Summary
हमने फेफड़ों के वर्गों को उत्पन्न करने के लिए एक वाइब्रेटोम और एगरोज-एम्बेडेड फेफड़े के ऊतकों का उपयोग करके एक ऊतक-प्रसंस्करण तकनीक विकसित की है, जिससे फेफड़ों की वास्तुकला की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों के अधिग्रहण की अनुमति मिलती है। हमने विशिष्ट फेफड़े के संरचनात्मक मार्करों का उपयोग करके स्थानिक प्रोटीन अभिव्यक्ति का निरीक्षण करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला कर दिया।
Abstract
इसकी अंतर्निहित संरचनात्मक नाजुकता के कारण, फेफड़े को सूक्ष्म रीडआउट के लिए संसाधित करने के लिए अधिक कठिन ऊतकों में से एक माना जाता है। सेक्शनिंग के लिए संरचनात्मक समर्थन जोड़ने के लिए, फेफड़े के ऊतकों के टुकड़े आमतौर पर पैराफिन या ओसीटी यौगिक में एम्बेडेड होते हैं और क्रमशः माइक्रोटोम या क्रायोस्टेट के साथ काटे जाते हैं। एक और हालिया तकनीक, जिसे सटीक-कट फेफड़े के स्लाइस के रूप में जाना जाता है, अगारोज घुसपैठ के माध्यम से ताजा फेफड़े के ऊतकों को संरचनात्मक समर्थन जोड़ता है और संस्कृति में प्राथमिक फेफड़े के ऊतकों को बनाए रखने के लिए एक मंच प्रदान करता है। हालांकि, एपिटोप मास्किंग और ऊतक विरूपण के कारण, इनमें से कोई भी तकनीक पर्याप्त रूप से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य उन्नत प्रकाश इमेजिंग रीडआउट के विकास के लिए खुद को उधार नहीं देती है जो कई एंटीबॉडी और प्रजातियों में संगत होगी।
यह अंत करने के लिए, हमने एक ऊतक-प्रसंस्करण पाइपलाइन विकसित की है, जो निश्चित फेफड़ों के ऊतकों के एगरोज एम्बेडिंग का उपयोग करती है, जो स्वचालित वाइब्रेटोम सेक्शनिंग के साथ मिलकर होती है। इसने माउस, सुअर और मानव फेफड़ों में 200 माइक्रोन से 70 माइक्रोन मोटी फेफड़ों के फेफड़ों की पीढ़ी की सुविधा प्रदान की, जिसके लिए कोई एंटीजन पुनर्प्राप्ति की आवश्यकता नहीं होती है, और देशी पृथक ऊतक के कम से कम "संसाधित" संस्करण का प्रतिनिधित्व करते हैं। इन स्लाइस का उपयोग करते हुए, हम एक मल्टीप्लेक्स इमेजिंग रीडआउट प्रकट करते हैं जो उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों को उत्पन्न करने में सक्षम है जिनकी स्थानिक प्रोटीन अभिव्यक्ति का उपयोग फेफड़ों की चोट और उत्थान के अंतर्निहित तंत्र को मापने और बेहतर ढंग से समझने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
पूर्व विवो फेफड़े के ऊतक स्लाइस बड़े पैमाने पर फेफड़ों की बीमारी1 के अध्ययन में उपयोग किया जाता है। वर्तमान सोने के मानकों, विशेष रूप से नैदानिक और अनुवाद बड़े पशु अध्ययन में, hematoxylin और eosin धुंधला रोजगार brightfield माइक्रोस्कोपी और पर्यवेक्षक आधारित स्कोरिंग के साथ मिलकर आकलन और ग्रेड फेफड़ों की शिथिलता 2,3. जबकि अभी भी एक मूल्यवान तकनीक है, यह स्थानिक संकल्प और मार्करों की संख्या के संदर्भ में सीमाओं को प्रदर्शित करता है जिन्हें एक साथ चित्रित किया जा सकता है। इसके अलावा, फेफड़े के ऊतकों को व्यापक विलायक-आधारित washes से गुजरना पड़ता है, जिसके परिणामस्वरूप निर्जलीकरण, संकोचन और इसकी अंतिम इमेजिंग4 से पहले ऊतक का पुनर्जलीकरण होता है। यह प्रक्रिया न केवल समय लेने वाली है, बल्कि पर्यावरण के अनुकूल भी है, प्रोटीन एपिटोप्स को मास्क करती है, और संरचनात्मक ऊतक परिवर्तन 5,6,7,8 का आह्वान कर सकती है। हालांकि, फेफड़ों के ऊतकों के लिए, सेक्शनिंग से पहले पैराफिन में एम्बेड करना फेफड़े की संरचनात्मक नाजुकता के कारण एक आवश्यकता रही है। इसके विपरीत, मस्तिष्क जैसे ठोस अंगों को एक कंपन माइक्रोटोम (वाइब्रेटोम) का उपयोग करके काटा जा सकता है, दोनों निश्चित और ताजा ऊतक 9,10,11,12 में।
फेफड़े के ऊतकों में vibratome सेक्शनिंग सक्षम करने के लिए, एक विधि परिशुद्धता कट फेफड़े स्लाइस (पीसीएलएस) कहा जाता है जहां कम पिघलने बिंदु agarose वायुमार्ग या रक्त वाहिकाओं के माध्यम से ताजा फेफड़ों के ऊतकों में इंजेक्ट किया जाता है और13,14 जमने के लिए छोड़ दिया गया था. वायुमार्ग में agarose तो vibratome अनुभाग 9,14 की अनुमति देने के लिए पर्याप्त संरचनात्मक समर्थन प्रदान करता है. कृन्तकों में, यह प्राप्त करना आसान है क्योंकि श्वासनली के माध्यम से अगारोज़ को इंजेक्ट किया जा सकता है; हालांकि, सुअर और मानव ऊतक में, यह एक दिया बायोप्सी15,16 के भीतर एक उपयुक्त वायुमार्ग/पोत का पता लगाने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है. पोत स्थित है, तो भी अगर इस तरह के एक वायुमार्ग/पोत स्थित है, पर्याप्त बल आमतौर पर बाद फेफड़ों की आकृति विज्ञान17 को प्रभावित कर सकते हैं जो agarose, इंजेक्ट करने के लिए आवश्यक है.
पैराफिन एम्बेडिंग/सेक्शनिंग/धुंधला और पीसीएलएस वर्कफ़्लो में अनुभव की गई चुनौतियों को दूर करने के लिए, हमने निश्चित फेफड़ों के ऊतकों के लिए एक नई प्रसंस्करण पाइपलाइन स्थापित की है। यह वर्कफ़्लो सेक्शनिंग के लिए वाइब्रेटोम के उपयोग की अनुमति देता है, पीसीएलएस की तुलना में पतले स्लाइस का उत्पादन कर सकता है, और मल्टीप्लेक्स प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए एंटीजन पुनर्प्राप्ति की आवश्यकता नहीं है कि स्लाइस पैदा करता है। यह विधि फेफड़ों के वर्गों को उत्पन्न करने के लिए "कम से कम प्रसंस्करण" का एक साधन प्रदान करती है जिसका उपयोग उन्नत प्रकाश माइक्रोस्कोपी में किया जा सकता है। इसके अलावा, इमेजिंग रीडआउट का उपयोग ऊतक 18,19,20,21के वॉल्यूमेट्रिक आर्किटेक्चर को कैप्चर करके फेफड़ों के ऊतकों के भीतर कोशिकाओं और शारीरिक संरचनाओं के स्थानिक संबंधों को प्रदर्शित करने के लिए किया जा सकता है। यह पत्र इन फेफड़ों के वर्गों को उत्पन्न करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है और इन ऊतकों में से प्रत्येक पर लागू मल्टीप्लेक्स दाग को प्रदर्शित करता है और इन उन्नत इमेजिंग डेटा का उपयोग परिमाणीकरण के लिए कैसे किया जा सकता है।
Protocol
3R को बनाए रखने के प्रयास में अन्य अंग प्रणालियों का उपयोग करके शोधकर्ताओं द्वारा माउस फेफड़े दान किए गए थे। सूअरों में सभी प्रक्रियाएं यूरोपीय निर्देश 2010/63/EU के अनुसार की गईं और माल्मो-लुंड एथिकल कमेटी ऑन एनिमल रिसर्च (Dnr 5.8.18-05527/2019) द्वारा अनुमोदित की गईं और स्वीडिश रिसर्च काउंसिल के कोडेक्स दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित की गईं। स्वीडिश नेशनल एथिक्स कमेटी (Dnr 2020-07115 और Dnr 2020-01864) द्वारा मानव नमूनों के उपयोग के लिए स्वीकृति प्रदान की गई थी। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों और उपकरणों से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।
1. समाधान और सामग्री की तैयारी
- 48 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में फेफड़े के ऊतकों को ठीक करें। इसके बाद, फेफड़े के ऊतकों को फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) से भरा 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 0.01% सोडियम एज़ाइड होता है।
- बाँझ पीबीएस के 50 एमएल में कम पिघलने बिंदु agarose के 1.5 ग्राम भंग करके एक 3% (डब्ल्यू / वी) agarose समाधान तैयार करें. एक प्लास्टिक कप, ठीक संदंश, और बाँझ कैंची तैयार.
- एक माइक्रोवेव में अगारोज़ को उबाल आने तक गर्म करें, फिर इसे पानी के स्नान में 42 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें। उपयोग के लिए तैयार होने तक पानी के स्नान में संग्रहीत करके अगारोज़ को उसके तरल रूप में रखें।
नोट: अगारोज को गर्म करते समय, माइक्रोवेव को तब तक देखें जब तक कि यह उबलना शुरू न हो जाए ताकि यह ओवरफ्लो न हो। यह आमतौर पर लगभग 1.5 मिनट लेता है।
2. फेफड़े के ऊतक अगारोज में एम्बेडेड
- पीबीएस-एज़ाइड से फेफड़े की बायोप्सी उठाएं और ठीक संदंश और बाँझ कैंची का उपयोग करके फेफड़ों के लोब को ध्यान से काटें। फेफड़े के लोब को छोटे ब्लॉकों में काटें।
नोट: फुफ्फुस का आवरण के साथ सेक्शनिंग संभव है, जबकि इसकी मोटी इलास्टिन बंडल वाइब्रेटोम ब्लेड के साथ काटने में बाधा डाल सकते हैं। इस प्रकार, यदि आवश्यक नहीं है तो हम इसे हटाने की सलाह देते हैं। - बीच से एक प्लास्टिक कप काटें और उसके तल पर थोड़ी मात्रा में एगरोज डालें। अगारोज की सतह पर एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब (रिम हटा दिया गया) से ढक्कन रखें और बाद में उपयोग के लिए एगरोज को जमने की अनुमति देने के लिए 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कप स्टोर करें।
- 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर से प्लास्टिक कप को पुनः प्राप्त करें, ढक्कन पर लगभग 1 एमएल तरल एगरोज जोड़ें, फिर धीरे से ढक्कन पर फेफड़े के ऊतक ब्लॉक को रखें। कमरे के तापमान पर अर्द्ध जम के लिए 2-3 मिनट के लिए agarose छोड़ दें. फिर, धीरे-धीरे तरल agarose फेफड़ों के ऊतकों पर डालना जब तक यह पूरी तरह से जलमग्न है.
- लगभग 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रेफ्रिजरेट करें जब तक कि अगारोज जम न जाए। अगला, ध्यान से ऊतक (चित्रा 1) के चारों ओर लगभग 5 मिमी मोटाई की एक समान परत छोड़कर, फेफड़ों के ऊतकों के आसपास अतिरिक्त agarose को हटाने के लिए एक तेज ब्लेड का उपयोग करें.
3. फेफड़े के ऊतक वर्गों को काटना
- सेक्शनिंग के लिए फेफड़े के ऊतक को तैयार करने के लिए, सुपर गोंद का उपयोग करके वाइब्रेटोम के नमूना डिस्क पर प्रत्येक ऊतक ब्लॉक संलग्न करें। अगला, पीबीएस के साथ vibratome बफर ट्रे भरें और आसपास के बर्फ स्नान में बर्फ जगह. अंत में, बफर ट्रे में नमूना डिस्क को सावधानीपूर्वक स्थापित करें।
- निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ वाइब्रेटोम के साथ फेफड़े के ऊतकों को स्लाइस करें: मोटाई: 200 माइक्रोन, आवृत्ति: 100 हर्ट्ज, ब्लेड का आयाम: 1.3 मिमी, और ब्लेड की आगे की गति 0.02-0.03 मिमी/सेकंड, जो ऊतक कठोरता पर निर्भर करता है।
नोट: ब्लेड की गति 0.01 मिमी/सेकेंड तक कम होने पर 70 माइक्रोन की मोटाई तक काटना संभव है। कुछ वाइब्रेटोम (जैसे, लीका V1200s) एक कटिंग विंडो सेट करके सेक्शनिंग के स्वचालन की अनुमति देते हैं। - वर्गों को इकट्ठा करने के लिए, धीरे पीबीएस में 0.01% azide से भरा एक 24 अच्छी तरह से थाली में vibratome ट्रे से एक ब्रश के साथ स्कूपिंग द्वारा ऊतक टुकड़ा हस्तांतरण. अंत में, 4 डिग्री सेल्सियस पर फेफड़ों के स्लाइस को संरक्षित करें।
4. इलास्टिन, सीडी 31, एचटीआईआई -280 और एसएमए की इम्यूनोस्टेनिंग
- Permeabilize और ब्लॉक (1% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन + 0.5% ट्राइटन + 5% सामान्य बकरी सीरम) 45 मिनट के लिए कोमल मिलाते हुए के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक।
- प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें (एसएमए 1:500; इलास्टिन 1:250; सीडी31 1:250; HTII-280 1:250) पीबीएस में, प्रति अच्छी तरह से 300 माइक्रोन जोड़ें, और कोमल झटकों के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं।
- टुकड़ा को छूने और एक विंदुक टिप के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी को हटाने के बिना, पीबीएस के साथ 3 x 20 मिनट (400 μL) धो लें.
- पीबीएस में माध्यमिक एंटीबॉडी (1: 1000) पतला, अच्छी तरह से प्रति में 300 माइक्रोन जोड़ें, और 90 मिनट के लिए कोमल मिलाते हुए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- एक विंदुक टिप के साथ माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें, एक 30 मिनट इनक्यूबेशन के लिए 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (1:1000) और टमाटर लेक्टिन 488 (1:500) जोड़ें, और पीबीएस के साथ 3 x 10 मिनट के लिए धो लें.
- स्लाइड पर बढ़ते माध्यम की तीन बूँदें प्लेस एक coverslip माउंट, और इमेजिंग के लिए आगे बढ़ना.
Representative Results
फेफड़े के ऊतकों के स्लाइस पैदा करने की प्रक्रिया में तैयारी, एम्बेडिंग और सेक्शनिंग सहित कई महत्वपूर्ण चरण शामिल हैं। अगारोज समाधान (3% (डब्ल्यू / वी) बाँझ पीबीएस के 50 एमएल में कम पिघलने बिंदु agarose के 1.5 ग्राम भंग करके बनाया जाता है। आवश्यक उपभोग्य सामग्रियों में एक प्लास्टिक कप, 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब (रिम हटा दिया गया), संदंश और कैंची से ढक्कन शामिल हैं। फेफड़े के ऊतकों को ध्यान से ठीक संदंश और बाँझ कैंची(चित्रा 1ए,बी)के साथ छोटे ब्लॉकों में उच्छेदित किया जाता है। अगला, फेफड़े के ऊतकों ब्लॉकों एम्बेड करने के लिए, कप के नीचे agarose की एक छोटी राशि के साथ भर जाता है, एक ढक्कन agarose की सतह पर रखा है, और कप 5 मिनट (चित्रा 1C) के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है. लगभग 1 एमएल तरल एगरोज को ढक्कन में जोड़ा जाता है, और फेफड़े के ऊतक ब्लॉक को ढक्कन पर रखा जाता है। कमरे के तापमान (चित्रा 1 डी) पर अर्ध-जमने के लिए 2-3 मिनट के लिए अगारोज छोड़ दिया जाता है। एक बार एक फेफड़े ब्लॉक अर्द्ध ठोस agarose द्वारा जगह में आयोजित किया जाता है, तरल agarose तो कप में डाला जाता है जब तक फेफड़े ऊतक ब्लॉक पूरी तरह से जलमग्न है. यह 15 मिनट (चित्रा 1ई, एफ) के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है। कम-गलना-बिंदु agarose एम्बेडिंग फेफड़ों के ऊतकों को आवश्यक समर्थन और कठोरता प्रदान करता है, जो टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया के दौरान इसकी मूल वास्तुकला को बनाए रखने में मदद करता है। फेफड़े के ऊतकों के आसपास के अतिरिक्त एगरोज को हटाने के लिए एक तेज ब्लेड का उपयोग किया जाता है। लगभग 5 मिमी मोटाई की एक समान परत ऊतक (चित्रा 1 जी) के आसपास छोड़ दिया है। उत्तेजित फेफड़े के ऊतक ब्लॉक को तब ऊतक धारक (चित्रा 1एच) पर सावधानीपूर्वक चिपकाया जाता है। वाइब्रेटोम बफर ट्रे पीबीएस से भरी हुई है, बर्फ को आसपास के बर्फ स्नान में रखा गया है, और बफर ट्रे (चित्रा 1I) में स्थापित नमूना डिस्क। पैनल पर सेट वाइब्रेटोम काटने के पैरामीटर थे: टुकड़ा मोटाई: 200 माइक्रोन; आवृत्ति: 100 हर्ट्ज; ब्लेड का आयाम: 1.3 मिमी; ब्लेड की आगे की गति: 0.02-0.03 मिमी / अंत में, धुंधला मुक्त चल स्लाइस (चित्रा 1K-एम) पर किया जाता है.
इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला चिकनी मांसपेशी एक्टिन (एसएमए, एक चिकनी मांसपेशी कोशिका और मायोफिब्रोब्लास्ट मार्कर), इलास्टिन (बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन) और लाइकोपर्सिकॉन एस्कुलेंटम लेक्टिन (एलईए) के लिए प्रत्येक प्रजाति से 200 माइक्रोन वर्गों में किया गया था, जो ब्रोन्कोएलेवोलर उपकला कोशिकाओं को बांधता है। फेफड़े एक संरचनात्मक रूप से विषम ऊतक है और इस तरह, अंतर एसएमए और इलास्टिन वितरण संरचनाओं में मनाया जाता है, जिसमें वायुकोशीय नलिकाएं, रक्त वाहिकाएं, इंट्रापल्मोनरी ब्रोन्किओल्स और चूहों, सूअरों और मनुष्यों (चित्रा 2ए-एल) से एल्वियोली शामिल हैं। एक ब्रोंकिओल के एक 20 माइक्रोन मात्रा का एक उच्च संकल्प प्रतिपादन से पता चलता है कि कैसे फेफड़ों के भीतर ठीक संरचनाओं एक अर्द्ध तीन आयामी स्तर (पूरक वीडियो एस 1) पर जांच की जा सकती है. एक मात्रात्मक उदाहरण के रूप में, छवि अनुरेखण का उपयोग, हम दिखाते हैं कि एल्वियोली का आकार नमूनों (एन = 20 एल्वियोली) (चित्रा 2 एल, एम) के बीच कैसे भिन्न होता है।
यह दिखाने के लिए कि इन उन्नत इमेजिंग डेटा का मात्रात्मक रूप से उपयोग करना कैसे संभव है, हमने एक वयस्क और एक शिशु से मानव फेफड़ों के ऊतकों में टाइप 2 न्यूमोसाइट (टीआईआई) सेल वितरण की तुलना की। मानव-विशिष्ट प्रकार 2 वायुकोशीय कोशिका एंटीबॉडी, HTII-280, मानव प्रकार 2 कोशिकाओं(चित्रा 3A-F)की सतह के लिए एक मजबूत संबंध है। इन कोशिकाओं को आगे वॉल्यूमेट्रिक इमेजिंग (पूरक वीडियो एस 2) का उपयोग करके एकल वायुकोशीय के त्रि-आयामी स्थान में देखा जा सकता है। वयस्क और शिशु नमूनों के बीच TII संख्या को निर्धारित करने के लिए, हमने HTII-280 गिनती को 10 यादृच्छिक क्षेत्रों (fov) में संसाधित किया। इन नमूनों के बीच, शिशु के नमूने में काफी अधिक टीआईआई सेल काउंट (चित्रा 3 जी) प्राप्त हुआ। हालांकि, शिशु के नमूने ने वयस्क की तुलना में काफी अधिक पाड़ कवरेज का प्रदर्शन किया, जो उच्च सेल नंबर(चित्रा 3एच)की व्याख्या कर सकता है। इसके लिए खाते में, हमने तब मचान कवरेज के आधार पर टीआईआई की संख्या का आकलन किया, ऊतक के प्रति मिमी2 कोशिकाओं के रूप में, जो अभी भी शिशु नमूने(चित्रा 3I)में टीआईआई की काफी अधिक संख्या बनाए रखता है। इस प्रकार, शिशु के नमूने में उच्च टीआईआई गिनती बढ़ी हुई पाड़ कवरेज के कारण नहीं है और मचान के क्षेत्र के आधार पर फेफड़ों में सेल वितरण का आकलन करने के महत्व पर प्रकाश डालती है, न कि समग्र एफओवी।
चित्रा 1: फेफड़े के ऊतकों के स्लाइस काटने के लिए प्रोटोकॉल। (ए) समाधान और सामग्री: बाँझ फॉस्फेट-बफर खारा के 50 एमएल में कम-पिघलने बिंदु एगरोज के 1.5 ग्राम को भंग करके प्राप्त एक 3% (डब्ल्यू / वी) एगरोज समाधान; एक प्लास्टिक का कप; 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब से एक ढक्कन; संदंश, और कैंची। (बी) फेफड़ों के ऊतकों ठीक संदंश और बाँझ कैंची का उपयोग करके विच्छेदित थे. (सी) कप के निचले हिस्से को थोड़ी मात्रा में अगारोज से भरें और ढक्कन को अगारोज की सतह पर रखें; फिर, इसे 5 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। (डी) धीरे-धीरे ढक्कन में 1-2 एमएल तरल एगरोज जोड़ें, ढक्कन पर फेफड़े के ऊतक का हिस्सा सावधानी से रखें, और इसे 2 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। (ई, एफ) तरल agarose कप में डालो जब तक फेफड़े के ऊतकों का हिस्सा पूरी तरह से जलमग्न है, 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान, और फिर प्लास्टिक के कप को धीरे से तोड़ लें। (जी) ऊतक के चारों ओर लगभग 5 मिमी मोटाई की एक समान परत छोड़कर, फेफड़े के ऊतकों के आसपास अतिरिक्त agarose को हटाने के लिए एक तेज ब्लेड का प्रयोग करें. (एच) उत्तेजित फेफड़े के ऊतक ब्लॉक को तब ऊतक धारक पर सावधानी से चिपकाया जाता है। (I) पीबीएस के साथ वाइब्रेटोम बफर ट्रे भरें, आसपास के बर्फ स्नान में बर्फ रखें, और नमूना डिस्क को बफर ट्रे में स्थापित करें। (जे) वाइब्रेटोम के पैनल पर काटने के पैरामीटर सेट करें; स्लाइस मोटाई: 200 माइक्रोन, आवृत्ति: 100 हर्ट्ज, चाकू का आयाम: 1.3 मिमी, और 0.02-0.04 मिमी/सेकेंड के ब्लेड की आगे की गति। (के-एम) एक मुक्त अस्थायी टुकड़ा की प्रतिनिधि छवियों अभी भी agarose में एम्बेडेड और immunofluorescence धुंधला के लिए तैयार. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: मानव, सुअर और माउस में फेफड़ों की संरचना की इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां। (ए-एल) क्रमशः माउस, सुअर और मानव से फेफड़े के ऊतकों के स्लाइस में एक वायुकोशीय वाहिका, रक्त वाहिका, ब्रोंकियोल और एल्वियोली की प्रतिनिधि छवियां। एसएमए (हरे रंग में दिखाया गया है) चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के लिए एक मार्कर है और फेफड़ों के ऊतकों की संवहनी और ब्रोन्कियल दीवारों में मनाया जाता है। इलास्टिन (लाल रंग में दिखाया गया है) फेफड़ों के बाह्य मैट्रिक्स का हिस्सा है। (एम) मानव, सुअर और माउस दोनों नमूनों के लिए प्रत्येक फेफड़े के ऊतकों के टुकड़े पर 20 यादृच्छिक पदों का चयन करके वायुकोशीय आकार की मात्रा। हिस्टोग्राम का उपयोग प्रत्येक समूह के भीतर वायुकोशीय आकार के वितरण को स्पष्ट करने के लिए किया गया था। स्केल बार = 50 माइक्रोन (ए-एफ, एच-एल), 100 माइक्रोन (जी)। *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001। संक्षिप्ताक्षर: DAPI = 4′, 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल; एलईए = लाइकोपर्सिकॉन एस्कुलेंटम लेक्टिन; एसएमए = चिकनी मांसपेशी एक्टिन; एमएस = माउस; ह्म् कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3. "मानव वयस्क और शिशु नमूनों में टाइप 2 न्यूमोसाइट वितरण"। (ए, बी) HTII-280 (लाल रंग में दिखाया गया है), CD31 (हरे रंग में दिखाया गया है), और LEA (ग्रे में दिखाया गया है) के लिए दाग वाले वयस्क और शिशु मानव फेफड़े के ऊतकों की प्रतिनिधि छवियां। (सी, डी) वयस्क और शिशु मानव की प्रतिनिधि छवियां अकेले टाइप 2 न्यूमोसाइट वितरण दिखा रही हैं। (ई, एफ) वयस्क और शिशु मानव फेफड़ों के नमूनों से एक व्यक्ति प्रकार 2 न्यूमोसाइट की एकल-कोशिका रिज़ॉल्यूशन प्रतिनिधि छवियां। (जी) वयस्क और शिशु नमूनों के बीच टाइप 2 न्यूमोसाइट्स की संख्या का परिमाणीकरण। (ज) वयस्क और शिशु नमूनों में फेफड़े के ऊतकों पाड़ क्षेत्र कवरेज (% बनाम वायु) की मात्रा। (I) वयस्क और शिशु नमूनों में ऊतक की टाइप-2 न्यूमोसाइट प्रति मिमीमात्रा का परिमाणन। स्केल बार = 5 माइक्रोन (ई, एफ), 100 माइक्रोन (एडी)। n = 10 fov प्रति नमूना। *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001। संक्षिप्ताक्षर: DAPI = 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल; एलईए = लाइकोपर्सिकॉन एस्कुलेंटम लेक्टिन; HTII = मानव प्रकार II कोशिकाएं; सीडी 31 = प्लेटलेट एंडोथेलियल सेल आसंजन अणु -1 / fov = देखने का क्षेत्र। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक वीडियो S1: डीएपीआई, एलईए, एसएमए और इलास्टिन का उपयोग करके दाग वाले एकल पोर्सिन वायुमार्ग के 20 माइक्रोन इमेजिंग वॉल्यूम का वीडियो वायुमार्ग की दीवार तत्वों की संरचना का एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन दृश्य दिखा रहा है। संक्षिप्ताक्षर: DAPI = 4′, 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल; एलईए = लाइकोपर्सिकॉन एस्कुलेंटम लेक्टिन; SMA = चिकनी मांसपेशी एक्टिन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक वीडियो S2: DAPI, LEA, और HTII-280 का उपयोग कर दाग एक एकल वायुकोशीय इमेजिंग मात्रा के 30 माइक्रोन इमेजिंग मात्रा के वीडियो संरचना भर में प्रकार 2 न्यूमोसाइट वितरण दिखा रहा है. संक्षिप्ताक्षर: DAPI = 4′, 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल; एलईए = लाइकोपर्सिकॉन एस्कुलेंटम लेक्टिन; SMA = चिकनी मांसपेशी एक्टिन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हम फेफड़े वर्गों को उत्पन्न करने के लिए एक बेहतर vibratome आधारित विधि प्रस्तुत करते हैं. पैराफिन आधारित प्रसंस्करण तकनीकों की तुलना में, इस विधि अधिक लागत प्रभावी, समय कुशल, और पर्यावरण22 के लिए बेहतर है. इसके अलावा, इस विधि फुफ्फुसीय ऊतक स्लाइस की संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने में मदद करता है और प्रतिजन पुनर्प्राप्ति के लिए की आवश्यकता के बिना उन्नत immunofluorescence इमेजिंग के लिए अनुमति देता है. हालाँकि, हमारे प्रयोगों के दौरान, हमें इस वर्कफ़्लो की कुछ सीमाएँ भी मिलीं। रोगग्रस्त फेफड़े रोग परिवर्तनों के कारण ऊतक विनाश के कारण काटने की प्रक्रिया में हस्तक्षेप कर सकते हैं। सेक्शनिंग के लिए वाइब्रेटोम का उपयोग करते समय, वायुमार्ग की रुकावटें और गंभीर फाइब्रोटिक फेफड़े के ऊतक ब्लेड को बाधित कर सकते हैं, जिससे इन ऊतकों को काटने की प्रक्रिया अधिक चुनौतीपूर्ण हो जाती है। हालांकि, ब्लेड की गति को कम करके और एक ठीक तूलिका के साथ ऊतक का समर्थन करके इसे दूर किया जा सकता है। इसी तरह की चुनौतियां फुफ्फुस के मोटा होने से उत्पन्न होती हैं, जो फुफ्फुसशोथ में एक सामान्य परिणाम है, पुरानी प्रतिरोधी फुफ्फुसीय रोग (सीओपीडी), और इडियोपैथिक फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस (आईपीएफ)23,24,25। फुफ्फुस एक प्रयोग के लिए ब्याज की नहीं है, तो, हम यह सेक्शनिंग से पहले या अलगाव से दूर एक फेफड़ों की मात्रा से दूर हटाने की सलाह देते हैं. यदि फुफ्फुस का आवरण आवश्यक है, तो इसे ऊपर के समान हेरफेर का उपयोग करके काटा जा सकता है, जिसमें धीमी ब्लेड गति और एक ठीक ब्रश से टुकड़ा समर्थन शामिल है।
जबकि सटीक-कट फेफड़े के स्लाइस फेफड़ों के त्रि-आयामी वास्तुकला और देशी वातावरण को संरक्षित कर सकते हैं26, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि पीसीएलएस उत्पन्न करना एक जटिल और समय लेने वाली प्रक्रिया है। फेफड़े के ऊतक स्लाइस पैदा करने की सफलता बहुत हद तक agarose भरने की दक्षता पर निर्भर करती है, जो बदले में, प्राप्त ऊतक में बरकरार फुफ्फुस का आवरण और व्यवहार्य इंजेक्शन साइटों की उपस्थिति से प्रभावित होती है। कृन्तकों में प्राप्त करना आसान है क्योंकि अगारोज को श्वासनली के माध्यम से बरकरार फेफड़ों में आसानी से पेश किया जा सकता है27,28,29. हालांकि, बड़े पशु अनुसंधान में, एक प्रयोग भर में लिया बायोप्सी आम तौर पर बाहर का फेफड़े खंडों, जोcannulate करने के लिए एक बड़ा पर्याप्त वायुमार्ग की कमी से कर रहे हैं 30,31. इस प्रकार, ब्रोन्कस या रक्त वाहिकाओं में एगरोज को इंजेक्ट करने के बजाय, हम इस पद्धति को अपनाते हैं जहां फेफड़े के ऊतक, मूल या नमूना मात्रा की प्रजातियों की परवाह किए बिना, फेफड़े के ऊतक स्लाइस उत्पन्न करने के लिए कम-पिघलने-बिंदु एगरोज में एम्बेडेड होते हैं। यह दृष्टिकोण तकनीकी रूप से आसान है और इसका उद्देश्य जितना संभव हो ऊतक क्षति को कम करना है। हमारे अनुभव के आधार पर, इस विधि ने फेफड़ों के ऊतक वर्गों को उत्पन्न करने में उच्च दक्षता और आसानी का प्रदर्शन किया है। यह प्रभावी रूप से एल्वियोली की आकृति विज्ञान को संरक्षित करता है और फेफड़ों के ऊतकों को काटने के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है, जिससे दोहराए जाने योग्य उच्च-रिज़ॉल्यूशन मल्टीप्लेक्स प्रतिदीप्ति इमेजिंग की पीढ़ी को सक्षम किया जा सकता है।
इस अध्ययन में, हम आगे उत्पन्न इमेजिंग डेटा के लिए दो नमूना आधारित मात्रा का प्रदर्शन करते हैं। प्रजातियों के नमूनों में वायुकोशीय आकार में अंतर का आकलन करने के लिए पहली बार उपयोग की गई छवि अनुरेखण। अप्रत्याशित रूप से, माउस एल्वियोली सबसे छोटे थे, जबकि सुअर और मानव एल्वियोली आकार में समान थे, सूअरों को फेफड़ों के अनुसंधान के लिए एक दिलचस्प अनुवाद मॉडल के रूप में उजागर करते थे।
दूसरी मात्रा के लिए, हमने एक वयस्क और शिशु फेफड़ों के नमूने के बीच एचटीआईआई वितरण की तुलना की। टाइप 2 न्यूमोसाइट्स डिस्टल फेफड़े के उपकला की संरचना में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। टीआईआई की यह अनूठी क्षमता वायुकोशीय उपकला32 की मरम्मत और पुनर्जनन में योगदान देती है। स्वस्थ वयस्क मानव फेफड़े में, टीआईआई कुल कोशिका आबादी का लगभग 15% हिस्सा है, जबकि वायुकोशीय सतह क्षेत्र का उनका कवरेज लगभग 5%33 होने का अनुमान है। HTII-280 चोट के लिए वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं के विकास और प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त फेफड़े-विशिष्ट मार्कर है, और यह विशेष रूप से TIIs के एपिकल प्लाज्मा झिल्ली के लिए स्थानीयकृत है। प्रयोग में, वयस्क ऊतक एक दाता रोगी से प्राप्त किया गया था जो इंट्रासेरेब्रल रक्तस्राव के कारण मर गया था और समवर्ती फेफड़ों की चोट थी, जबकि शिशु का नमूना श्वासावरोध से संबंधित मृत्यु दर से आया था। हमारे निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि शिशु के नमूने की तुलना में वयस्क फेफड़ों के नमूने में एचटीआईआई -280 की अभिव्यक्ति काफी कम थी। दिलचस्प है, जबकि HTII-280 HTIIs के बहुमत में व्यक्त किया जाता है, इसकी अभिव्यक्ति भी ऊतक की गुणवत्ता से प्रभावित किया जा सकता है, और यह काफी घायल मानव फेफड़ों के ऊतकों34 में कम हो गया है. वृद्ध फेफड़े के ऊतकों युवा ऊतकों की तुलना में टीआईआई की संख्या और स्रावी गतिविधि में उल्लेखनीय कमी का प्रदर्शन, और बुजुर्ग व्यक्तियों उन युवा ऊतकों35 की तुलना में काफी कम प्रसार, स्राव और टीआईआई के विरोधी एपोप्टोटिक गतिविधि का प्रदर्शन करते हैं। इस के साथ ध्यान में रखते हुए, पहचान और मानव TIIs के लिए विशिष्ट एक सेल सतह प्रोटीन की पहचान और पता लगाने फेफड़ों की चोट की गंभीरता का आकलन करने और फेफड़ों की मरम्मत36,37 को बढ़ाने के उद्देश्य से उपचार दृष्टिकोण का मूल्यांकन करने में सहायता कर सकता है. इस प्रकार, इस पाइपलाइन का उपयोग करते हुए, स्वास्थ्य और बीमारी के बड़े मानव समूहों में वायुकोशीय टीआईआई अध्ययन करना बहुत रुचि होगी।
अंत में, इस प्रोटोकॉल फेफड़ों के ऊतकों को काटने के लिए एक तेजी से और आसान दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है. यह विधि फेफड़ों के ऊतकों की तैयारी, काटने और धुंधला होने के लिए विस्तृत निर्देश प्रदान करती है, जिससे बरकरार फेफड़े के ऊतकों की संरचना का संरक्षण सुनिश्चित होता है। यह स्वस्थ और रोगग्रस्त फेफड़ों की वास्तुकला दोनों का अध्ययन करने के लिए मॉडल का अनुकूलन करता है, जिससे प्रयोगात्मक दक्षता में सुधार होता है। कुल मिलाकर, यह अध्ययन प्रजातियों में फेफड़े के ऊतकों के पैथोफिज़ियोलॉजी में जटिल स्थानिक जीव विज्ञान की जांच करने के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण का परिचय देता है, जो रोग और मरम्मत में खेलने वाले आणविक तंत्र को बेहतर ढंग से समझने में मदद कर सकता है।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
लेखक कृतज्ञतापूर्वक लुंड विश्वविद्यालय के वॉलनबर्ग मॉलिक्यूलर मेडिसिन फाउंडेशन और स्टेम सेल सेंटर से प्राप्त धन को स्वीकार करते हैं और निकॉन ए 1 आरएचडी तक पहुंच के लिए लुंड यूनिवर्सिटी बायोइमेजिंग सेंटर (एलबीआईसी) को स्वीकार करते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well tissue culture inserts | SARSTEDT | 83.3932.300 | |
| 4% paraformaldehyde | SOLVECO | 6095714 | |
| 4’, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher scientific | D1306 | |
| 50 mL Falcon tube | SARSTEDT | 2045221 | |
| Cluster of differentiation 31 (CD31) | Abcam | ab28364 | |
| Confocal microscope | Nikon | A1R HD25 | |
| Elastin | Abcam | ab23747 | |
| Epredia X1000 Coverslip | Thermo Fisher scientific | 10318963 | |
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher scientific | 10149870 | |
| Forceps | AESCULAP | FB395R | |
| Goat anti-mouse 647 | Invitrogen | A21235 | |
| Goat anti-rabbit 568 | Invitrogen | A11011 | |
| Human type II cells | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | |
| Invitrogen Fluoromount-G Mounting Medium | Thermo Fisher scientific | E41473 | |
| Low gelling temperature Agarose | Sigma-Aldrich | 1003467046 | |
| Lycopersicon Esculentum lectin | Thermo Fisher scientific | 2531965 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher scientific | 50-100-8798 | |
| Plastic cup | kontorsgiganten | 885221 | |
| Scissors | STILLE | 101-8380-18 | |
| Smooth muscle actin | Abcam | ab5694 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | K54329188239 | |
| Super glue | LOCTITE | 2721643 | |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200S |
References
- Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
- Kawasaki, H., et al. The NanoSuit method: a novel histological approach for examining paraffin sections in a nondestructive manner by correlative light and electron microscopy. Laboratory Investigation. 100 (1), 161-173 (2020).
- Silva, I., et al. A Semi-quantitative scoring system for green histopathological evaluation of large animal models of acute lung injury. BIO-PROTOCOL. 12 (16), e4493 (2022).
- Kim, J. H., et al. Optimizing tissue-clearing conditions based on analysis of the critical factors affecting tissue-clearing procedures. Scientific Reports. 8 (1), 12815 (2018).
- Jain, D., et al. Immunocytochemistry for predictive biomarker testing in lung cancer cytology. Cancer Cytopathology. 127 (5), 325-339 (2019).
- Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. Histological stains: a literature review and case study. Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2015).
- Morrison, L. E., Lefever, M. R., Lewis, H. N., Kapadia, M. J., Bauer, D. R. Conventional histological and cytological staining with simultaneous immunohistochemistry enabled by invisible chromogens. Laboratory Investigation. 102 (5), 545-553 (2022).
- Dineshshankar, J., et al. Kerosene as an alternative to xylene in histopathological tissue processing and staining: An experimental study. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11 (6), 376 (2019).
- Abdelaal, H. M., et al. Comparison of vibratome and compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining. Biological Procedures Online. 17 (1), 2 (2015).
- Siwczak, F., Hiller, C., Pfannkuche, H., Schneider, M. R. Culture of vibrating microtome tissue slices as a 3D model in biomedical research. Journal of Biological Engineering. 17 (1), 36 (2023).
- Bèchet, N. B., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I.
- Bèchet, N. B., Kylkilahti, T. M., Mattsson, B., Petrasova, M., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I. Light sheet fluorescence microscopy of optically cleared brains for studying the glymphatic system. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 40 (10), 1975-1986 (2020).
- Bai, Y., Ai, X. Utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle. Journal of Visualized Experiments. (183), (2022).
- Gerckens, M., et al. Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
- Lam, M., Lamanna, E., Organ, L., Donovan, C., Bourke, J. E. Perspectives on precision cut lung slices—powerful tools for investigation of mechanisms and therapeutic targets in lung diseases. Frontiers in Pharmacology. 14, 1162889 (2023).
- Liu, G., et al. Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology. Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).
- Cooper, P. R., et al. Formoterol and salmeterol induce a similar degree of β 2- adrenoceptor tolerance in human small airways but via different mechanisms. British Journal of Pharmacology. 163 (3), 521-532 (2011).
- Ochoa, L. F., et al. Imaging of murine whole lung fibrosis by large scale 3D microscopy aided by tissue optical clearing. Scientific Reports. 8 (1), 13348 (2018).
- Tehrani, K. F., Park, J., Chaney, E. J., Tu, H., Boppart, S. A. Nonlinear imaging histopathology: a pipeline to correlate gold-standard hematoxylin and eosin staining with modern nonlinear microscopy. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 29 (4), (2023).
- Branchfield, K., et al. A three-dimensional study of alveologenesis in mouse lung. Developmental Biology. 409 (2), 429-441 (2016).
- Li, Y., et al. Precision vibratome for high-speed ultrathin biotissue cutting and organ-wide imaging. iScience. 24 (9), 103016 (2021).
- Qian, G., et al. DOCK2 promotes pleural fibrosis by modulating mesothelial to mesenchymal transition. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 66 (2), 171-182 (2022).
- Cagle, P. T., Allen, T. C. Pathology of the pleura: What the pulmonologists need to know. Respirology. 16 (3), 430-438 (2011).
- Jantz, M. A., Antony, V. B.
- Viana, F., O’Kane, C. M., Schroeder, G. N. Precision-cut lung slices: A powerful ex vivo model to investigate respiratory infectious diseases. Molecular Microbiology. 117 (3), 578-588 (2022).
- Paddenberg, R., Mermer, P., Goldenberg, A., Kummer, W. Videomorphometric analysis of hypoxic pulmonary vasoconstriction of intra-pulmonary arteries using murine precision cut lung slices. Journal of Visualized Experiments. (83), e50970 (2014).
- Lyons-Cohen, M. R., Thomas, S. Y., Cook, D. N., Nakano, H. Precision-cut mouse lung slices to visualize live pulmonary dendritic cells. Journal of Visualized Experiments. (122), e55465 (2017).
- Klouda, T., Kim, H., Kim, J., Visner, G., Yuan, K. Precision cut lung slices as an efficient tool for ex vivo pulmonary vessel structure and contractility studies. Journal of Visualized Experiments. (171), e62392 (2021).
- Ghaidan, H., et al. Reduction of primary graft dysfunction using cytokine adsorption during organ preservation and after lung transplantation. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
- Guenthart, B. A., et al. Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform. Nature Communications. 10 (1), 1985 (1985).
- Ruaro, B., et al. The history and mystery of alveolar epithelial type II cells: focus on their physiologic and pathologic role in lung. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2566 (2021).
- Crapo, J. D., Barry, B. E., Gehr, P., Bachofen, M., Weibel, E. R. Cell number and cell characteristics of the normal human lung. The American Review of Respiratory Disease. 126 (2), 332-337 (1982).
- Evans, K. V., Lee, J. -H. Alveolar wars: The rise of in vitro models to understand human lung alveolar maintenance, regeneration, and disease. Stem Cells Translational Medicine. 9 (8), 867-881 (2020).
- Chen, J. -X., et al. Sirtuin 3 ameliorates lung senescence and improves type II alveolar epithelial cell function by enhancing the FoxO3a-dependent antioxidant defense mechanism. Stem Cells and Development. 30 (17), 843-855 (2021).
- Zacharias, W. J., et al. Regeneration of the lung alveolus by an evolutionarily conserved epithelial progenitor. Nature. 555 (7695), 251-255 (2018).
- Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (10), 891-901 (2010).
