Summary
Vi har utvecklat en vävnadsbearbetningsteknik som använder en vibratom- och agarosinbäddad lungvävnad för att generera lungsnitt, vilket gör det möjligt att ta högupplösta bilder av lungarkitekturen. Vi använde immunofluorescensfärgning för att observera spatialt proteinuttryck med hjälp av specifika lungstrukturella markörer.
Abstract
På grund av dess inneboende strukturella bräcklighet anses lungan vara en av de svårare vävnaderna att bearbeta för mikroskopiska avläsningar. För att lägga till strukturellt stöd för snittning bäddas bitar av lungvävnad vanligtvis in i paraffin- eller OCT-förening och skärs med en mikrotom respektive kryostat. En nyare teknik, känd som precisionsskurna lungskivor, ger strukturellt stöd till färsk lungvävnad genom agarosinfiltration och ger en plattform för att upprätthålla primär lungvävnad i odling. Men på grund av epitopmaskering och vävnadsförvrängning lämpar sig ingen av dessa tekniker tillräckligt för utveckling av reproducerbara avancerade ljusavbildningsavläsningar som skulle vara kompatibla med flera antikroppar och arter.
För detta ändamål har vi utvecklat en pipeline för vävnadsbearbetning, som använder agarosinbäddning av fixerad lungvävnad, kopplad till automatiserad vibratomsektionering. Detta underlättade genereringen av lungsektioner från 200 μm till 70 μm tjocka, i mus-, gris- och humanlungor, som inte kräver någon antigenhämtning och representerar den minst "bearbetade" versionen av den naturliga isolerade vävnaden. Med hjälp av dessa skivor avslöjar vi en multiplex avbildningsavläsning som kan generera högupplösta bilder vars rumsliga proteinuttryck kan användas för att kvantifiera och bättre förstå mekanismerna bakom lungskada och regenerering.
Introduction
Ex vivo lungvävnadsskivor används i stor utsträckning i studien av lungsjukdom1. Nuvarande guldstandarder, särskilt i kliniska och translationella stordjursstudier, använder hematoxylin- och eosinfärgning i kombination med ljusfältsmikroskopi och observatörsbaserad poängsättning för att bedöma och gradera lungdysfunktion 2,3. Även om det fortfarande är en värdefull teknik, uppvisar den begränsningar när det gäller rumslig upplösning och antalet markörer som kan avbildas samtidigt. Dessutom måste lungvävnad genomgå omfattande lösningsmedelsbaserade tvättar, vilket resulterar i uttorkning, krympning och rehydrering av vävnaden innan dess slutliga avbildning4. Denna process är inte bara tidskrävande utan också miljöovänlig, maskerar proteinepitoper och kan framkalla strukturella vävnadsförändringar 5,6,7,8. För lungvävnad har dock inbäddning i paraffin före snittning varit en nödvändighet på grund av lungans strukturella bräcklighet. Däremot kan fasta organ som hjärnan skäras med hjälp av en vibrerande mikrotom (vibratom), både i fixerad och färsk vävnad 9,10,11,12.
För att möjliggöra vibratomsnitt i lungvävnad etablerades en metod som kallas precisionsskurna lungskivor (PCLS) där agaros med låg smältpunkt injiceras i färsk lungvävnad via luftvägarna eller blodkärlen och lämnas att stelna13,14. Agarosen i luftvägarna ger tillräckligt strukturellt stöd för att sedan tillåta vibratomsektion 9,14. Hos gnagare är detta enkelt att uppnå eftersom agaros kan injiceras via luftstrupen; I gris- och humanvävnad kan det dock vara svårt att hitta en lämplig luftväg/kärl inom en given biopsi15,16. Dessutom, även om en sådan luftväg/ett sådant kärl är lokaliserat, krävs vanligtvis betydande kraft för att injicera agarosen, vilket kan påverka efterföljande lungmorfologi17.
För att övervinna de utmaningar som upplevs vid paraffininbäddning/snittning/färgning och PCLS-arbetsflödet har vi etablerat en ny bearbetningspipeline för fixerad lungvävnad. Detta arbetsflöde gör det möjligt att använda en vibratom för snittning, kan producera tunnare skivor än i PCLS och ger skivor som inte kräver antigenhämtning för multiplex fluorescensavbildning. Denna metod erbjuder ett sätt att "minst bearbetning" för att generera lungsnitt som kan användas i avancerad ljusmikroskopi. Dessutom kan avbildningsavläsningar användas för att demonstrera de rumsliga förhållandena mellan celler och anatomiska strukturer i lungvävnaden genom att fånga den volymetriska arkitekturen hos vävnaden 18,19,20,21. Denna artikel beskriver protokollet för att generera dessa lungsektioner och visar multiplexfärgning applicerad på var och en av dessa vävnader och hur dessa avancerade bilddata kan användas för kvantifiering.
Protocol
Muslungor donerades av forskare som använde andra organsystem i ett försök att upprätthålla 3R. Alla försök på grisar utfördes i enlighet med det europeiska direktivet 2010/63/EU och godkändes av Malmö-Lunds djurförsöksetiska kommitté (Dnr 5.8.18-05527/2019) och utfördes enligt Vetenskapsrådets CODEX-riktlinjer. Godkännande för användning av humanprover beviljades av Statens etikprövningsnämnd (Dnr 2020-07115 och Dnr 2020-01864). Se materialtabellen för detaljer relaterade till alla material och instrument som används i detta protokoll.
1. Beredning av lösningar och material
- Fixera lungvävnaden i 4% paraformaldehyd i rumstemperatur i 48 timmar. Överför sedan lungvävnaden till ett 50 ml koniskt rör fyllt med fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) som innehåller 0,01 % natriumazid.
- Bered en agaroslösning på 3 % (vikt/volym) genom att lösa upp 1,5 g agaros med låg smältpunkt i 50 ml steril PBS. Förbered en plastmugg, en fin pincett och en steril sax.
- Värm agarosen i mikrovågsugn tills den kokar och kyl sedan ner den till 42 °C i ett vattenbad. Förvara agarosen i flytande form genom att förvara den i vattenbadet tills den ska användas.
OBS: När du värmer agarosen, titta på mikrovågsugnen tills den börjar koka så att den inte svämmar över. Detta tar vanligtvis cirka 1,5 min.
2. Lungvävnad inbäddad i agaros
- Lyft lungbiopsin från PBS-aziden och dissekera lungloberna försiktigt med en fin pincett och steril sax. Skär lungloben i mindre block.
OBS: Även om sektionering med pleura är möjlig, kan dess tjocka elastinbuntar hindra skärning med vibratombladet. Därför rekommenderar vi att den tas bort om det inte är nödvändigt. - Skär en plastmugg genom mitten och tillsätt en liten mängd agaros i botten. Placera locket från ett 50 ml koniskt rör (kanten borttagen) på agarosens yta och förvara koppen vid 4 °C i 5 minuter så att agarosen stelnar för senare användning.
- Ta ut plastmuggen ur kylskåpet med 4 °C, tillsätt cirka 1 ml flytande agaros på locket och placera sedan försiktigt lungvävnadsblocket på locket. Låt agarosen stå i 2-3 minuter för att halvstelna i rumstemperatur. Häll sedan långsamt den flytande agarosen på lungvävnaden tills den är helt nedsänkt.
- Kyl vid 4 °C i cirka 15 minuter tills agarosen stelnat. Använd sedan försiktigt ett vasst blad för att ta bort extra agaros som omger lungvävnaden och lämna ett jämnt lager med en tjocklek på cirka 5 mm runt vävnaden (Figur 1).
3. Skärning av lungvävnadssnitt
- För att förbereda lungvävnaden för snittning, fäst varje vävnadsblock på vibratomets provskiva med superlim. Fyll sedan vibratombuffertbrickan med PBS och lägg is i det omgivande isbadet. Installera slutligen provskivan försiktigt i buffertfacket.
- Skär lungvävnaden med vibratomet med följande inställningar: tjocklek: 200 μm, frekvens: 100 Hz, bladets amplitud: 1,3 mm och bladets framåthastighet på 0,02-0,03 mm/s, vilket beror på vävnadens styvhet.
OBS: Skärning är möjlig ner till en tjocklek på 70 μm om bladhastigheten reduceras till 0.01 mm/s. Vissa vibratomer (t.ex. Leica V1200s) möjliggör automatisering av sektionering genom att ställa in ett skärfönster. - För att samla sektioner, överför försiktigt vävnadsskivan genom att skopa den med en borste från vibratombrickan till en 24-hålsplatta fylld med 0,01 % azid i PBS. Bevara slutligen lungskivorna vid 4 °C.
4. Immunfärgning av elastin, CD31, HTII-280 och SMA
- Permeabilisera och blockera (1 % bovint serumalbumin + 0,5 % Triton + 5 % normalt getserum) vävnaden vid 4 °C under lätt skakning i 45 minuter.
- Späd de primära antikropparna (SMA 1:500; elastin 1:250; CD31 1:250; HTII-280 1:250) i PBS, tillsätt 300 μl i varje brunn och inkubera över natten vid 4 °C under lätt omskakning.
- Tvätta 3 x 20 min (400 μL) med PBS utan att röra vid skivan och ta bort de primära antikropparna med en pipettspets.
- Späd de sekundära antikropparna (1:1000) i PBS, tillsätt 300 μl i varje brunn och inkubera vid 4 °C under lätt omskakning i 90 minuter.
- Ta bort de sekundära antikropparna med en pipettspets, tillsätt 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI)(1:1000) och tomatlektin-488 (1:500) under en inkubation på 30 minuter och tvätta i 3 x 10 minuter med PBS.
- Placera tre droppar monteringsmedium på objektglaset, montera ett täckglas och fortsätt till bildbehandling.
Representative Results
Processen att generera lungvävnadsskivor involverar flera viktiga steg, inklusive förberedelse, inbäddning och snittning. Agaroslösningen (3 % (vikt/volym) framställs genom att lösa upp 1,5 g agaros med låg smältpunkt i 50 ml steril PBS. Förbrukningsvaror som behövs inkluderar en plastmugg, lock från ett 50 ml koniskt rör (kanten borttagen), pincett och sax. Lungvävnaden avlägsnas försiktigt i mindre block med en fin pincett och steril sax (Figur 1A,B). Därefter, för att bädda in lungvävnadsblocken, fylls botten av koppen med en liten mängd agaros, ett lock placeras på agarosens yta och koppen förvaras vid 4 °C i 5 minuter (Figur 1C). Cirka 1 ml flytande agaros tillsätts till locket och lungvävnadsblocket placeras på locket. Agarosen får stå i 2-3 minuter för att halvstelna vid rumstemperatur (Figur 1D). När en lungblockad hålls på plats av den halvstelnade agarosen, hälls flytande agaros i koppen tills lungvävnadsblocket är helt nedsänkt. Detta förvaras vid 4 °C i 15 minuter (Figur 1E,F). Den låga smältpunkten agarosinbäddning ger nödvändigt stöd och styvhet till lungvävnaden, vilket hjälper till att bibehålla dess ursprungliga arkitektur under skivningsprocessen. Ett vasst blad används för att ta bort överflödig agaros som omger lungvävnaden. Ett jämnt skikt med en tjocklek på cirka 5 mm lämnas runt vävnaden (Figur 1G). Det utskurna lungvävnadsblocket limmas sedan försiktigt på vävnadshållaren (Figur 1H). Vibratombuffertbrickan fylls med PBS, is placeras i det omgivande isbadet och provskivan installeras i buffertbrickan (Figur 1I). De parametrar för vibratomskärning som ställdes in på panelen var: skivtjocklek: 200 μm; frekvens: 100 Hz; bladets amplitud: 1,3 mm; bladets hastighet framåt: 0,02-0,03 mm/s, vilket beror på vävnadens styvhet (Figur 1J). Slutligen utförs färgning på fritt flytande skivor (Figur 1K-M).
Immunofluorescensfärgning utfördes i 200 μm snitt från varje art för aktin i glatt muskulatur (SMA, en glatt muskelcell och myofibroblastmarkör), elastin (extracellulärt matrixprotein) och Lycopersicon Esculentum lectin (LEA), som binder till bronkoalveolära epitelceller. Lungan är en strukturellt heterogen vävnad och som sådan observeras differentiell SMA- och elastinfördelning över strukturer, inklusive alveolära kanaler, blodkärl, intrapulmonella bronkioler och alveoler från möss, grisar och människor (Figur 2A-L). En högupplöst rendering av en 20 μm volym av en bronkiol visar hur finstrukturer i lungan kan undersökas på en semi-tredimensionell nivå (Supplemental Video S1). Som ett kvantitativt exempel, med hjälp av bildspårning, visar vi hur storleken på alveolerna skiljer sig åt mellan proverna (n = 20 alveoler) (Figur 2L,M).
För att visa hur det är möjligt att kvantitativt utnyttja dessa avancerade avbildningsdata jämförde vi celldistributioner av typ 2-pneumocyter (TII) i mänsklig lungvävnad från en vuxen och ett spädbarn. Den humanspecifika alveolära cellantikroppen HTII-280 av typ 2 har en stark affinitet till ytan av humana typ 2-celler (figur 3A-F). Dessa celler kan vidare ses i det tredimensionella utrymmet av en enda alveol med hjälp av volymetrisk avbildning (Supplemental Video S2). För att kvantifiera TII-talet mellan vuxen- och spädbarnsproverna bearbetade vi HTII-280-räkningen över 10 slumpmässiga synfält (fov). Mellan dessa prover gav spädbarnsprovet ett signifikant högre TII-cellantal (Figur 3G). Spädbarnsprovet uppvisade dock också en signifikant högre byggnadsställningstäckning än den vuxne, vilket skulle kunna förklara det högre cellantalet (Figur 3H). För att ta hänsyn till detta bedömde vi sedan antalet TII baserat på byggnadsställningens täckning, som celler per mm2 vävnad, som fortfarande bibehöll ett signifikant högre antal TII i spädbarnsprovet (Figur 3I). Således beror det högre TII-antalet i spädbarnsprovet inte på ökad scaffold-täckning och belyser vikten av att bedöma cellfördelningar i lungan baserat på ställningens area, inte den totala synfältet.
Figur 1: Protokoll för skärning av lungvävnadsskivor. A) Lösningar och material: En agaroslösning på 3 % (w/v) som erhålls genom att 1,5 g agaros med låg smältpunkt löses upp i 50 ml steril fosfatbuffrad koksaltlösning. en plastmugg; ett lock av 50 ml koniskt rör; pincett och sax. (B) Lungvävnaderna dissekerades med hjälp av en fin pincett och steril sax. (C) Fyll botten av koppen med en liten mängd agaros och placera locket på agarosens yta; Förvara den sedan vid 4 °C i 5 minuter. (D) Tillsätt långsamt 1-2 ml flytande agaros till locket, placera försiktigt lungvävnadsbiten på locket och förvara den vid 4 °C i 2 minuter. (E,F) Häll den flytande agarosen i koppen tills lungvävnadsbiten är helt nedsänkt, förvara den vid 4 °C i 15 minuter. och bryt sedan plastkoppen försiktigt. (G) Använd ett vasst blad för att avlägsna överskott av agaros som omger lungvävnaden och lämna ett jämnt skikt med en tjocklek på cirka 5 mm runt vävnaden. H) Det utskurna lungvävnadsblocket limmas sedan försiktigt fast på vävnadshållaren. (I) Fyll vibratombuffertbrickan med PBS, placera is i det omgivande isbadet och installera provskivan i buffertbrickan. (J) Ställ in skärparametrar på vibratomens panel; skivtjocklek: 200 μm, frekvens: 100 Hz, knivens amplitud: 1,3 mm och bladets framhastighet på 0,02-0,04 mm/s. (K-M) Representativa bilder av en fritt flytande skiva som fortfarande är inbäddad i agaros och redo för immunofluorescensfärgning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Immunofluorescensbilder av lungstrukturen hos människa, gris och mus. (A-L) Representativa bilder av en alveolär gång, blodkärl, bronkiol och alveoler i lungvävnadsskivor från mus, gris respektive människa. SMA (visas i grönt) är en markör för glatta muskelceller och observeras i lungvävnadens kärl- och bronkialväggar. Elastin (visas i rött) utgör en del av lungornas extracellulära matris. (M) Kvantifiering av alveolär storlek genom att välja 20 slumpmässiga positioner på varje lungvävnadsskiva för både humana, gris- och musprover. Histogram användes för att illustrera fördelningen av alveolär storlek inom varje grupp. Skalstreck = 50 μm (AF, H-L), 100 μm (G). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Förkortningar: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol; LEA = Lycopersicon Esculentum lectin; SMA = aktin för glatt muskulatur; ms = mus; hmn = människa. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3. Distribution av typ 2-pneumocyter i prover från vuxna och spädbarn hos människa. (A,B) Representativa bilder av lungvävnad från vuxna och spädbarn färgade för HTII-280 (visas i rött), CD31 (visas i grönt) och LEA (visas i grått). (C,D) Representativa bilder av vuxna och spädbarn som visar enbart distribution av typ 2-pneumocyter. (E,F) Representativa bilder av en enskild typ 2-pneumocyt med encellsupplösning från lungprover från vuxna och spädbarn hos människa. G) Kvantifiering av antalet pneumocyter av typ 2 mellan prover från vuxna och spädbarn. H) Kvantifiering av lungvävnadsställningens yttäckning (% jämfört med luft) i prover från vuxna och spädbarn. (I) Kvantifiering av typ 2-pneumocyter permm2 vävnad i prover från vuxna och spädbarn. Skalstreck = 5 μm (E,F), 100 μm (A-D). n = 10 fov per prov. Oparat t-test eller Mann-Whitney-test. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Förkortningar: DAPI = 4', 6-diamidino-2-fenylindol; LEA = Lycopersicon Esculentum lectin; HTII = humana typ II-celler; CD31 = Trombocytendotelcellsadhesionsmolekyl-1/kluster av differentiering 31; fov = synfält. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande video S1: Video av 20 μm avbildningsvolym av en enda svinluftväg färgad med DAPI, LEA, SMA och elastin som visar en högupplöst bild av strukturen hos luftvägsväggelement. Förkortningar: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol; LEA = Lycopersicon Esculentum lectin; SMA = aktin för glatt muskulatur. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande video S2: Video av 30 μm avbildningsvolym av en enda alveol färgad med DAPI, LEA och HTII-280 som visar typ 2-pneumocytfördelning över strukturen. Förkortningar: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol; LEA = Lycopersicon Esculentum lectin; SMA = aktin för glatt muskulatur. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
I detta protokoll presenterar vi en förbättrad vibratombaserad metod för att generera lungsnitt. Jämfört med paraffinbaserade bearbetningstekniker är denna metod mer kostnadseffektiv, tidseffektiv och bättre för miljön22. Dessutom hjälper denna metod till att upprätthålla den strukturella integriteten hos lungvävnadsskivor och möjliggör avancerad immunofluorescensavbildning utan behov av antigenhämtning. Men under våra experiment hittade vi också vissa begränsningar i det här arbetsflödet. Sjuka lungor kan störa skärprocessen på grund av vävnadsförstörelse orsakad av patologiska förändringar. När du använder vibratomet för snittning kan luftvägsobstruktioner och svår fibrotisk lungvävnad hindra bladet, vilket gör processen att skära dessa vävnader mer utmanande. Detta kan dock övervinnas genom att minska bladhastigheten och stödja vävnaden med en fin pensel. Liknande utmaningar uppstår på grund av förtjockning av lungsäcken, vilket är ett vanligt utfall vid lungsäcksinflammation, kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL) och idiopatisk lungfibros (IPF)23,24,25. Om lungsäcken inte är av intresse för ett experiment rekommenderar vi att du tar bort den före snittning eller genom isolering av en lungvolym bort från lungsäcken. Om lungsäcken är nödvändig kan den skäras med en liknande manipulation som ovan, med långsammare bladhastigheter och skivstöd från en fin borste.
Även om precisionsskurna lungskivor kan bevara den tredimensionella arkitekturen och den ursprungliga miljön i lungan26, är det viktigt att notera att generering av PCLS är en komplex och tidskrävande process. Framgången med att generera lungvävnadsskivor beror i hög grad på effektiviteten av agarosfyllning, som i sin tur påverkas av närvaron av intakt pleura och livskraftiga injektionsställen i den erhållna vävnaden. Detta är enkelt att uppnå hos gnagare eftersom agaros lätt kan föras in genom luftstrupen i intakta lungor27,28,29. Men i stordjursforskning är biopsier som tas under ett experiment vanligtvis från distala lungsegment, som saknar tillräckligt stora luftvägar för att kanylera30,31. Således, istället för att injicera agaros i bronkerna eller blodkärlen, använder vi denna metod där lungvävnad, oavsett ursprungsart eller provvolym, bäddas in i agaros med låg smältpunkt för att generera lungvävnadsskivor. Detta tillvägagångssätt är tekniskt enklare och syftar till att minimera vävnadsskador så mycket som möjligt. Baserat på vår erfarenhet har denna metod visat sig vara mer effektiv och enkel när det gäller att generera lungvävnadssnitt. Den bevarar effektivt alveolernas morfologi och är särskilt lämplig för att skära lungvävnad, vilket möjliggör generering av repeterbar högupplöst multiplex fluorescensavbildning.
I denna studie demonstrerar vi vidare två urvalsbaserade kvantifieringar för de bilddata som genereras. Den första använde bildspårning för att bedöma skillnader i alveolär storlek mellan olika arter. Föga förvånande var musalveoler de minsta, medan gris- och människoalveoler var lika stora, vilket lyfter fram grisar som en intressant translationell modell för lungforskning.
För den andra kvantifieringen jämförde vi HTII-fördelningen mellan ett lungprov från en vuxen och ett spädbarn. Typ 2-pneumocyter spelar en viktig roll i strukturen av det distala lungepitelet. Denna unika förmåga hos TII bidrar till reparation och regenerering av det alveolära epitelet32. I den friska vuxna mänskliga lungan står TII för cirka 15 % av den totala cellpopulationen, medan deras täckning av den alveolära ytan uppskattas till cirka 5 %33. HTII-280 är en allmänt erkänd lungspecifik markör för att studera utvecklingen och svaret av alveolära epitelceller på skada, och den är specifikt lokaliserad till de apikala plasmamembranen hos TII. I experimentet erhölls vuxen vävnad från en donatorpatient som avlidit på grund av intracerebral blödning och hade samtidig lungskada, medan spädbarnsprovet kom från en kvävningsrelaterad dödlighet. Våra resultat tyder på att uttrycket av HTII-280 var signifikant lägre i lungprovet hos vuxna än i spädbarnsprovet. Intressant nog, medan HTII-280 uttrycks i majoriteten av HTII, kan dess uttryck också påverkas av vävnadskvalitet, och det är signifikant reducerat i skadad mänsklig lungvävnad34. Åldrade lungvävnader uppvisar en signifikant minskning av antalet och den sekretoriska aktiviteten hos TII jämfört med unga vävnader, och äldre individer uppvisar betydligt lägre proliferation, utsöndring och anti-apoptotisk aktivitet hos TII jämfört med dessa unga vävnader35. I linje med detta kan identifiering och detektion av ett cellyteprotein som är specifikt för humana TII hjälpa till att bedöma svårighetsgraden av lungskada och utvärdera behandlingsmetoder som syftar till att förbättra lungreparationen36,37. Således, med hjälp av denna pipeline, skulle det vara av stort intresse att genomföra alveolära TII-studier i större mänskliga kohorter av hälsa och sjukdom.
Sammanfattningsvis presenterar detta protokoll ett snabbare och enklare tillvägagångssätt för att skära lungvävnad. Denna metod ger detaljerade instruktioner för beredning, skärning och färgning av lungvävnad, vilket säkerställer bevarandet av den intakta lungvävnadsstrukturen. Det optimerar modellen för att studera både friska och sjuka lungarkitekturer, vilket leder till förbättrad experimentell effektivitet. Sammantaget introducerar denna studie ett lovande tillvägagångssätt för att undersöka komplex rumslig biologi i lungvävnadens patofysiologi mellan arter, vilket kan bidra till att bättre förstå de molekylära mekanismerna som spelar in i sjukdom och reparation.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma för finansieringen från Stiftelsen Wallenberg Molekylär Medicin och Stamcellscentrum vid Lunds universitet samt Lund University Bioimaging Centre (LBIC) för tillgången till Nikon A1RHD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well tissue culture inserts | SARSTEDT | 83.3932.300 | |
| 4% paraformaldehyde | SOLVECO | 6095714 | |
| 4’, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher scientific | D1306 | |
| 50 mL Falcon tube | SARSTEDT | 2045221 | |
| Cluster of differentiation 31 (CD31) | Abcam | ab28364 | |
| Confocal microscope | Nikon | A1R HD25 | |
| Elastin | Abcam | ab23747 | |
| Epredia X1000 Coverslip | Thermo Fisher scientific | 10318963 | |
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher scientific | 10149870 | |
| Forceps | AESCULAP | FB395R | |
| Goat anti-mouse 647 | Invitrogen | A21235 | |
| Goat anti-rabbit 568 | Invitrogen | A11011 | |
| Human type II cells | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | |
| Invitrogen Fluoromount-G Mounting Medium | Thermo Fisher scientific | E41473 | |
| Low gelling temperature Agarose | Sigma-Aldrich | 1003467046 | |
| Lycopersicon Esculentum lectin | Thermo Fisher scientific | 2531965 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher scientific | 50-100-8798 | |
| Plastic cup | kontorsgiganten | 885221 | |
| Scissors | STILLE | 101-8380-18 | |
| Smooth muscle actin | Abcam | ab5694 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | K54329188239 | |
| Super glue | LOCTITE | 2721643 | |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200S |
References
- Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
- Kawasaki, H., et al. The NanoSuit method: a novel histological approach for examining paraffin sections in a nondestructive manner by correlative light and electron microscopy. Laboratory Investigation. 100 (1), 161-173 (2020).
- Silva, I., et al. A Semi-quantitative scoring system for green histopathological evaluation of large animal models of acute lung injury. BIO-PROTOCOL. 12 (16), e4493 (2022).
- Kim, J. H., et al. Optimizing tissue-clearing conditions based on analysis of the critical factors affecting tissue-clearing procedures. Scientific Reports. 8 (1), 12815 (2018).
- Jain, D., et al. Immunocytochemistry for predictive biomarker testing in lung cancer cytology. Cancer Cytopathology. 127 (5), 325-339 (2019).
- Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. Histological stains: a literature review and case study. Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2015).
- Morrison, L. E., Lefever, M. R., Lewis, H. N., Kapadia, M. J., Bauer, D. R. Conventional histological and cytological staining with simultaneous immunohistochemistry enabled by invisible chromogens. Laboratory Investigation. 102 (5), 545-553 (2022).
- Dineshshankar, J., et al. Kerosene as an alternative to xylene in histopathological tissue processing and staining: An experimental study. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11 (6), 376 (2019).
- Abdelaal, H. M., et al. Comparison of vibratome and compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining. Biological Procedures Online. 17 (1), 2 (2015).
- Siwczak, F., Hiller, C., Pfannkuche, H., Schneider, M. R. Culture of vibrating microtome tissue slices as a 3D model in biomedical research. Journal of Biological Engineering. 17 (1), 36 (2023).
- Bèchet, N. B., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I.
- Bèchet, N. B., Kylkilahti, T. M., Mattsson, B., Petrasova, M., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I. Light sheet fluorescence microscopy of optically cleared brains for studying the glymphatic system. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 40 (10), 1975-1986 (2020).
- Bai, Y., Ai, X. Utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle. Journal of Visualized Experiments. (183), (2022).
- Gerckens, M., et al. Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
- Lam, M., Lamanna, E., Organ, L., Donovan, C., Bourke, J. E. Perspectives on precision cut lung slices—powerful tools for investigation of mechanisms and therapeutic targets in lung diseases. Frontiers in Pharmacology. 14, 1162889 (2023).
- Liu, G., et al. Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology. Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).
- Cooper, P. R., et al. Formoterol and salmeterol induce a similar degree of β 2- adrenoceptor tolerance in human small airways but via different mechanisms. British Journal of Pharmacology. 163 (3), 521-532 (2011).
- Ochoa, L. F., et al. Imaging of murine whole lung fibrosis by large scale 3D microscopy aided by tissue optical clearing. Scientific Reports. 8 (1), 13348 (2018).
- Tehrani, K. F., Park, J., Chaney, E. J., Tu, H., Boppart, S. A. Nonlinear imaging histopathology: a pipeline to correlate gold-standard hematoxylin and eosin staining with modern nonlinear microscopy. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 29 (4), (2023).
- Branchfield, K., et al. A three-dimensional study of alveologenesis in mouse lung. Developmental Biology. 409 (2), 429-441 (2016).
- Li, Y., et al. Precision vibratome for high-speed ultrathin biotissue cutting and organ-wide imaging. iScience. 24 (9), 103016 (2021).
- Qian, G., et al. DOCK2 promotes pleural fibrosis by modulating mesothelial to mesenchymal transition. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 66 (2), 171-182 (2022).
- Cagle, P. T., Allen, T. C. Pathology of the pleura: What the pulmonologists need to know. Respirology. 16 (3), 430-438 (2011).
- Jantz, M. A., Antony, V. B.
- Viana, F., O’Kane, C. M., Schroeder, G. N. Precision-cut lung slices: A powerful ex vivo model to investigate respiratory infectious diseases. Molecular Microbiology. 117 (3), 578-588 (2022).
- Paddenberg, R., Mermer, P., Goldenberg, A., Kummer, W. Videomorphometric analysis of hypoxic pulmonary vasoconstriction of intra-pulmonary arteries using murine precision cut lung slices. Journal of Visualized Experiments. (83), e50970 (2014).
- Lyons-Cohen, M. R., Thomas, S. Y., Cook, D. N., Nakano, H. Precision-cut mouse lung slices to visualize live pulmonary dendritic cells. Journal of Visualized Experiments. (122), e55465 (2017).
- Klouda, T., Kim, H., Kim, J., Visner, G., Yuan, K. Precision cut lung slices as an efficient tool for ex vivo pulmonary vessel structure and contractility studies. Journal of Visualized Experiments. (171), e62392 (2021).
- Ghaidan, H., et al. Reduction of primary graft dysfunction using cytokine adsorption during organ preservation and after lung transplantation. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
- Guenthart, B. A., et al. Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform. Nature Communications. 10 (1), 1985 (1985).
- Ruaro, B., et al. The history and mystery of alveolar epithelial type II cells: focus on their physiologic and pathologic role in lung. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2566 (2021).
- Crapo, J. D., Barry, B. E., Gehr, P., Bachofen, M., Weibel, E. R. Cell number and cell characteristics of the normal human lung. The American Review of Respiratory Disease. 126 (2), 332-337 (1982).
- Evans, K. V., Lee, J. -H. Alveolar wars: The rise of in vitro models to understand human lung alveolar maintenance, regeneration, and disease. Stem Cells Translational Medicine. 9 (8), 867-881 (2020).
- Chen, J. -X., et al. Sirtuin 3 ameliorates lung senescence and improves type II alveolar epithelial cell function by enhancing the FoxO3a-dependent antioxidant defense mechanism. Stem Cells and Development. 30 (17), 843-855 (2021).
- Zacharias, W. J., et al. Regeneration of the lung alveolus by an evolutionarily conserved epithelial progenitor. Nature. 555 (7695), 251-255 (2018).
- Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (10), 891-901 (2010).
