Summary
Ce travail présente une préparation alternative de rétine à montage plat dans laquelle l’ablation des corps cellulaires photorécepteurs permet une diffusion plus rapide des anticorps et un meilleur accès des pipettes patch aux neurones rétiniens internes pour l’immunohistochimie, l’hybridation in situ et les expériences d’électrophysiologie.
Abstract
Les cellules bipolaires et les cellules horizontales de la rétine des vertébrés sont les premiers neurones à traiter l’information visuelle après la détection des photons par les photorécepteurs. Ils effectuent des opérations fondamentales telles que l’adaptation à la lumière, la sensibilité au contraste et l’opposition spatiale et chromatique. Une compréhension complète des circuits précis et des mécanismes biochimiques qui régissent leur comportement fera progresser la recherche en neurosciences visuelles et la médecine ophtalmologique. Cependant, les préparations actuelles pour l’examen des cellules bipolaires et horizontales (montures entières rétiniennes et coupes verticales) sont limitées dans leur capacité à saisir l’anatomie et la physiologie de ces cellules. Dans ce travail, nous présentons une méthode permettant d’éliminer les corps des cellules photoréceptrices des rétines de souris vivantes et à montage plat, offrant un meilleur accès aux cellules bipolaires et horizontales pour un clampage efficace et un immunomarquage rapide. Les rétines fendues sont préparées en prenant en sandwich une rétine de souris isolée entre deux morceaux de nitrocellulose, puis en les séparant doucement. La séparation divise la rétine juste au-dessus de la couche plexiforme externe pour produire deux morceaux de nitrocellulose, l’un contenant les corps des cellules photoréceptrices et l’autre contenant la rétine interne restante. Contrairement aux coupes verticales de rétine, la préparation de la rétine fendue ne coupe pas les processus dendritiques des neurones rétiniens internes, ce qui permet d’enregistrer des cellules bipolaires et horizontales qui intègrent les contributions des réseaux couplés aux jonctions lacunaires et des cellules amacrines à champ large. Ce travail démontre la polyvalence de cette préparation pour l’étude des cellules horizontales et bipolaires dans des expériences d’électrophysiologie, d’immunohistochimie et d’hybridation in situ .
Introduction
La rétine est un mince tissu neural situé dans l’œil postérieur où la lumière est interceptée et transformée en un signal électrochimique qui peut être interprété par le cerveau. À l’arrière de la rétine, les photorécepteurs des bâtonnets et des cônes sont stimulés par la lumière, ce qui réduit le taux de libération tonique du neurotransmetteur, le glutamate1. Les premiers neurones à ressentir et à répondre à ce changement de concentration de glutamate induit par la lumière sont les cellules bipolaires (BC) et les cellules horizontales (HC), dont les somas résident dans la région la plus externe de la couche nucléaire interne (INL). Ces neurones de second ordre effectuent la première étape du traitement du signal dans la rétine et façonnent les caractéristiques critiques de la vision telles que l’adaptation à la lumière, la sensibilité au contraste et l’opposition spatiale/couleur2. Bien que ces fonctions aient été attribuées aux BC et aux HC, les circuits et les mécanismes biochimiques sous-jacents à ces processus ne sont pas entièrement compris3. Par conséquent, l’avancement des outils et des méthodes d’exploration de la physiologie de la Colombie-Britannique et de la Santé Canada est d’une importance capitale.
Les coupes verticales (transversales) de la rétine se sont longtemps avérées être le modèle le plus pratique pour étudier les BC et les HC ; cependant, certains aspects de la physiologie de la BC et de la HC sont inaccessibles à l’expérimentateur dans le cadre de ce modèle. Les enregistrements directs des HC ou les mesures indirectes de leurs effets sur les BC ne reflètent pas la connectivité endogène de la rétine puisque les processus latéraux de ces cellules sont sectionnés lors du tincage. Les préparations pour la rétine monture entière contournent ce problème en préservant ces processus latéraux, mais les couches rétiniennes environnantes posent un défi pour accéder à ces cellules4. Bien qu’il existe de nombreux exemples d’immunomarquage 5,6,7,8 et d’enregistrements de patch clamp9 à partir de neurones INL dans des rétines entières, il est possible d’accélérer et de simplifier la collecte de ces données. Les limites inhérentes aux sections transversales et les défis de l’ensemble du modèle de montage ont donc inspiré le développement de cette préparation alternative de la rétine à montage plat.
Les travaux suivants décrivent un protocole permettant de retirer facilement la couche de photorécepteurs des rétines vivantes à montage plat afin d’améliorer l’accès aux BC et aux HC pour un clampage patch simplifié et un immunomarquage plus rapide et plus efficace. Le décollement de deux morceaux de membrane nitrocellulosique attachés de chaque côté d’une rétine isolée déchire le tissu à travers les axones photorécepteurs, laissant une rétine fendue qui retient la couche plexiforme externe (OPL) et toutes les couches rétiniennes internes. Alors que d’autres ont décrit des protocoles pour séparer mécaniquement les couches de la rétine, ces méthodes sont soit mal adaptées aux applications de patch clamping et de microscopie, soit nécessitent une manipulation fastidieuse du tissu. Plusieurs de ces méthodes nécessitent des tissus congelés ou lyophilisés pour la séparation des couches, ce qui les rend incompatibles avec les expériences d’électrophysiologie10,11,12. D’autres sont conçus pour les tissus vivants, mais nécessitent 5 à 15 peelings séquentiels avec du papier filtre 4,11 ou un traitement à la trypsine 13 pour éliminer les photorécepteurs. La technique décrite ici améliore ses prédécesseurs en simplifiant la procédure d’élimination des photorécepteurs et en élargissant le répertoire des applications en aval.
Protocol
Les souris ont reçu de l’eau et de la nourriture à volonté et ont été maintenues sur un cycle lumière/obscurité de 12 h. Les souris ont été euthanasiées par exposition à l’isoflurane suivie d’une luxation cervicale. Toutes les procédures pour les animaux étaient conformes aux directives des National Institutes of Health et approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Oregon Health and Science University.
REMARQUE : L’énucléation de l’œil, la dissection de la rétine et la division de la rétine doivent être effectuées le plus rapidement possible pour préserver la santé des tissus vivants. Essayez de terminer la dissection en < 4 minutes par œil. Ces trois étapes doivent être effectuées de manière séquentielle. Souris de type sauvage : Des souris C57BL/6J mâles et femelles adultes (>3 mois) ont été utilisées pour des expériences. Pour la morphologie des synapses, des souris exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) sous le promoteur Pcp2 (Pcp2-cre/GFP)14 ont été utilisées. Souris transgéniques : Pour la visualisation horizontale des cellules avec la GFP lors d’expériences d’immunohistochimie ou d’électrophysiologie, une souris triplement transgénique a été utilisée : vGATFLPo ; vGlut2Cre ; Ai80d. Les souches vGATFlpo et vGluT2Cre sont des souris knock-in exprimant la Flpo ou la Cre recombinase en aval de leurs promoteurs respectifs. La souris Ai80d est une souris rapporteure intersectionnelle (CatCh/EYFP) etn’exprimera que la rhodopsine (ChR2) dans les cellules exprimant les recombinases Cre et Flpo. Ainsi, la souris triple transgénique n’exprime ChR2 que dans les cellules ayant des antécédents d’expression à la fois de VGAT et de vGluT2.
1. Préparation des matériaux pour la dissection de la rétine et le fractionnement de la rétine
- Préparer des morceaux de membrane nitrocellulosique
REMARQUE : Le détachement de la rétine fendue de la membrane nitrocellulosique réduit la fluorescence de fond en microscopie et simplifie l’enregistrement par patch clamp. L’ablation de la membrane peut être effectuée avant ou après la fixation des tissus. Pour les rétines fendues fixes, il n’est pas nécessaire de traiter les morceaux de membrane nitrocellulosique. Pour les rétines fendues vivantes, traitez la membrane selon les étapes 1.1.3 à 1.1.5 pour faciliter le détachement en douceur du tissu.- Coupez 16 morceaux (ou plus) de membrane nitrocellulosique en carrés de 5 mm x 5 mm. Extra peut être préparé en vrac et stocké pour une utilisation future.
- Mettez de côté la moitié des morceaux de membrane pour une utilisation ultérieure. Ces pièces ne seront pas traitées avec une solution de blocage.
- Incuber les morceaux restants dans une solution de blocage IHC sans détergent (comme 3 % de sérum de cheval + 0,025 % de NaN3 dilué dans du PBS) pendant 10 minutes à température ambiante, en agitant doucement.
ATTENTION : Utilisez un EPI approprié lorsque vous manipulez du NaN3, car il s’agit d’une toxine puissante. - Lavez soigneusement les morceaux de membrane par incubation dans un milieu Ames tamponné au bicarbonate pendant 10 minutes à température ambiante, en agitant doucement.
- Séchez complètement à l’air libre les morceaux de membrane bloqués (~20 min). Étiquetez et conservez les morceaux de membrane à température ambiante, en les séparant des morceaux de membrane non traités.
- Préparer les médias Ames
- Préparer le milieu Ames tamponné au bicarbonate et maintenir la solution à température ambiante sous carbogenation constante (95 % d’O2 et 5 % de CO2).
2. Énucléation de l’œil de souris
- Euthanasier la souris par n’importe quelle méthode disponible conformément aux directives de l’IACUC de l’établissement.
- Retournez la souris d’un côté et appuyez doucement avec deux doigts autour de l’orbite. Cela provoquera le gonflement de l’œil du crâne.
- À l’aide de ciseaux de dissection incurvés, coupez sous l’œil bombé pour sectionner le nerf optique et séparer l’œil du crâne.
- Prélevez l’œil avec des ciseaux et placez-le dans une boîte de Pétri remplie de milieux Ames glacés.
REMARQUE : Pour les applications en aval dans lesquelles le tissu sera fixé après la fente, le PBS glacé peut être utilisé à la place du milieu Ames. - Répétez les étapes 2.1 à 2.4 pour l’œil restant.
3. Dissection de la rétine
- Utilisez la pipette de transfert en verre personnalisée pour transférer un œil sur une nouvelle boîte de Pétri contenant des milieux Ames frais et glacés.
REMARQUE : La large ouverture de la pipette de transfert personnalisée empêche l’écrasement accidentel du tissu et l’utilisation de verre minimise l’adhérence du tissu aux parois de la pipette. Cependant, une pipette de transfert en plastique à large ouverture est également acceptable si l’expérimentateur est déjà compétent dans l’utilisation de cet outil. - Utilisez une pince pour stabiliser l’œil en épinglant son tissu conjonctif supplémentaire au fond de la boîte de Pétri. Ensuite, percez l’œil le long de la ligne ora serrata à l’aide d’une aiguille 25G pour créer un point d’entrée pour les ciseaux Vannas.
- À l’aide de ciseaux Vannas, coupez le long de la ligne de l’ora serrata jusqu’à ce que la cornée se détache du reste de l’œil (figure supplémentaire 1A). Retirez la lentille de l’œilleton à l’aide d’une pince (Figure 1B supplémentaire).
- Utilisez la pipette en verre personnalisée pour transférer l’œilleton sur un grand volume (≥100 ml) d’Ames carbogené et répétez les étapes 3.1 à 3.3 avec l’œil restant.
REMARQUE : Les œilletons sont placés dans des Ames carbogenés pour maintenir la santé des tissus pendant que la dissection est effectuée sur l’autre œil. - Transférez un œilleton dans une boîte de Pétri remplie d’Ames fraîchement carbogenés.
- À l’aide de ciseaux de Vannas, faites une petite cisaille vers l’intérieur à partir du bord de la sclérotique, puis utilisez deux paires de pinces pour éloigner la sclérotique de la rétine (figure supplémentaire 1C). Évitez de saisir la rétine avec la pince. Au lieu de cela, séparez les lambeaux de la sclérotique créés par la ciseau ciseau.
- Utilisez les ciseaux de Vannas pour couper le nerf optique reliant la sclérotique et la rétine (figure supplémentaire 1D), puis soulevez doucement la rétine de la sclérotique à l’aide des ciseaux ou de la pince pour isoler la rétine. (Figure 1A).
REMARQUE : Bien que l’EPR reste généralement attaché à l’œilleton, aucune étape supplémentaire n’est requise pour retirer l’EPR dans le cas où il est attaché à la rétine. À ce stade, les bords de la rétine peuvent éventuellement être coupés avec un scalpel pour éviter qu’ils ne s’enroulent pendant l’étape d’aplatissement (Figure 1B). - À l’aide d’un scalpel, coupez la rétine en deux ou en quatre (figure 1C), puis utilisez la pipette de transfert personnalisée pour remettre les morceaux dans un grand volume (≥ 100 ml) de milieu Ames carbogène continu.
REMARQUE : Le choix des moitiés ou des quarts est subjectif. Choisissez la meilleure option pour l’application souhaitée. - Répétez les étapes 3.5 à 3.8 pour l’œil restant avant de procéder à la division de la rétine.
4. Séparation de la rétine
- Jetez le milieu Ames des boîtes de Pétri et remplacez-le par du milieu Ames fraîchement carbogé.
REMARQUE : Pour maintenir la carbogenation pendant le reste de la procédure de fendage de la rétine, remplacez le milieu dans la boîte de Pétri par des Ames fraîchement carbogenés environ toutes les 5 minutes. - À l’aide de la pipette de transfert personnalisée, placez un morceau de rétine sur une lame de verre (7,5 cm x 5 cm), côté ganglionnaire vers le haut, puis aplatissez-le en enlevant le liquide environnant à l’aide d’une lingette délicate (Figure 1D). Si nécessaire, tirez doucement sur les bords de la rétine avec un pinceau à pointe fine sous un microscope à dissection.
- À l’aide d’une pince, abaisser un morceau sec de membrane de nitrocellulose de 5 mm x 5 mm sur la rétine, ce qui le fait adhérer au côté des cellules ganglionnaires (figure 1E).
REMARQUE : Si le retrait de la membrane des tissus vivants est nécessaire (c.-à-d. pour l’électrophysiologie), utilisez un morceau sec de membrane traitée au sérum pour cette étape (voir les étapes 1.1.3 à 1.1.5 pour plus de détails). Cela réduit la force de l’adhérence à la couche de cellules ganglionnaires, ce qui facilite l’élimination de la rétine de la nitrocellulose après la scission. - Retournez la rétine de manière à ce que la nitrocellulose repose sur la lame de verre et placez un morceau sec de membrane de 5 mm x 5 mm sur le côté photorécepteur de la rétine (Figure 1F).
- Mettez la pointe mouillée du pinceau en contact avec l’espace entre les deux membranes et laissez l’action capillaire aspirer l’Ames dans le sandwich (Figure 1G). Cela réduit l’adhérence des membranes à la rétine et n’est nécessaire que si la rétine a été trop séchée avec la lingette délicate.
REMARQUE : Si la rétine a perdu son aspect brillant, elle a été trop séchée et l’étape 4.5 est nécessaire. - Pour assurer une adhérence uniforme, appliquez une légère pression vers le bas sur la membrane supérieure à l’aide d’un pinceau humide (figure 1H).
- Tout en épinglant la membrane inférieure au verre avec une paire de pinces, utilisez un mouvement lent et régulier pour décoller doucement la membrane supérieure avec une deuxième paire de pinces. Cela provoquera la division de la rétine juste au-dessus de l’OPL (Figure 1I).
- Jeter la membrane supérieure contenant les photorécepteurs (Figure 1J, à gauche). La membrane inférieure contient la rétine interne, désormais appelée rétine fendue (Figure 1J, à droite).
- Remettez immédiatement la rétine fendue dans le support Ames carbogé.
REMARQUE : Pour les expériences sur des tissus vivants, les rétines peuvent bénéficier d’une période de récupération de 15 à 30 minutes chez les Ames carbogenés après la scission.
Figure 1 : Procédure de division de la rétine. (A) Après l’énucléation et la préparation de l’œilleton dans un milieu froid de PBS ou d’Ames, isoler la rétine de la souris de l’œilleton et remplacer le PBS par un milieu d’Ames carbogé à température ambiante. (B) À l’aide d’un scalpel, coupez les bords de la rétine jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de régions avec une courbure vers l’intérieur (facultatif). (C) Coupez la rétine en quartiers ou en moitiés à l’aide d’un scalpel. (D) Placez un morceau de rétine sur une lame de verre (côté ganglionnaire vers le haut) à l’aide de la pipette de transfert personnalisée et retirez tout l’excédent d’Ames à l’aide d’une lingette délicate. Assurez-vous que la rétine semi-sèche repose à plat sur le verre avant de passer à l’étape suivante. Utilisez la pointe d’un pinceau mouillé par Ames pour déplier doucement les régions de la rétine qui ne sont pas plates. (E) À l’aide d’une pince, placez un morceau prédécoupé de membrane nitrocellulosique sèche (5 mm x 5 mm) sur la rétine aplatie. (F) Retournez le morceau de nitrocellulose de manière à ce que le côté photorécepteur de la rétine soit maintenant orienté vers le haut. Placez ensuite un autre morceau de membrane sèche sur la rétine. (G) Touchez la pointe humide de la brosse à l’espace entre les deux membranes et laissez l’action capillaire aspirer l’Ames dans le sandwich. Cela réduit l’adhérence des membranes à la rétine et n’est nécessaire que si la rétine a été trop séchée avec la lingette délicate. (H) Utilisez la pointe d’un pinceau humide pour appuyer doucement vers le bas sur le centre de la rétine prise en sandwich. (I) Utilisez une paire de pinces pour épingler le morceau inférieur de membrane sur la lame de verre, tout en utilisant une autre paire de pinces pour décoller doucement le morceau supérieur de membrane du bas. (J) La rétine interne (à gauche) reste sur la membrane inférieure tandis que les photorécepteurs (à droite) sont retirés avec la membrane supérieure. Les panels (A), (B), (C), (D) et (J) ont été acquis à l’aide d’un microscope à dissection ; la barre d’échelle représente environ 1 mm ; (E-I) ont été acquis avec l’appareil photo d’un smartphone sans grossissement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
5. Préparation de rétines fendues pour des expériences d’immunofluorescence
REMARQUE : La rétine fendue sera toujours attachée à la membrane de nitrocellulose jusqu’à l’étape 5.5. Effectuez les étapes 5.1, 5.2, 5.3 ou 5.4, pas les quatre, car il s’agit d’expériences différentes.
ATTENTION : Utilisez l’EPI approprié et procédez avec précaution lors de la manipulation du paraformaldéhyde (fixateur).
- Préparation pour l’immunofluorescence à montage plat
- Incuber la rétine fendue dans du paraformaldéhyde à 4 % sur de la glace pendant 30 minutes en utilisant suffisamment de solution pour recouvrir complètement la rétine.
- Lavez les rétines fendues 3 fois dans 5 à 10 ml de PBS à température ambiante. Pause facultative : Les rétines fendues peuvent être laissées dans le PBS à 4 °C jusqu’à 24 h.
- Préparation à l’immunofluorescence avec des coupes verticales de la rétine fendue
- Incuber la rétine fendue dans du paraformaldéhyde à 4 % sur de la glace pendant 30 minutes en utilisant suffisamment de solution pour recouvrir complètement la rétine.
- Lavez les rétines fendues 3 fois dans 5 à 10 ml de PBS à température ambiante. Pause facultative : Les rétines fendues peuvent être laissées dans le PBS à 4 °C jusqu’à 24 h.
- Avec la membrane toujours attachée, immergez séquentiellement la rétine fendue dans 10 %, 20 % et 30 % de saccharose à 4 °C pendant 1 h chacun pour cryoprotéger le tissu.
- Intégrez les rétines fendues cryoprotégées dans un composé à température de coupe optimale (O.C.T.) et conservez-les à -80 °C (jusqu’à 6 mois) jusqu’à la cryosection.
- Retirez les rétines fendues incrustées de -80 °C et utilisez un cryostat pour couper des sections de 20 μm d’épaisseur. Montez les coupes sur des lames de microscope en verre chargées électrostatiquement, laissez-les sécher à l’air libre, puis stockez-les à -20 °C jusqu’à 6 mois.
- Préparation à l’hybridation in situ à double fluorescence et à l’immunohistochimie
- Incuber la rétine fendue dans du paraformaldéhyde à 4 % sur de la glace pendant 2 h en utilisant suffisamment de solution pour recouvrir complètement la rétine.
- Lavez les rétines fendues 3 fois dans 5 à 10 ml de PBS à température ambiante. Pause facultative : Les rétines fendues peuvent être laissées dans le PBS à 4 °C jusqu’à 24 h.
- Préparation à l’électrophysiologie
- Préparez les pipettes patch en tirant des pipettes en verre borosilicaté à paroi épaisse avec du filament à l’aide d’un extracteur de micropipette. N’utilisez que des pipettes dont la résistance mesurée est comprise entre 6 et 10 MΩ.
- Remplir les pipettes tirées avec une solution interne contenant (en mM) : 125 K-gluconate, 8 KCl, 5 HEPES, 1 MgCl 2, 1 CaCl 2,0,2 EGTA, 3 ATP-Mg et 0,5 GTP-Na.
- Retrait de la rétine fendue de la membrane nitrocellulosique
- À l’aide d’un stylo barrière hydrophobe, préparez des puits circulaires sur une lame de microscope (~1 cm de diamètre) et laissez-les sécher à l’air libre pendant 5 à 10 minutes.
- Placez les rétines fendues dans les puits de stylo barrière hydrophobe préparés et ajoutez suffisamment de PBS pour les recouvrir complètement.
- Sous un microscope à dissection, poussez les poils d’un pinceau fin sous les bords du tissu et soulevez-les doucement vers le haut. De cette manière, travaillez autour de la rétine en cercle pour l’éloigner de la membrane.
- Utilisez une pince pour retirer la membrane sous le morceau de rétine flottant.
- Aspirez soigneusement le PBS restant afin que le morceau de rétine repose sur la lame du microscope, ganglion côté cellule vers le bas.
REMARQUE : Les étapes suivantes ne doivent pas être effectuées de manière séquentielle. Choisissez le protocole approprié pour l’application souhaitée (c.-à-d. immunomarquage ou hybridation in situ à double fluorescence [FISH] et immunohistochimie [IHC] ou électrophysiologie).
6. Immunomarquage
- Si ce n’est pas encore fait, utilisez un stylo barrière hydrophobe pour créer des puits circulaires sur une lame de microscope (~1 cm de diamètre) et laissez-les sécher à l’air libre pendant 5 à 10 minutes. Toutes les étapes d’incubation et de lavage seront effectuées dans ces enclos.
- Incuber les rétines fendues ou les coupes verticales de la rétine dans une solution d’incubation d’anticorps (AIS : 3 % de sérum de cheval, 0,5 % de Triton X-100, 0,025 % de NaN3 dans le PBS) pendant 30 min à température ambiante.
- Incuber les rétines fendues ou les coupes verticales de la rétine avec des anticorps primaires dilués dans l’AIS pendant 1 h à température ambiante.
REMARQUE : Le temps d’incubation des anticorps primaires nécessitera une optimisation pour différentes cibles protéiques et anticorps. - Lavez le mouchoir 3x dans du PBS à température ambiante.
- Incuber le tissu avec des anticorps secondaires dilués dans l’AIS pendant 1 h à température ambiante. Lavez le mouchoir 3x dans du PBS à température ambiante.
- Si une coloration nucléaire est souhaitée, incuber le tissu avec du DAPI dilué dans du PBS pendant 30 s à température ambiante. Lavez le mouchoir 1x dans du PBS à température ambiante.
- Appliquez une goutte de support de montage de diapositives sur chaque morceau de tissu et montez une lamelle de protection en verre.
- Appliquez du vernis à ongles sur les bords de la lamelle pour sceller l’échantillon. Conservez la lame à 4 °C.
7. Double FISH et IHC
- Cuire les rétines fendues à 40 °C pendant 30 min dans un four d’hybridation pour augmenter l’adhérence à la lame.
- Complétez le protocole RNAscope FISH selon le protocole du fabricant avec les exceptions et modifications suivantes :
- Aucune étape de prélèvement d’antigène n’est requise. Utilisez la protéase III avec un temps d’incubation de 18 min à température ambiante.
- Effectuez toutes les étapes de lavage sur la lame à l’intérieur des puits réalisés par un stylo barrière hydrophobe.
- Incuber les échantillons dans de l’anticorps primaire dilué (voir tableau des matériaux) dans du PBS pendant 30 min à 40 °C dans l’étuve d’hybridation. Lavez les échantillons 3 fois dans du PBS à température ambiante.
- Incuber les échantillons dans de l’anticorps secondaire dilué (voir tableau des matériaux) dans du PBS pendant 30 min à 40 °C dans l’étuve d’hybridation. Lavez les échantillons 3 fois dans du PBS à température ambiante.
- Incuber les échantillons dans 1x DAPI pendant 30 s à température ambiante. Lavez les échantillons 1x dans du PBS à température ambiante.
- Appliquez une goutte de support de montage anti-décoloration sur chaque morceau de tissu et montez une lamelle en verre.
- Appliquez du vernis à ongles sur les bords de la lamelle pour sceller l’échantillon. Conservez la lame à 4 °C.
8. Électrophysiologie
- Après avoir retiré la membrane de nitrocellulose, transférez une rétine fendue dans la chambre d’enregistrement patch-clamp et ancrez-la doucement en place avec une harpe en platine.
- Tout au long de l’expérience, perfusez en continu la rétine fendue avec une solution d’Ames carbogène contenant 95 % d’O 2 et 5 % de CO2. Maintenir la solution entre 32 et 34 °C.
REMARQUE : Au cours de l’expérience, le tissu peut être visualisé à l’aide de la microscopie à contraste de gradient Dodt. - Sous l’éclairage de la pièce, effectuez un serrage de tension de la cellule entière pour enregistrer à partir des neurones INL.
- Pendant l’enregistrement, simulez les réponses lumineuses à l’aide d’une unité d’injection microcellulaire pour appliquer des composés pharmaceutiques, ou d’une LED de 470 nm pour stimuler la channelrhodopsine (ChR2).
REMARQUE : L’intensité lumineuse peut être mesurée à l’aide d’un wattmètre optique numérique.
- Pendant l’enregistrement, simulez les réponses lumineuses à l’aide d’une unité d’injection microcellulaire pour appliquer des composés pharmaceutiques, ou d’une LED de 470 nm pour stimuler la channelrhodopsine (ChR2).
9. Microscopie confocale
- Pour l’immunofluorescence confocale, prenez des images avec un microscope confocal à l’aide d’un objectif à immersion dans l’huile 40x/1,3 ou 63x/1,40. Utilisez FIJI pour régler la luminosité et le contraste et pour générer des projections Z à partir de piles d’images.
Representative Results
La division de la rétine préserve les terminaisons photoréceptrices
Pour confirmer que la division de la rétine n’endommage pas les dendrites des neurones de second ordre dans l’OPL, des coupes verticales de rétines divisées ont été colorées avec des anticorps dirigés contre la protéine synaptique de la vésicule synaptique synaptophysine (vert) et la protéine kinase C alpha (PKCα ; rouge). La bande intense de marquage de la synaptophysine sur le dessus de la rétine divisée indique que les terminaisons synaptiques des photorécepteurs sont conservées (Figure 2). De plus, la coloration PKCα révèle une morphologie normale des cellules bipolaires en bâtonnets (GR). Aucun noyau de photorécepteur n’est visible, ce qui indique que la rétine est divisée entre l’OPL et la rangée la plus interne de cellules photoréceptrices (Figure 2).
Figure 2 : Les rétines divisées conservent les terminaisons des photorécepteurs. Micrographies confocales fluorescentes montrant une coupe transversale verticale d’une rétine de crachat cryosectionnée (20 μm d’épaisseur) après la procédure de fractionnement. Chaque image est une projection maximale d’une pile z confocale. La section a été immunomarquée avec des anticorps dirigés contre PKCα (en haut au centre) et la synaptophysine (en haut à droite) pour visualiser les globules rouges et les vésicules synaptiques, respectivement. L’image fusionnée (en bas) montre des vésicules synaptiques (en vert), qui résident dans les terminaisons des photorécepteurs, juste au-dessus des processus apicaux des globules rouges (en rouge) dans l’OPL. Les noyaux cellulaires sont marqués avec DAPI (bleu). Aucun noyau de photorécepteurs n’est visible dans l’ONL. Abréviations : ONL = couche nucléaire externe ; OPL = couche plexiforme externe ; INL = couche nucléaire interne ; IPL = couche plexiforme interne ; GC = cellules ganglionnaires. Barres d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
La morphologie de la synapse dans l’OPL est préservée après la division de la rétine
À l’aide d’une souris qui exprime la GFP dans les globules rouges sous le promoteur pcp2 14, les protéines pré- et post-synaptiques de l’OPL ont été immunomarquées pour évaluer l’intégrité de cette couche synaptique après une division14. Malgré les forces de cisaillement qui se produisent à travers les axones des photorécepteurs, la division ne perturbe pas la morphologie des synapses photorécepteurs-BC dans l’OPL, car le positionnement normal des dendrites des globules rouges, marquées pour RGS11, et des rubans synaptiques photorécepteurs, marqués pour CtBP215 est observé (Figure 3). Pour chaque contact synaptique entre les bâtonnets et les globules rouges, RGS11 peut être vu comme une ponctuation rouge qui se trouve dans la forme en fer à cheval des rubans synaptiques (vert). Dans une expérience subséquente, un anticorps anti-GPR179 16 a été utilisé pour marquer les extrémités dendritiques post-synaptiques ON-BC16, et un anticorps anti-PSD-95 a été utilisé pour marquer les terminaisons photoréceptrices pré-synaptiques des bâtonnets (Figure supplémentaire 2). Ces résultats confirment une fois de plus la stabilité de l’OPL dans la préparation de la rétine divisée, car il a été démontré que les dendrites de globules rouges s’associent étroitement à leur partenaire pré-synaptique, les terminaisons en bâtonnets.
Figure 3 : La morphologie de la synapse dans l’OPL est préservée après la division de la rétine. Images d’immunofluorescence confocale d’une rétine fendue d’une souris transgénique exprimant la GFP dans les globules rouges sous le promoteur Pcp2. Les niveaux d’expression de la GFP (en bleu) varient d’un globule rouge à l’autre dans la rétine. Après la scission, la rétine a été fixée, puis incubée avec des anticorps dirigés contre CtBP2 (vert) et RGS11 (rouge) pour marquer les rubans synaptiques des photorécepteurs et les extrémités dendritiques ON-BC, respectivement. Chaque paire rouge-vert représente un contact synaptique entre une tige et un ON-BC. Barres d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Le fractionnement de la rétine maintient la viabilité des globules rouges
Pour évaluer la viabilité des neurones rétiniens internes après une scission, un colorant nucléaire imperméable à la membrane et proche infrarouge (MI-NIR) a été utilisé, ce qui permet d’identifier les cellules mortes. Après incubation avec MI-NIR, les rétines divisées ont été fixées, puis marquées avec des anti-PKCα pour identifier les globules rouges. Les micrographies confococaux de la rétine divisée révèlent une variabilité régionale de la viabilité cellulaire à travers le tissu, certaines régions connaissant des taux de mort cellulaire plus élevés que d’autres. Cette variabilité peut résulter de dommages infligés à certaines régions de la rétine lors des procédures de dissection, de fendillement ou de manipulation (Figure 4). Étant donné que les corps cellulaires des globules rouges résident dans la région la plus externe de l’INL, près du site de la scission, une évaluation minutieuse de leur viabilité était justifiée. La faible colocalisation de PKCα et de MI-NIR a confirmé que la plupart des globules rouges restent viables après la division de la rétine (Figure 4).
Figure 4 : Les cellules bipolaires en bâtonnets sont viables après la division de la rétine. Micrographies confocales fluorescentes montrant une région d’une rétine fendue dans une perspective à montage plat. Après la scission, la rétine vivante a été incubée avec un colorant MI-NIR (rouge) pendant 30 min à 37 °C. La rétine a ensuite été fixée et immunomarquée avec des anticorps contre PKCα pour visualiser les globules rouges. Dans cette région de la rétine, la colocalisation de PKCα et de MI-NIR est peu fréquente. Le MI-NIR colocalise avec des noyaux (bleus) qui n’appartiennent pas aux globules rouges. Abréviations : MI-NIR = coloration vivante/morte imperméable à la membrane. Barres d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Les rétines fendues se prêtent à la double FISH et à l’IHC
En prolongeant le temps de fixation de l’IHC standard, les rétines divisées peuvent être traitées séquentiellement par FISH et IHC pour marquer simultanément les ARNm et les protéines17,18. Des expériences ont confirmé qu’une fixation de 2 h dans du paraformaldéhyde à 4 % permet un marquage robuste de l’ARNm tout en préservant les épitopes des protéines pour la liaison aux anticorps. La FISH a été réalisée sur des rétines divisées suivies d’une IHC pour visualiser l’expression de la sous-unité δ du récepteur GABAA (GABRD ; sondes d’ARNm anti-sens) en relation avec la position des globules rouges (anticorps anti-PKCα) dans l’INL externe (Figure 5A). L’expression de l’ARNm du GABRD semble rare dans les globules rouges (Figure 5A) ; cependant, le transcrit est abondamment exprimé par les cellules amacrines et les cellules ganglionnaires, comme en témoigne le motif de marquage sur les coupes transversales d’une rétine intacte (Figure 5B). Dans l’INL externe (Figure 5A), l’ARNm GABRD est réparti plus uniformément que dans l’INL interne (Figure 5C) où il est concentré dans des cellules distinctes. Les sondes antisens ciblant d’autres sous-unités du récepteur GABA produisent des motifs de marquage distincts, démontrant la spécificité des sondes (données non présentées).
Figure 5 : Double FISH et IHC dans une rétine fendue et une rétine intacte. (A, C) Micrographies confocales d’une rétine fendue à montage plat et (B) une coupe verticale d’une rétine intacte. Les images en (A) et (C) sont des projections maximales des coupes optiques dans les régions supérieure et inférieure de l’INL respectivement. Les rectangles en pointillés en (B) représentent les limites approximatives utilisées pour créer les projections indiquées en (A) et (C). La rétine fendue (A, C) a été fixée pendant 2 h, puis marquée avec des sondes d’ARNm antisens contre GABRD (rouge). Par la suite, la rétine fendue a été colorée avec des anticorps dirigés contre PKCα pour marquer les globules rouges (en vert). Le canal PKCα a été omis des projections de l’INL inférieur pour plus de clarté. La rétine intacte en (B) a été fixée pendant 24 h avant la section. Par la suite, la rétine fixe a été marquée avec des sondes d’ARNm antisens contre GABRD (rouge). Tous les échantillons ont été colorés au DAPI (bleu) pendant 20 s avant le montage de la lamelle. Abréviations : INL = couche nucléaire interne. Barres d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Les rétines divisées sont bien adaptées à l’enregistrement électrophysiologique patch-clamp des BC et HC
Pour patcher un soma BC ou HC dans une rétine traditionnelle à montage complet, la pipette doit s’approcher soit du côté des cellules ganglionnaires, soit du côté des photorécepteurs. Les deux approches nécessitent de traverser plusieurs couches rétiniennes pour atteindre l’INL, au cours de laquelle la pointe de la pipette est souvent obstruée par des débris. Dans une préparation de coupes de vibratome, les somas BC et HC sont facilement accessibles, mais leurs processus dendritiques peuvent être sectionnés, perturbant leurs connexions latérales. Dans les rétines divisées, cependant, les corps cellulaires des globules rouges et des HC se trouvent à la surface du tissu, ce qui améliore considérablement l’accès aux pipettes de patch tout en préservant les circuits latéraux de l’OPL.
La figure 6 montre les réponses lumineuses simulées chimiquement enregistrées à partir de BC dans une rétine divisée. Le milieu d’Ames perfusé a été complété par du L-AP4 (4 μM), un agoniste mGluR du groupe III, pour simuler la libération de glutamate par les photorécepteurs dans l’obscurité. L’antagoniste de mGluR6, CPPG (600 μM, dans Ames), a été soufflé sur les dendrites de la cellule patchée (maintenue à -60 mV) pour simuler un flash lumineux via inhibition de mGluR6. Les cellules ont réagi aux bouffées de CPPG avec deux types de courants entrants. L’un d’eux montre un courant transitoire suivi d’un plateau (Figure 6A), similaire aux courants canoniques évoqués par la lumière enregistrés à partir des globules rouges dans les tranches rétiniennes19. L’autre type reste maintenu pendant toute la durée de la bouffée (Figure 6B), ressemblant aux courants enregistrés par les cellules bipolaires à cône ON (ON-CBC)19.
Une expérience distincte a été réalisée pour cibler les HCs, un type de cellule avec un large champ dendritique qui est souvent difficile à conserver dans les préparations de tranches. Une lignée de souris exprimant la rhodopsine canale (ChR2) et la GFP dans les HC a été utilisée pour faciliter l’identification au microscope à fluorescence. Tout d’abord, les courants des HC ont été enregistrés en réponse à une série d’étapes de dépolarisation (-100 mV à 50 mV, taille de pas = 15 mV) auxquelles ils ont répondu par des courants entrants suivis de courants sortants (Figure 6C). Ces cellules ont ensuite été stimulées par une brève impulsion de lumière bleue (200 ms, 470 nm) produisant de grands courants entrants entraînés par ChR2 dans deux cellules (Figure 6D).
Figure 6 : Enregistrements par patch clamp à partir de neurones INL dans des rétines divisées. (A) Un globule rouge putatif et (B) un CBC ont été fixés en tension à -60 mV dans un milieu Ames perfusé contenant du L-AP4 (4 μM). L’inhalation de CPPG (600 μM) sur les dendrites des cellules serrées a provoqué un courant entrant qui était transitoire dans les globules rouges mais soutenu dans le CBC. L’enregistrement des globules rouges en (A) est une seule trace tandis que l’enregistrement des CBC en (B) représente la moyenne de 3 traces. (C) Un enregistrement de pince de raccordement à partir d’un HC dans un vGATFLPo ; vGlut2Cre ; Souris Ai80d. La ligne rouge indique la durée d’une impulsion lumineuse de 200 ms, 470 nm, utilisée pour invoquer le grand courant entrant à travers ChR2. (D) Réponses de courant injecté à partir d’un HC dont la tension a été serrée à -60 mV, puis passée de -70 mV à +35 mV à des intervalles de 15 mV et est revenue à -60 mV. L’encart montre les mêmes traces dans une fenêtre de 6 ms entourant le début de l’étape de tension. (E) Micrographie immunofluorescente d’une rétine fendue à montage plat montrant des cellules horizontales exprimant la GFP dans un vGATFLPo ; vGlut2Cre ; Souris Ai80d. Barre d’échelle = 20 μm. Les données d’électrophysiologie ont été recueillies à une fréquence d’échantillonnage de 20 kHz et filtrées à l’aide d’un filtre de Bessel passe-bas à 5 kHz. Les données ont ensuite été exportées, et la visualisation et l’analyse hors ligne ont été effectuées à l’aide de Python 3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Le dédoublement de la rétine permet une interrogation rapide de l’anatomie de l’INL et de l’OPL
La membrane limitante externe (ELM) et l’ONL de la rétine constituent une barrière de ~90 μm d’épaisseur, ce qui empêche la diffusion des anticorps dans la rétine interne et crée des conditions d’immunomarquage sous-optimales20,21,22. Par conséquent, l’immunomarquage des cibles dans l’OPL ou l’INL à l’aide d’une rétine à montage plat conventionnel nécessite des protocoles de coloration longs qui nécessitent souvent des incubations d’anticorpsde 48 à 96 h 5,6,7,8,20,22.
L’élimination des photorécepteurs permet une pénétration rapide des anticorps dans les neurones internes de la rétine. En conséquence, le marquage des cibles protéiques de la rétine interne peut être réalisé en aussi peu que 1 h avec l’utilisation d’anticorps primaires conjugués à un colorant. Des anticorps dirigés contre PKCα et Calbindin-D ont été utilisés pour marquer respectivement les globules rouges et les HC de l’INL (Figure 7). Contrairement aux coupes verticales traditionnelles de la rétine qui tronquent les processus latéraux des neurones à grand champ, la préparation de la rétine divisée permet de visualiser l’arbre dendritique complet des cellules à champ large telles que les HC (Figure 6E, Figure 7).
Figure 7 : Immunomarquage rapide des protéines internes de la rétine dans une rétine divisée. Images d’immunofluorescence confocale d’une rétine fendue d’un point de vue plat. La rétine fendue a été incubée avec des anticorps dirigés contre PKCα (jaune) et Calbindin-D (vert) pendant 1 h à température ambiante pour marquer respectivement les ON-BC et les HC. (A) Chaque image à canal unique est une projection Z moyenne composée de quatre sections optiques : DAPI, Moyenne z10-13 ; Calbindin-D, Moyenne z11-14 ; PKCα, Moyenne z11-14. (B) Dans l’image fusionnée, les mêmes projections sont superposées. Barres d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : Étapes clés de la dissection de la rétine. Toutes les images ont été prises à l’aide d’un appareil photo de smartphone monté sur les lentilles oculaires d’un microscope à dissection. (A) Image de haut en bas d’un œil de souris après l’ablation de la cornée. (B) Une image de haut en bas de l’œilleton de la souris après le retrait de la lentille. (C) Une petite incision est pratiquée dans la sclérotique sur l’œilleton de la souris. Les flèches indiquent les deux lambeaux de la sclérotique qui sont tirés dans des directions opposées par des forceps pour commencer à séparer la rétine de la sclère. (D) Une fois que la sclérotique a été partiellement retirée de la rétine, des ciseaux de Vannas sont insérés entre la sclérotique et la rétine, et le nerf optique est sectionné, libérant la rétine. Le cercle pointillé rouge montre la tête du nerf optique, et les ciseaux montrent la trajectoire de coupe correcte (insérer des ciseaux entre la sclérotique et la rétine). La rétine isolée après la sclérotique est arrachée. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 2 : Caractérisation des composantes pré- et post-synaptiques de l’OPL dans la rétine divisée. Images d’immunofluorescence confocale de l’OPL dans une rétine divisée. La rétine fendue a été incubée avec des anticorps contre GPR179 et PSD95 pendant 1 h à température ambiante pour marquer les extrémités dendritiques des ON-BC et les terminaisons des photorécepteurs en bâtonnets, respectivement. Les images de gauche et du centre sont des projections maximales de plusieurs coupes optiques ; Les mêmes projections sont superposées dans l’image la plus à droite. On a observé que GPR179 puncta dans les extrémités dendritiques de l’ON-BC s’associe étroitement aux terminaisons photoréceptrices des bâtonnets, démontrant des contacts synaptiques intacts au sein de l’OPL. Barres d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 3 : Dépannage : évaluation de la qualité d’une rétine fractionnée. Micrographies fluorescentes d’une rétine fendue colorée au DAPI pour visualiser les noyaux cellulaires. Les cellules peuvent être identifiées en fonction du diamètre et de la profondeur tissulaire du noyau. (A) Les noyaux photorécepteurs sont plus petits, plus brillants et plus superficiels, tandis que (B) les noyaux BC sont plus gros, plus faibles et plus profonds. (C) Une image à faible grossissement d’une région où les photorécepteurs ont été incomplètement éliminés. Les noyaux qui apparaissent au point proviennent de BC, qui sont plus profonds que les noyaux photorécepteurs sur les bords de l’image qui apparaissent flous. Barres d’échelle pour (A) et (B) = 20 μm. Barre d’échelle pour (C) = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
Une fois que les photorécepteurs ont transduit l’absorption des photons en libération de neurotransmetteurs, les BC et les HC sont les premiers neurones rétiniens à traiter le signal visuel23. Bien que l’importance de ces neurones soit bien appréciée, bon nombre de leurs fonctions sont incomplètement comprises ou inexplorées. De nombreuses études de physiologie de la Colombie-Britannique et de la Santé bénéficieraient probablement d’une préparation de rétine à montage plat qui améliore l’accès aux neurones INL tout en préservant la connectivité latérale. Le développement de la méthode de la rétine divisée représente un effort pour fournir un protocole facile pour l’acquisition d’enregistrements électrophysiologiques de haute qualité et de données microscopiques à partir de BC et de HC dans une orientation plate. La préparation de la rétine fendue décrite ici peut être réalisée en environ 20 minutes par souris (10 minutes par rétine) après l’isolement de la rétine, sans l’utilisation d’un équipement spécialisé. La méthode s’inspire des procédures existantes d’élimination des photorécepteurs, mais offre des améliorations significatives en termes de simplicité, de rapidité et de polyvalence 4,10,11,12,13. Contrairement aux méthodes précédentes de séparation des couches rétiniennes, le fractionnement de la rétine ne nécessite pas de congélation, de lyophilisation ou d’application répétée d’adhésifs sur la rétine. Avec de la pratique, presque tous les photorécepteurs peuvent être retirés en une seule déchirure avec la membrane nitrocellulosique. La rapidité et la facilité de cette approche permettent de minimiser le temps que la rétine passe hors d’Ames carbogené, ce qui permet une viabilité cellulaire élevée pendant de longues périodes ; Les rétines fendues peuvent être maintenues dans un milieu d’Ames carbogé pendant plusieurs heures après la fente. Pour témoigner de la santé des neurones INL dans cette préparation, une coloration des cellules vivantes/mortes (Figure 4) et une électrophysiologie patch-clamp (Figure 6) confirment la viabilité des globules rouges et des HC après une scission.
L’élimination de la couche de photorécepteurs dans les rétines divisées présente un avantage significatif lors de l’immunomarquage en réduisant considérablement le temps de diffusion des anticorps dans l’INL. Le marquage des anticorps primaires et secondaires peut être réalisé en 2 heures, ce qui constitue une amélioration substantielle par rapport à la coloration conventionnelle à montage plat qui peut prendre 72 heures ou plus selon la cible 5,6,7,8,20,22. En conséquence, les données microscopiques peuvent être acquises le même jour que la préparation des tissus, ce qui accélère considérablement le rythme des expériences d’immunofluorescence. Pour faciliter le recuit de la sonde d’ARNm, les expériences FISH recommandent généralement des temps de fixation beaucoup plus longs (~24 h) que l’immunomarquage18. Cependant, les expériences présentées ici démontrent qu’une fixation de 2 h produit tout de même un marquage FISH exceptionnel (Figure 5). Malgré l’allongement du temps de fixation de 30 min à 2 h, il n’a pas été nécessaire d’effectuer des étapes de récupération de l’antigène pour obtenir un excellent immunomarquage, mais cela peut varier en fonction de l’anticorps ou de l’antigène. Le traitement par protéase dans le protocole FISH peut interférer avec le marquage des anticorps, probablement en raison de la destruction des épitopes cibles. Ce problème a été contourné en utilisant des anticorps polyclonaux qui ciblent plusieurs épitopes, ce qui réduit la probabilité que la destruction des épitopes entrave l’immunomarquage. De plus, un traitement par protéase modérée (protéase ACD III) a été utilisé pour prévenir l’altération excessive de l’épitope tout en assurant une pénétration tissulaire suffisante.
Parfois, la rétine se divise à travers la couche nucléaire externe (ONL), laissant derrière elle des couches de somas photorécepteurs sans cellules INL visibles. Pour éviter cela, il faut s’assurer que la rétine repose complètement à plat sur le verre et que tout liquide résiduel autour de la rétine a été éliminé. Le fait d’appuyer plus fermement sur la nitrocellulose avec le pinceau peut également aider à prévenir le fendillement de l’ONL. Si la membrane devient trop humide ou si la rétine est repliée sur elle-même, les chances d’une fente réussie seront considérablement réduites. L’utilisation de DAPI pour colorer les noyaux cellulaires est utile pour évaluer la qualité de la scission et pour déterminer la couverture des photorécepteurs restants. Les noyaux photorécepteurs sont plus petits, plus brillants et plus superficiels (figure 3A supplémentaire), tandis que les noyaux BC sont plus gros, plus faibles et plus profonds (figure 3B supplémentaire). Dans certains cas, le plan de la déchirure varie légèrement sur le morceau de rétine, ce qui entraîne des plaques où les corps cellulaires des photorécepteurs n’ont pas été complètement enlevés (Figure 3C supplémentaire). Pour les applications en microscopie et en électrophysiologie, cela n’empêche pas la capacité de collecter des données de qualité dans les régions où les photorécepteurs ont été correctement éliminés ; De grands champs de rétine interne exposée peuvent facilement être détectés lors de l’imagerie ou de l’enregistrement avec une pipette patch. Si une élimination plus complète des photorécepteurs est souhaitée, une deuxième déchirure peut être effectuée avec un morceau supplémentaire de membrane nitrocellulosique, bien que l’élimination à 100 % des photorécepteurs ne soit pas garantie. La prudence est donc recommandée lors de l’utilisation de rétines divisées dans l’expression des gènes ou les études protéomiques où le matériel photorécepteur résiduel pourrait influencer les résultats. Pour les applications unicellulaires, cette préoccupation n’est pas justifiée, car les données des photorécepteurs peuvent être exclues de l’analyse.
Les avantages de la préparation de la rétine fendue sont peut-être les plus saillants dans les enregistrements électrophysiologiques d’interneurones à grand champ. Alors que les coupes verticales traditionnelles coupent les processus étendus des cellules à champ large, la préparation de la rétine divisée laisse l’OPL et l’IPL intacts, ce qui permet de capturer l’entrée des cellules à champ large telles que HCs 24, A17s25, TH ACs 26 et NOS-1 ACs27 qui seraient autrement négligées dans les coupes verticales. Par conséquent, l’interprétation des résultats et la comparaison avec les données antérieures recueillies à partir de coupes rétiniennes nécessitent une réflexion approfondie. Néanmoins, dans les expériences utilisant des imitations pharmacologiques de la stimulation lumineuse, ces résultats ressemblent aux données enregistrées à partir de coupes rétiniennes19. En exprimant ChR2 sous des promoteurs spécifiques à la cellule, on peut stimuler une population cellulaire souhaitée tout en enregistrant à partir de BC dans l’INL pour étudier l’impact de la cellule souhaitée sur la voie d’information verticale. L’enregistrement direct à partir de neurones INL plus profonds, tels que les cellules amacrines, est également possible dans la rétine divisée. Alors que dans ce cas, l’électrode de patch doit d’abord traverser les neurones INL plus superficiels, il y a beaucoup moins de tissu obstruant son chemin par rapport à une préparation traditionnelle de montage complet.
En plus de mesurer l’influence des cellules à grand champ sur d’autres neurones, cette méthode permet le clamping direct de patchs unicellulaires à partir de HCs, dont les dendrites forment un vaste réseau couplé à la jonction lacunaire dans l’OPL28. Les cellules horizontales envoient une rétroaction critique aux photorécepteurs qui façonnent la transmission de l’information verticale à travers la rétine. Cependant, comme les champs dendritiques des HC sont tronqués en tranches verticales, les données d’enregistrement de cellules uniques font défaut. Ce travail présente des HC anatomiquement et physiologiquement intacts à partir desquels des courants évoqués par ChR2 sont enregistrés dans une triple lignée de souris transgéniques (Figure 6 C-E). En dehors de la stimulation ChR2, la rétine fendue peut être utilisée pour étudier les courants HC endogènes et le couplage de jonction lacunaire28. Alors que la rétine divisée fournit un modèle pratique pour étudier la connectivité synaptique et l’activité neuronale induite par l’application chimique ou la stimulation de ChR2, l’absence de photorécepteurs exclut toute exploration directe des réponses naturelles à la lumière ou des mécanismes d’adaptation à la lumière.
L’imagerie in situ de la rétine a fait des progrès admirables ces dernières années. Cependant, la majorité des études d’imagerie sont limitées à la couche de cellules ganglionnaires dans les préparations de rétine à monture entière29. Les auteurs envisagent que l’absence de photorécepteurs dans la rétine divisée en fera un modèle idéal pour l’imagerie du calcium en direct dans l’OPL et l’INL. Au-delà de l’imagerie calcique, ce modèle a un grand potentiel d’utilisation avec des biocapteurs génétiquement codés tels que iGluSnFR 30,31, iGABASnFR32 et pHluorin33. Combinés à la préparation de la rétine divisée, ces outils puissants peuvent offrir une approche efficace pour explorer les interactions synaptiques et les propriétés biophysiques des BC et des HC qui contribuent au traitement de la lumière dans la rétine.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les subventions suivantes des NIH : subvention des NIH R01EY031596 (à C.M.) ; Subvention du NIH R01EY029985 (à C.M.) ; P30EY010572 de subvention du NIH (à C.M.) ; Subvention du NIH R01EY032564 (à B.S.). Nous remercions Tammie Haley pour son soutien technique dans la préparation des coupes de rétine, et le Dr Charles Allen pour avoir généreusement contribué aux sondes d’ARNm FISH utilisées dans ce travail.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1.5 glass coverslips | Fisherbrand | 12544E | |
| 2 pairs of Dumont #5 forceps | Ted Pella | 38125 | |
| 25 gauge needle | Becton Dickenson | 305122 | |
| 470 nm LED | THORLABS | M470L2 | |
| 5-306 curved scissors | Miltex | 5-306 | |
| 9" disposable pasteur pipetes | Fisherbrand | 13-678-20D | for constructing custom transfer pipette |
| Ai80d mouse | Jackson Laboratories | 25109 | RRID: IMSR_JAX:025109 |
| Ames Medium w/L-Glutamate | US Biological | A1372-25 | |
| amplifier control software | Molecular Devices | Clampex 10.3 software | |
| anti-calbindin D28K antibody | Invitrogen | PA-5 85669 | RRID: AB_2792808, host species = rabbit; 1:100 dilution |
| anti-CtBP2 antibody | BD Biosciences | 612044 | RRID: AB_399431, host species = mouse; 1:5000 dilution |
| anti-GPR179 antibody | NA | NA | gift from Kirill Martemyanov; Scripps Research Institute, Jupiter, FL; host species = sheep; 1:1000 dilution |
| anti-PKC alpha antibody | Sigma-Aldrich | P4334 | RRID: AB_477345, host species = rabbit; 1:5000 dilution |
| anti-PKC alpha antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc8393 AF594 | RRID: AB_628142, host species = mouse; 1:1000 dilution |
| anti-PSD95 antibody | BD Transduction Laboratories | 610495 | RRID: AB_397862, host species = mouse; 1:1000 dilution |
| anti-RGS11 antibody | NA | NA | gift from Ted Wensel; Baylor College of Medicine, Houston, TX; host species = rabbit; between 1:1000 and 1:5000 dilution |
| anti-Synaptophysin P38 antibody | Sigma | S-S5768 | RRID: AB_477523, host species = mouse; 1:1000 dilution |
| Aquamount mounting media | Epredia | 13800 | slide mounting media |
| C57BL/6J mouse | Jackson Laboratories | 000664 | RRID: IMSR_JAX:000664 |
| carbogen tank | Matheson | NA | 95% O2 and 5% CO2 |
| custom transfer pipette | custom build | NA | Instructions: use scissors to cut off the tip of a plasitc transfer pipette at the point it begins to taper. Use pliers to safely break off the last 2-3 inches of a glass pasteur pipette. Fit the narrow end of the glass pasteur pipette into the wide tip of the plastic transfer pipete. Wrap parafilm around the joint of the two pieces to enhance the seal. |
| Digitical optical power meter | THORLABS | PM100D | |
| dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| electrophysiology amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
| electrophysiology microscope | Olympus | OLYMPUS, BX50WI | Dodt gradient contrast microscopy |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| HC PL APO CS2 40x/1.3 | Leica | 506358 | |
| HC PL APO CS2 63x/1.40 | Leica | 15506350 | |
| Hybridization oven | Robbins Scientific | Model 1000 | for RNAscope protocol only |
| Immedge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| isoflurane | Piramal Critical Care | 66794-017-25 | |
| Kimwipe (delicate task wipe) | Kimtech Science | 34155 | |
| Leica HC PL APO CS2 40x/1.3 oil immersion objective | Leica | 506358 | |
| Leica HC PL APO CS2 63x/1.40 oil immersion objective | Leica | 15506350 | |
| Leica TCS SP8 X confocal microscope | Leica | discontinued | |
| medium 15 mm petri dish | Corning | 25060-60 | eyes are kept here during retina dissection |
| Merit 97-275 steel scissors | Merit | 97-275 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | p-97 | |
| Mm-Gabrd-C2 mRNA probe | ACD | 459481-C2 | |
| mouse euthanasia chamber | NA | NA | custom build; glass petri dish covering a small glass jar. |
| nitrocellulose membrane filters | GE Healthcare Life Sciences; Whatman | 7184-005 | 0.45 µm pore size |
| Picospritzer | General Valve Corporation | Picospritzer II | referred to in the text as microcellular injection unit |
| plastic transfer pipets | Fisherbrand | 13-711-7M | for constructing custom transfer pipette |
| Plastic tubing | Tygon | R-603 | for connection to carbogen tank |
| platinum harp | custom build | NA | for anchoring split retinas within the electrophysiology recording chamber. |
| size 0 paint brush | generic | NA | for flattening retina during splitting. |
| SlowFade Gold antifade reagent | Molecular Probes | S36937 | referred to in the text as anti-fade mounting media |
| small 10 mm petri dish | Falcon | 353001 | eyes are placed here following enucleation |
| small glass pane (7.5 cm x 5 cm) | generic | NA | isolatd retina pieces are placed onto this for the splitting procedure |
| Superfrost plus microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | electrostatically-charged glass microscope slides |
| Thick-walled borosilicate glass pipettes with filament | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | |
| Vannas Scissors; straight | Titan Medical | TMS121 | not brand specific; any comparable scissors will work |
| vGATFLPo mouse | Jackson Laboratories | 29591 | RRID: IMSR_JAX:029591 |
| vGlut2Cre mouse | Jackson Laboratories | 28863, 016963 | RRID: IMSR_JAX:028863, RRID: IMSR_JAX:016963 |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | BioLegend | 423105 | referred to in the text as MI-NIR |
References
- Morgans, C. W. Neurotransmitter release at ribbon synapses in the retina. Immunology & Cell Biology. 78 (4), 442-446 (2000).
- Euler, T., Haverkamp, S., Schubert, T., Baden, T. Retinal bipolar cells: elementary building blocks of vision. Nature Reviews Neuroscience. 15 (8), 507-519 (2014).
- Barnes, S., Grove, J. C. R., McHugh, C. F., Hirano, A. A., Brecha, N. C. Horizontal Cell Feedback to Cone Photoreceptors in Mammalian Retina: Novel Insights From the GABA-pH Hybrid Model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, (2020).
- Walston, S. T., Chang, Y. C., Weiland, J. D., Chow, R. H. Method to remove photoreceptors from whole mount retina in vitro. Journal of Neurophysiology. 118 (5), 2763-2769 (2017).
- Stefanov, A., Novelli, E., Strettoi, E. Inner retinal preservation in the photoinducible I307N rhodopsin mutant mouse, a model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. Journal of Comparative Neurology. 528 (9), 1502-1522 (2020).
- Matsuoka, R. L., Nguyen-Ba-Charvet, K. T., Parray, A., Badea, T. C., Chédotal, A., Kolodkin, A. L. Transmembrane semaphorin signaling controls laminar stratification in the mammalian retina. Nature. 470 (7333), 259-263 (2011).
- Matsuoka, R. L., et al. Guidance-Cue Control of Horizontal Cell Morphology, Lamination, and Synapse Formation in the Mammalian Outer Retina. Journal of Neuroscience. 32 (20), 6859-6868 (2012).
- Wässle, H., Puller, C., Müller, F., Haverkamp, S. Cone Contacts, Mosaics, and Territories of Bipolar Cells in the Mouse Retina. Journal of Neuroscience. 29 (1), 106-117 (2009).
- Thoreson, W. B., Dacey, D. M. Diverse Cell Types, Circuits, and Mechanisms for Color Vision in the Vertebrate Retina. Physiological Reviews. 99 (3), 1527-1573 (2019).
- Guido, M. E., et al. A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).
- Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis. Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28 (2017).
- Todorova, V., et al. Retinal Layer Separation (ReLayS) method enables the molecular analysis of photoreceptor segments and cell bodies, as well as the inner retina. Scientific Reports. 12 (1), 20195 (2022).
- Shiosaka, S., Kiyama, H., Tohyama, M. A simple method for the separation of retinal sublayers from the entire retina with special reference to application for cell culture. Journal of Neuroscience Methods. 10 (3), 229-235 (1984).
- Ivanova, E., Hwang, G. S., Pan, Z. H. Characterization of transgenic mouse lines expressing Cre-recombinase in the retina. Neuroscience. 165 (1), 233-243 (2010).
- Sarria, I., Orlandi, C., McCall, M. A., Gregg, R. G., Martemyanov, K. A. Intermolecular Interaction between Anchoring Subunits Specify Subcellular Targeting and Function of RGS Proteins in Retina ON-Bipolar Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (10), 2915-2925 (2016).
- Orlandi, C., Cao, Y., Martemyanov, K. A. Orphan Receptor GPR179 Forms Macromolecular Complexes With Components of Metabotropic Signaling Cascade in Retina ON-Bipolar Neurons. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 7153-7161 (2013).
- Dikshit, A., Zong, H., Anderson, C., Zhang, B., Ma, X. -J. Simultaneous Visualization of RNA and Protein Expression in Tissue Using a Combined RNAscopeTM In Situ Hybridization and Immunofluorescence Protocol. Methods in Molecular Biology. 2148, Clifton, N.J. 301-312 (2020).
- Wang, F., et al.
- Morgans, C. W., et al. TRPM1 is required for the depolarizing light response in retinal ON-bipolar cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19174-19178 (2009).
- Alessio, E., Zhang, D. Q. Immunostaining of whole-mount retinas with the CLARITY tissue clearing method. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (7), 5054 (2020).
- Ferguson, L. R., Dominguez, J. M., Balaiya, S., Grover, S., Chalam, K. V. Retinal Thickness Normative Data in Wild-Type Mice Using Customized Miniature SD-OCT. PLoS ONE. 8 (6), e67265 (2013).
- Ivanova, E., Toychiev, A. H., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments JoVE. (82), e51018 (2013).
- Kolb, H.
- Chaya, T., et al. Versatile functional roles of horizontal cells in the retinal circuit. Scientific Reports. 7 (1), 5540 (2017).
- Egger, V., Diamond, J. S. A17 Amacrine Cells and Olfactory Granule Cells: Parallel Processors of Early Sensory Information. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 600537 (2020).
- Dacey, D. M.
- Park, S. J., et al. Connectomic analysis reveals an interneuron with an integral role in the retinal circuit for night vision. eLife. 9, 56077 (2020).
- Janssen-Bienhold, U., et al. Connexin57 is expressed in dendro-dendritic and axo-axonal gap junctions of mouse horizontal cells and its distribution is modulated by light. The Journal of Comparative Neurology. 513 (4), 363-374 (2009).
- Jain, V., et al. The functional organization of excitation and inhibition in the dendrites of mouse direction-selective ganglion cells. eLife. 9, 52949 (2020).
- Marvin, J. S., et al. Stability, affinity, and chromatic variants of the glutamate sensor iGluSnFR. Nature Methods. 15 (11), 936-939 (2018).
- Strauss, S., et al. Center-surround interactions underlie bipolar cell motion sensitivity in the mouse retina. Nature Communications. 13 (1), 5574 (2022).
- Marvin, J. S., et al. A genetically encoded fluorescent sensor for in vivo imaging of GABA. Nature Methods. 16 (8), 763-770 (2019).
- Beckwith-Cohen, B., Holzhausen, L. C., Wang, T. M., Rajappa, R., Kramer, R. H. Localizing Proton-Mediated Inhibitory Feedback at the Retinal Horizontal Cell-Cone Synapse with Genetically-Encoded pH Probes. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 39 (4), 651-662 (2019).
