Summary
Dette arbeidet presenterer et alternativt flatmount retinapreparat der fjerning av fotoreceptorcellelegemer muliggjør raskere antistoffdiffusjon og forbedret patchpipettetilgang til indre retinale nevroner for immunhistokjemi, in situ hybridisering og elektrofysiologieksperimenter.
Abstract
Bipolare celler og horisontale celler i vertebrate retina er de første nevronene som behandler visuell informasjon etter at fotoner er detektert av fotoreceptorer. De utfører grunnleggende operasjoner som lystilpasning, kontrastfølsomhet og romlig og fargeopponens. En fullstendig forståelse av de nøyaktige kretsene og biokjemiske mekanismene som styrer deres oppførsel, vil fremme visuell nevrovitenskapsforskning og oftalmologisk medisin. Imidlertid er nåværende preparater for å undersøke bipolare og horisontale celler (retinale hele fester og vertikale skiver) begrenset i deres evne til å fange anatomien og fysiologien til disse cellene. I dette arbeidet presenterer vi en metode for å fjerne fotoreceptorcellelegemer fra levende, flatmonterte musenetthinner, noe som gir forbedret tilgang til bipolare og horisontale celler for effektiv patchklemming og rask immunmerking. Split retinas er tilberedt ved å smøre en isolert mus retina mellom to stykker nitrocellulose, og deretter forsiktig peeling dem fra hverandre. Separasjonen splitter netthinnen like over det ytre pleksiforme laget for å gi to stykker nitrocellulose, en som inneholder fotoreceptorcellelegemene og en annen som inneholder gjenværende indre retina. I motsetning til vertikale retina-skiver, kutter det delte retinapreparatet ikke de dendritiske prosessene i indre retinale nevroner, noe som muliggjør opptak fra bipolare og horisontale celler som integrerer bidragene fra gapkrysskoblede nettverk og bredfeltamakrinceller. Dette arbeidet demonstrerer allsidigheten til dette preparatet for studier av horisontale og bipolare celler i elektrofysiologi, immunhistokjemi og in situ hybridiseringseksperimenter.
Introduction
Netthinnen er et tynt nevralt vev som ligger i det bakre øyet hvor lys fanges opp og behandles til et elektrokjemisk signal som kan tolkes av hjernen. På baksiden av netthinnen stimuleres stang- og keglefotoreceptorer av lys, noe som reduserer tonisk frigjøringshastighet for nevrotransmitteren, glutamat1. De første nevronene som opplever og reagerer på denne lysinduserte endringen i glutamatkonsentrasjon er bipolare celler (BC) og horisontale celler (HCs), hvis somas bor i den ytre regionen av det indre kjernefysiske laget (INL). Disse andreordens nevronene utfører den første fasen av signalbehandling i netthinnen og former kritiske synsfunksjoner som lystilpasning, kontrastfølsomhet og romlig / fargeopponens2. Selv om disse funksjonene har blitt tilskrevet BC og HC, er kretsene og biokjemiske mekanismene som ligger til grunn for disse prosessene ikke fullt ut forstått3. Derfor er utviklingen av verktøy og metoder for å utforske BC- og HC-fysiologi av avgjørende betydning.
Vertikale (tverrgående) retinaseksjoner har lenge vist seg å være den mest praktiske modellen for å studere BC og HCs; Imidlertid er visse aspekter av BC- og HC-fysiologi utilgjengelige for eksperimentøren under denne modellen. Direkte opptak fra HCer eller indirekte målinger av deres effekter på BC gjenspeiler ikke retinas endogene tilkobling, siden de laterale prosessene til disse cellene blir kuttet under kutting. Hele mount retina preparater omgå dette problemet ved å bevare disse laterale prosesser, men de omkringliggende retinal lagene utgjør en utfordring for å få tilgang til disse cellene4. Mens det er rikelig eksempler på immunostaining 5,6,7,8 og patch clamp recordings9 fra INL-nevroner i hele mount retinas, er det en mulighet til å fremskynde og forenkle innsamlingen av disse dataene. De iboende begrensningene i tverrsnitt og utfordringene med hele monteringsmodellen inspirerte dermed utviklingen av dette alternative flatmount retinapreparatet.
Følgende arbeid beskriver en protokoll for enkelt å fjerne fotoreceptorlaget fra levende, flatmonterte retinaer for å forbedre tilgangen til BC og HC for forenklet patchklemming og raskere, mer effektiv immunmerking. Peeling fra hverandre to stykker nitrocellulosemembran festet til hver side av en isolert retina tårer vevet gjennom fotoreceptoraksonene, og etterlater en splittet retina som beholder det ytre pleksiforme laget (OPL) og alle indre retinale lag. Mens andre har beskrevet protokoller for mekanisk separering av lag av netthinnen, er disse metodene enten dårlig egnet til patchklemming og mikroskopiapplikasjoner eller krever kjedelig manipulering av vevet. Flere av disse metodene krever frosset eller lyofilisert vev for lagseparasjon, noe som gjør dem uforenlige med elektrofysiologiske eksperimenter10,11,12. Andre er designet for levende vev, men krever 5-15 sekvensielle peelinger med filterpapir 4,11 eller behandling med trypsin 13 for å fjerne fotoreseptorene. Teknikken beskrevet her forbedrer sine forgjengere ved å forenkle prosedyren for fjerning av fotoreseptorer og utvide repertoaret til nedstrømsapplikasjoner.
Protocol
Mus ble utstyrt med vann og mat ad libitum og ble opprettholdt på en 12 timers lys / mørk syklus. Mus ble avlivet ved eksponering for isofluran etterfulgt av cervikal luksasjon. Alle dyreprosedyrer var i samsvar med National Institutes of Health retningslinjer og godkjent av Oregon Health and Science University Institutional Animal Care and Use Committee.
MERK: Øyeenukleasjon, retina disseksjon og retina splitting bør utføres så raskt som mulig for å bevare helsen til det levende vevet. Ta sikte på å fullføre disseksjonen på < 4 minutter per øye. Disse tre trinnene skal utføres sekvensielt. Villtypemus: Voksne (>3 måneder) hann- og hunnmus av typen C57BL/6J ble brukt til eksperimenter. For synapsemorfologi ble mus som uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) under Pcp2-promotoren (Pcp2-cre/GFP)14 brukt. Transgene mus: For horisontal cellevisualisering med GFP under immunhistokjemi eller elektrofysiologieksperimenter ble det brukt en trippel-transgen mus: vGATFLPo; vGlut2Cre; AI80D. VGATFlpo- og vGluT2Cre-stammene er innslagsmus som uttrykker Flpo eller Cre recombinase nedstrøms for sine respektive promotorer. Ai80d-musen er en interseksjonell reportermus (CatCh/EYFP) og vil bare uttrykke Ca2+ permeabelt kanalrhodopsin (ChR2) i celler som uttrykker Cre- og Flpo-rekombinaser. Dermed uttrykker den triple transgene musen bare ChR2 i celler med en historie med både VGAT og vGluT2-uttrykk.
1. Materialforberedelse for retina disseksjon og retina splitting
- Forbered biter av nitrocellulosemembran
MERK: Løsne den delte netthinnen fra nitrocellulosemembranen reduserer bakgrunnsfluorescens i mikroskopi og forenkler patchklemmeopptak. Membranfjerning kan utføres før eller etter vevfiksering. For faste splittede netthinner er det ikke nødvendig å behandle bitene av nitrocellulosemembran. For levende delte netthinner, behandle membranen i henhold til trinn 1.1.3 - 1.1.5 for å lette mild løsrivelse fra vevet.- Skjær 16 stykker (eller mer) nitrocellulosemembran i 5 mm x 5 mm firkanter. Ekstra kan tilberedes i bulk og lagres for fremtidig bruk.
- Sett til side halvparten av membranstykkene for senere bruk. Disse stykkene vil ikke bli behandlet med en blokkerende løsning.
- Inkuber de resterende bitene i en vaskemiddelfri IHC-blokkeringsløsning (f.eks. 3 % hesteserum + 0,025 % NaN3 fortynnet i PBS) i 10 minutter ved romtemperatur, rist forsiktig.
FORSIKTIG: Bruk egnet personlig verneutstyr ved håndtering av NaN3, da det er et kraftig giftstoff. - Vask membranbitene grundig ved inkubering i bikarbonatbufrede Ames-medier i 10 minutter ved romtemperatur, rist forsiktig.
- Lufttørk de blokkerte membranbitene helt (~20 min). Merk og oppbevar membranbitene ved romtemperatur, og hold dem atskilt fra de ubehandlede membranstykkene.
- Forbered Ames-medier
- Forbered bikarbonatbufrede Ames-medier og hold oppløsningen ved romtemperatur under konstant karbogenering (95%O2 og 5% CO2).
2. Museøye enukleasjon
- Avlive musen med en hvilken som helst tilgjengelig metode i henhold til institusjonelle IACUC-retningslinjer.
- Vend musen på den ene siden og bruk to fingre til å trykke forsiktig ned rundt øyehulen. Dette vil føre til at øyet buler ut fra skallen.
- Bruk buet disseksjonssaks, klipp under det bulte øyet for å kutte optisk nerve og for å skille øyet fra skallen.
- Scoop øyet med saks og legg det i en petriskål fylt med iskaldt Ames media.
MERK: For nedstrøms applikasjoner der vevet skal festes etter splitting, kan iskald PBS brukes i stedet for Ames-medier. - Gjenta trinn 2.1 - 2.4 for det gjenværende øyet.
3. Netthinnen disseksjon
- Bruk den tilpassede glassoverføringspipetten til å overføre ett øye til en ny petriskål som inneholder friske, iskalde Ames-medier.
MERK: Den brede åpningen av den tilpassede overføringspipetten forhindrer utilsiktet klemming av vevet, og bruk av glass minimerer vedheft av vevet til pipettens vegger. Imidlertid er en bred munnplastoverføringspipette også akseptabelt hvis eksperimentøren allerede er dyktig til å bruke dette verktøyet. - Bruk tang for å stabilisere øyet ved å feste det ekstra bindevevet til bunnen av petriskålen. Deretter punkterer du øyet langs ora serrata-linjen ved hjelp av en 25G-nål for å lage et inngangspunkt for Vannas-saksen.
- Bruk Vannas-saks til å klippe langs ora serrata-linjen til hornhinnen kommer fri fra resten av øyet (tilleggsfigur 1A). Fjern linsen fra øyemuslingen med tang (tilleggsfigur 1B).
- Bruk den tilpassede glasspipetten til å overføre øyekoppen til et stort volum (≥100 ml) karbogenerte Ames og gjenta trinn 3.1–3.3 med resten av øyet.
MERK: Øyekopper plasseres i karbogenerte Ames for å opprettholde vevshelse mens disseksjonen utføres på det andre øyet. - Overfør en øyekopp til en petriskål fylt med nykarbogenerte Ames.
- Bruk Vannas saks, lag et lite klipp innover fra kanten av sclera, og bruk deretter to par tang for å skrelle sclera bort fra netthinnen (tilleggsfigur 1C). Unngå å ta tak i netthinnen med tangen. I stedet trekker du fra hverandre klaffene på sclera skapt av sakseklippet.
- Bruk Vannas-saksen til å klippe optisk nerve som forbinder sclera og netthinnen (tilleggsfigur 1D), og lirk deretter netthinnen forsiktig fra sclera ved hjelp av saks eller tang for å isolere netthinnen. (Figur 1A).
MERK: Mens RPE vanligvis forblir festet til øyekoppen, er det ikke nødvendig med ekstra trinn for å fjerne RPE hvis den er festet til netthinnen. På dette tidspunktet kan kantene på netthinnen eventuelt trimmes med en skalpell for å forhindre krølling under utflatingstrinnet (figur 1B). - Bruk en skalpell til å dele netthinnen i halvdeler eller kvartaler (figur 1C), og bruk deretter den tilpassede overføringspipetten til å returnere bitene til et stort volum (≥ 100 ml) kontinuerlig karbogenerte Ames-medier.
MERK: Valget av halvdeler eller kvartaler er subjektivt. Velg det beste alternativet for ønsket applikasjon. - Gjenta trinn 3,5–3,8 for det gjenværende øyet før du fortsetter med deling av netthinnen.
4. Retina splitting
- Kast Ames-mediet fra petriskålene og erstatt det med nykarbogenerte Ames.
MERK: For å opprettholde karbogenasjon gjennom resten av retina-splittingsprosedyren, bytt ut mediet i petriskålen med ferske karbogenerte Ames omtrent hvert 5. minutt. - Bruk den tilpassede overføringspipetten til å plassere et stykke netthinne på et glassglass (7,5 cm x 5 cm), ganglioncellesiden opp, og flat det deretter ut ved å fjerne den omkringliggende væsken med en delikat arbeidsserviett (figur 1D). Trekk om nødvendig retinalkantene forsiktig med en fin penselspiss under et disseksjonsmikroskop.
- Bruk tang til å senke en tørr 5 mm x 5 mm bit nitrocellulosemembran ned på netthinnen, slik at den fester seg til ganglioncellesiden (figur 1E).
MERK: Hvis membranfjerning fra levende vev er nødvendig (dvs. for elektrofysiologi), bruk et tørt stykke serumbehandlet membran for dette trinnet (se trinn 1.1.3 - 1.1.5 for detaljer). Dette reduserer styrken av adhesjonen til ganglioncellelaget, noe som gjør det lettere å fjerne netthinnen fra nitrocellulosen etter splittelsen. - Snu netthinnen slik at nitrocellulosen hviler på glassglasset og plasser et tørt stykke 5 mm x 5 mm membran på fotoreseptorsiden av netthinnen (figur 1F).
- Berør den fuktede tuppen av penselen mot mellomrommet mellom de to membranene og la kapillærvirkningen suge Ames inn i smørbrødet (figur 1G). Dette reduserer membranens vedheft til netthinnen og er bare nødvendig hvis netthinnen har blitt altfor tørket med den delikate arbeidstørken.
MERK: Hvis netthinnen har mistet sitt skinnende utseende, har den blitt altfor tørket, og trinn 4.5 er nødvendig. - For å sikre jevn adherens, bruk lett nedadgående trykk på den øvre membranen med en våt pensel (figur 1H).
- Mens du fester den nedre membranen til glasset med ett par tang, bruk en langsom, jevn bevegelse for å forsiktig skrelle den øvre membranen bort med et andre par tang. Dette vil føre til at netthinnen splittes like over OPL (figur 1I).
- Kast den øvre membranen som inneholder fotoreseptorene (figur 1J, venstre). Den nedre membranen inneholder den indre netthinnen, heretter kalt en delt netthinne (figur 1J, til høyre).
- Sett umiddelbart den splittede netthinnen tilbake til karbogenerte Ames-medier.
MERK: For eksperimenter på levende vev kan netthinnen ha nytte av en 15-30 minutters gjenopprettingsperiode i karbogenerte Ames etter splitting.
Figur 1: Delt netthinneprosedyre . (A) Etter enukleasjon og klargjøring av øyekopper i kalde PBS- eller Ames-medier, isoler musehinnen fra øyekoppen og erstatt PBS med romtemperatur, karbogenerte Ames-medier. (B) Bruk en skalpell, trim kantene på netthinnen bort til det ikke er noen regioner med en innoverkrøll (valgfritt). (C) Skjær netthinnen i kvartaler eller halvdeler ved hjelp av en skalpell. (D) Plasser ett stykke netthinne på et glassglass (ganglioncellesiden opp) ved hjelp av den tilpassede overføringspipetten og fjern alt overflødig Ames ved hjelp av en delikat oppgaveserviett. Forsikre deg om at den halvtørre netthinnen ligger flatt på glasset før du går videre til neste trinn. Bruk en Ames-fuktet penselspiss for å forsiktig utfolde områder av netthinnen som ikke er flate. (E) Bruk tang, plasser et ferdigkuttet stykke tørr nitrocellulosemembran (5 mm x 5 mm) på den flate netthinnen. (F) Vend biten av nitrocellulose slik at fotoreceptorsiden av netthinnen nå vender oppover. Legg deretter et annet tørt stykke membran på netthinnen. (G) Berør den våte tuppen av børsten mot mellomrommet mellom de to membranene og la kapillærvirkningen suge Ames inn i smørbrødet. Dette reduserer membranens vedheft til netthinnen og er bare nødvendig hvis netthinnen ble altfor tørket med den delikate oppgavetørken. (H) Bruk en våt penselspiss til å trykke forsiktig nedover på midten av den sammenklemte netthinnen. (I) Bruk ett par tang til å feste det nederste stykket membran på glassglasset, mens du bruker et annet par tang for å forsiktig skrelle det øverste stykket membran bort fra den nederste. (J) Den indre netthinnen (venstre) forblir på bunnmembranen mens fotoreseptorene (høyre) trekkes bort med den øverste membranen. Panelene (A), (B), (C), (D) og (J) ble anskaffet ved hjelp av et disseksjonsmikroskop; skalastangen representerer ca. 1 mm; paneler (E-I) ble anskaffet med et smarttelefonkamera uten forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
5. Fremstilling av delte netthinner for immunfluorescenseksperimenter
MERK: Den delte netthinnen vil fortsatt være festet til nitrocellulosemembranen frem til trinn 5.5. Fullfør enten trinn 5.1, 5.2, 5.3 eller 5.4, ikke alle fire da disse er for forskjellige eksperimenter.
FORSIKTIG: Bruk egnet PPE og fortsett forsiktig ved håndtering av paraformaldehyd (fikseringsmiddel).
- Forberedelse for flatmount immunfluorescens
- Inkuber den delte netthinnen i 4% paraformaldehyd på is i 30 minutter med nok løsning for å dekke netthinnen helt.
- Vask de delte netthinnene 3x i 5-10 ml romtemperatur PBS. Valgfri pause: Delte netthinner kan stå i PBS ved 4 °C i opptil 24 timer.
- Forberedelse for immunfluorescens med vertikale seksjoner av delt retina
- Inkuber den delte netthinnen i 4% paraformaldehyd på is i 30 minutter med nok løsning for å dekke netthinnen helt.
- Vask de delte netthinnene 3x i 5-10 ml romtemperatur PBS. Valgfri pause: Delte netthinner kan stå i PBS ved 4 °C i opptil 24 timer.
- Med membranen fortsatt festet, senk den delte netthinnen sekvensielt ned i 10%, 20% og 30% sukrose ved 4 ° C i 1 time hver for å kryobeskytte vevet.
- Legg de kryobeskyttede delte netthinnene inn i optimal skjæretemperatur (O.C.T.) forbindelse og oppbevar dem ved -80 °C (opptil 6 måneder) til kryoseksjonering.
- Fjern de innebygde delte netthinnene fra -80 °C og bruk en kryostat til å kutte seksjoner som er 20 μm tykke. Monter seksjonene på elektrostatisk ladede glassmikroskoplysbilder, la dem lufttørke, og oppbevar dem deretter ved -20 °C i opptil 6 måneder.
- Forberedelse for dobbel fluorescens in situ hybridisering og immunhistokjemi
- Inkuber den delte netthinnen i 4% paraformaldehyd på is i 2 timer med nok løsning for å dekke netthinnen helt.
- Vask de delte netthinnene 3x i 5-10 ml romtemperatur PBS. Valgfri pause: Delte netthinner kan stå i PBS ved 4 °C i opptil 24 timer.
- Forberedelse til elektrofysiologi
- Forbered patchpipetter ved å trekke tykkveggede borosilikatglasspipetter med filament ved hjelp av en mikropipetteavtrekker. Bruk kun pipetter med en målt motstand mellom 6-10 MΩ.
- Fyll de trukne pipettene med intern oppløsning som inneholder (i mM): 125 K-glukonat, 8 KCl, 5 HEPES, 1 MgCl 2, 1 CaCl 2,0,2 EGTA, 3 ATP-Mg og 0,5 GTP-Na.
- Fjerning av den delte netthinnen fra nitrocellulosemembranen
- Bruk en hydrofob barrierepenn til å klargjøre sirkulære brønner på et mikroskopglass (~1 cm i diameter) og la dem lufttørke i 5-10 minutter.
- Plasser de splittede netthinnene i de forberedte hydrofobe barrierepennbrønnene og tilsett nok PBS til å dekke dem helt.
- Under et disseksjonsmikroskop, skyv børstene på en fin pensel under kantene på vevet og løft forsiktig oppover. På denne måten jobber du rundt netthinnen i en sirkel for å løfte den bort fra membranen.
- Bruk tang for å fjerne membranen fra undersiden av det flytende stykket netthinnen.
- Aspirer forsiktig bort den gjenværende PBS slik at stykket netthinnen hviler på mikroskoplysbildet, ganglioncellesiden ned.
MERK: Følgende trinn skal ikke utføres sekvensielt. Velg riktig protokoll for ønsket applikasjon (dvs. immunfarging eller dobbel fluorescens in situ hybridisering [FISH] og immunhistokjemi [IHC] eller elektrofysiologi).
6. Immunfarging
- Hvis de ennå ikke er forberedt, bruk en hydrofob barrierepenn til å lage sirkulære brønner på et mikroskopglass (~ 1 cm i diameter) og la dem lufttørke i 5-10 minutter. Alle inkubasjonstrinn og vasketrinn vil bli utført i disse pennebrønnene.
- Inkuber delte retinaer eller vertikale delte retinaseksjoner i antistoffinkubasjonsløsning (AIS: 3% hesteserum, 0,5% Triton X-100, 0,025% NaN3 i PBS) i 30 minutter ved romtemperatur.
- Inkuber delte retinaer eller vertikale delte retinaseksjoner med primære antistoffer fortynnet i AIS i 1 time ved romtemperatur.
MERK: Primær antistoffinkubasjonstid vil kreve optimalisering for forskjellige proteinmål og antistoffer. - Vask vevet 3x i romtemperatur PBS.
- Inkuber vevet med sekundære antistoffer fortynnet i AIS i 1 time ved romtemperatur. Vask vevet 3x i romtemperatur PBS.
- Hvis nukleær farging er ønsket, inkuber vevet med DAPI fortynnet i PBS i 30 s ved romtemperatur. Vask vevet 1x i romtemperatur PBS.
- Påfør en dråpe glidemonteringsmedier på hvert stykke vev og monter et glassdeksel.
- Påfør neglelakk rundt kantene på dekselet for å forsegle prøven. Oppbevar lysbildet på 4 °C.
7. Dual FISH og IHC
- Stek de delte netthinnene ved 40 °C i 30 minutter i en hybridiseringsovn for å øke klebeeffekten til lysbildet.
- Fullfør RNAscope FISH-protokollen i henhold til produsentens protokoll med følgende unntak og endringer:
- Ingen antigen henting trinn er nødvendig. Bruk protease III med en inkubasjonstid på 18 min ved romtemperatur.
- Utfør alle vasketrinn på lysbildet i brønnene laget av en hydrofob barrierepenn.
- Inkuber prøvene i primært antistoff fortynnet (se materialfortegnelse) i PBS i 30 minutter ved 40 °C i hybridiseringsovnen. Vask prøvene 3x i romtemperatur PBS.
- Inkuber prøvene i sekundært antistoff fortynnet (se materialtabell) i PBS i 30 minutter ved 40 °C i hybridiseringsovnen. Vask prøvene 3x i romtemperatur PBS.
- Inkuber prøvene i 1x DAPI i 30 s ved romtemperatur. Vask prøvene 1x i romtemperatur PBS.
- Påfør en dråpe anti-fade monteringsmedier på hvert stykke vev og monter et glassdeksel.
- Påfør neglelakk rundt kantene på dekselet for å forsegle prøven. Oppbevar lysbildet på 4 °C.
8. Elektrofysiologi
- Etter å ha fjernet nitrocellulosemembranen, overfør en delt netthinne inn i lappeklemmekammeret og forankre den forsiktig på plass med en platinaharpe.
- Gjennom hele forsøket gjennomsyrer kontinuerlig den delte netthinnen med Ames-oppløsning karbogenert med 95%O2 og 5% CO2. Oppløsningen skal opprettholdes mellom 32-34 °C.
MERK: Under forsøket kan vevet visualiseres ved hjelp av Dodt gradient kontrastmikroskopi. - Under rombelysning, utfør helcellespenningsklemming for å registrere fra INL-nevroner.
- Under opptak, simuler lysresponser ved hjelp av en mikrocellulær injeksjonsenhet for å påføre farmasøytiske forbindelser, eller en 470 nm LED for å stimulere kanalrhodopsin (ChR2).
MERK: Lysintensiteten kan måles ved hjelp av en digital optisk strømmåler.
- Under opptak, simuler lysresponser ved hjelp av en mikrocellulær injeksjonsenhet for å påføre farmasøytiske forbindelser, eller en 470 nm LED for å stimulere kanalrhodopsin (ChR2).
9. Konfokal mikroskopi
- For konfokal immunfluorescens, ta bilder med et konfokalmikroskop ved hjelp av et 40x/1.3 eller 63x/1.40 oljenedsenkingsmål. Bruk FIJI til å justere lysstyrke og kontrast og til å generere Z-projeksjoner fra bildestakker.
Representative Results
Retina splitting bevarer fotoreceptorterminaler
For å bekrefte at retina splitting ikke skader dendrittene av andre ordens nevroner i OPL, ble vertikale seksjoner av delte retina farget med antistoffer mot det synaptiske vesikkelproteinet synaptophysin (grønn) og proteinkinase C alfa (PKCα; rød). Det intense båndet av synaptofysinmerking over toppen av den delte netthinnen indikerer at fotoreseptorsynaptiske terminaler beholdes (figur 2). Videre avslører PKCα-farging normal morfologi av stavbipolare celler (RBC). Ingen fotoreseptorkjerner er synlige, noe som indikerer at netthinnen er delt mellom OPL og innerste rad av fotoreseptorcellelegemer (figur 2).
Figur 2: Delte netthinner beholder fotoreseptorterminaler. Fluorescerende konfokalmikrografer som viser et vertikalt tverrsnitt av en spytteretina som ble kryoseksjonert (20 μm tykkelse) etter spalteprosedyren. Hvert bilde er en maksimal projeksjon av en konfokal z-stack. Snittet ble immunmerket med antistoffer mot PKCα (øverst i midten) og synaptofysin (øverst til høyre) for å visualisere henholdsvis RBC og synaptiske vesikler. Det sammenslåtte bildet (nederst) viser synaptiske vesikler (grønn), som ligger i fotoreceptorterminalene, like over de apikale prosessene til RBCene (rød) i OPL. Cellekjerner er merket med DAPI (blå). Ingen fotoreseptorkjerner er synlige i ONL. Forkortelser: ONL = ytre nukleært lag; OPL = ytre pleksiformt lag; INL = indre nukleært lag; IPL = indre pleksiformt lag; GC = ganglionceller. Skala barer = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Synapsemorfologi i OPL er bevart etter netthinnesplitting
Ved bruk av en mus som uttrykker GFP i RBC under pcp2-promotoren, ble 14 pre- og postsynaptiske proteiner i OPL immunmerket for å vurdere integriteten til dette synaptiske laget etter en splittelse14. Til tross for skjærkreftene som forekommer gjennom fotoreseptorenes aksoner, forstyrrer ikke splitting morfologien til fotoreseptor-BC-synapser i OPL, da normal posisjonering av RBC-dendritter, merket for RGS11, og fotoreseptorsynaptiske bånd, merket for CtBP215, observeres (figur 3). For hver synaptisk kontakt mellom stenger og RBC kan RGS11 ses som rød puncta som ligger innenfor hesteskoformen til de synaptiske båndene (grønn). I et påfølgende eksperiment ble et anti-GPR179-antistoff 16 brukt til å merke de postsynaptiske ON-BC-dendrittiske spissene16, og et anti-PSD-95-antistoff ble brukt til å merke presynaptiske stavfotoreceptorterminaler (tilleggsfigur 2). Disse resultatene bekrefter igjen stabiliteten til OPL i det delte retinapreparatet, da RBC-dendritter er vist å være nært forbundet med deres presynaptiske partner, stangterminalene.
Figur 3: Synapsemorfologi i OPL bevares etter netthinnesplitting. Konfokale immunfluorescensbilder av en delt retina fra en transgen mus som uttrykker GFP i RBC under Pcp2-promotoren. Nivåer av GFP-uttrykk (blå) varierer over RBC i netthinnen. Etter splitting ble netthinnen fiksert, deretter inkubert med antistoffer mot CtBP2 (grønn) og RGS11 (rød) for å merke henholdsvis fotoreceptorsynaptiske bånd og ON-BC dendrittiske spisser. Hvert rødgrønne par representerer en synaptisk kontakt mellom en stang og en ON-BC. Skala barer = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Retina splitting opprettholder RBC levedyktighet
For å vurdere levedyktigheten til de indre retinale nevronene etter en splittelse, ble det brukt et membran ugjennomtrengelig, nær-infrarødt nukleært fargestoff (MI-NIR), som muliggjør identifisering av døde celler. Etter inkubasjon med MI-NIR ble delte retina fiksert, deretter merket med anti-PKCα for å identifisere RBC. Konfokale mikrografer av delt retina avslører regional variasjon i celle levedyktighet over vevet, med noen regioner som opplever høyere frekvenser av celledød enn andre. Denne variasjonen kan skyldes skade påført visse regioner av netthinnen under disseksjons-, spalte- eller håndteringsprosedyrene (figur 4). Gitt at cellelegemene til RBC bor i den ytterste regionen av INL, nær stedet for splittelsen, var en nøye evaluering av deres levedyktighet berettiget. Knapp samlokalisering av PKCα og MI-NIR bekreftet at de fleste RBC forblir levedyktige etter retina splitting (figur 4).
Figur 4: Stavbipolare celler er levedyktige etter netthinnesplitting. Fluorescerende konfokale mikrografer som viser en region av en delt retina i et flatmontert perspektiv. Etter splitting ble den levende netthinnen inkubert med MI-NIR fargestoff (rødt) i 30 minutter ved 37 °C. Netthinnen ble deretter fiksert og immunmerket med antistoffer mot PKCα for å visualisere RBC. I denne regionen av netthinnen er samlokalisering av PKCα og MI-NIR sjelden. MI-NIR samlokaliserer med kjerner (blå) som ikke tilhører RBC. Forkortelser: MI-NIR = membran ugjennomtrengelig NIR levende/død flekk. Skala barer = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Delte netthinner er mottagelige for dobbel FISH og IHC
Ved å forlenge fikseringstiden for standard IHC, kan delte netthinner behandles sekvensielt av FISH og IHC for å merke mRNA og proteiner samtidig17,18. Eksperimenter bekreftet at en 2 timers fiksering i 4% paraformaldehyd gir robust mRNA-merking samtidig som proteinepitoper bevares for antistoffbinding. FISH ble utført på delte netthinner etterfulgt av IHC for å visualisere ekspresjonen av GABA A-reseptorsubenheten δ (GABRD; anti-sense mRNA-prober) i forhold til posisjonen til RBC (anti-PKCα antistoff) i ytre INL (figur 5A). GABRD mRNA-uttrykk synes sjeldent i RBC (figur 5A); Transkripsjonen uttrykkes imidlertid rikelig av amakrine celler og ganglionceller, noe som fremgår av merkemønsteret på tverrsnitt fra en intakt retina (figur 5B). I den ytre INL (figur 5A) er GABRD mRNA jevnere fordelt sammenlignet med den indre INL (figur 5C) hvor den er konsentrert i forskjellige celler. Antisenseprober rettet mot andre GABA-reseptorunderenheter produserer distinkte merkingsmønstre, som demonstrerer spesifisiteten til probene (data ikke vist).
Figur 5: Dobbel FISH og IHC i en delt netthinne og en intakt netthinne. (A, C) Konfokale mikrografer av en flatmount split retina og (B) en vertikal seksjon fra en intakt retina. Bilder i (A) og (C) er maksimale projeksjoner av optiske seksjoner i henholdsvis øvre og nedre regioner av INL. De stiplede rektanglene i (B) representerer de omtrentlige grensene som brukes til å lage projeksjonene vist i (A) og (C). Den delte netthinnen (A, C) ble fiksert i 2 timer, deretter merket med antisens mRNA-sonder mot GABRD (rød). Etterpå ble den delte netthinnen farget med antistoffer mot PKCα for å merke RBC (grønn). PKCα-kanalen ble utelatt fra projeksjoner av nedre INL for klarhet. Intakt netthinne i (B) ble fiksert i 24 timer før snitting. Etterpå ble den faste netthinnen merket med antisens mRNA-sonder mot GABRD (rød). Alle prøvene ble farget med DAPI (blå) i 20 s før coverslip-montering. Forkortelser: INL = indre kjernelag. Skalastenger = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Delte netthinner er godt egnet til patch-klemme elektrofysiologi opptak fra BCs og HCs
For å lappe en BC- eller HC-soma i en tradisjonell helmontert netthinne, må pipetten nærme seg enten fra ganglioncellesiden eller fotoreseptorsiden. Begge tilnærmingene krever kryssing av flere retinale lag for å nå INL, hvor pipettespissen ofte blir blokkert av rusk. I et vibratomstykkepreparat er BC- og HC-somaene lett tilgjengelige, men deres dendrittiske prosesser kan bli kuttet og forstyrre deres laterale forbindelser. I delte netthinner sitter imidlertid cellelegemene til RBC og HCer på vevets overflate, noe som gir sterkt forbedret tilgang til patchpipetter samtidig som OPLs laterale kretser opprettholdes.
Figur 6 viser kjemisk simulerte lysresponser registrert fra BC i en delt netthinne. Perfusert Ames-medium ble supplert med L-AP4 (4 μM), en gruppe III mGluR-agonist, for å simulere glutamatfrigjøring fra fotoreseptorer i mørke. mGluR6-antagonisten, CPPG (600 μM, i Ames), ble pustet på dendrittene i den lappede cellen (holdt ved -60 mV) for å simulere et lysglimt via hemming av mGluR6. Celler reagerte på CPPG-puffer med to typer innadgående strømmer. En type viser en forbigående strøm etterfulgt av et platå (figur 6A), lik de kanoniske lysfremkalte strømmene registrert fra RBC i netthinneskiver19. Den andre typen forblir opprettholdt gjennom hele puffvarigheten (figur 6B), som ligner strømmer registrert fra ON-kjegle bipolare celler (ON-CBC)19.
Et eget eksperiment ble utført for å målrette HC, en celletype med et bredt dendrittisk felt som ofte er vanskelig å bevare i skivepreparater. En muselinje som uttrykker kanalrhodopsin (ChR2) og GFP i HCs ble brukt for å lette enkel identifisering under et fluorescensmikroskop. Først ble strømmer fra HCer registrert som respons på en rekke depolariseringstrinn (-100 mV til 50 mV, trinnstørrelse = 15 mV) som de reagerte på med innadgående strømmer etterfulgt av utadgående strømmer (figur 6C). Disse cellene ble deretter stimulert med en kort blålyspuls (200 ms, 470 nm) som produserte store, ChR2-drevne innadgående strømmer i to celler (figur 6D).
Figur 6: Patch clamp recordings fra INL-nevroner i delte netthinner. (A) En antatt RBC og (B) CBC ble spenningsklemmet ved -60 mV i perfuserte Ames-medier inneholdende L-AP4 (4 μM). Puffing CPPG (600 μM) på dendrittene i de klemte cellene påkalte en innadgående strøm som var forbigående i RBC, men opprettholdt i CBC. RBC-opptaket i (A) er et enkelt spor, mens CBC-opptaket i (B) representerer gjennomsnittet av 3 spor. (C) Et patchklemmeopptak fra en HC i en vGATFLPo; vGlut2Cre; Ai80d mus. Den røde linjen viser varigheten av en 200 ms, 470 nm lyspuls som brukes til å påkalle den store, innadgående strømmen gjennom ChR2. (D) Injiserte strømresponser fra en HC som var spenningsklemt ved -60 mV, deretter gikk mellom -70 mV og +35 mV i 15 mV-intervaller og returnerte til -60 mV. Innfellingen viser de samme sporene i et 6 ms vindu rundt starten av spenningstrinnet. (E) Immunfluorescerende mikrografi av en flatmount split retina som viser horisontale celler som uttrykker GFP i en vGATFLPo; vGlut2Cre; Ai80d mus. Skala bar = 20 μm. Elektrofysiologiske data ble samlet inn med 20 kHz samplingsfrekvens og filtrert med et lavpassfilter fra Bessel ved 5 kHz. Data ble deretter eksportert, og offline visualisering og analyse ble utført ved hjelp av Python 3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Retina splitting muliggjør rask undersøkelse av INL og OPL anatomi
Netthinnens ytre begrensende membran (ELM) og ONL utgjør en ~90 μm tykk barriere, noe som hindrer diffusjon av antistoffer i den indre netthinnen og skaper suboptimale immunfargingsforhold20,21,22. Derfor krever immunmerkingsmål i OPL eller INL ved bruk av en konvensjonell flatmount retina tidkrevende fargeprotokoller som ofte nødvendiggjør 48-96 h antistoffinkubasjoner 5,6,7,8,20,22.
Fjerning av fotoreceptorene muliggjør rask antistoffpenetrasjon av indre retinale nevroner. Som et resultat kan merking av indre retinaproteinmål oppnås på så lite som 1 time ved bruk av fargekonjugerte primære antistoffer. Antistoffer mot PKCα og Calbindin-D ble brukt til å merke henholdsvis RBC og HC av INL (figur 7). I motsetning til tradisjonelle vertikale retinaseksjoner som avkorter de laterale prosessene til bredfeltneuroner, muliggjør det delte retinapreparatet visualisering av hele dendritisk arbor av bredfeltceller som HCer (figur 6E, figur 7).
Figur 7: Rask immunmerking av indre retinaproteiner i en delt netthinne. Konfokale immunfluorescensbilder av en delt retina fra et flatmontert perspektiv. Den delte netthinnen ble inkubert med antistoffer mot PKCα (gul) og Calbindin-D (grønn) i 1 time ved romtemperatur for å merke henholdsvis ON-BCs og HCs. (A) Hvert enkeltkanalbilde er en gjennomsnittlig Z-projeksjon sammensatt av fire optiske seksjoner: DAPI, Gjennomsnittlig z10-13; Calbindin-D, gjennomsnittlig z11-14; PKCα, Gjennomsnitt z11-14. (B) I det sammenslåtte bildet legges de samme projeksjonene oppå. Skala barer = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 1: Nøkkelstadier i netthinnedisseksjonen. Alle bildene ble tatt med et smarttelefonkamera montert på de okulære linsene til et disseksjonsmikroskop. (A) Et ovenfra-og-ned-bilde av et museøye etter fjerning av hornhinnen. (B) Et ovenfra-og-ned-bilde av musens øyekopp etter at linsen er fjernet. (C) Et lite snitt er laget i sclera på musens øyemus. Piler indikerer de to klaffene på scleraen som trekkes i motsatt retning av tang for å begynne å skille netthinnen fra scleraen. (D) Etter at sclera har blitt delvis trukket bort fra netthinnen, settes Vannas saks inn mellom sclera og netthinnen, og optisk nerve er kuttet, frigjør netthinnen. Den røde stiplede sirkelen viser synsnervehodet, og saksen viser riktig skjærebane (sett saks mellom sclera og netthinnen). Den isolerte netthinnen etter sclera er pried bort. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 2: Karakterisering av pre- og postsynaptiske komponenter i OPL i delt netthinne. Konfokale immunfluorescensbilder fra OPL i en delt netthinne. Den delte netthinnen ble inkubert med antistoffer mot GPR179 og PSD95 i 1 time ved romtemperatur for å merke til henholdsvis dendritiske spisser av ON-BC og terminalene til stavfotoreceptorer. De venstre og midterste bildene er maksimale projeksjoner av flere optiske seksjoner; De samme projeksjonene legges over i bildet lengst til høyre. GPR179 puncta i ON-BC dendritiske spisser er sett å assosiere tett med stavfotoreceptorterminalene, og demonstrerer intakte synaptiske kontakter i OPL. Skala barer = 10 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 3: Feilsøking: vurdering av kvaliteten på en delt netthinne. Fluorescerende mikrografer av en delt retina farget med DAPI for å visualisere cellekjerner. Celler kan identifiseres basert på diameteren og vevsdybden til kjernen. (A) Fotoreseptorkjerner er mindre, lysere og mer overfladiske, mens (B) BC-kjerner er større, dimmere og dypere. (C) Et bilde med lav forstørrelse av et område der fotoreseptorer ble fjernet ufullstendig. Kjernene som vises i fokus er fra BC, som er dypere enn fotoreseptorkjernene på kantene av bildet som virker ute av fokus. Skalastenger for (A) og (B) = 20 μm. Skalastang for (C) = 50 μm. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Etter at fotoreceptorer transducerer fotonabsorpsjon i nevrotransmitterfrigivelse, er BC og HCs de første retinale nevronene som behandler det visuelle signalet23. Mens betydningen av disse nevronene er godt verdsatt, er mange av deres funksjoner ufullstendig forstått eller uutforsket helt. Mange BC- og HC-fysiologistudier vil sannsynligvis ha nytte av et flatmontert retinapreparat som forbedrer tilgangen til INL-nevroner samtidig som lateral tilkobling opprettholdes. Utviklingen av split retina-metoden representerer et forsøk på å gi en enkel protokoll for å anskaffe elektrofysiologiske opptak av høy kvalitet og mikroskopidata fra BC og HC i en flatmontert retning. Det delte netthinnepreparatet beskrevet her kan utføres på ca. 20 minutter per mus (10 minutter per netthinne) etter netthinneisolasjon, uten bruk av spesialutstyr. Metoden henter inspirasjon fra eksisterende prosedyrer for fjerning av fotoreseptorer, men gir betydelige forbedringer i enkelhet, hastighet og allsidighet 4,10,11,12,13. I motsetning til tidligere metoder for å separere retinale lag, krever retina splitting ikke frysing, lyofilisering eller gjentatt påføring av lim på netthinnen. Med praksis kan nesten alle fotoreceptorer fjernes i en enkelt tåre med nitrocellulosemembranen. Hastigheten og enkelheten i denne tilnærmingen gjør at man kan minimere tiden netthinnen bruker ut av karbogenerte Ames, noe som muliggjør høy celle levedyktighet i lange perioder; delte netthinner kan opprettholdes i karbogenerte Ames-medier i flere timer etter splittelse. Som et bevis på helsen til INL-nevroner i dette preparatet, bekrefter en levende / død celleflekk (figur 4) og patch-klemme elektrofysiologi (figur 6) levedyktigheten til RBC og HC etter en splittelse.
Fjernelsen av fotoreseptorlaget i delte netthinner gir en betydelig fordel under immunmerking ved dramatisk å redusere diffusjonstiden for antistoffer i INL. Primær og sekundær antistoffmerking kan fullføres innen 2 timer, en betydelig forbedring av konvensjonell flatmount farging som kan ta 72 timer eller lenger, avhengig av målet 5,6,7,8,20,22. Som et resultat kan mikroskopidata oppnås samme dag som vevpreparasjon, noe som drastisk akselererer tempoet i immunfluorescenseksperimenter. For å lette glødning av mRNA-sonder, anbefaler FISH-eksperimenter vanligvis mye lengre fikseringstider (~24 timer) enn immunmerking18. Forsøkene som presenteres her viser imidlertid at en 2 timers fiksering fortsatt gir eksepsjonell FISH-merking (figur 5). Til tross for at fiksasjonstiden ble forlenget fra 30 min til 2 timer, var det ikke nødvendig å utføre antigenuthentingstrinn for å oppnå utmerket immunmerking, men dette kan variere med antistoffet eller antigenet. Proteasebehandlingen i FISH-protokollen kan forstyrre antistoffmerkingen, sannsynligvis på grunn av destruksjon av målepitoper. Dette problemet ble omgått ved å bruke polyklonale antistoffer som retter seg mot flere epitoper, noe som reduserer sannsynligheten for at epitopdestruksjon vil hindre immunmerking. I tillegg ble en moderat proteasebehandling (ACD protease III) brukt for å forhindre overdreven epitopforandring samtidig som det ga tilstrekkelig vevspenetrasjon.
Av og til vil netthinnen i stedet splittes gjennom det ytre kjernefysiske laget (ONL), og etterlate lag av fotoreceptor somas uten INL-celler synlige. For å unngå dette bør man sørge for at netthinnen ligger helt flatt på glasset, og at eventuell restvæske fra rundt netthinnen er fjernet. Å trykke fastere på nitrocellulosen med penselen kan også bidra til å forhindre splitting gjennom ONL. Hvis membranen blir for våt eller netthinnen brettes over seg selv, vil sjansene for en vellykket splittelse bli sterkt redusert. Bruk av DAPI for å farge cellekjerner er nyttig for å vurdere kvaliteten på splittelsen og for å bestemme dekningen av gjenværende fotoreceptorer. Fotoreseptorkjerner er mindre, lysere og mer overfladiske (tilleggsfigur 3A), mens BC-kjerner er større, dimmere og dypere (tilleggsfigur 3B). I noen tilfeller vil riftens plan variere litt over netthinnen, noe som resulterer i flekker der fotoreseptorens cellelegemer ikke er helt fjernet (tilleggsfigur 3C). For applikasjoner innen mikroskopi og elektrofysiologi hindrer dette ikke muligheten til å samle kvalitetsdata fra regioner der fotoreceptorer er fjernet på riktig måte; Store felt av eksponert indre netthinne kan lett bli funnet ved avbildning eller opptak med en patchpipette. Hvis mer fullstendig fotoreceptorfjerning er ønsket, kan en ny rift utføres med et ekstra stykke nitrocellulosemembran, selv om 100% fjerning av fotoreceptor ikke er garantert. Forsiktighet anbefales derfor ved bruk av delte netthinner i genuttrykks- eller proteomikkstudier der gjenværende fotoreseptormateriale kan påvirke resultatene. For enkeltcelleapplikasjoner er denne bekymringen uberettiget, da data fra fotoreceptorer kan utelukkes fra analyse.
Fordelene ved det delte netthinnepreparatet er kanskje mest fremtredende i elektrofysiologiske registreringer av bredfeltinternevroner. Mens tradisjonelle vertikale skiver kutter de omfattende prosessene med bredfeltceller, forlater det delte retinapreparatet OPL og IPL intakt, slik at man kan fange inngang fra bredfeltceller som HCs 24, A17s25, TH ACs 26 og NOS-1 ACs27 som ellers ville bli oversett i vertikale skiver. Derfor krever tolkning av resultater og sammenligning med tidligere data samlet inn fra retinale skiver nøye gjennomtenkt. Likevel, i eksperimenter med farmakologiske etterligninger av lysstimulering, ligner disse resultatene data registrert fra retinalskiver19. Ved å uttrykke ChR2 under cellespesifikke promotorer, kan man stimulere en ønsket cellepopulasjon mens man registrerer fra BCs i INL for å undersøke ønsket celles innvirkning på den vertikale informasjonsveien. Opptak direkte fra dypere INL-nevroner, som amakrine celler, er også mulig i den delte netthinnen. Mens patchelektroden i dette tilfellet først må bevege seg gjennom de mer overfladiske INL-nevronene, er det betydelig mindre vev som hindrer banen sammenlignet med et tradisjonelt helmonteringspreparat.
I tillegg til å måle påvirkning av bredfeltceller på andre nevroner, muliggjør denne metoden direkte enkeltcellepatchklemming fra HC, hvis dendritter danner et omfattende gap-junction-koblet nettverk i OPL28. Horisontale celler sender kritisk tilbakemelding til fotoreceptorer som former overføringen av vertikal informasjon gjennom netthinnen. Men siden de dendritiske feltene til HCer er avkortet i vertikale skiver, mangler enkeltcelleopptaksdata. Dette arbeidet presenterer anatomisk og fysiologisk intakte HCer hvorfra ChR2-fremkalte strømmer registreres i en trippel transgen muselinje (figur 6 C-E). Utenfor ChR2-stimulering kan den delte netthinnen brukes til å studere endogene HC-strømmer og gapkrysskobling28. Mens den delte netthinnen gir en praktisk modell for å studere synaptisk tilkobling og nevronaktivitet indusert ved kjemisk applikasjon eller ChR2-stimulering, utelukker mangelen på fotoreceptorer direkte utforskning av naturlige lysresponser eller lystilpasningsmekanismer.
In situ avbildning i netthinnen har gjort beundringsverdig fremgang de siste årene. Imidlertid er flertallet av bildebehandlingsstudier begrenset til ganglioncellelaget i hele mount retina-preparater29. Forfatterne ser for seg at fraværet av fotoreceptorer i delt retina vil gjøre det til en ideell modell for levende kalsiumavbildning i OPL og INL. Utover kalsiumavbildning har denne modellen stort potensial for bruk med genetisk kodede biosensorer som iGluSnFR 30,31, iGABASnFR32 og pHluorin33. Kombinert med det delte retinapreparatet, kan disse kraftige verktøyene tilby en effektiv tilnærming til å utforske synaptiske interaksjoner og biofysiske egenskaper av BC og HCer som bidrar til lysbehandling i netthinnen.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av følgende NIH-stipender: NIH-stipend R01EY031596 (til C.M.); NIH-stipend R01EY029985 (til C.M.); NIH-stipend P30EY010572 (til C.M.); NIH stipend R01EY032564 (til BS). Vi takker Tammie Haley for hennes tekniske støtte i forberedelsen av netthinneseksjoner, og Dr. Charles Allen for sjenerøst å bidra med mRNA FISH-sondene som brukes i dette arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1.5 glass coverslips | Fisherbrand | 12544E | |
| 2 pairs of Dumont #5 forceps | Ted Pella | 38125 | |
| 25 gauge needle | Becton Dickenson | 305122 | |
| 470 nm LED | THORLABS | M470L2 | |
| 5-306 curved scissors | Miltex | 5-306 | |
| 9" disposable pasteur pipetes | Fisherbrand | 13-678-20D | for constructing custom transfer pipette |
| Ai80d mouse | Jackson Laboratories | 25109 | RRID: IMSR_JAX:025109 |
| Ames Medium w/L-Glutamate | US Biological | A1372-25 | |
| amplifier control software | Molecular Devices | Clampex 10.3 software | |
| anti-calbindin D28K antibody | Invitrogen | PA-5 85669 | RRID: AB_2792808, host species = rabbit; 1:100 dilution |
| anti-CtBP2 antibody | BD Biosciences | 612044 | RRID: AB_399431, host species = mouse; 1:5000 dilution |
| anti-GPR179 antibody | NA | NA | gift from Kirill Martemyanov; Scripps Research Institute, Jupiter, FL; host species = sheep; 1:1000 dilution |
| anti-PKC alpha antibody | Sigma-Aldrich | P4334 | RRID: AB_477345, host species = rabbit; 1:5000 dilution |
| anti-PKC alpha antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc8393 AF594 | RRID: AB_628142, host species = mouse; 1:1000 dilution |
| anti-PSD95 antibody | BD Transduction Laboratories | 610495 | RRID: AB_397862, host species = mouse; 1:1000 dilution |
| anti-RGS11 antibody | NA | NA | gift from Ted Wensel; Baylor College of Medicine, Houston, TX; host species = rabbit; between 1:1000 and 1:5000 dilution |
| anti-Synaptophysin P38 antibody | Sigma | S-S5768 | RRID: AB_477523, host species = mouse; 1:1000 dilution |
| Aquamount mounting media | Epredia | 13800 | slide mounting media |
| C57BL/6J mouse | Jackson Laboratories | 000664 | RRID: IMSR_JAX:000664 |
| carbogen tank | Matheson | NA | 95% O2 and 5% CO2 |
| custom transfer pipette | custom build | NA | Instructions: use scissors to cut off the tip of a plasitc transfer pipette at the point it begins to taper. Use pliers to safely break off the last 2-3 inches of a glass pasteur pipette. Fit the narrow end of the glass pasteur pipette into the wide tip of the plastic transfer pipete. Wrap parafilm around the joint of the two pieces to enhance the seal. |
| Digitical optical power meter | THORLABS | PM100D | |
| dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| electrophysiology amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
| electrophysiology microscope | Olympus | OLYMPUS, BX50WI | Dodt gradient contrast microscopy |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| HC PL APO CS2 40x/1.3 | Leica | 506358 | |
| HC PL APO CS2 63x/1.40 | Leica | 15506350 | |
| Hybridization oven | Robbins Scientific | Model 1000 | for RNAscope protocol only |
| Immedge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| isoflurane | Piramal Critical Care | 66794-017-25 | |
| Kimwipe (delicate task wipe) | Kimtech Science | 34155 | |
| Leica HC PL APO CS2 40x/1.3 oil immersion objective | Leica | 506358 | |
| Leica HC PL APO CS2 63x/1.40 oil immersion objective | Leica | 15506350 | |
| Leica TCS SP8 X confocal microscope | Leica | discontinued | |
| medium 15 mm petri dish | Corning | 25060-60 | eyes are kept here during retina dissection |
| Merit 97-275 steel scissors | Merit | 97-275 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | p-97 | |
| Mm-Gabrd-C2 mRNA probe | ACD | 459481-C2 | |
| mouse euthanasia chamber | NA | NA | custom build; glass petri dish covering a small glass jar. |
| nitrocellulose membrane filters | GE Healthcare Life Sciences; Whatman | 7184-005 | 0.45 µm pore size |
| Picospritzer | General Valve Corporation | Picospritzer II | referred to in the text as microcellular injection unit |
| plastic transfer pipets | Fisherbrand | 13-711-7M | for constructing custom transfer pipette |
| Plastic tubing | Tygon | R-603 | for connection to carbogen tank |
| platinum harp | custom build | NA | for anchoring split retinas within the electrophysiology recording chamber. |
| size 0 paint brush | generic | NA | for flattening retina during splitting. |
| SlowFade Gold antifade reagent | Molecular Probes | S36937 | referred to in the text as anti-fade mounting media |
| small 10 mm petri dish | Falcon | 353001 | eyes are placed here following enucleation |
| small glass pane (7.5 cm x 5 cm) | generic | NA | isolatd retina pieces are placed onto this for the splitting procedure |
| Superfrost plus microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | electrostatically-charged glass microscope slides |
| Thick-walled borosilicate glass pipettes with filament | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | |
| Vannas Scissors; straight | Titan Medical | TMS121 | not brand specific; any comparable scissors will work |
| vGATFLPo mouse | Jackson Laboratories | 29591 | RRID: IMSR_JAX:029591 |
| vGlut2Cre mouse | Jackson Laboratories | 28863, 016963 | RRID: IMSR_JAX:028863, RRID: IMSR_JAX:016963 |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | BioLegend | 423105 | referred to in the text as MI-NIR |
References
- Morgans, C. W. Neurotransmitter release at ribbon synapses in the retina. Immunology & Cell Biology. 78 (4), 442-446 (2000).
- Euler, T., Haverkamp, S., Schubert, T., Baden, T. Retinal bipolar cells: elementary building blocks of vision. Nature Reviews Neuroscience. 15 (8), 507-519 (2014).
- Barnes, S., Grove, J. C. R., McHugh, C. F., Hirano, A. A., Brecha, N. C. Horizontal Cell Feedback to Cone Photoreceptors in Mammalian Retina: Novel Insights From the GABA-pH Hybrid Model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, (2020).
- Walston, S. T., Chang, Y. C., Weiland, J. D., Chow, R. H. Method to remove photoreceptors from whole mount retina in vitro. Journal of Neurophysiology. 118 (5), 2763-2769 (2017).
- Stefanov, A., Novelli, E., Strettoi, E. Inner retinal preservation in the photoinducible I307N rhodopsin mutant mouse, a model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. Journal of Comparative Neurology. 528 (9), 1502-1522 (2020).
- Matsuoka, R. L., Nguyen-Ba-Charvet, K. T., Parray, A., Badea, T. C., Chédotal, A., Kolodkin, A. L. Transmembrane semaphorin signaling controls laminar stratification in the mammalian retina. Nature. 470 (7333), 259-263 (2011).
- Matsuoka, R. L., et al. Guidance-Cue Control of Horizontal Cell Morphology, Lamination, and Synapse Formation in the Mammalian Outer Retina. Journal of Neuroscience. 32 (20), 6859-6868 (2012).
- Wässle, H., Puller, C., Müller, F., Haverkamp, S. Cone Contacts, Mosaics, and Territories of Bipolar Cells in the Mouse Retina. Journal of Neuroscience. 29 (1), 106-117 (2009).
- Thoreson, W. B., Dacey, D. M. Diverse Cell Types, Circuits, and Mechanisms for Color Vision in the Vertebrate Retina. Physiological Reviews. 99 (3), 1527-1573 (2019).
- Guido, M. E., et al. A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).
- Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis. Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28 (2017).
- Todorova, V., et al. Retinal Layer Separation (ReLayS) method enables the molecular analysis of photoreceptor segments and cell bodies, as well as the inner retina. Scientific Reports. 12 (1), 20195 (2022).
- Shiosaka, S., Kiyama, H., Tohyama, M. A simple method for the separation of retinal sublayers from the entire retina with special reference to application for cell culture. Journal of Neuroscience Methods. 10 (3), 229-235 (1984).
- Ivanova, E., Hwang, G. S., Pan, Z. H. Characterization of transgenic mouse lines expressing Cre-recombinase in the retina. Neuroscience. 165 (1), 233-243 (2010).
- Sarria, I., Orlandi, C., McCall, M. A., Gregg, R. G., Martemyanov, K. A. Intermolecular Interaction between Anchoring Subunits Specify Subcellular Targeting and Function of RGS Proteins in Retina ON-Bipolar Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (10), 2915-2925 (2016).
- Orlandi, C., Cao, Y., Martemyanov, K. A. Orphan Receptor GPR179 Forms Macromolecular Complexes With Components of Metabotropic Signaling Cascade in Retina ON-Bipolar Neurons. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 7153-7161 (2013).
- Dikshit, A., Zong, H., Anderson, C., Zhang, B., Ma, X. -J. Simultaneous Visualization of RNA and Protein Expression in Tissue Using a Combined RNAscopeTM In Situ Hybridization and Immunofluorescence Protocol. Methods in Molecular Biology. 2148, Clifton, N.J. 301-312 (2020).
- Wang, F., et al.
- Morgans, C. W., et al. TRPM1 is required for the depolarizing light response in retinal ON-bipolar cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19174-19178 (2009).
- Alessio, E., Zhang, D. Q. Immunostaining of whole-mount retinas with the CLARITY tissue clearing method. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (7), 5054 (2020).
- Ferguson, L. R., Dominguez, J. M., Balaiya, S., Grover, S., Chalam, K. V. Retinal Thickness Normative Data in Wild-Type Mice Using Customized Miniature SD-OCT. PLoS ONE. 8 (6), e67265 (2013).
- Ivanova, E., Toychiev, A. H., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments JoVE. (82), e51018 (2013).
- Kolb, H.
- Chaya, T., et al. Versatile functional roles of horizontal cells in the retinal circuit. Scientific Reports. 7 (1), 5540 (2017).
- Egger, V., Diamond, J. S. A17 Amacrine Cells and Olfactory Granule Cells: Parallel Processors of Early Sensory Information. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 600537 (2020).
- Dacey, D. M.
- Park, S. J., et al. Connectomic analysis reveals an interneuron with an integral role in the retinal circuit for night vision. eLife. 9, 56077 (2020).
- Janssen-Bienhold, U., et al. Connexin57 is expressed in dendro-dendritic and axo-axonal gap junctions of mouse horizontal cells and its distribution is modulated by light. The Journal of Comparative Neurology. 513 (4), 363-374 (2009).
- Jain, V., et al. The functional organization of excitation and inhibition in the dendrites of mouse direction-selective ganglion cells. eLife. 9, 52949 (2020).
- Marvin, J. S., et al. Stability, affinity, and chromatic variants of the glutamate sensor iGluSnFR. Nature Methods. 15 (11), 936-939 (2018).
- Strauss, S., et al. Center-surround interactions underlie bipolar cell motion sensitivity in the mouse retina. Nature Communications. 13 (1), 5574 (2022).
- Marvin, J. S., et al. A genetically encoded fluorescent sensor for in vivo imaging of GABA. Nature Methods. 16 (8), 763-770 (2019).
- Beckwith-Cohen, B., Holzhausen, L. C., Wang, T. M., Rajappa, R., Kramer, R. H. Localizing Proton-Mediated Inhibitory Feedback at the Retinal Horizontal Cell-Cone Synapse with Genetically-Encoded pH Probes. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 39 (4), 651-662 (2019).
