बाद ओपीएल में सिनैप्स आकृति विज्ञान संरक्षित है। पीसीपी 2 प्रमोटर के तहत आरबीसी में जीएफपी व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक माउस से विभाजित रेटिना की कॉन्फोकल इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां। रेटिना में आरबीसी में जीएफपी अभिव्यक्ति (नीला) का स्तर भिन्न होता है। विभाजन के बाद, रेटिना को तय किया गया, फिर क्रमशः फोटोरिसेप्टर सिनैप्टिक रिबन और ओएन-बीसी डेंड्राइटिक टिप्स को लेबल करने के लिए सीटीबीपी 2 (हरा) और आरजीएस 11 (लाल) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया। प्रत्येक लाल-हरे रंग की जोड़ी एक रॉड और एक ओएन-बीसी के बीच एक सिनैप्टिक संपर्क का प्रतिनिधित्व करती है। स्केल सलाखों = 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

रेटिना विभाजन आरबीसी व्यवहार्यता को बनाए रखता है।

विभाजन के बाद आंतरिक-रेटिना न्यूरॉन्स की व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए, एक झिल्ली अभेद्य, निकट-अवरक्त परमाणु डाई (एमआई-एनआईआर) का उपयोग किया गया था, जो मृत कोशिकाओं की पहचान को सक्षम बनाता है। एमआई-एनआईआर के साथ इनक्यूबेशन के बाद, विभाजित रेटिना को तय किया गया, फिर आरबीसी की पहचान करने के लिए एंटी-पीकेसी के साथ लेबल किया गया। विभाजित रेटिना के कॉन्फोकल माइक्रोग्राफ ऊतक में सेल व्यवहार्यता में क्षेत्रीय परिवर्तनशीलता को प्रकट करते हैं, कुछ क्षेत्रों में दूसरों की तुलना में कोशिका मृत्यु की उच्च दर का अनुभव होता है। यह परिवर्तनशीलता विच्छेदन, विभाजन या हैंडलिंग प्रक्रियाओं के दौरान रेटिना के कुछ क्षेत्रों पर किए गए नुकसान के परिणामस्वरूप हो सकती है (चित्रा 4)। यह देखते हुए कि आरबीसी के सेल निकाय आईएनएल के सबसे बाहरी क्षेत्र में रहते हैं, विभाजन की साइट के करीब, उनकी व्यवहार्यता का सावधानीपूर्वक मूल्यांकन आवश्यक था। पीकेसीएन और एमआई-एनआईआर के दुर्लभ सह-स्थानीयकरण ने पुष्टि की कि अधिकांश आरबीसी रेटिना विभाजन के बाद व्यवहार्य रहते हैं (चित्रा 4)।

Figure 4
चित्रा 4: रेटिना विभाजन के बाद रॉड द्विध्रुवी कोशिकाएं व्यवहार्य हैं। फ्लोरोसेंट कॉन्फोकल माइक्रोग्राफ एक फ्लैटमाउंट परिप्रेक्ष्य में एक विभाजित रेटिना के क्षेत्र को दर्शाता है। विभाजित होने के बाद, जीवित रेटिना को 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एमआई-एनआईआर डाई (लाल) के साथ इनक्यूबेट किया गया था। इसके बाद रेटिना को ठीक किया गया और आरबीसी की कल्पना करने के लिए पीकेसीएन के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोलेबल किया गया। रेटिना के इस क्षेत्र में, पीकेसी और एमआई-एनआईआर का सह-स्थानीयकरण असामान्य है। MI-NIR नाभिक (नीले) के साथ मिलकर बनता है जो RBCs से संबंधित नहीं हैं। संक्षेप: MI-NIR = झिल्ली अभेद्य NIR जीवित / मृत दाग। स्केल सलाखों = 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  

विभाजित रेटिना दोहरी मछली और आईएचसी के लिए उत्तरदायी हैं।

मानक आईएचसी के लिए निर्धारण समय का विस्तार करके, विभाजित रेटिना को फिश और आईएचसी द्वारा क्रमिक रूप से संसाधित किया जा सकता है ताकि एमआरएनए और प्रोटीन को एक साथ17,18 लेबल किया जा सके। प्रयोगों ने पुष्टि की कि 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में 2 घंटे का निर्धारण मजबूत एमआरएनए लेबलिंग पैदा करता है, जबकि एंटीबॉडी बाइंडिंग के लिए प्रोटीन एपिटोप्स को संरक्षित करता है। बाहरी आईएनएल में आरबीसी (एंटी-पीकेसी एंटीबॉडी) की स्थिति के संबंध में जीएबीएए रिसेप्टर सबयूनिट δ (जीएबीआरडी; एंटी-सेंस एमआरएनए जांच) की अभिव्यक्ति की कल्पना करने के लिए आईएचसी के बाद विभाजित रेटिना पर फिश का प्रदर्शन किया गया था (चित्रा 5 ए)। आरबीसी में जीएबीआरडी एमआरएनए अभिव्यक्ति दुर्लभ दिखाई देती है (चित्रा 5 ए); हालांकि, प्रतिलेख बहुतायत से अमाक्रिन कोशिकाओं और गैंग्लियन कोशिकाओं द्वारा व्यक्त किया जाता है जैसा कि एक बरकरार रेटिना (चित्रा 5 बी) से अनुप्रस्थ वर्गों पर लेबलिंग पैटर्न द्वारा स्पष्ट है। बाहरी आईएनएल (चित्रा 5 ए) में, जीएबीआरडी एमआरएनए आंतरिक आईएनएल (चित्रा 5 सी) की तुलना में अधिक समान रूप से वितरित किया जाता है जहां यह अलग-अलग कोशिकाओं में केंद्रित होता है। अन्य जीएबीए रिसेप्टर सबयूनिट्स को लक्षित करने वाली एंटीसेंस जांच अलग-अलग लेबलिंग पैटर्न का उत्पादन करती है, जो जांच की विशिष्टता का प्रदर्शन करती है (डेटा नहीं दिखाया गया है)।

Figure 5
चित्र 5: एक विभाजित रेटिना और एक बरकरार रेटिना में दोहरी मछली और आईएचसी। (ए, सी) एक फ्लैटमाउंट स्प्लिट रेटिना के कॉन्फोकल माइक्रोग्राफ और (बी) एक बरकरार रेटिना से एक ऊर्ध्वाधर खंड। (ए) और (सी) में छवियां क्रमशः आईएनएल के ऊपरी और निचले क्षेत्रों में ऑप्टिकल वर्गों के अधिकतम अनुमान हैं। (बी) में बिंदीदार आयताकार (ए) और (सी) में दिखाए गए अनुमानों को बनाने के लिए उपयोग की जाने वाली अनुमानित सीमाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। विभाजित रेटिना (ए, सी) को 2 घंटे के लिए तय किया गया था, फिर जीएबीआरडी (लाल) के खिलाफ एंटीसेंस एमआरएनए जांच के साथ लेबल किया गया था। बाद में, विभाजित रेटिना को आरबीसी (हरा) लेबल करने के लिए पीकेसी के खिलाफ एंटीबॉडी से दाग दिया गया था। स्पष्टता के लिए पीकेसीएन चैनल को निचले आईएनएल के अनुमानों से हटा दिया गया था। (बी) में बरकरार रेटिना को सेक्शनिंग से पहले 24 घंटे के लिए तय किया गया था। बाद में, निश्चित रेटिना को जीएबीआरडी (लाल) के खिलाफ एंटीसेंस एमआरएनए जांच के साथ लेबल किया गया था। कवरस्लिप माउंटिंग से पहले सभी नमूनों को 20 सेकंड के लिए डीएपीआई (नीले) से दाग दिया गया था। संक्षेप: INL = आंतरिक परमाणु परत। स्केल सलाखों = 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

विभाजित रेटिना बीसी और एचसी से पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं।

एक पारंपरिक पूरे माउंट रेटिना में बीसी या एचसी सोमा को पैच करने के लिए, पिपेट को गैंग्लियन सेल साइड या फोटोरिसेप्टर साइड से संपर्क करना चाहिए। दोनों दृष्टिकोणों को आईएनएल तक पहुंचने के लिए कई रेटिना परतों को पार करने की आवश्यकता होती है, जिसके दौरान पिपेट टिप अक्सर मलबे से बाधित हो जाती है। एक वाइब्रेटोम स्लाइस तैयारी में, बीसी और एचसी सोमा आसानी से सुलभ होते हैं, लेकिन उनकी डेंड्राइटिक प्रक्रियाओं को अलग किया जा सकता है, जिससे उनके पार्श्व कनेक्शन बाधित हो सकते हैं। विभाजित रेटिना में, हालांकि, आरबीसी और एचसी के सेल शरीर ऊतक की सतह पर बैठते हैं, जो ओपीएल के पार्श्व सर्किटरी को संरक्षित करते हुए पैच पिपेट तक बहुत बेहतर पहुंच प्रदान करते हैं।

चित्रा 6 एक विभाजित रेटिना में बीसी से दर्ज रासायनिक रूप से नकली प्रकाश प्रतिक्रियाओं को दर्शाता है। अंधेरे में फोटोरिसेप्टर से ग्लूटामेट रिलीज का अनुकरण करने के लिए परफ्यूज्ड एम्स माध्यम को एल-एपी 4 (4 μM), एक समूह III mGluR एगोनिस्ट के साथ पूरक किया गया था। mGluR6 विरोधी, CPPG (600 μM, एम्स में), mGluR6 के निषेध के माध्यम से प्रकाश फ्लैश का अनुकरण करने के लिए पैच ्ड सेल (-60 mV पर आयोजित) के डेंड्राइट पर फूला गया था। कोशिकाओं ने दो प्रकार की आंतरिक धाराओं के साथ सीपीपीजी पफ का जवाब दिया। एक प्रकार एक क्षणिक धारा को दर्शाता है जिसके बाद एक पठार (चित्रा 6 ए) होता है, जो रेटिना स्लाइस19 में आरबीसी से दर्ज कैननिकल प्रकाश-उत्पन्न धाराओं के समान होता है। अन्य प्रकार पफ अवधि (चित्रा 6 बी) के दौरान निरंतर रहता है, जो ओएन शंकु द्विध्रुवी कोशिकाओं (ओएन-सीबीसी) 19 से दर्ज धाराओं जैसा दिखता है।

एचसी को लक्षित करने के लिए एक अलग प्रयोग किया गया था, एक विस्तृत डेंड्राइटिक क्षेत्र के साथ एक सेल प्रकार जिसे अक्सर स्लाइस तैयारी में संरक्षित करना मुश्किल होता है। एचसी में चैनल रोडोप्सिन (सीएचआर 2) और जीएफपी को व्यक्त करने वाली एक माउस लाइन का उपयोग फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत आसान पहचान की सुविधा के लिए किया गया था। सबसे पहले, एचसी से धाराओं को विध्रुवण चरणों (-100 एमवी से 50 एमवी, चरण आकार = 15 एमवी) की एक श्रृंखला के जवाब में दर्ज किया गया था, जिसके लिए उन्होंने बाहरी धाराओं के बाद आंतरिक धाराओं के साथ प्रतिक्रिया दी (चित्रा 6 सी)। इन कोशिकाओं को तब एक संक्षिप्त नीली प्रकाश पल्स (200 एमएस, 470 एनएम) के साथ उत्तेजित किया गया था, जो दो कोशिकाओं में बड़ी, सीएचआर 2-संचालित आंतरिक धाराओं का उत्पादन करती थी (चित्रा 6 डी)।

Figure 6
चित्रा 6: विभाजित रेटिना में आईएनएल न्यूरॉन्स से पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग । (ए) एल-एपी 4 (4 μM) युक्त संक्रमित एम्स मीडिया में -60 mV पर एक कथित RBC और (B) CBC को वोल्टेज-क्लैंप किया गया था। क्लैंप ्ड कोशिकाओं के डेंड्राइट पर पफिंग सीपीपीजी (600 μM) ने एक आंतरिक प्रवाह का आह्वान किया जो आरबीसी में क्षणिक था लेकिन सीबीसी में बना हुआ था। (ए) में आरबीसी रिकॉर्डिंग एक एकल ट्रेस है जबकि (बी) में सीबीसी रिकॉर्डिंग 3 निशान के औसत का प्रतिनिधित्व करती है। (सी) एक vGATFLPo में एक HC से एक पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग; vGlut2Cre; Ai80d माउस. लाल रेखा 200 एमएस, 470 एनएम प्रकाश पल्स की अवधि को दर्शाती है जिसका उपयोग CHR2 के माध्यम से बड़े, आंतरिक प्रवाह को आमंत्रित करने के लिए किया जाता है। (D) एक HC से इंजेक्ट की गई वर्तमान प्रतिक्रियाओं को -60 mV पर वोल्टेज लगाया गया था, फिर 15 mV अंतराल में -70 mV और +35 mV के बीच कदम रखा गया और -60 mV पर वापस आ गया। इनसेट वोल्टेज चरण की शुरुआत के आसपास 6 एमएस विंडो में समान निशान दिखाता है। (ई) एक फ्लैटमाउंट स्प्लिट रेटिना का इम्यूनोफ्लोरोसेंट माइक्रोग्राफ जो एक वीजीएटीएफएलपीओ में जीएफपी को व्यक्त करने वाली क्षैतिज कोशिकाओं को दर्शाता है; vGlut2Cre; Ai80d माउस. स्केल बार = 20 μm। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी डेटा को 20 kHz नमूना दर पर एकत्र किया गया था और 5 kHz पर कम-पास बेसेल फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर किया गया था। डेटा तब निर्यात किया गया था, और पायथन 3 का उपयोग करके ऑफ़लाइन विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

रेटिना विभाजन आईएनएल और ओपीएल शरीर रचना विज्ञान की तेजी से पूछताछ को सक्षम बनाता है।

रेटिना की बाहरी सीमित झिल्ली (ईएलएम) और ओएनएल में एक बाधा ~ 90 μm मोटी होती है, जो आंतरिक रेटिना में एंटीबॉडी के प्रसार को बाधित करती है और20,21,22 की स्थिति बनाती है। इसलिए, पारंपरिक फ्लैटमाउंट रेटिना का उपयोग करके ओपीएल या आईएनएल में इम्यूनोलेबलिंग लक्ष्यों को समय-गहन धुंधला प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है, जिसके लिए अक्सर 48-96 एच एंटीबॉडी ऊष्मायन 5,6,7,8,20,22 की आवश्यकता होती है।

फोटोरिसेप्टर को हटाने से आंतरिक रेटिना न्यूरॉन्स के तेजी से एंटीबॉडी प्रवेश की अनुमति मिलती है। नतीजतन, डाई-संयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी के उपयोग के साथ आंतरिक-रेटिना प्रोटीन लक्ष्यों की लेबलिंग 1 घंटे से भी कम समय में प्राप्त की जा सकती है। पीकेसी और कैलबिनडिन-डी के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग क्रमशः आईएनएल के आरबीसी और एचसी को लेबल करने के लिए किया गया था (चित्रा 7)। पारंपरिक ऊर्ध्वाधर रेटिना वर्गों के विपरीत जो वाइड-फील्ड न्यूरॉन्स की पार्श्व प्रक्रियाओं को छोटा करते हैं, विभाजित रेटिना तैयारी एचसी (चित्रा 6 ई, चित्रा 7) जैसे वाइड-फील्ड कोशिकाओं के पूर्ण डेंड्राइटिक आर्बर के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाती है।

Figure 7
चित्रा 7: एक विभाजित रेटिना में आंतरिक रेटिना प्रोटीन का तेजी से इम्यूनोलेबलिंग। एक फ्लैटमाउंट परिप्रेक्ष्य से एक विभाजित रेटिना की कॉन्फोकल इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां। विभाजित रेटिना को क्रमशः ओएन-बीसी और एचसी लेबल करने के लिए कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पीकेसी (पीला) और कैलबिनडिन-डी (हरा) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया था। (ए) प्रत्येक एकल चैनल छवि एक औसत जेड-प्रोजेक्शन है जो चार ऑप्टिकल वर्गों से बना है: डीएपीआई, औसत जेड 10-13; कैलबिनडिन-डी, औसत जेड 11-14; पीकेसी, औसत जेड 11-14। (बी) मर्ज की गई छवि में, समान अनुमानों को सुपरइम्पोज किया जाता है। स्केल सलाखों = 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 1: रेटिना विच्छेदन के प्रमुख चरण। सभी छवियों को एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के ओकुलर लेंस पर लगाए गए स्मार्टफोन कैमरे के साथ लिया गया था। (ए) कॉर्निया को हटाने के बाद माउस आंख की एक टॉप-डाउन छवि। (बी) लेंस को हटा दिए जाने के बाद माउस आईकप की एक टॉप-डाउन छवि। (C) माउस आईकप पर श्वेतपटल में एक छोटा चीरा लगाया जाता है। तीर श्वेतपटल के दो फ्लैप को इंगित करते हैं जो रेटिना को श्वेतपटल से अलग करना शुरू करने के लिए बल द्वारा विपरीत दिशाओं में खींचे जाते हैं। (डी) रेटिना से स्क्लेरा को आंशिक रूप से दूर खींचने के बाद, वन्नास कैंची को श्वेतपटल और रेटिना के बीच डाला जाता है, और रेटिना को मुक्त करते हुए ऑप्टिक तंत्रिका को अलग कर दिया जाता है। लाल बिंदीदार वृत्त ऑप्टिक तंत्रिका सिर को दर्शाता है, और कैंची सही काटने के प्रक्षेपवक्र को प्रदर्शित करती है (श्वेतपटल और रेटिना के बीच कैंची डालें)। श्वेतपटल के बाद पृथक रेटिना को हटा दिया जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 2: विभाजित रेटिना में ओपीएल के पूर्व और पोस्ट-सिनैप्टिक घटकों का लक्षण वर्णन। एक विभाजित रेटिना में ओपीएल से कॉन्फोकल इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां। विभाजित रेटिना को क्रमशः ओएन-बीसी और रॉड फोटोरिसेप्टर के टर्मिनलों के डेंड्राइटिक टिप्स को लेबल करने के लिए कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए जीपीआर 179 और पीएसडी 95 के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया था। बाएं और केंद्र छवियां कई ऑप्टिकल वर्गों के अधिकतम अनुमान हैं; उसी अनुमान को दाईं छवि में सुपरइम्पोज किया जाता है। ओएन-बीसी डेंड्राइटिक टिप्स में जीपीआर 179 पंक्टा को रॉड फोटोरिसेप्टर टर्मिनलों के साथ निकटता से जुड़ा हुआ देखा जाता है, जो ओपीएल के भीतर बरकरार सिनैप्टिक संपर्कों का प्रदर्शन करता है। स्केल बार = 10 μm. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 3: समस्या निवारण: एक विभाजित रेटिना की गुणवत्ता का आकलन। सेल नाभिक की कल्पना करने के लिए डीएपीआई के साथ सना हुआ एक विभाजित रेटिना का फ्लोरोसेंट माइक्रोग्राफ। कोशिकाओं को नाभिक के व्यास और ऊतक की गहराई के आधार पर पहचाना जा सकता है। (ए) फोटोरिसेप्टर नाभिक छोटे, उज्जवल और अधिक सतही होते हैं, जबकि (बी) बीसी नाभिक बड़े, मंद और गहरे होते हैं। (सी) एक क्षेत्र की कम आवर्धन छवि जहां फोटोरिसेप्टर को पूरी तरह से हटा दिया गया था। फोकस में दिखाई देने वाले नाभिक बीसी से होते हैं, जो छवि के किनारों पर फोटोरिसेप्टर नाभिक से गहरे होते हैं जो फोकस से बाहर दिखाई देते हैं। (ए) और (बी) के लिए स्केल सलाखों = 20 μm। (C) के लिए स्केल बार = 50 μm. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

फोटोरिसेप्टर फोटॉन अवशोषण को न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज में ट्रांसड्यूस करने के बाद, बीसी और एचसी दृश्य संकेत23 को संसाधित करने वाले पहले रेटिना न्यूरॉन्स हैं। जबकि इन न्यूरॉन्स के महत्व की अच्छी तरह से सराहना की जाती है, उनके कई कार्यों को पूरी तरह से समझा या अस्पष्टीकृत किया जाता है। कई बीसी और एचसी फिजियोलॉजी अध्ययनों को एक फ्लैटमाउंट रेटिना तैयारी से लाभ होगा जो पार्श्व कनेक्टिविटी को संरक्षित करते हुए आईएनएल न्यूरॉन्स तक पहुंच में सुधार करता है। विभाजित रेटिना विधि का विकास एक फ्लैटमाउंट अभिविन्यास में बीसी और एचसी से उच्च गुणवत्ता वाले इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग और माइक्रोस्कोपी डेटा प्राप्त करने के लिए एक आसान प्रोटोकॉल प्रदान करने के प्रयास का प्रतिनिधित्व करता है। यहां वर्णित विभाजित रेटिना तैयारी विशेष उपकरणों के उपयोग के बिना, रेटिना अलगाव के बाद लगभग 20 मिनट प्रति माउस (10 मिनट प्रति रेटिना) में की जा सकती है। विधि मौजूदा फोटोरिसेप्टर हटाने की प्रक्रियाओं से प्रेरणा लेती है लेकिन सादगी, गति और बहुमुखी प्रतिभा 4,10,11,12,13 में महत्वपूर्ण सुधार प्रदान करती है। रेटिना परतों को अलग करने के पिछले तरीकों के विपरीत, रेटिना विभाजन को रेटिना में ठंड, लियोफिलाइजेशन, या चिपकने वाले पदार्थों के बार-बार आवेदन की आवश्यकता नहीं होती है। अभ्यास के साथ, लगभग सभी फोटोरिसेप्टर को नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली के साथ एक आंसू में हटाया जा सकता है। इस दृष्टिकोण की गति और आसानी रेटिना को कार्बोजेनेटेड एम्स से बाहर खर्च होने वाले समय को कम करने की अनुमति देती है, जिससे लंबे समय तक उच्च सेल व्यवहार्यता सक्षम होती है; विभाजित रेटिना को विभाजन के बाद कई घंटों तक कार्बोजेनेटेड एम्स मीडिया में बनाए रखा जा सकता है। इस तैयारी में आईएनएल न्यूरॉन्स के स्वास्थ्य के प्रमाण के रूप में, एक जीवित / मृत सेल दाग (चित्रा 4) और पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी (चित्रा 6) विभाजन के बाद आरबीसी और एचसी की व्यवहार्यता की पुष्टि करते हैं।

विभाजित रेटिना में फोटोरिसेप्टर परत को हटाने से आईएनएल में एंटीबॉडी के प्रसार समय को नाटकीय रूप से कम करके इम्यूनोलेबलिंग के दौरान एक महत्वपूर्ण लाभ मिलता है। प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी लेबलिंग 2 घंटे के भीतर पूरी की जा सकती है, पारंपरिक फ्लैटमाउंट स्टेनिंग में पर्याप्त सुधार जो लक्ष्य 5,6,7,8,20,22 के आधार पर 72 घंटे या उससे अधिक समय ले सकता है। नतीजतन, माइक्रोस्कोपी डेटा को ऊतक तैयारी के रूप में उसी दिन प्राप्त किया जा सकता है, जिससे इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रयोगों की गति में काफी तेजी आती है। एमआरएनए जांच एनीलिंग की सुविधा के लिए, फिश प्रयोग आमतौर पर इम्यूनोलेबलिंग18 की तुलना में बहुत लंबे समय तक निर्धारण समय (~ 24 घंटे) की सिफारिश करते हैं। हालांकि, यहां प्रस्तुत प्रयोगों से पता चलता है कि 2 घंटे का निर्धारण अभी भी असाधारण मछली लेबलिंग (चित्रा 5) का उत्पादन करता है। निर्धारण समय को 30 मिनट से 2 घंटे तक बढ़ाने के बावजूद, उत्कृष्ट इम्यूनोलेबलिंग प्राप्त करने के लिए एंटीजन पुनर्प्राप्ति चरणों को करना आवश्यक नहीं था, लेकिन यह एंटीबॉडी या एंटीजन के साथ भिन्न हो सकता है। फिश प्रोटोकॉल में प्रोटीज उपचार एंटीबॉडी लेबलिंग में हस्तक्षेप कर सकता है, संभवतः लक्ष्य एपिटोप्स के विनाश के कारण। इस मुद्दे को पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करके दरकिनार कर दिया गया था जो कई एपिटोप्स को लक्षित करते हैं, जिससे संभावना कम हो जाती है कि एपिटोप विनाश इम्यूनोलेबलिंग में बाधा डालेगा। इसके अतिरिक्त, एक मध्यम प्रोटीज उपचार (एसीडी प्रोटीज III) का उपयोग अत्यधिक एपिटोप परिवर्तन को रोकने के लिए किया गया था, जबकि अभी भी पर्याप्त ऊतक प्रवेश प्रदान किया गया था।

कभी-कभी, रेटिना इसके बजाय बाहरी परमाणु परत (ओएनएल) के माध्यम से विभाजित हो जाएगा, जिससे फोटोरिसेप्टर सोमा की परतें पीछे छूट जाएंगी, जिसमें कोई आईएनएल कोशिकाएं दिखाई नहीं देंगी। इसे रोकने के लिए, किसी को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि रेटिना ग्लास पर पूरी तरह से सपाट है, और रेटिना के चारों ओर से किसी भी अवशिष्ट तरल को हटा दिया गया है। पेंटब्रश के साथ नाइट्रोसेल्यूलोज पर अधिक मजबूती से दबाने से ओएनएल के माध्यम से विभाजन को रोकने में भी मदद मिल सकती है। यदि झिल्ली बहुत गीली हो जाती है या रेटिना अपने आप मुड़ जाता है, तो एक सफल विभाजन की संभावना बहुत कम हो जाएगी। सेल नाभिक को दागने के लिए DAPI का उपयोग विभाजन की गुणवत्ता का आकलन करने और शेष फोटोरिसेप्टर के कवरेज का निर्धारण करने के लिए उपयोगी है। फोटोरिसेप्टर नाभिक छोटे, उज्जवल और अधिक सतही होते हैं (पूरक चित्रा 3 ए), जबकि बीसी नाभिक बड़े, मंद और गहरे होते हैं (पूरक चित्रा 3 बी)। कुछ मामलों में, आंसू का विमान रेटिना के टुकड़े में थोड़ा भिन्न होगा, जिसके परिणामस्वरूप पैच होंगे जहां फोटोरिसेप्टर सेल बॉडी को पूरी तरह से हटाया नहीं गया है (पूरक चित्रा 3 सी)। माइक्रोस्कोपी और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी में अनुप्रयोगों के लिए, यह उन क्षेत्रों से गुणवत्ता डेटा एकत्र करने की क्षमता में बाधा नहीं डालता है जहां फोटोरिसेप्टर को ठीक से हटा दिया गया है; पैच पिपेट के साथ इमेजिंग या रिकॉर्डिंग करते समय उजागर आंतरिक रेटिना के बड़े क्षेत्र आसानी से पाए जा सकते हैं। यदि अधिक पूर्ण फोटोरिसेप्टर हटाने की इच्छा है, तो नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली के एक अतिरिक्त टुकड़े के साथ एक दूसरा आंसू किया जा सकता है, हालांकि 100% फोटोरिसेप्टर हटाने की गारंटी नहीं है। इसलिए जीन अभिव्यक्ति या प्रोटिओमिक्स अध्ययनों में विभाजित रेटिना का उपयोग करते समय सावधानी बरतने की सलाह दी जाती है जहां अवशिष्ट फोटोरिसेप्टर सामग्री परिणामों को प्रभावित कर सकती है। एकल सेल अनुप्रयोगों के लिए, यह चिंता अनुचित है, क्योंकि फोटोरिसेप्टर से डेटा को विश्लेषण से बाहर रखा जा सकता है।

विभाजित रेटिना तैयारी के फायदे शायद वाइड-फील्ड इंटरन्यूरॉन्स की इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग में सबसे प्रमुख हैं। जबकि पारंपरिक ऊर्ध्वाधर स्लाइस वाइड-फील्ड कोशिकाओं की व्यापक प्रक्रियाओं को अलग करते हैं, विभाजित रेटिना तैयारी ओपीएल और आईपीएल को बरकरार रखती है, जिससे एचसी24, ए 17 एस 25, टीएच एसी 26 और एनओएस -1 एसी27 जैसे वाइड-फील्ड कोशिकाओं से इनपुट कैप्चर करने की अनुमति मिलती है जो अन्यथा ऊर्ध्वाधर स्लाइस में अनदेखी की जाएगी। इसलिए, परिणामों की व्याख्या और रेटिना स्लाइस से एकत्र किए गए पिछले डेटा के साथ तुलना के लिए सावधानीपूर्वक विचार की आवश्यकता होती है। बहरहाल, प्रकाश उत्तेजना के औषधीय मिमिक्स का उपयोग करने वाले प्रयोगों में, ये परिणाम रेटिना स्लाइस19 से दर्ज किए गए डेटा से मिलते जुलते हैं। सेल-विशिष्ट प्रमोटरों के तहत सीएचआर 2 को व्यक्त करके, ऊर्ध्वाधर सूचना मार्ग पर वांछित सेल के प्रभाव की जांच करने के लिए आईएनएल में बीसी से रिकॉर्डिंग करते समय वांछित सेल आबादी को उत्तेजित किया जा सकता है। गहरे आईएनएल न्यूरॉन्स से सीधे रिकॉर्डिंग, जैसे कि एमोक्राइन कोशिकाएं, विभाजित रेटिना में भी संभव हैं। जबकि इस मामले में पैच इलेक्ट्रोड को पहले अधिक सतही आईएनएल न्यूरॉन्स के माध्यम से यात्रा करनी चाहिए, पारंपरिक पूरे माउंट तैयारी की तुलना में इसके मार्ग में बाधा डालने वाले काफी कम ऊतक हैं।

अन्य न्यूरॉन्स पर वाइड-फील्ड कोशिकाओं के प्रभाव को मापने के अलावा, यह विधि एचसी से सीधे एकल-सेल पैच क्लैंपिंग को सक्षम करती है, जिनके डेंड्राइट ओपीएल28 में एक व्यापक अंतर-जंक्शन युग्मित नेटवर्क बनाते हैं। क्षैतिज कोशिकाएं फोटोरिसेप्टर को महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया भेजती हैं जो रेटिना के माध्यम से ऊर्ध्वाधर जानकारी के संचरण को आकार देती हैं। हालांकि, चूंकि एचसी के डेंड्राइटिक क्षेत्रों को ऊर्ध्वाधर स्लाइस में काट दिया जाता है, इसलिए एकल सेल रिकॉर्डिंग डेटा की कमी होती है। यह काम शारीरिक और शारीरिक रूप से बरकरार एचसी प्रस्तुत करता है जिसमें से सीएचआर 2-इवोकेटेड धाराओं को ट्रिपल ट्रांसजेनिक माउस लाइन (चित्रा 6 सी-ई) में दर्ज किया जाता है। सीएचआर 2 उत्तेजना के बाहर, विभाजित रेटिना का उपयोग अंतर्जात एचसी धाराओं और गैप जंक्शन युग्मन28 का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। जबकि विभाजित रेटिना रासायनिक अनुप्रयोग या सीएचआर 2 उत्तेजना द्वारा प्रेरित सिनैप्टिक कनेक्टिविटी और न्यूरोनल गतिविधि का अध्ययन करने के लिए एक सुविधाजनक मॉडल प्रदान करता है, फोटोरिसेप्टर की कमी प्राकृतिक प्रकाश प्रतिक्रियाओं या प्रकाश अनुकूलन तंत्र के किसी भी प्रत्यक्ष अन्वेषण को रोकती है।

रेटिना में सीटू इमेजिंग ने हाल के वर्षों में सराहनीय प्रगति की है। हालांकि, अधिकांश इमेजिंग अध्ययन पूरे माउंट रेटिना तैयारी29 में गैंग्लियन सेल परत तक सीमित हैं। लेखकों की कल्पना है कि विभाजित रेटिना में फोटोरिसेप्टर की अनुपस्थिति इसे ओपीएल और आईएनएल में लाइव कैल्शियम इमेजिंग के लिए एक आदर्श मॉडल बना देगी। कैल्शियम इमेजिंग से परे, इस मॉडल में आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड बायोसेंसर जैसे iGluSnFR30,31, iGABASnFR32, और pHluorin 33 के साथ उपयोग की बहुत संभावना है। विभाजित रेटिना तैयारी के साथ संयुक्त, ये शक्तिशाली उपकरण बीसी और एचसी के सिनैप्टिक इंटरैक्शन और बायोफिज़िकल गुणों की खोज के लिए एक कुशल दृष्टिकोण प्रदान कर सकते हैं जो रेटिना में प्रकाश प्रसंस्करण में योगदान करते हैं।

Disclosures

लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

यह काम निम्नलिखित एनआईएच अनुदानों द्वारा समर्थित था: एनआईएच अनुदान R01EY031596 (सीएम को); एनआईएच अनुदान R01EY029985 (सीएम को); एनआईएच अनुदान P30EY010572 (सीएम को); एनआईएच अनुदान R01EY032564 (बीएस को)। हम रेटिना सेक्शन तैयार करने में उनके तकनीकी समर्थन के लिए टैमी हेली को धन्यवाद देते हैं, और डॉ चार्ल्स एलन इस काम में उपयोग किए जाने वाले एमआरएनए फिश जांच में उदारतापूर्वक योगदान देने के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#1.5 glass coverslips Fisherbrand 12544E
2 pairs of Dumont #5 forceps Ted Pella 38125
25 gauge needle Becton Dickenson 305122
470 nm LED THORLABS M470L2
5-306 curved scissors Miltex 5-306
9" disposable pasteur pipetes  Fisherbrand 13-678-20D for constructing custom transfer pipette
Ai80d mouse Jackson Laboratories 25109 RRID: IMSR_JAX:025109
Ames Medium w/L-Glutamate US Biological A1372-25
amplifier control software Molecular Devices Clampex 10.3 software
anti-calbindin D28K antibody Invitrogen PA-5 85669 RRID: AB_2792808, host species = rabbit; 1:100 dilution
anti-CtBP2 antibody BD Biosciences 612044 RRID:  AB_399431, host species = mouse; 1:5000 dilution
anti-GPR179 antibody NA NA gift from Kirill Martemyanov; Scripps Research Institute, Jupiter, FL; host species = sheep; 1:1000 dilution
anti-PKC alpha antibody Sigma-Aldrich P4334 RRID: AB_477345, host species = rabbit; 1:5000 dilution
anti-PKC alpha antibody Santa Cruz Biotechnology sc8393 AF594 RRID: AB_628142, host species = mouse; 1:1000 dilution
anti-PSD95 antibody BD Transduction Laboratories 610495 RRID:  AB_397862, host species = mouse; 1:1000 dilution
anti-RGS11 antibody NA NA gift from Ted Wensel; Baylor College of Medicine, Houston, TX;  host species = rabbit; between 1:1000 and 1:5000 dilution
anti-Synaptophysin P38 antibody Sigma S-S5768 RRID: AB_477523, host species = mouse; 1:1000 dilution
Aquamount mounting media Epredia 13800 slide mounting media
C57BL/6J mouse Jackson Laboratories 000664 RRID: IMSR_JAX:000664
carbogen tank Matheson NA 95% O2 and 5% CO2
custom transfer pipette custom build NA Instructions: use scissors to cut off the tip of a plasitc transfer pipette at the point it begins to taper. Use pliers to safely break off the last 2-3 inches of a glass pasteur pipette. Fit the narrow end of the glass pasteur pipette into the wide tip of the plastic transfer pipete. Wrap parafilm around the joint of the two pieces to enhance the seal.
Digitical optical power meter THORLABS  PM100D
dissection microscope Zeiss Stemi 2000
electrophysiology amplifier Molecular Devices Axopatch 200B
electrophysiology microscope Olympus OLYMPUS, BX50WI Dodt gradient contrast microscopy
Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-01
HC PL APO CS2 40x/1.3  Leica 506358
HC PL APO CS2 63x/1.40  Leica 15506350
Hybridization oven Robbins Scientific Model 1000 for RNAscope protocol only
Immedge hydrophobic barrier pen Vector Laboratories H-4000
isoflurane Piramal Critical Care 66794-017-25
Kimwipe (delicate task wipe) Kimtech Science 34155
Leica HC PL APO CS2 40x/1.3 oil immersion objective Leica 506358
Leica HC PL APO CS2 63x/1.40 oil immersion objective Leica 15506350
Leica TCS SP8 X confocal microscope  Leica discontinued
medium 15 mm petri dish Corning 25060-60 eyes are kept here during retina dissection
Merit 97-275 steel scissors Merit 97-275
Micropipette Puller Sutter Instrument p-97
Mm-Gabrd-C2 mRNA probe ACD 459481-C2
mouse euthanasia chamber NA NA custom build; glass petri dish covering a small glass jar.
nitrocellulose membrane filters GE Healthcare Life Sciences; Whatman 7184-005 0.45 µm pore size
Picospritzer General Valve Corporation Picospritzer II  referred to in the text as microcellular injection unit
plastic transfer pipets Fisherbrand 13-711-7M for constructing custom transfer pipette
Plastic tubing Tygon R-603 for connection to carbogen tank
platinum harp custom build NA for anchoring split retinas within the electrophysiology recording chamber.  
size 0 paint brush generic NA for flattening retina during splitting. 
SlowFade Gold antifade reagent Molecular Probes S36937  referred to in the text as anti-fade mounting media
small 10 mm petri dish Falcon 353001 eyes are placed here following enucleation
small glass pane (7.5 cm x 5 cm) generic NA isolatd retina pieces are placed onto this for the splitting procedure
Superfrost plus microscope slides Fisherbrand 12-550-15 electrostatically-charged glass microscope slides
Thick-walled borosilicate glass pipettes with filament  Sutter Instrument BF150-86-10HP
Vannas Scissors; straight Titan Medical TMS121 not brand specific; any comparable scissors will work
vGATFLPo mouse Jackson Laboratories 29591 RRID: IMSR_JAX:029591
vGlut2Cre mouse Jackson Laboratories 28863, 016963 RRID: IMSR_JAX:028863, RRID: IMSR_JAX:016963
Zombie NIR Fixable Viability Kit BioLegend 423105 referred to in the text as MI-NIR

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References

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Hecht, R. M., Shi, Q., Garrett, T. R., Sivyer, B., Morgans, C. Split Retina as an Improved Flatmount Preparation for Studying Inner Nuclear Layer Neurons in Vertebrate Retina. J. Vis. Exp. (203), e65757, doi:10.3791/65757 (2024).

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