Summary
Detta arbete presenterar en alternativ flatmount näthinneförberedelse där avlägsnandet av fotoreceptorcellkroppar möjliggör snabbare antikroppsdiffusion och förbättrad tillgång till plåsterpipetter till inre retinala neuroner för immunhistokemi, in situ-hybridisering och elektrofysiologiska experiment.
Abstract
Bipolära celler och horisontella celler i ryggradsdjurens näthinna är de första nervcellerna som bearbetar visuell information efter att fotoner detekterats av fotoreceptorer. De utför grundläggande operationer som ljusanpassning, kontrastkänslighet och rumslig och färgmässig motsättning. En fullständig förståelse för de exakta kretsarna och de biokemiska mekanismerna som styr deras beteende kommer att främja visuell neurovetenskaplig forskning och oftalmologisk medicin. De nuvarande förberedelserna för att undersöka bipolära och horisontella celler (näthinnens hela fästen och vertikala skivor) är dock begränsade i sin förmåga att fånga dessa cellers anatomi och fysiologi. I detta arbete presenterar vi en metod för att avlägsna fotoreceptorcellkroppar från levande, flatmount musnäthinnor, vilket ger förbättrad tillgång till bipolära och horisontella celler för effektiv patch clamping och snabb immunmärkning. Delade näthinnor framställs genom att en isolerad musnäthinna kläms in mellan två bitar nitrocellulosa och sedan försiktigt skalas isär. Separationen delar näthinnan strax ovanför det yttre plexiforma skiktet för att ge två bitar nitrocellulosa, en som innehåller fotoreceptorcellkropparna och en annan som innehåller den återstående inre näthinnan. Till skillnad från vertikala näthinneskivor skär inte den delade näthinneförberedelsen av de dendritiska processerna i inre näthinneneuroner, vilket möjliggör inspelningar från bipolära och horisontella celler som integrerar bidragen från gap junction-kopplade nätverk och bredfältsamakrina celler. Detta arbete visar mångsidigheten hos denna förberedelse för studier av horisontella och bipolära celler i elektrofysiologi, immunhistokemi och in situ hybridiseringsexperiment.
Introduction
Näthinnan är en tunn nervvävnad som ligger i det bakre ögat där ljus fångas upp och bearbetas till en elektrokemisk signal som kan tolkas av hjärnan. På baksidan av näthinnan stimuleras fotoreceptorer av ljus och koner, vilket minskar frisättningen av neurotransmittornglutamat 1. De första neuronerna som upplever och reagerar på denna ljusinducerade förändring i glutamatkoncentrationen är de bipolära cellerna (BC) och horisontella cellerna (HC), vars soma ligger i den yttersta regionen av det inre kärnskiktet (INL). Dessa andra ordningens neuroner utför det första steget av signalbehandling i näthinnan och formar kritiska funktioner i synen såsom ljusanpassning, kontrastkänslighet och rumslig/färgopposition2. Även om dessa funktioner har tillskrivits BC och HC, är de kretsar och biokemiska mekanismer som ligger till grund för dessa processer intehelt förstådda. Därför är utvecklingen av verktyg och metoder för att utforska BC- och HC-fysiologi av största vikt.
Vertikala (tvärgående) näthinnesnitt har länge visat sig vara den mest praktiska modellen för att studera BC och HC; Vissa aspekter av BC- och HC-fysiologin är dock otillgängliga för experimentatorn under denna modell. Direkta registreringar från HC eller indirekta mätningar av deras effekter på BC återspeglar inte näthinnans endogena konnektivitet eftersom de laterala processerna i dessa celler skärs av under skivning. Preparat för hela näthinnan kringgår detta problem genom att bevara dessa laterala utskott, men de omgivande näthinnelagren utgör en utmaning för att komma åtdessa celler. Även om det finns rikligt med exempel på immunfärgning 5,6,7,8 och patch clamp-inspelningar9 från INL-neuroner i hela näthinnor, finns det en möjlighet att påskynda och förenkla insamlingen av dessa data. De inneboende begränsningarna hos tvärsnitt och utmaningarna med hela monteringsmodellen inspirerade därför utvecklingen av denna alternativa flatmount näthinneförberedelse.
Följande arbete beskriver ett protokoll för att enkelt ta bort fotoreceptorskiktet från levande, flatmount näthinnor för att förbättra tillgången till BC och HC för förenklad patch clamping och snabbare, effektivare immunmärkning. Att dra isär två bitar av nitrocellulosamembran fästa på vardera sidan av en isolerad näthinna sliter vävnaden genom fotoreceptoraxonerna och lämnar en delad näthinna som behåller det yttre plexiforma skiktet (OPL) och alla inre näthinnelager. Medan andra har beskrivit protokoll för att mekaniskt separera lager av näthinnan, är dessa metoder antingen dåligt lämpade för patch-clamping och mikroskopiapplikationer eller kräver omständlig manipulation av vävnaden. Flera av dessa metoder kräver fryst eller frystorkad vävnad för skiktseparation, vilket gör dem oförenliga med elektrofysiologiska experiment10,11,12. Andra är utformade för levande vävnad, men kräver 5-15 sekventiella peelingar med filterpapper 4,11 eller behandling med trypsin 13 för att ta bort fotoreceptorerna. Tekniken som beskrivs här förbättrar sina föregångare genom att förenkla proceduren för borttagning av fotoreceptorer och utöka repertoaren för nedströmsapplikationer.
Protocol
Mössen försågs med vatten och mat ad libitum och hölls på en 12 timmars ljus/mörker-cykel. Möss avlivades genom exponering för isofluran följt av cervikal luxation. Alla djurförsök var i enlighet med National Institutes of Healths riktlinjer och godkända av Oregon Health and Science University Institutional Animal Care and Use Committee.
OBS: Ögonenukleation, näthinnedissektion och näthinnedelning bör utföras så snabbt som möjligt för att bevara den levande vävnadens hälsa. Sikta på att slutföra dissektionen på < 4 minuter per öga. Dessa tre steg ska utföras sekventiellt. Vildtypsmöss: Vuxna (>3 månader) han- och honmöss av typen C57BL/6J användes för experiment. För synapsmorfologi användes möss som uttryckte grönt fluorescerande protein (GFP) under Pcp2-promotorn (Pcp2-cre/GFP)14 . Transgena möss: För horisontell cellvisualisering med GFP under immunhistokemiska eller elektrofysiologiska experiment användes en trippeltransgen mus: vGATFLPo; vGlut2Cre; Ai80d. Stammarna vGATFlpo och vGluT2Cre är knock-in-möss som uttrycker Flpo eller Cre-rekombinas nedströms sina respektive promotorer. Ai80d-musen är en intersektionell reportermus (CatCh/EYFP) och kommer endast att uttrycka Ca2+ permeabla kanalrodopsin (ChR2) i celler som uttrycker Cre- och Flpo-rekombinaser. Således uttrycker den trippeltransgena musen endast ChR2 i celler med en historia av både VGAT- och vGluT2-uttryck.
1. Materialförberedelse för näthinnedissektion och näthinnedelning
- Förbered bitar av nitrocellulosamembran
OBS: Att lossa den delade näthinnan från nitrocellulosamembranet minskar bakgrundsfluorescensen i mikroskopi och förenklar inspelningen av patch clamp. Membranborttagning kan utföras före eller efter vävnadsfixering. För fasta kluvna näthinnor är det inte nödvändigt att behandla bitarna av nitrocellulosamembran. För levande spjälkade näthinnor, behandla membranet enligt steg 1.1.3 - 1.1.5 för att underlätta skonsam lossning från vävnaden.- Skär 16 bitar (eller mer) nitrocellulosamembran i rutor på 5 mm x 5 mm. Extra kan beredas i bulk och lagras för framtida bruk.
- Lägg undan hälften av membranbitarna för senare användning. Dessa bitar kommer inte att behandlas med en blockerande lösning.
- Inkubera de återstående bitarna i en tvättmedelsfri IHC-blockerande lösning (t.ex. 3 % hästserum + 0,025 %NaN3 utspätt i PBS) i 10 minuter vid rumstemperatur, skaka försiktigt.
VARNING: Använd lämplig personlig skyddsutrustning vid hantering av NaN3, eftersom det är ett potent toxin. - Tvätta membranbitarna noggrant genom inkubation i bikarbonatbuffrat Ames-medium i 10 minuter i rumstemperatur, skaka försiktigt.
- Lufttorka de blockerade membranbitarna helt (~20 min). Märk och förvara membranbitarna i rumstemperatur, håll dem åtskilda från de obehandlade membranbitarna.
- Förbereda Ames-media
- Bered bikarbonatbuffrat Ames-medium och behåll lösningen vid rumstemperatur under konstant karbogenation (95 % O 2 och 5 % CO2 ).
2. Eye enukleation hos mus
- Avliva musen med alla tillgängliga metoder enligt institutionella IACUC-riktlinjer.
- Vänd musen åt sidan och använd två fingrar för att försiktigt trycka ner runt ögonhålan. Detta kommer att få ögat att bukta ut från skallen.
- Använd en böjd dissektionssax och klipp under det utbuktande ögat för att skära av synnerven och separera ögat från skallen.
- Skopa ögat med en sax och lägg det i en petriskål fylld med iskall Ames media.
OBS: För nedströmsapplikationer där vävnaden kommer att fixeras efter klyvning kan iskall PBS användas istället för Ames media. - Upprepa steg 2.1 - 2.4 för det återstående ögat.
3. Dissektion av näthinnan
- Använd den specialanpassade glasöverföringspipetten för att överföra ena ögat till en ny petriskål som innehåller färskt, iskallt Ames-media.
OBS: Den breda öppningen på den anpassade överföringspipetten förhindrar oavsiktlig klämning av vävnaden, och användning av glas minimerar vidhäftning av vävnaden till pipettens väggar. En plastöverföringspipett med bred mun är dock också acceptabel om experimentatorn redan är skicklig på att använda detta verktyg. - Använd en pincett för att stabilisera ögat genom att fästa dess extra bindväv i botten av petriskålen. Punktera sedan ögat längs ora serrata-linjen med en 25G-nål för att skapa en ingångspunkt för Vannas-saxen.
- Använd en Vannas-sax för att klippa längs ora serrata-linjen tills hornhinnan lossnar från resten av ögat (tilläggsfigur 1A). Ta bort linsen från ögonmusslan med en pincett (tilläggsfigur 1B).
- Använd den anpassade glaspipetten för att överföra ögonmusslan till en stor volym (≥100 ml) karbogenerad Ames och upprepa steg 3.1 - 3.3 med det återstående ögat.
OBS: Ögonmusslor placeras i karbogenerade Ames för att bibehålla vävnadshälsan medan dissektionen utförs på det andra ögat. - Överför en ögonmussla till en petriskål fylld med nykarbogenerad Ames.
- Använd en Vannas-sax och gör ett litet klipp inåt från kanten av scleran och använd sedan två par pincetter för att dra bort sclera från näthinnan (tilläggsfigur 1C). Undvik att ta tag i näthinnan med pincetten. Dra istället isär flikarna på sclera som skapats av saxsaxen.
- Använd Vannas-saxen för att klippa av synnerven som förbinder sclera och näthinnan (tilläggsfigur 1D), bänd sedan försiktigt näthinnan från sclera med saxen eller pincetten för att isolera näthinnan. (Figur 1A).
OBS: Även om RPE vanligtvis förblir fäst vid ögonmusslan, krävs inga extra steg för att ta bort RPE i händelse av att den är fäst vid näthinnan. Vid denna tidpunkt kan näthinnans kanter eventuellt trimmas med en skalpell för att förhindra krusning under tillplattningssteget (Figur 1B). - Använd en skalpell för att skära näthinnan i halvor eller fjärdedelar (Figur 1C) och använd sedan den anpassade överföringspipetten för att återföra bitarna till en stor volym (≥ 100 ml) kontinuerligt karbogenerat Ames-media.
OBS: Valet av halvor eller fjärdedelar är subjektivt. Välj det bästa alternativet för den önskade applikationen. - Upprepa steg 3.5 - 3.8 för det återstående ögat innan du fortsätter med näthinnedelningen.
4. Näthinnan klyvs
- Släng Ames-mediet från petriskålarna och ersätt det med nykarbonerad Ames.
OBS: För att bibehålla karbogenering under resten av näthinnedelningsproceduren, byt ut mediet i petriskålen mot nykarbogenerad Ames ungefär var 5:e minut. - Använd den anpassade överföringspipetten och placera en bit näthinna på ett glasglas (7.5 cm x 5 cm), gangliecellsidan uppåt, och platta sedan till den genom att ta bort den omgivande vätskan med en känslig arbetsservett (Figur 1D). Om det behövs, dra försiktigt i näthinnans kanter med en pensel med fin spets under ett dissektionsmikroskop.
- Använd en pincett för att sänka ner en torr bit nitrocellulosamembran på näthinnan med en tång, så att den fäster vid gangliecellsidan (Figur 1E).
OBS: Om membranborttagning från levande vävnad krävs (dvs. för elektrofysiologi), använd en torr bit serumbehandlat membran för detta steg (se steg 1.1.3 - 1.1.5 för detaljer). Detta minskar vidhäftningsstyrkan till gangliecelskiktet, vilket gör det lättare att ta bort näthinnan från nitrocellulosan efter delningen. - Vänd på näthinnan så att nitrocellulosan vilar på glasglaset och placera en torr bit av 5 mm x 5 mm membran på fotoreceptorsidan av näthinnan (Figur 1F).
- Rör vid den våta spetsen på penseln mot utrymmet mellan de två membranen och låt kapillärverkan suga in Ames i smörgåsen (Figur 1G). Detta minskar hinnornas vidhäftning till näthinnan och är endast nödvändigt om näthinnan har torkats för mycket med den känsliga torkduken.
OBS: Om näthinnan har tappat sitt glänsande utseende har den torkats för mycket och steg 4.5 är nödvändigt. - För att säkerställa jämn vidhäftning, tryck lätt nedåt på det övre membranet med en våt pensel (Figur 1H).
- Medan du fäster det nedre membranet på glaset med en pincett, använd en långsam, stadig rörelse för att försiktigt dra bort det övre membranet med en andra pincett. Detta kommer att få näthinnan att dela sig precis ovanför OPL (Figur 1I).
- Kassera det övre membranet som innehåller fotoreceptorerna (Figur 1J, vänster). Det nedre membranet innehåller den inre näthinnan, hädanefter kallad en delad näthinna (Figur 1J, höger).
- Sätt omedelbart tillbaka den delade näthinnan till karbogenerad Ames-media.
OBS: För experiment på levande vävnad kan näthinnan dra nytta av en återhämtningsperiod på 15-30 minuter hos karbogenerade Ames efter delning.
Figur 1: Procedur för delad näthinna. A) Efter beredning av enukleation och ögonmussla i kallt PBS- eller Ames-media, isolera musens näthinna från ögonmusslan och ersätt PBS med rumstempererade, karbogenerade Ames-medier. (B) Använd en skalpell och klipp bort näthinnans kanter tills det inte finns några områden med en inåtböjd böj (valfritt). (C) Skär näthinnan i fjärdedelar eller halvor med hjälp av en skalpell. (D) Placera en bit näthinna på ett objektglas (gangliecellsidan uppåt) med hjälp av den anpassade överföringspipetten och ta bort allt överflödigt Ames med en delikat arbetsservett. Se till att den halvtorra näthinnan ligger platt på glaset innan du går vidare till nästa steg. Använd en Ames-fuktad penselspets för att försiktigt veckla ut områden på näthinnan som inte är platta. (E) Använd en pincett och placera en förskuren bit torrt nitrocellulosamembran (5 mm x 5 mm) på den tillplattade näthinnan. (F) Vänd på nitrocellulosabiten så att fotoreceptorsidan av näthinnan nu är vänd uppåt. Placera sedan ytterligare en torr bit membran på näthinnan. (G) Rör vid den våta spetsen på borsten mot utrymmet mellan de två membranen och låt kapillärverkan suga in Ames i smörgåsen. Detta minskar hinnornas vidhäftning till näthinnan och är endast nödvändigt om näthinnan har torkats för mycket med den känsliga arbetsservetten. (H) Använd en våt penselspets för att försiktigt trycka nedåt på mitten av den inklämda näthinnan. (I) Använd en pincett för att fästa den nedre delen av membranet på glasglaset, medan du använder en annan pincett för att försiktigt dra bort den övre delen av membranet från den nedre. (J) Den inre näthinnan (vänster) förblir på det nedre membranet medan fotoreceptorerna (höger) dras bort med det övre membranet. Panelerna (A), (B), (C), (D) och (J) förvärvades med hjälp av ett dissektionsmikroskop; skalstapeln representerar cirka 1 mm; paneler (E-I) förvärvades med en smartphone-kamera utan förstoring. Klicka här för att se en större version av denna figur.
5. Beredning av delade näthinnor för immunofluorescensexperiment
OBS: Den delade näthinnan kommer fortfarande att vara fäst vid nitrocellulosamembranet fram till steg 5.5. Slutför antingen steg 5.1, 5.2, 5.3 eller 5.4, inte alla fyra eftersom dessa är för olika experiment.
VARNING: Använd lämplig personlig skyddsutrustning och var försiktig vid hantering av paraformaldehyd (fixativ).
- Förberedelse för flatmount immunofluorescens
- Inkubera den delade näthinnan i 4 % paraformaldehyd på is i 30 minuter med tillräckligt med lösning för att helt täcka näthinnan.
- Tvätta de delade näthinnorna 3 gånger i 5-10 ml rumstemperatur PBS. Valfri paus: Delade näthinnor kan lämnas i PBS vid 4 °C i upp till 24 timmar.
- Förberedelse för immunofluorescens med vertikala snitt av delad näthinna
- Inkubera den delade näthinnan i 4 % paraformaldehyd på is i 30 minuter med tillräckligt med lösning för att helt täcka näthinnan.
- Tvätta de delade näthinnorna 3 gånger i 5-10 ml rumstemperatur PBS. Valfri paus: Delade näthinnor kan lämnas i PBS vid 4 °C i upp till 24 timmar.
- Med membranet fortfarande fastsatt, sänk sekventiellt ner den delade näthinnan i 10 %, 20 % och 30 % sackaros vid 4 °C i 1 timme vardera för att kryoskydda vävnaden.
- Bädda in de kryoskyddade delade näthinnorna i optimal skärtemperatur (O.C.T.) och förvara dem vid -80 °C (upp till 6 månader) fram till kryosektion.
- Ta bort de inbäddade delade näthinnorna från -80 °C och använd en kryostat för att skära sektioner som är 20 μm tjocka. Montera sektionerna på elektrostatiskt laddade glasobjektglas, låt dem lufttorka och förvara dem sedan vid -20 °C i upp till 6 månader.
- Förberedelse för dubbel fluorescens in situ-hybridisering och immunhistokemi
- Inkubera den delade näthinnan i 4 % paraformaldehyd på is i 2 timmar med tillräckligt med lösning för att helt täcka näthinnan.
- Tvätta de delade näthinnorna 3 gånger i 5-10 ml rumstemperatur PBS. Valfri paus: Delade näthinnor kan lämnas i PBS vid 4 °C i upp till 24 timmar.
- Förberedelse för elektrofysiologi
- Förbered patchpipetter genom att dra i tjockväggiga borosilikatglaspipetter med filament med hjälp av en mikropipettavdragare. Använd endast pipetter med ett uppmätt motstånd mellan 6-10 MΩ.
- Fyll tillbaka de dragna pipetterna med en intern lösning innehållande (i mM): 125 K-glukonat, 8 KCl, 5 HEPES, 1 MgCl 2, 1 CaCl 2,0,2 EGTA, 3 ATP-Mg och 0,5 GTP-Na.
- Avlägsnande av den delade näthinnan från nitrocellulosamembranet
- Använd en hydrofob barriärpenna och förbered cirkulära brunnar på ett objektglas (~1 cm i diameter) och låt dem lufttorka i 5-10 minuter.
- Placera de delade näthinnorna i de förberedda hydrofoba barriärpennbrunnarna och tillsätt tillräckligt med PBS för att helt täcka dem.
- Under ett dissektionsmikroskop, tryck borsten på en fin pensel under kanterna på vävnaden och lyft försiktigt uppåt. På detta sätt arbetar du runt näthinnan i en cirkel för att lyfta bort den från membranet.
- Använd en pincett för att ta bort membranet från undersidan av den flytande näthinnan.
- Aspirera försiktigt bort den återstående PBS:en så att näthinnebiten vilar på objektglaset med gangliecellsidan nedåt.
OBS: Följande steg ska inte utföras sekventiellt. Välj lämpligt protokoll för den önskade applikationen (dvs. immunfärgning eller dubbel fluorescens in situ-hybridisering [FISH] och immunhistokemi [IHC] eller elektrofysiologi).
6. Immunfärgning
- Om den ännu inte är förberedd, använd en hydrofob barriärpenna för att skapa cirkulära brunnar på ett objektglas (~1 cm i diameter) och låt dem lufttorka i 5-10 minuter. Alla inkubationssteg och tvättsteg kommer att utföras i dessa pennbrunnar.
- Inkubera de delade näthinnan eller de vertikala delade näthinnesnitten i antikroppsinkubationslösning (AIS: 3 % hästserum, 0,5 % Triton X-100, 0,025 % NaN3 i PBS) i 30 minuter vid rumstemperatur.
- Inkubera de delade näthinnan eller de vertikala delade näthinnesnitten med primära antikroppar utspädda i AIS i 1 timme vid rumstemperatur.
OBS: Primär antikroppsinkubationstid kommer att kräva optimering för olika proteinmål och antikroppar. - Tvätta servetten 3 gånger i rumstemperatur PBS.
- Inkubera vävnaden med sekundära antikroppar utspädda i AIS i 1 timme vid rumstemperatur. Tvätta servetten 3 gånger i rumstemperatur PBS.
- Om kärnfärgning önskas, inkubera vävnaden med DAPI utspädd i PBS i 30 s vid rumstemperatur. Tvätta servetten 1x i rumstemperatur PBS.
- Applicera en droppe diabildsmonteringsmedia på varje vävnadsbit och montera en glastäckare.
- Applicera nagellack runt kanterna på täckglaset för att försegla provet. Förvara objektglaset vid 4 °C.
7. Dubbel FISH och IHC
- Grädda de delade näthinnorna vid 40 °C i 30 minuter i en hybridiseringsugn för att öka vidhäftningen till objektglaset.
- Fyll i RNAscope FISH-protokollet enligt tillverkarens protokoll med följande undantag och ändringar:
- Inget antigenhämtningssteg krävs. Använd proteas III med en inkubationstid på 18 minuter vid rumstemperatur.
- Utför alla tvättsteg på rutschkanan i brunnarna gjorda av en hydrofob barriärpenna.
- Inkubera proverna i primär antikropp utspädd (se materialtabell) i PBS i 30 minuter vid 40 °C i hybridiseringsugnen. Tvätta proverna 3x i rumstemperatur PBS.
- Inkubera proverna i sekundär antikropp utspädd (se materialtabell) i PBS i 30 minuter vid 40 °C i hybridiseringsugnen. Tvätta proverna 3x i rumstemperatur PBS.
- Inkubera proverna i 1x DAPI i 30 s vid rumstemperatur. Tvätta proverna 1x i rumstemperatur PBS.
- Applicera en droppe anti-bleknings monteringsmedia på varje vävnadsbit och montera ett täckglas av glas.
- Applicera nagellack runt kanterna på täckglaset för att försegla provet. Förvara objektglaset vid 4 °C.
8. Elektrofysiologi
- Efter att ha tagit bort nitrocellulosamembranet, överför en delad näthinna till patch-clamp inspelningskammare och förankra den försiktigt på plats med en platinaharpa.
- Under hela experimentet perfunderas kontinuerligt den delade näthinnan med Ames-lösning karbogenerad med 95 % O 2 och 5 % CO2 . Förvara lösningen mellan 32-34 °C.
OBS: Under experimentet kan vävnaden visualiseras med hjälp av Dodt gradientkontrastmikroskopi. - Under rumsbelysning, utför helcellsspänningsklämning för att spela in från INL-neuroner.
- Under inspelning, simulera ljusresponser med hjälp av en mikrocellulär injektionsenhet för att applicera farmaceutiska föreningar, eller en 470 nm LED för att stimulera channelrhodopsin (ChR2).
OBS: Ljusintensiteten kan mätas med en digital optisk effektmätare.
- Under inspelning, simulera ljusresponser med hjälp av en mikrocellulär injektionsenhet för att applicera farmaceutiska föreningar, eller en 470 nm LED för att stimulera channelrhodopsin (ChR2).
9. Konfokalmikroskopi
- För konfokal immunofluorescens, ta bilder med ett konfokalmikroskop med ett 40x/1.3 eller 63x/1.40 oljenedsänkningsobjektiv. Använd FIJI för att justera ljusstyrka och kontrast och för att generera Z-projektioner från bildstaplar.
Representative Results
Näthinneklyvning bevarar fotoreceptorterminaler
För att bekräfta att näthinneklyvning inte skadar dendriterna hos andra ordningens neuroner i OPL, färgades vertikala sektioner av delade näthinnor med antikroppar mot synaptikvesikelproteinet synaptophysin (grönt) och proteinkinas C alfa (PKCα; rött). Det intensiva bandet av synaptofysinmärkning över toppen av den delade näthinnan indikerar att fotoreceptorns synaptiska terminaler behålls (figur 2). Dessutom avslöjar PKCα-färgning normal morfologi hos stavbipolära celler (RBC). Inga fotoreceptorkärnor är synliga, vilket tyder på att näthinnan är delad mellan OPL och den innersta raden av fotoreceptorcellkroppar (figur 2).
Figur 2: Delade näthinnor behåller fotoreceptorterminaler. Fluorescerande konfokalmikroskop som visar ett vertikalt tvärsnitt av en näthinna som kryosektionerats (20 μm tjocklek) efter klyvningsproceduren. Varje bild är en maximal projektion av en konfokal z-stack. Sektionen immunmärktes med antikroppar mot PKCα (överst i mitten) och synaptophysin (överst till höger) för att visualisera röda blodkroppar respektive synaptiska vesiklar. Den sammanslagna bilden (nederst) visar synaptiska vesiklar (gröna), som finns i fotoreceptorterminalerna, strax ovanför de apikala processerna för de röda blodkropparna (röda) i OPL. Cellkärnor är märkta med DAPI (blått). Inga fotoreceptorkärnor är synliga i ONL. Förkortningar: ONL = yttre kärnskikt; OPL = yttre plexiformt skikt; INL = inre kärnskiktet, IPL = inre plexiformt skikt; GC = ganglieceller. Skalstreck = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Synapsmorfologin i OPL bevaras efter näthinnedelning
Med hjälp av en mus som uttrycker GFP i röda blodkroppar under pcp2-promotornimmunmärktes 14 pre- och postsynaptiska proteiner i OPL för att bedöma integriteten hos detta synaptiska skikt efter en delningav 14. Trots skjuvkrafterna som uppstår genom fotoreceptorernas axoner, stör klyvningen inte morfologin hos fotoreceptor-BC-synapser i OPL, eftersom normal positionering av RBC-dendriter, märkta för RGS11, och fotoreceptorsynaptiska band, märkta för CtBP215 observeras (figur 3). För varje synaptisk kontakt mellan stavar och röda blodkroppar kan RGS11 ses som röda puncta som ligger inom hästskoformen på de synaptiska banden (gröna). I ett efterföljande experiment användes en anti-GPR179-antikropp 16 för att märka de postsynaptiska ON-BC-dendritiska spetsarna16, och en anti-PSD-95-antikropp användes för att märka presynaptiska stavfotoreceptorterminaler (tilläggsfigur 2). Dessa resultat bekräftar återigen stabiliteten hos OPL i den delade näthinnan, eftersom RBC-dendriter har visat sig vara nära associerade med sin presynaptiska partner, stavterminalerna.
Figur 3: Synapsmorfologin i OPL bevaras efter näthinnedelning. Konfokala immunofluorescensbilder av en delad näthinna från en transgen mus som uttrycker GFP i röda blodkroppar under Pcp2-promotorn. Nivåerna av GFP-uttryck (blått) varierar mellan röda blodkroppar i näthinnan. Efter delningen fixerades näthinnan och inkuberades sedan med antikroppar mot CtBP2 (grön) och RGS11 (röd) för att märka fotoreceptorsynaptiska band respektive ON-BC dendritiska spetsar. Varje röd-grönt par representerar en synaptisk kontakt mellan en stav och en ON-BC. Skalstreck = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Näthinneklyvning upprätthåller RBC:s livskraft
För att bedöma livskraften hos de inre näthinneneuronerna efter en delning användes ett membranogenomträngligt, nära-infrarött kärnfärgämne (MI-NIR), vilket möjliggör identifiering av döda celler. Efter inkubation med MI-NIR fixerades delade näthinnor och märktes sedan med anti-PKCα för att identifiera röda blodkroppar. Konfokalmikroskop av den delade näthinnan avslöjar regional variation i cellviabilitet över vävnaden, med vissa regioner som upplever högre celldöd än andra. Denna variabilitet kan bero på skador på vissa regioner i näthinnan under dissektions-, klyvnings- eller hanteringsprocedurerna (Figur 4). Med tanke på att cellkropparna hos röda blodkroppar finns i den yttersta regionen av INL, nära platsen för delningen, var en noggrann utvärdering av deras livskraft motiverad. Sällsynt samlokalisering av PKCα och MI-NIR bekräftade att de flesta röda blodkroppar förblir livskraftiga efter näthinnedelning (Figur 4).
Figur 4: Bipolära stavceller är livskraftiga efter näthinnedelning. Fluorescerande konfokalmikroskop som visar ett område av en delad näthinna i ett platt perspektiv. Efter delningen inkuberades den levande näthinnan med MI-NIR-färgämne (rött) i 30 minuter vid 37 °C. Näthinnan fixerades sedan och immunmärktes med antikroppar mot PKCα för att visualisera röda blodkroppar. I denna region av näthinnan är samlokalisering av PKCα och MI-NIR sällsynt. MI-NIR samlokaliseras med kärnor (blå) som inte tillhör röda blodkroppar. Förkortningar: MI-NIR = membranogenomtränglig NIR levande/död fläck. Skalstreck = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Delade näthinnor är mottagliga för dubbla FISH och IHC
Genom att förlänga bindningstiden för standard IHC kan delade näthinnor bearbetas sekventiellt av FISH och IHC för att märka mRNA och proteiner samtidigt17,18. Experiment bekräftade att en 2 timmars fixering i 4 % paraformaldehyd ger robust mRNA-märkning samtidigt som proteinepitoper bevaras för antikroppsbindning. FISH utfördes på delade näthinnor följt av IHC för att visualisera uttrycket av GABA A-receptorsubenheten δ (GABRD; anti-sense mRNA-sonder) i förhållande till positionen för röda blodkroppar (anti-PKCα-antikroppar) i den yttre INL (Figur 5A). GABRD-mRNA-uttryck verkar sällsynt hos röda blodkroppar (figur 5A). Transkriptionen uttrycks dock rikligt av amakrina celler och ganglieceller, vilket framgår av märkningsmönstret på tvärsnitt från en intakt näthinna (figur 5B). I den yttre INL (Figur 5A) är GABRD-mRNA mer jämnt fördelat jämfört med den inre INL (Figur 5C) där det är koncentrerat i distinkta celler. Antisense-prober som riktar sig mot andra GABA-receptorsubenheter producerar distinkta märkningsmönster, vilket visar probernas specificitet (data visas inte).
Figur 5: Dubbla FISH och IHC i en delad näthinna och en intakt näthinna. (A, C) Konfokalmikrobilder av en flatmount split näthinna och (B) ett vertikalt snitt från en intakt näthinna. Bilderna i (A) och (C) är maximala projektioner av optiska sektioner i de övre respektive nedre regionerna av INL. De prickade rektanglarna i (B) representerar de ungefärliga gränser som används för att skapa projektionerna som visas i (A) och (C). Den delade näthinnan (A, C) fixerades i 2 timmar och märktes sedan med antisense-mRNA-sonder mot GABRD (röd). Efteråt färgades den delade näthinnan med antikroppar mot PKCα för att märka röda blodkroppar (gröna). PKCα-kanalen utelämnades från projektioner av den lägre INL för tydlighetens skull. Den intakta näthinnan i (B) fixerades i 24 timmar före snittning. Efteråt märktes den fixerade näthinnan med antisense-mRNA-sonder mot GABRD (röd). Alla prover färgades med DAPI (blå) i 20 s före montering av täckglas. Förkortningar: INL = inre kärnskikt. Skalstaplar = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Delade näthinnor är väl lämpade för elektrofysiologisk registrering med patch-clamp från BC och HC
För att lappa en BC- eller HC-soma i en traditionell hel näthinna måste pipetten närma sig från antingen gangliecellsidan eller fotoreceptorsidan. Båda tillvägagångssätten kräver att man korsar flera näthinnelager för att nå INL, under vilken pipettspetsen ofta blockeras av skräp. I ett vibratomskivpreparat är BC- och HC-somorna lättillgängliga, men deras dendritiska utskott kan vara avskurna, vilket stör deras laterala anslutningar. I delade näthinnor sitter dock cellkropparna av röda blodkroppar och HC på vävnadens yta, vilket ger kraftigt förbättrad tillgång till patchpipetter samtidigt som OPL:s laterala kretsar bevaras.
Figur 6 visar kemiskt simulerade ljusresponser registrerade från BC i en delad näthinna. Perfunderat Ames-medium kompletterades med L-AP4 (4 μM), en grupp III mGluR-agonist, för att simulera glutamatfrisättning från fotoreceptorer i mörker. mGluR6-antagonisten, CPPG (600 μM, i Ames), puffades på dendriterna i den lappade cellen (som hölls vid -60 mV) för att simulera en ljusblixt via hämning av mGluR6. Cellerna reagerade på CPPG-puffar med två typer av inåtgående strömmar. En typ visar en transient ström följt av en platå (Figur 6A), liknande de kanoniska ljusframkallade strömmarna som registrerats från röda blodkroppar i näthinneskivor19. Den andra typen förblir ihållande under hela puffens varaktighet (Figur 6B) och liknar strömmar som registreras från bipolära ON-konceller (ON-CBC)19.
Ett separat experiment utfördes för att rikta in sig på HC, en celltyp med ett brett dendritiskt fält som ofta är svårt att bevara i skivberedningar. En muslinje som uttrycker kanalen rhodopsin (ChR2) och GFP i HC användes för att underlätta enkel identifiering under ett fluorescensmikroskop. Först registrerades strömmar från HC som svar på en serie depolarisationssteg (-100 mV till 50 mV, stegstorlek = 15 mV) som de svarade på med inåtgående strömmar följt av utåtriktade strömmar (Figur 6C). Dessa celler stimulerades sedan med en kort blå ljuspuls (200 ms, 470 nm) som producerade stora, ChR2-drivna inåtgående strömmar i två celler (figur 6D).
Figur 6: Patch clamp-inspelningar från INL-neuroner i delade näthinnor. (A) En förmodad RBC och (B) CBC spänningsklämdes fast vid -60 mV i perfunderade Ames-medier innehållande L-AP4 (4 μM). Puffning av CPPG (600 μM) på dendriterna i de klämda cellerna framkallade en inåtgående ström som var övergående i RBC men bibehölls i CBC. RBC-registreringen i (A) är ett enda spår medan CBC-registreringen i (B) representerar genomsnittet av 3 spårningar. C) En inspelning med patchklämma från en HC i en vGATFLPo. vGlut2Cre; Ai80d mus. Den röda linjen visar varaktigheten av en ljuspuls på 200 ms, 470 nm som används för att anropa den stora, inåtgående strömmen genom ChR2. (D) Injicerade strömsvar från en HC som spänningsklämdes vid -60 mV, stegade sedan mellan -70 mV och +35 mV i 15 mV-intervaller och återgick till -60 mV. Infällningen visar samma spår i ett 6 ms fönster som omger början av spänningssteget. E) Immunofluorescensmikroskop av en flatmount delad näthinna som visar horisontella celler som uttrycker GFP i en vGATFLPo. vGlut2Cre; Ai80d mus. Skalstapel = 20 μm. Elektrofysiologiska data samlades in med en samplingsfrekvens på 20 kHz och filtrerades med ett lågpassfilter från Bessel vid 5 kHz. Data exporterades sedan och offlinevisualisering och analys utfördes med hjälp av Python 3. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Näthinneklyvning möjliggör snabb undersökning av INL- och OPL-anatomin
Näthinnans yttre begränsande membran (ELM) och ONL består av en barriär ~90 μm tjock, vilket hindrar diffusionen av antikroppar in i den inre näthinnan och skapar suboptimala immunfärgningsförhållanden20,21,22. Därför kräver immunmärkning av mål i OPL eller INL med hjälp av en konventionell platt näthinna tidskrävande färgningsprotokoll som ofta kräver 48-96 timmars antikroppsinkubationer 5,6,7,8,20,22.
Genom att ta bort fotoreceptorerna kan man snabbt penetrera antikroppar i inre näthinnans nervceller. Som ett resultat kan märkning av proteinmål i den inre näthinnan uppnås på så lite som 1 timme med användning av färgämneskonjugerade primära antikroppar. Antikroppar mot PKCα och Calbindin-D användes för att märka röda blodkroppar respektive HC i INL (Figur 7). Till skillnad från traditionella vertikala näthinnesektioner som trunkerar de laterala processerna hos vidfältsneuroner, möjliggör den delade näthinneförberedelsen visualisering av hela den dendritiska axeln hos bredfältsceller som HC (Figur 6E, Figur 7).
Figur 7: Snabb immunmärkning av inre näthinneproteiner i en delad näthinna. Konfokala immunofluorescensbilder av en delad näthinna från ett flatmount-perspektiv. Den delade näthinnan inkuberades med antikroppar mot PKCα (gul) och Calbindin-D (grön) i 1 timme vid rumstemperatur för att märka ON-BC respektive HC. (A) Varje enkanalsbild är en genomsnittlig Z-projektion som består av fyra optiska sektioner: DAPI, Average z10-13; Calbindin-D, Genomsnitt z11-14; PKCα, genomsnitt z11-14. (B) I den sammanfogade bilden är samma projektioner överlagrade. Skalstreck = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Viktiga stadier av näthinnedissektionen. Alla bilder är tagna med en smartphonekamera monterad på ögonlinserna i ett dissektionsmikroskop. (A) En bild uppifrån och ned av ett musöga efter avlägsnande av hornhinnan. (B) En bild uppifrån och ned av musmusslan efter att linsen har tagits bort. (C) Ett litet snitt görs i sklera på musmusslan. Pilar indikerar de två flikarna på sklera som dras i motsatta riktningar av en pincett för att börja separera näthinnan från sklera. (D) Efter att skleran delvis har dragits bort från näthinnan förs Vannas-saxen in mellan skleran och näthinnan, och synnerven skärs av, vilket frigör näthinnan. Den röda prickade cirkeln visar synnervshuvudet, och saxen visar den korrekta skärbanan (sätt in saxen mellan sclera och näthinnan). Den isolerade näthinnan efter sklera bänds bort. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Karakterisering av pre- och postsynaptiska komponenter av OPL i den delade näthinnan. Konfokala immunofluorescensbilder från OPL i en delad näthinna. Den delade näthinnan inkuberades med antikroppar mot GPR179 och PSD95 i 1 timme vid rumstemperatur för att märka till de dendritiska spetsarna på ON-BC respektive terminalerna på stavfotoreceptorer. Den vänstra och mittersta bilden är maximala projektioner av flera optiska sektioner; Samma projektioner läggs ovanpå varandra i bilden längst till höger. GPR179-puncta i ON-BC-dendritiska spetsar ses vara nära associerade med stavens fotoreceptorterminaler, vilket visar intakta synaptiska kontakter inom OPL. Skalstreck = 10 μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 3: Felsökning: bedömning av kvaliteten på en delad näthinna. Fluorescerande mikrobilder av en delad näthinna färgad med DAPI för att visualisera cellkärnor. Celler kan identifieras baserat på kärnans diameter och vävnadsdjup. (A) Fotoreceptorkärnor är mindre, ljusare och ytligare, medan (B) BC-kärnor är större, svagare och djupare. (C) En bild med låg förstoring av ett område där fotoreceptorer inte avlägsnats fullständigt. Kärnorna som visas i fokus kommer från BC, som är djupare än fotoreceptorkärnorna i bildens kanter som verkar oskarpa. Skalstreck för (A) och (B) = 20 μm. Skalstapel för (C) = 50 μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Efter att fotoreceptorer har överfört fotonabsorption till frisättning av neurotransmittorer, är BC och HC de första retinala neuronerna som bearbetar den visuella signalen23. Även om betydelsen av dessa neuroner är välkänd, är många av deras funktioner ofullständigt förstådda eller helt outforskade. Många BC- och HC-fysiologiska studier skulle sannolikt dra nytta av ett flatmount-näthinnepreparat som förbättrar tillgången till INL-neuroner samtidigt som lateral konnektivitet bevaras. Utvecklingen av split retina metoden representerar ett försök att tillhandahålla ett enkelt protokoll för att samla in högkvalitativa elektrofysiologiska registreringar och mikroskopidata från BC och HC i en platt orientering. Förberedelsen av delad näthinna som beskrivs här kan utföras på cirka 20 minuter per mus (10 minuter per näthinna) efter näthinneisolering, utan användning av specialutrustning. Metoden hämtar inspiration från befintliga procedurer för borttagning av fotoreceptorer men erbjuder betydande förbättringar i enkelhet, hastighet och mångsidighet 4,10,11,12,13. Till skillnad från tidigare metoder för att separera näthinneskikt kräver näthinnedelning inte frysning, frystorkning eller upprepad applicering av lim på näthinnan. Med övning kan nästan alla fotoreceptorer avlägsnas i en enda reva med nitrocellulosamembranet. Snabbheten och enkelheten i detta tillvägagångssätt gör att man kan minimera den tid som näthinnan tillbringar utanför karbogenerad Ames, vilket möjliggör hög cellviabilitet under långa perioder; Delade näthinnor kan bibehållas i karbogenerade Ames-medier i flera timmar efter delning. Som ett bevis på hälsan hos INL-neuroner i denna förberedelse, bekräftar en levande/död cellfärgning (Figur 4) och patch-clamp-elektrofysiologi (Figur 6) livskraften hos RBC och HC efter en delning.
Avlägsnandet av fotoreceptorskiktet i delade näthinnor ger en betydande fördel under immunmärkning genom att dramatiskt minska diffusionstiden för antikroppar i INL. Primär och sekundär antikroppsmärkning kan slutföras inom 2 timmar, en betydande förbättring jämfört med konventionell flatmount-färgning som kan ta 72 timmar eller längre beroende på målet 5,6,7,8,20,22. Som ett resultat kan mikroskopidata samlas in samma dag som vävnadspreparation, vilket drastiskt påskyndar takten i immunfluorescensexperiment. För att underlätta mRNA-sondglödgning rekommenderar FISH-experiment vanligtvis mycket längre fixeringstider (~24 timmar) än immunmärkning18. Experimenten som presenteras här visar dock att en 2 timmars fixering fortfarande ger exceptionell FISH-märkning (figur 5). Trots att fixeringstiden förlängdes från 30 minuter till 2 timmar var det inte nödvändigt att utföra antigenhämtningssteg för att få utmärkt immunmärkning, men detta kan variera beroende på antikroppen eller antigenet. Proteasbehandlingen i FISH-protokollet kan störa antikroppsmärkningen, sannolikt på grund av att målepitoper förstörs. Detta problem kringgicks genom att använda polyklonala antikroppar som riktar sig mot flera epitoper, vilket minskar sannolikheten för att epitopdestruktion skulle hindra immunmärkning. Dessutom användes en måttlig proteasbehandling (ACD-proteas III) för att förhindra överdriven epitopförändring samtidigt som den gav tillräcklig vävnadspenetration.
Ibland kommer näthinnan istället att dela sig genom det yttre kärnskiktet (ONL) och lämna efter sig lager av fotoreceptorsoma utan synliga INL-celler. För att förhindra detta bör man se till att näthinnan ligger helt platt på glaset och att eventuell kvarvarande vätska runt näthinnan har avlägsnats. Att trycka hårdare på nitrocellulosan med penseln kan också hjälpa till att förhindra att den spricker igenom ONL. Om membranet blir för vått eller om näthinnan viks över sig själv, kommer chanserna för en lyckad delning att minska kraftigt. Att använda DAPI för att färga cellkärnor är användbart för att bedöma kvaliteten på delningen och för att bestämma täckningen av återstående fotoreceptorer. Fotoreceptorkärnor är mindre, ljusare och ytligare (tilläggsfigur 3A), medan BC-kärnor är större, svagare och djupare (tilläggsfigur 3B). I vissa fall kommer revans plan att variera något över näthinnan, vilket resulterar i fläckar där fotoreceptorernas cellkroppar inte har avlägsnats helt (tilläggsfigur 3C). För tillämpningar inom mikroskopi och elektrofysiologi hindrar detta inte möjligheten att samla in kvalitetsdata från regioner där fotoreceptorer har avlägsnats på ett korrekt sätt. Stora fält av exponerad inre näthinna kan lätt hittas vid avbildning eller inspelning med en lapppipett. Om mer fullständigt avlägsnande av fotoreceptorer önskas kan en andra rivning utföras med en extra bit nitrocellulosamembran, även om 100 % fotoreceptorborttagning inte kan garanteras. Försiktighet rekommenderas därför vid användning av delade näthinnor i genuttrycks- eller proteomikstudier där kvarvarande fotoreceptormaterial kan påverka resultaten. För encellstillämpningar är denna oro obefogad, eftersom data från fotoreceptorer kan uteslutas från analys.
Fördelarna med den delade näthinnan är kanske mest framträdande vid elektrofysiologiska registreringar av interneuroner med brett fält. Medan traditionella vertikala skivor skär av de omfattande processerna i bredfältsceller, lämnar den delade näthinneförberedelsen OPL och IPL intakta, vilket gör att man kan fånga input från bredfältsceller som HC 24, A1725, TH AC26 och NOS-1 AC27 som annars skulle förbises i vertikala skivor. Därför kräver tolkning av resultat och jämförelse med tidigare data som samlats in från näthinneskivor noggrann eftertanke. Icke desto mindre, i experiment med farmakologiska imitationer av ljusstimulering, liknar dessa resultat data som registrerats från näthinneskivor19. Genom att uttrycka ChR2 under cellspecifika promotorer kan man stimulera en önskad cellpopulation samtidigt som man spelar in från BC i INL för att undersöka den önskade cellens inverkan på den vertikala informationsvägen. Inspelning direkt från djupare INL-neuroner, såsom amakrina celler, är också möjlig i den delade näthinnan. Även om plåsterelektroden i detta fall först måste färdas genom de mer ytliga INL-neuronerna, finns det betydligt mindre vävnad som hindrar dess väg jämfört med en traditionell helmonteringsförberedelse.
Förutom att mäta påverkan av bredfältsceller på andra nervceller, möjliggör denna metod direkt encellspatch clamping från HC, vars dendriter bildar ett omfattande gap-junction-kopplat nätverk i OPL28. Horisontella celler skickar kritisk återkoppling till fotoreceptorer som formar överföringen av vertikal information genom näthinnan. Men eftersom de dendritiska fälten i HC trunkeras i vertikala skivor, saknas encellsregistreringsdata. Detta arbete presenterar anatomiskt och fysiologiskt intakta HC från vilka ChR2-framkallade strömmar registreras i en trippel transgen muslinje (Figur 6 C-E). Utanför ChR2-stimulering kan den delade näthinnan användas för att studera endogena HC-strömmar och gap junctioncoupling 28. Medan den delade näthinnan ger en bekväm modell för att studera synaptisk konnektivitet och neuronal aktivitet inducerad av kemisk applicering eller ChR2-stimulering, utesluter bristen på fotoreceptorer all direkt utforskning av naturliga ljusreaktioner eller ljusanpassningsmekanismer.
In situ-avbildning i näthinnan har gjort beundransvärda framsteg under de senaste åren. Majoriteten av avbildningsstudierna är dock begränsade till gangliecellskiktet i hela näthinnepreparat29. Författarna föreställer sig att frånvaron av fotoreceptorer i den delade näthinnan kommer att göra den till en idealisk modell för levande kalciumavbildning i OPL och INL. Utöver kalciumavbildning har denna modell stor potential för användning med genetiskt kodade biosensorer som iGluSnFR 30,31, iGABASnFR32 och pHluorin33. I kombination med den delade näthinnan kan dessa kraftfulla verktyg erbjuda ett effektivt tillvägagångssätt för att utforska de synaptiska interaktionerna och biofysiska egenskaperna hos BC och HC som bidrar till ljusbearbetning i näthinnan.
Disclosures
Författarna deklarerar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av följande NIH-anslag: NIH-anslag R01EY031596 (till C.M.); NIH-bidrag R01EY029985 (till C.M.); NIH-bidrag P30EY010572 (till C.M.); NIH-stipendium R01EY032564 (till BS). Vi tackar Tammie Haley för hennes tekniska stöd vid förberedelse av näthinnesnitt och Dr. Charles Allen för att generöst ha bidragit med mRNA FISH-sonderna som används i detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1.5 glass coverslips | Fisherbrand | 12544E | |
| 2 pairs of Dumont #5 forceps | Ted Pella | 38125 | |
| 25 gauge needle | Becton Dickenson | 305122 | |
| 470 nm LED | THORLABS | M470L2 | |
| 5-306 curved scissors | Miltex | 5-306 | |
| 9" disposable pasteur pipetes | Fisherbrand | 13-678-20D | for constructing custom transfer pipette |
| Ai80d mouse | Jackson Laboratories | 25109 | RRID: IMSR_JAX:025109 |
| Ames Medium w/L-Glutamate | US Biological | A1372-25 | |
| amplifier control software | Molecular Devices | Clampex 10.3 software | |
| anti-calbindin D28K antibody | Invitrogen | PA-5 85669 | RRID: AB_2792808, host species = rabbit; 1:100 dilution |
| anti-CtBP2 antibody | BD Biosciences | 612044 | RRID: AB_399431, host species = mouse; 1:5000 dilution |
| anti-GPR179 antibody | NA | NA | gift from Kirill Martemyanov; Scripps Research Institute, Jupiter, FL; host species = sheep; 1:1000 dilution |
| anti-PKC alpha antibody | Sigma-Aldrich | P4334 | RRID: AB_477345, host species = rabbit; 1:5000 dilution |
| anti-PKC alpha antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc8393 AF594 | RRID: AB_628142, host species = mouse; 1:1000 dilution |
| anti-PSD95 antibody | BD Transduction Laboratories | 610495 | RRID: AB_397862, host species = mouse; 1:1000 dilution |
| anti-RGS11 antibody | NA | NA | gift from Ted Wensel; Baylor College of Medicine, Houston, TX; host species = rabbit; between 1:1000 and 1:5000 dilution |
| anti-Synaptophysin P38 antibody | Sigma | S-S5768 | RRID: AB_477523, host species = mouse; 1:1000 dilution |
| Aquamount mounting media | Epredia | 13800 | slide mounting media |
| C57BL/6J mouse | Jackson Laboratories | 000664 | RRID: IMSR_JAX:000664 |
| carbogen tank | Matheson | NA | 95% O2 and 5% CO2 |
| custom transfer pipette | custom build | NA | Instructions: use scissors to cut off the tip of a plasitc transfer pipette at the point it begins to taper. Use pliers to safely break off the last 2-3 inches of a glass pasteur pipette. Fit the narrow end of the glass pasteur pipette into the wide tip of the plastic transfer pipete. Wrap parafilm around the joint of the two pieces to enhance the seal. |
| Digitical optical power meter | THORLABS | PM100D | |
| dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| electrophysiology amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
| electrophysiology microscope | Olympus | OLYMPUS, BX50WI | Dodt gradient contrast microscopy |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| HC PL APO CS2 40x/1.3 | Leica | 506358 | |
| HC PL APO CS2 63x/1.40 | Leica | 15506350 | |
| Hybridization oven | Robbins Scientific | Model 1000 | for RNAscope protocol only |
| Immedge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| isoflurane | Piramal Critical Care | 66794-017-25 | |
| Kimwipe (delicate task wipe) | Kimtech Science | 34155 | |
| Leica HC PL APO CS2 40x/1.3 oil immersion objective | Leica | 506358 | |
| Leica HC PL APO CS2 63x/1.40 oil immersion objective | Leica | 15506350 | |
| Leica TCS SP8 X confocal microscope | Leica | discontinued | |
| medium 15 mm petri dish | Corning | 25060-60 | eyes are kept here during retina dissection |
| Merit 97-275 steel scissors | Merit | 97-275 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | p-97 | |
| Mm-Gabrd-C2 mRNA probe | ACD | 459481-C2 | |
| mouse euthanasia chamber | NA | NA | custom build; glass petri dish covering a small glass jar. |
| nitrocellulose membrane filters | GE Healthcare Life Sciences; Whatman | 7184-005 | 0.45 µm pore size |
| Picospritzer | General Valve Corporation | Picospritzer II | referred to in the text as microcellular injection unit |
| plastic transfer pipets | Fisherbrand | 13-711-7M | for constructing custom transfer pipette |
| Plastic tubing | Tygon | R-603 | for connection to carbogen tank |
| platinum harp | custom build | NA | for anchoring split retinas within the electrophysiology recording chamber. |
| size 0 paint brush | generic | NA | for flattening retina during splitting. |
| SlowFade Gold antifade reagent | Molecular Probes | S36937 | referred to in the text as anti-fade mounting media |
| small 10 mm petri dish | Falcon | 353001 | eyes are placed here following enucleation |
| small glass pane (7.5 cm x 5 cm) | generic | NA | isolatd retina pieces are placed onto this for the splitting procedure |
| Superfrost plus microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | electrostatically-charged glass microscope slides |
| Thick-walled borosilicate glass pipettes with filament | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | |
| Vannas Scissors; straight | Titan Medical | TMS121 | not brand specific; any comparable scissors will work |
| vGATFLPo mouse | Jackson Laboratories | 29591 | RRID: IMSR_JAX:029591 |
| vGlut2Cre mouse | Jackson Laboratories | 28863, 016963 | RRID: IMSR_JAX:028863, RRID: IMSR_JAX:016963 |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | BioLegend | 423105 | referred to in the text as MI-NIR |
References
- Morgans, C. W. Neurotransmitter release at ribbon synapses in the retina. Immunology & Cell Biology. 78 (4), 442-446 (2000).
- Euler, T., Haverkamp, S., Schubert, T., Baden, T. Retinal bipolar cells: elementary building blocks of vision. Nature Reviews Neuroscience. 15 (8), 507-519 (2014).
- Barnes, S., Grove, J. C. R., McHugh, C. F., Hirano, A. A., Brecha, N. C. Horizontal Cell Feedback to Cone Photoreceptors in Mammalian Retina: Novel Insights From the GABA-pH Hybrid Model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, (2020).
- Walston, S. T., Chang, Y. C., Weiland, J. D., Chow, R. H. Method to remove photoreceptors from whole mount retina in vitro. Journal of Neurophysiology. 118 (5), 2763-2769 (2017).
- Stefanov, A., Novelli, E., Strettoi, E. Inner retinal preservation in the photoinducible I307N rhodopsin mutant mouse, a model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. Journal of Comparative Neurology. 528 (9), 1502-1522 (2020).
- Matsuoka, R. L., Nguyen-Ba-Charvet, K. T., Parray, A., Badea, T. C., Chédotal, A., Kolodkin, A. L. Transmembrane semaphorin signaling controls laminar stratification in the mammalian retina. Nature. 470 (7333), 259-263 (2011).
- Matsuoka, R. L., et al. Guidance-Cue Control of Horizontal Cell Morphology, Lamination, and Synapse Formation in the Mammalian Outer Retina. Journal of Neuroscience. 32 (20), 6859-6868 (2012).
- Wässle, H., Puller, C., Müller, F., Haverkamp, S. Cone Contacts, Mosaics, and Territories of Bipolar Cells in the Mouse Retina. Journal of Neuroscience. 29 (1), 106-117 (2009).
- Thoreson, W. B., Dacey, D. M. Diverse Cell Types, Circuits, and Mechanisms for Color Vision in the Vertebrate Retina. Physiological Reviews. 99 (3), 1527-1573 (2019).
- Guido, M. E., et al. A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).
- Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis. Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28 (2017).
- Todorova, V., et al. Retinal Layer Separation (ReLayS) method enables the molecular analysis of photoreceptor segments and cell bodies, as well as the inner retina. Scientific Reports. 12 (1), 20195 (2022).
- Shiosaka, S., Kiyama, H., Tohyama, M. A simple method for the separation of retinal sublayers from the entire retina with special reference to application for cell culture. Journal of Neuroscience Methods. 10 (3), 229-235 (1984).
- Ivanova, E., Hwang, G. S., Pan, Z. H. Characterization of transgenic mouse lines expressing Cre-recombinase in the retina. Neuroscience. 165 (1), 233-243 (2010).
- Sarria, I., Orlandi, C., McCall, M. A., Gregg, R. G., Martemyanov, K. A. Intermolecular Interaction between Anchoring Subunits Specify Subcellular Targeting and Function of RGS Proteins in Retina ON-Bipolar Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (10), 2915-2925 (2016).
- Orlandi, C., Cao, Y., Martemyanov, K. A. Orphan Receptor GPR179 Forms Macromolecular Complexes With Components of Metabotropic Signaling Cascade in Retina ON-Bipolar Neurons. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 7153-7161 (2013).
- Dikshit, A., Zong, H., Anderson, C., Zhang, B., Ma, X. -J. Simultaneous Visualization of RNA and Protein Expression in Tissue Using a Combined RNAscopeTM In Situ Hybridization and Immunofluorescence Protocol. Methods in Molecular Biology. 2148, Clifton, N.J. 301-312 (2020).
- Wang, F., et al.
- Morgans, C. W., et al. TRPM1 is required for the depolarizing light response in retinal ON-bipolar cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19174-19178 (2009).
- Alessio, E., Zhang, D. Q. Immunostaining of whole-mount retinas with the CLARITY tissue clearing method. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (7), 5054 (2020).
- Ferguson, L. R., Dominguez, J. M., Balaiya, S., Grover, S., Chalam, K. V. Retinal Thickness Normative Data in Wild-Type Mice Using Customized Miniature SD-OCT. PLoS ONE. 8 (6), e67265 (2013).
- Ivanova, E., Toychiev, A. H., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments JoVE. (82), e51018 (2013).
- Kolb, H.
- Chaya, T., et al. Versatile functional roles of horizontal cells in the retinal circuit. Scientific Reports. 7 (1), 5540 (2017).
- Egger, V., Diamond, J. S. A17 Amacrine Cells and Olfactory Granule Cells: Parallel Processors of Early Sensory Information. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 600537 (2020).
- Dacey, D. M.
- Park, S. J., et al. Connectomic analysis reveals an interneuron with an integral role in the retinal circuit for night vision. eLife. 9, 56077 (2020).
- Janssen-Bienhold, U., et al. Connexin57 is expressed in dendro-dendritic and axo-axonal gap junctions of mouse horizontal cells and its distribution is modulated by light. The Journal of Comparative Neurology. 513 (4), 363-374 (2009).
- Jain, V., et al. The functional organization of excitation and inhibition in the dendrites of mouse direction-selective ganglion cells. eLife. 9, 52949 (2020).
- Marvin, J. S., et al. Stability, affinity, and chromatic variants of the glutamate sensor iGluSnFR. Nature Methods. 15 (11), 936-939 (2018).
- Strauss, S., et al. Center-surround interactions underlie bipolar cell motion sensitivity in the mouse retina. Nature Communications. 13 (1), 5574 (2022).
- Marvin, J. S., et al. A genetically encoded fluorescent sensor for in vivo imaging of GABA. Nature Methods. 16 (8), 763-770 (2019).
- Beckwith-Cohen, B., Holzhausen, L. C., Wang, T. M., Rajappa, R., Kramer, R. H. Localizing Proton-Mediated Inhibitory Feedback at the Retinal Horizontal Cell-Cone Synapse with Genetically-Encoded pH Probes. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 39 (4), 651-662 (2019).
