Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

חתך ויברטומי אוטומטי של רקמת ריאה משובצת אגרוז להדמיית פלואורסצנטיות מרובת משתתפים

Published: October 6, 2023 doi: 10.3791/65943
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3,4
1Wallenberg Centre for Molecular Medicine, Lund University, 2Department of Clinical Sciences, Lund University, 3Lund Stem Cell Centre, Lund University, 4Department of Cardiothoracic Surgery and Transplantation, Skåne University Hospital

Summary

פיתחנו טכניקת עיבוד רקמות המשתמשת ברקמת ריאה משובצת ויברטומה ואגרוז ליצירת קטעי ריאה, ובכך אפשרנו רכישה של תמונות ברזולוציה גבוהה של ארכיטקטורת ריאות. השתמשנו בצביעת אימונופלואורסנציה כדי לצפות בביטוי חלבונים מרחבי באמצעות סמנים מבניים ספציפיים של הריאה.

Abstract

בשל השבריריות המבנית הטבועה בה, הריאה נחשבת לאחת הרקמות הקשות יותר לעיבוד עבור קריאות מיקרוסקופיות. כדי להוסיף תמיכה מבנית לחתך, חתיכות של רקמת ריאה מוטמעות בדרך כלל בתרכובת פרפין או OCT ונחתכות עם מיקרוטום או קריוסטט, בהתאמה. טכניקה עדכנית יותר, המכונה פרוסות ריאה חתוכות במדויק, מוסיפה תמיכה מבנית לרקמת ריאה טרייה באמצעות חדירת אגרוז ומספקת פלטפורמה לשמירה על רקמת הריאה הראשונית בתרבית. עם זאת, בשל מיסוך אפיטופים ועיוות רקמות, אף אחת מהטכניקות הללו אינה מתאימה לפיתוח קריאות הדמיית אור מתקדמות הניתנות לשחזור, שיהיו תואמות בין נוגדנים ומינים מרובים.

לשם כך, פיתחנו צנרת לעיבוד רקמות, המשתמשת בהטבעה אגרוזית של רקמת ריאה קבועה, יחד עם חתך ויברטומי אוטומטי. זה הקל על יצירת קטעי ריאה בעובי של 200 מיקרומטר עד 70 מיקרומטר, בריאות עכבר, חזיר ואדם, שאינם דורשים שליפת אנטיגן, ומייצגים את הגרסה הכי פחות "מעובדת" של הרקמה המבודדת המקומית. באמצעות פרוסות אלה, אנו חושפים קריאת הדמיה מרובת משתתפים המסוגלת להפיק תמונות ברזולוציה גבוהה שניתן להשתמש בביטוי החלבונים המרחבי שלהן כדי לכמת ולהבין טוב יותר את המנגנונים העומדים בבסיס פגיעה והתחדשות ריאתית.

Introduction

פרוסות רקמת ריאה Ex vivo נמצאות בשימוש נרחב במחקר של מחלת ריאות1. תקני הזהב הנוכחיים, במיוחד במחקרים קליניים ותרגומיים בבעלי חיים גדולים, משתמשים בהמטוקסילין ובצביעת אאוזין בשילוב עם מיקרוסקופ ברייטפילד וניקוד מבוסס צופה כדי להעריך ולדרג תפקוד ריאות 2,3. למרות שהיא עדיין טכניקה בעלת ערך, היא מציגה מגבלות במונחים של רזולוציה מרחבית ומספר הסמנים שניתן לצלם בו זמנית. יתר על כן, רקמת הריאה נדרשת לעבור שטיפות נרחבות על בסיס ממס, מה שגורם להתייבשות, התכווצות והתייבשות מחדש של הרקמה לפני ההדמיה הסופיתשלה 4. תהליך זה לא רק גוזל זמן אלא גם אינו ידידותי לסביבה, מסווה אפיטופים של חלבונים, ועלול לעורר שינויים מבנייםברקמה 5,6,7,8. עם זאת, עבור רקמת ריאה, הטבעה בפרפין לפני חתך היה הכרח בשל השבריריות המבנית של הריאה. לעומת זאת, איברים מוצקים כמו המוח ניתנים לחיתוך באמצעות מיקרוטום רוטט (ויברטום), הן ברקמה קבועה והן ברקמה טרייה 9,10,11,12.

כדי לאפשר חתך ויברטומי ברקמת ריאה, נקבעה שיטה המכונה פרוסות ריאה חתוכות בדיוק (PCLS) שבה נקודת התכה נמוכה מוזרקת לרקמת ריאה טרייה דרך דרכי הנשימה או כלי הדם ומשאירה להתמצק13,14. האגרוז בדרכי הנשימה מספק תמיכה מבנית מספקת כדי לאפשר חתך ויברטומי 9,14. במכרסמים, זה פשוט להשגה כמו agarose ניתן להזריק דרך קנה הנשימה; עם זאת, ברקמת חזיר ואדם, זה יכול להיות מאתגר לאתר נתיב אוויר / כלי מתאים בתוך ביופסיה נתונה15,16. יתר על כן, גם אם נמצא נתיב אוויר/כלי שיט כזה, נדרש בדרך כלל כוח משמעותי כדי להזריק את האגרוז, מה שעשוי להשפיע על מורפולוגיית הריאה הבאה17.

כדי להתגבר על האתגרים המנוסים בהטבעה / חתך / צביעה של פרפין וזרימת העבודה של PCLS, הקמנו צינור עיבוד חדש לרקמת ריאה קבועה. תהליך עבודה זה מאפשר שימוש בויברטום לחיתוך, יכול לייצר פרוסות דקות יותר מאשר ב- PCLS, ומניב פרוסות שאינן דורשות שליפת אנטיגן להדמיית פלואורסצנטיות מרובה. שיטה זו מציעה אמצעי של "עיבוד מינימלי" ליצירת קטעי ריאות שניתן להשתמש בהם במיקרוסקופ אור מתקדם. יתר על כן, ניתן להשתמש בקריאות הדמיה כדי להדגים את היחסים המרחביים של תאים ומבנים אנטומיים בתוך רקמת הריאה על ידי לכידת הארכיטקטורה הנפחית של הרקמה 18,19,20,21. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול ליצירת מקטעי ריאה אלה ומדגים כתמים מרובים המיושמים על כל אחת מהרקמות הללו וכיצד ניתן להשתמש בנתוני הדמיה מתקדמים אלה לצורך כימות.

Protocol

ריאות עכבר נתרמו על ידי חוקרים באמצעות מערכות איברים אחרות במאמץ לקיים את 3Rs. כל ההליכים בחזירים בוצעו בהתאם לדירקטיבה האירופית 2010/63/EU ואושרו על ידי הוועדה האתית לחקר בעלי חיים במאלמו-לונד (Dnr 5.8.18-05527/2019) ונערכו בהתאם להנחיות CODEX של מועצת המחקר השבדית. אישור לשימוש בדגימות אנושיות ניתן על ידי ועדת האתיקה הלאומית השבדית (Dnr 2020-07115 ו- Dnr 2020-01864). עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. הכנת פתרונות וחומרים

  1. תקן את רקמת הריאה ב 4% paraformaldehyde בטמפרטורת החדר במשך 48 שעות. לאחר מכן, להעביר את רקמת הריאה לצינור חרוטי 50 מ"ל מלא במי מלח חוצצים פוספט (PBS) המכיל 0.01% נתרן אזיד.
  2. הכינו תמיסת אגרוז 3% (w/v) על ידי המסת 1.5 גרם של אגרוז בעל נקודת התכה נמוכה ב-50 מ"ל של PBS סטרילי. הכינו פלסטיק, מלקחיים עדינים ומספריים סטריליים.
  3. מחממים את האגרוז במיקרוגל עד שהוא רותח, ואז מקררים אותו ל 42 מעלות צלזיוס באמבט מים. שמור את האגרוז בצורתו הנוזלית על ידי אחסונו, באמבט המים עד שיהיה מוכן לשימוש.
    הערה: בעת חימום האגרוז, צפו במיקרוגל עד שהוא מתחיל לרתוח כדי שלא יעלה על גדותיו. זה בדרך כלל לוקח בערך 1.5 דקות.

2. רקמת ריאה משובצת באגרוז

  1. הרימו את ביופסיית הריאה מה-PBS-azide ונתחו בזהירות את אונות הריאה בעזרת מלקחיים עדינים ומספריים סטריליים. חתכו את אונת הריאה לגושים קטנים יותר.
    הערה: בעוד חתך עם הצדר אפשרי, צרורות אלסטין עבים שלה יכול לעכב חיתוך עם להב ויברטום. לכן, אנו ממליצים על הסרתו אם אין צורך.
  2. חותכים פלסטיק באמצע ומוסיפים כמות קטנה של אגרוז לתחתיתה. מניחים את המכסה מצינור חרוטי 50 מ"ל (השפה מוסרת) על פני האגרוז ומאחסנים את הכוס ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לאפשר לאגרוז להתמצק לשימוש מאוחר יותר.
  3. מוציאים את הפלסטיק מהמקרר בטמפרטורה 4°C, מוסיפים כ-1 מ"ל של אגרוז נוזלי על המכסה, ואז מניחים בעדינות את בלוק רקמת הריאה על המכסה. השאירו את האגרוז למשך 2-3 דקות כדי להתמצק למחצה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשפוך לאט את agarose נוזלי על רקמת הריאה עד שהוא שקוע לחלוטין.
  4. מכניסים למקרר ל-4°C למשך כ-15 דקות עד שהאגרוז מתמצק. לאחר מכן, השתמשו בזהירות בלהב חד כדי להסיר אגרוז נוסף סביב רקמת הריאה, והשאירו שכבה אחידה בעובי של כ-5 מ"מ סביב הרקמה (איור 1).

3. חיתוך קטעי רקמת ריאה

  1. כדי להכין את רקמת הריאה לחתך, חברו כל בלוק רקמה לדיסק הדגימה של הוויברטומה באמצעות דבק על. לאחר מכן, מלאו את מגש חיץ הוויברטום ב-PBS והניחו קרח באמבט הקרח שמסביב. לבסוף, התקן בזהירות את דיסק הדגימה במגש החיץ.
  2. פורסים את רקמת הריאה עם הוויברטומה עם ההגדרות הבאות: עובי: 200 מיקרומטר, תדירות: 100 הרץ, משרעת הלהב: 1.3 מ"מ, ומהירות קדימה של הלהב של 0.02-0.03 מ"מ לשנייה, התלויה בנוקשות הרקמות.
    הערה: חיתוך אפשרי עד לעובי של 70 מיקרומטר אם מהירות הלהב מופחתת ל-0.01 מ"מ לשנייה. ויברטומים מסוימים (למשל, Leica V1200s) מאפשרים אוטומציה של חתכים על ידי הגדרת חלון חיתוך.
  3. כדי לאסוף חלקים, העבירו בעדינות את פרוסת הטישו על ידי גריפה עם מברשת ממגש הוויברטום לצלחת של 24 בארות מלאה ב-0.01% אזיד ב-PBS. לבסוף, לשמר את פרוסות הריאה ב 4 °C (75 °F).

4. אימונוסטיין של אלסטין, CD31, HTII-280 ו-SMA

  1. יש לחדור ולחסום (אלבומין בסרום בקר 1% + 0.5% טריטון + 5% סרום עיזים רגיל) את הרקמה ב-4°C תחת ניעור עדין למשך 45 דקות.
  2. לדלל את הנוגדנים הראשוניים (SMA 1:500; אלסטין 1:250; CD31 1:250; HTII-280 1:250) ב-PBS, יש להוסיף 300 μL לכל באר, ולדגור למשך הלילה ב-4°C תחת ניעור עדין.
  3. מבלי לגעת בפרוסה ולהסיר את הנוגדנים הראשוניים עם קצה פיפטה, יש לשטוף 3 x 20 דקות (400 μL) עם PBS.
  4. לדלל את הנוגדנים המשניים (1:1000) ב- PBS, להוסיף 300 μL לכל באר, ולדגור ב 4 ° C תחת ניעור עדין במשך 90 דקות.
  5. הסר את הנוגדנים המשניים עם קצה פיפטה, הוסף 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (1:1000) ועגבניות lectin-488 (1:500) עבור דגירה של 30 דקות, ושטף במשך 3 x 10 דקות עם PBS.
  6. הניחו שלוש טיפות של אמצעי הרכבה על השקופית, הרכיבו מכסה והמשיכו להדמיה.

Representative Results

תהליך יצירת פרוסות רקמת הריאה כולל מספר שלבים מרכזיים, כולל הכנה, הטבעה וחתך. תמיסת האגרוז (3% (w/v) מיוצרת על ידי המסת 1.5 גרם של אגרוז בעל נקודת התכה נמוכה ב-50 מ"ל של PBS סטרילי. החומרים המתכלים הדרושים כוללים פלסטיק, מכסה מצינור חרוטי של 50 מ"ל (השפה הוסרה), מלקחיים ומספריים. רקמת הריאה עוברת כריתה זהירה לגושים קטנים יותר בעזרת מלקחיים עדינים ומספריים סטריליים (איור 1A,B). לאחר מכן, כדי להטמיע את גושי רקמת הריאה, תחתית הכוס מלאה בכמות קטנה של האגרוז, מכסה מונח על פני השטח של האגרוז, והכוס מאוחסנת בטמפרטורה של 4°C למשך 5 דקות (איור 1C). כ 1 מ"ל של agarose נוזלי מתווסף למכסה, ואת בלוק רקמת הריאה ממוקם על המכסה. האגרוז נשאר למשך 2-3 דקות כדי להתמצק למחצה בטמפרטורת החדר (איור 1D). ברגע שגוש ריאה מוחזק במקומו על ידי האגרוז המוצק למחצה, האגרוז הנוזלי מוזג לכוס עד שגוש רקמת הריאה שקוע במלואו. זה מאוחסן ב-4°C למשך 15 דקות (איור 1E,F). הטמעת האגרוז בעלת נקודת ההתכה הנמוכה מספקת את התמיכה והנוקשות הדרושות לרקמת הריאה, מה שעוזר לשמור על הארכיטקטורה המקורית שלה במהלך תהליך החיתוך. להב חד משמש להסרת אגרוז עודף סביב רקמת הריאה. סביב הרקמה נותרת שכבה אחידה בעובי של כ-5 מ"מ (איור 1G). לאחר מכן בלוק רקמת הריאה שנכרת מודבק בזהירות על מחזיק הרקמה (איור 1H). מגש חיץ הוויברטומים מלא ב-PBS, קרח ממוקם באמבט הקרח שמסביב, ודיסק הדגימה מותקן במגש החיץ (איור 1I). פרמטרי חיתוך הוויברטומה שנקבעו בלוח היו: עובי פרוסה: 200 מיקרומטר; תדר: 100 הרץ; משרעת הלהב: 1.3 מ"מ; מהירות קדימה של הלהב: 0.02-0.03 מ"מ לשנייה, אשר תלויה בנוקשות הרקמה (איור 1J). לבסוף, הצביעה מתבצעת על פרוסות צפות בחופשיות (איור 1K-M).

צביעה אימונופלואורסצנטית בוצעה בחתכים של 200 מיקרומטר מכל מין עבור אקטין שריר חלק (SMA, תא שריר חלק וסמן מיופיברובלסט), אלסטין (חלבון מטריצה חוץ-תאי) וליקופסיקון אסקולנטום לקטין (LEA), הנקשר לתאי אפיתל ברונכואלבאולריים. הריאה היא רקמה הטרוגנית מבחינה מבנית, ולכן נצפתה התפלגות דיפרנציאלית של SMA ואלסטין בין מבנים, כולל צינורות מכתשית, כלי דם, סימפונות תוך-ריאתיים ונאדיות מעכברים, חזירים ובני אדם (איור 2A-L). עיבוד ברזולוציה גבוהה של נפח 20 מיקרומטר של סימפונות מראה כיצד ניתן לבחון מבנים עדינים בתוך הריאה ברמה תלת ממדית למחצה (וידאו משלים S1). כדוגמה כמותית, תוך שימוש במעקב אחר תמונות, אנו מראים כיצד גודל הנאדיות שונה בין דגימות (n = 20 נאדיות) (איור 2L,M).

כדי להראות כיצד ניתן לנצל כמותית את נתוני ההדמיה המתקדמים הללו, השווינו התפלגות תאי פנאומוציט מסוג 2 (TII) ברקמת ריאה אנושית ממבוגר ותינוק. לנוגדן תאי מכתשית מסוג 2 הספציפי לאדם, HTII-280, יש זיקה חזקה לפני השטח של תאים אנושיים מסוג 2 (איור 3A-F). תאים אלה ניתן גם לראות בחלל התלת-ממדי של נאדית בודדת באמצעות הדמיה נפחית (וידאו משלים S2). כדי לכמת את מספר TII בין דגימות המבוגרים והתינוקות, עיבדנו את ספירת HTII-280 על פני 10 שדות ראייה אקראיים (fov). בין הדגימות האלה, דגימת התינוקות הניבה ספירת תאי TII גבוהה משמעותית (איור 3G). אולם דגימת התינוקות גם הראתה כיסוי פיגומים גבוה משמעותית מאשר המבוגר, מה שיכול להסביר את מספר התאים הגבוה יותר (איור 3H). כדי להסביר זאת, לאחר מכן הערכנו את מספר TIIs בהתבסס על כיסוי פיגומים, כתאים למ"מ 2 של רקמה, שעדיין שמרו על מספר גבוה משמעותית של TII בדגימת התינוקות (איור 3I). לפיכך, ספירת TII גבוהה יותר בדגימת התינוקות אינה נובעת מכיסוי פיגומים מוגבר ומדגישה את החשיבות של הערכת התפלגות התאים בריאה בהתבסס על שטח הפיגום ולא על בסיס ה- FOV הכולל.

Figure 1
איור 1: פרוטוקול לחיתוך פרוסות רקמת ריאה. (A) התמיסות והחומרים: תמיסת אגרוז של 3% (w/v) המתקבלת על ידי המסת 1.5 גרם של אגרוז בעל נקודת התכה נמוכה ב-50 מ"ל של מלח סטרילי חוצץ פוספט; פלסטיק; מכסה מ 50 מ"ל צינור חרוט; מלקחיים, ומספריים. (B) רקמות הריאה נותחו באמצעות מלקחיים עדינים ומספריים סטריליים. (ג) ממלאים את תחתית הכוס בכמות קטנה של אגרוז ומניחים את המכסה על פני האגרוז; לאחר מכן, אחסנו אותו בטמפרטורה של 4°C למשך 5 דקות. (D) הוסיפו 1-2 מ"ל של אגרוז נוזלי למכסה באיטיות, הניחו את גוש רקמת הריאה על המכסה בזהירות, ואחסנו אותו בטמפרטורה של 4°C למשך 2 דקות. (E,F) מזגו את האגרוז הנוזלי לכוס עד שגוש רקמת הריאה שקוע במלואו, אחסנו אותו בטמפרטורה של 4°C למשך 15 דקות, ואז לשבור את הפלסטיק בעדינות. (G) השתמשו בלהב חד כדי להסיר עודפי אגרוז סביב רקמת הריאה, והשאירו שכבה אחידה בעובי של כ-5 מ"מ סביב הרקמה. (H) בלוק רקמת הריאה שנכרת מודבק בזהירות על מחזיק הרקמה. (I) מלא את מגש מאגר הוויברטומים ב-PBS, מקם קרח באמבט הקרח שמסביב והתקן את דיסק הדגימה במגש החיץ. (J) להגדיר פרמטרי חיתוך בלוח הוויברטום; עובי פרוסה: 200 מיקרומטר, תדירות: 100 הרץ, משרעת הסכין: 1.3 מ"מ, ומהירות קדימה של הלהב 0.02-0.04 מ"מ לשנייה. (K-M) תמונות מייצגות של פרוסה צפה בחופשיות עדיין משובצת באגרוז ומוכנה לצביעת אימונופלואורסצנטיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תמונות אימונופלואורסצנטיות של מבנה הריאה בבני אדם, חזירים ועכברים. (A-L) תמונות מייצגות של צינור מכתשית, כלי דם, סימפונות ונאדיות בפרוסות רקמת ריאה של עכבר, חזיר ואדם, בהתאמה. SMA (מוצג בירוק) הוא סמן לתאי שריר חלקים ונצפה בדפנות כלי הדם והסימפונות של רקמת הריאה. אלסטין (מוצג באדום) מהווה חלק מהמטריצה החוץ תאית של הריאות. (M) כימות גודל הנאדיות על ידי בחירת 20 מיקומים אקראיים על כל פרוסת רקמת ריאה עבור דגימות אדם, חזיר ועכבר. היסטוגרמות שימשו כדי להמחיש את התפלגות גודל הנאדיות בתוך כל קבוצה. פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר (A-F, H-L), 100 מיקרומטר (G). מבחן Kruskall-Wallis. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. קיצורים: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; LEA = Lycopersicon Esculentum lectin; SMA = אקטין שריר חלק; ms = עכבר; HMN = אדם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3. התפלגות פנאומוציט מסוג 2 בדגימות אדם, מבוגרים ותינוקות. (א,ב) תמונות מייצגות של רקמת ריאה אנושית של מבוגרים ותינוקות מוכתמת עבור HTII-280 (מוצג באדום), CD31 (מוצג בירוק) ו-LEA (מוצג באפור). (ג,ד) תמונות מייצגות של בני אדם בוגרים ותינוקות המציגות התפלגות פנאומוציט מסוג 2 בלבד. (ה,ו) רזולוציה של תא בודד מייצגת תמונות של פנאומוציט מסוג 2 בודד מדגימות ריאה אנושיות של מבוגרים ותינוקות. (G) כימות מספר הפנאומוציטים מסוג 2 בין דגימות מבוגרים לתינוקות. (H) כימות כיסוי שטח פיגום רקמת הריאה (% לעומת אוויר) בדגימות מבוגרים ותינוקות. (I) כימות של פנאומוציט מסוג 2 למ"מ 2 של רקמה בדגימות מבוגרים ותינוקות. פסי קנה מידה = 5 מיקרומטר (E,F), 100 מיקרומטר (A-D). n = 10 fov לדגימה. מבחן t לא מזווג או מבחן מאן-ויטני. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. קיצורים: DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole; LEA = Lycopersicon Esculentum lectin; HTII = תאים מסוג II אנושיים; CD31 = מולקולת הידבקות תאי אנדותל טסיות דם-1/אשכול התמיינות 31; FOV = שדה ראייה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

וידאו משלים S1: וידאו של נפח הדמיה של 20 מיקרומטר של נתיב אוויר חזירי יחיד מוכתם באמצעות DAPI, LEA, SMA ואלסטין המציג תצוגה ברזולוציה גבוהה של המבנה של אלמנטים בדופן נתיב האוויר. קיצורים: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; LEA = Lycopersicon Esculentum lectin; SMA = אקטין שריר חלק. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

וידאו משלים S2: וידאו של נפח הדמיה של 30 מיקרומטר של נאדית בודדת מוכתמת באמצעות DAPI, LEA ו-HTII-280 המראה פיזור פנאומוציט מסוג 2 על פני המבנה. קיצורים: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; LEA = Lycopersicon Esculentum lectin; SMA = אקטין שריר חלק. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

בפרוטוקול זה אנו מציגים שיטה משופרת מבוססת ויברטומים ליצירת קטעי ריאה. בהשוואה לטכניקות עיבוד מבוססות פרפין, שיטה זו חסכונית יותר, חסכונית יותר בזמן וטובה יותר לסביבה22. יתר על כן, שיטה זו מסייעת לשמור על שלמות המבנה של פרוסות רקמת הריאה ומאפשרת הדמיה אימונופלואורסצנטית מתקדמת ללא צורך בשליפת אנטיגן. עם זאת, במהלך הניסויים שלנו, מצאנו גם מגבלות מסוימות לזרימת העבודה הזו. ריאות חולות יכולות להפריע לתהליך החיתוך עקב הרס רקמות הנגרם על ידי שינויים פתולוגיים. בעת שימוש בויברטומה לחיתוך, חסימות דרכי הנשימה ורקמת ריאה פיברוטית חמורה יכולות לעכב את הלהב, מה שהופך את תהליך חיתוך רקמות אלה למאתגר יותר. עם זאת, ניתן להתגבר על כך על ידי הפחתת מהירות הלהב ותמיכה ברקמה עם מברשת צבע עדינה. אתגרים דומים נובעים מהתעבות הצדר, שהיא תוצאה שכיחה בדלקת ריאות, מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) ופיברוזיס ריאתי אידיופתי (IPF)23,24,25. אם הצדר אינו מעניין לניסוי, אנו ממליצים להסיר אותו לפני החתך או על ידי בידוד נפח ריאה הרחק מהצדר. אם הצדר נחוץ, ניתן לחתוך אותו באמצעות מניפולציה דומה לזו שלעיל, הכוללת מהירויות להב איטיות יותר ותמיכה בפרוסה ממברשת עדינה.

בעוד פרוסות ריאה חתוכות במדויק יכולות לשמר את הארכיטקטורה התלת-ממדית והסביבה הטבעית של הריאה26, חשוב לציין כי יצירת PCLS היא תהליך מורכב וגוזל זמן. ההצלחה של יצירת פרוסות רקמת הריאה תלויה מאוד ביעילות של מילוי agarose, אשר, בתורו, מושפע על ידי נוכחות של צדר שלם אתרי הזרקה קיימא ברקמה המתקבלת. זה פשוט להשגה במכרסמים כמו agarose יכול בקלות להיות מוכנס דרך קנה הנשימה לתוך ריאות שלמות27,28,29. עם זאת, במחקר בבעלי חיים גדולים, ביופסיות שנלקחות בניסוי הן בדרך כלל ממקטעי ריאות דיסטליים, אשר חסרים נתיב אוויר גדול מספיק כדי לקנן30,31. לכן, במקום להזריק אגרוז לסימפונות או לכלי הדם, אנו מאמצים שיטה זו שבה רקמת הריאה, ללא קשר למין המקור או נפח הדגימה, מוטמעת באגרוז בנקודת התכה נמוכה כדי ליצור פרוסות רקמת ריאה. גישה זו קלה יותר מבחינה טכנית ומטרתה למזער את הנזק לרקמות ככל האפשר. בהתבסס על הניסיון שלנו, שיטה זו הוכיחה יעילות גבוהה יותר וקלות ביצירת קטעי רקמת ריאה. הוא משמר ביעילות את המורפולוגיה של הנאדיות ומתאים במיוחד לחיתוך רקמת ריאה, ומאפשר יצירת הדמיה פלואורסצנטית רב-תכליתית ברזולוציה גבוהה הניתנת לחזרה.

במחקר זה, אנו מדגימים גם שני כימות מבוסס מדגם עבור נתוני ההדמיה שנוצרו. הראשון השתמש במעקב אחר תמונות כדי להעריך הבדלים בגודל הנאדיות בין דגימות מינים. באופן לא מפתיע, נאדיות עכברים היו הקטנות ביותר, בעוד נאדיות חזיר ונאדיות אנושיות היו דומות בגודלן, מה שהדגיש חזירים כמודל תרגום מעניין לחקר ריאות.

לצורך הכימות השני, השווינו את התפלגות HTII בין דגימת ריאות של מבוגרים לתינוקות. פנאומוציטים מסוג 2 ממלאים תפקיד חיוני במבנה אפיתל הריאה הדיסטלי. יכולת ייחודית זו של TIIs תורמת לתיקון והתחדשות של אפיתל מכתשית32. בריאה האנושית הבוגרת והבריאה, TIIs מהווים כ-15% מכלל אוכלוסיית התאים, בעוד שהכיסוי שלהם של שטח הפנים של הנאדיות מוערך בכ-5%33. HTII-280 הוא סמן ספציפי לריאות מוכר לחקר ההתפתחות והתגובה של תאי אפיתל בנאדיות לפציעה, והוא ממוקם באופן ספציפי לקרומי הפלזמה האפיקליים של TIIs. בניסוי התקבלה רקמה בוגרת מתורם שנפטר עקב דימום תוך-מוחי וסבל מפגיעה ריאתית במקביל, ואילו דגימת התינוק הגיעה מתמותה הקשורה לחנק. הממצאים שלנו מצביעים על כך שהביטוי של HTII-280 היה נמוך משמעותית בדגימת הריאה הבוגרת מאשר בדגימת התינוקות. מעניין לציין כי בעוד HTII-280 מתבטא ברוב HTIIs, הביטוי שלו יכול להיות מושפע גם מאיכות הרקמות, והוא מופחת באופן משמעותי ברקמת הריאה האנושית הפגועה34. רקמות ריאה מזדקנות מציגות ירידה משמעותית במספר ובפעילות ההפרשה של TII בהשוואה לרקמות צעירות, ואנשים מבוגרים מפגינים התפשטות, הפרשה ופעילות אנטי-אפופטוטית נמוכה משמעותית של TII בהשוואה לרקמות צעירות35. בהתאם לכך, זיהוי וזיהוי של חלבון פנים-תא ספציפי ל-TIIs אנושיים יכול לסייע בהערכת חומרת הפגיעה הריאה ובהערכת גישות טיפול שמטרתן לשפר את תיקון הריאות36,37. לכן, באמצעות צינור זה, יהיה זה עניין רב לערוך מחקרי TII בנאדיות בקבוצות אנושיות גדולות יותר של בריאות ומחלות.

לסיכום, פרוטוקול זה מציג גישה מהירה וקלה יותר לחיתוך רקמת ריאה. שיטה זו מספקת הוראות מפורטות להכנת רקמת הריאה, חיתוך וצביעה, ומבטיחה שמירה על מבנה רקמת הריאה השלם. הוא מייעל את המודל לחקר ארכיטקטורת ריאות בריאות וחולות כאחד, מה שמוביל לשיפור יעילות הניסוי. בסך הכל, מחקר זה מציג גישה מבטיחה לחקר ביולוגיה מרחבית מורכבת בפתופיזיולוגיה של רקמת ריאה בין מינים, אשר יכולה לסייע בהבנה טובה יותר של המנגנונים המולקולריים הפועלים במחלות ובתיקון.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים בהכרת תודה על המימון שהתקבל מקרן וולנברג לרפואה מולקולרית וממרכז תאי גזע באוניברסיטת לונד ומודים למרכז ההדמיה הביולוגית של אוניברסיטת לונד (LBIC) על הגישה ל-Nikon A1RHD.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 well tissue culture inserts SARSTEDT 83.3932.300
4% paraformaldehyde SOLVECO 6095714
4’, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher scientific D1306
50 mL Falcon tube  SARSTEDT 2045221
Cluster of differentiation 31 (CD31) Abcam ab28364
Confocal microscope  Nikon A1R HD25
Elastin Abcam ab23747
Epredia X1000 Coverslip Thermo Fisher scientific 10318963
Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides Thermo Fisher scientific 10149870
Forceps AESCULAP FB395R
Goat anti-mouse 647  Invitrogen  A21235
Goat anti-rabbit 568 Invitrogen  A11011
Human type II cells Terrace Biotech TB-27AHT2-280 
Invitrogen Fluoromount-G Mounting Medium Thermo Fisher scientific E41473
Low gelling temperature Agarose Sigma-Aldrich 1003467046
Lycopersicon Esculentum lectin Thermo Fisher scientific 2531965
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher scientific 50-100-8798
Plastic cup kontorsgiganten 885221
Scissors STILLE 101-8380-18
Smooth muscle actin Abcam ab5694
Sodium azide Sigma-Aldrich K54329188239
Super glue LOCTITE 2721643
Vibrating microtome Leica VT1200S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
  2. Kawasaki, H., et al. The NanoSuit method: a novel histological approach for examining paraffin sections in a nondestructive manner by correlative light and electron microscopy. Laboratory Investigation. 100 (1), 161-173 (2020).
  3. Silva, I., et al. A Semi-quantitative scoring system for green histopathological evaluation of large animal models of acute lung injury. BIO-PROTOCOL. 12 (16), e4493 (2022).
  4. Kim, J. H., et al. Optimizing tissue-clearing conditions based on analysis of the critical factors affecting tissue-clearing procedures. Scientific Reports. 8 (1), 12815 (2018).
  5. Jain, D., et al. Immunocytochemistry for predictive biomarker testing in lung cancer cytology. Cancer Cytopathology. 127 (5), 325-339 (2019).
  6. Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. Histological stains: a literature review and case study. Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2015).
  7. Morrison, L. E., Lefever, M. R., Lewis, H. N., Kapadia, M. J., Bauer, D. R. Conventional histological and cytological staining with simultaneous immunohistochemistry enabled by invisible chromogens. Laboratory Investigation. 102 (5), 545-553 (2022).
  8. Dineshshankar, J., et al. Kerosene as an alternative to xylene in histopathological tissue processing and staining: An experimental study. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11 (6), 376 (2019).
  9. Abdelaal, H. M., et al. Comparison of vibratome and compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining. Biological Procedures Online. 17 (1), 2 (2015).
  10. Siwczak, F., Hiller, C., Pfannkuche, H., Schneider, M. R. Culture of vibrating microtome tissue slices as a 3D model in biomedical research. Journal of Biological Engineering. 17 (1), 36 (2023).
  11. Bèchet, N. B., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I. Glymphatic pathways in the gyrencephalic brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 41 (9), 2264-2279 (2021).
  12. Bèchet, N. B., Kylkilahti, T. M., Mattsson, B., Petrasova, M., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I. Light sheet fluorescence microscopy of optically cleared brains for studying the glymphatic system. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 40 (10), 1975-1986 (2020).
  13. Bai, Y., Ai, X. Utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle. Journal of Visualized Experiments. (183), (2022).
  14. Gerckens, M., et al. Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).
  15. Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
  16. Lam, M., Lamanna, E., Organ, L., Donovan, C., Bourke, J. E. Perspectives on precision cut lung slices—powerful tools for investigation of mechanisms and therapeutic targets in lung diseases. Frontiers in Pharmacology. 14, 1162889 (2023).
  17. Liu, G., et al. Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology. Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).
  18. Cooper, P. R., et al. Formoterol and salmeterol induce a similar degree of β 2- adrenoceptor tolerance in human small airways but via different mechanisms. British Journal of Pharmacology. 163 (3), 521-532 (2011).
  19. Ochoa, L. F., et al. Imaging of murine whole lung fibrosis by large scale 3D microscopy aided by tissue optical clearing. Scientific Reports. 8 (1), 13348 (2018).
  20. Tehrani, K. F., Park, J., Chaney, E. J., Tu, H., Boppart, S. A. Nonlinear imaging histopathology: a pipeline to correlate gold-standard hematoxylin and eosin staining with modern nonlinear microscopy. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 29 (4), (2023).
  21. Branchfield, K., et al. A three-dimensional study of alveologenesis in mouse lung. Developmental Biology. 409 (2), 429-441 (2016).
  22. Li, Y., et al. Precision vibratome for high-speed ultrathin biotissue cutting and organ-wide imaging. iScience. 24 (9), 103016 (2021).
  23. Qian, G., et al. DOCK2 promotes pleural fibrosis by modulating mesothelial to mesenchymal transition. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 66 (2), 171-182 (2022).
  24. Cagle, P. T., Allen, T. C. Pathology of the pleura: What the pulmonologists need to know. Respirology. 16 (3), 430-438 (2011).
  25. Jantz, M. A., Antony, V. B. Pleural fibrosis. Clinics in Chest Medicine. 27 (2), 181-191 (2006).
  26. Viana, F., O’Kane, C. M., Schroeder, G. N. Precision-cut lung slices: A powerful ex vivo model to investigate respiratory infectious diseases. Molecular Microbiology. 117 (3), 578-588 (2022).
  27. Paddenberg, R., Mermer, P., Goldenberg, A., Kummer, W. Videomorphometric analysis of hypoxic pulmonary vasoconstriction of intra-pulmonary arteries using murine precision cut lung slices. Journal of Visualized Experiments. (83), e50970 (2014).
  28. Lyons-Cohen, M. R., Thomas, S. Y., Cook, D. N., Nakano, H. Precision-cut mouse lung slices to visualize live pulmonary dendritic cells. Journal of Visualized Experiments. (122), e55465 (2017).
  29. Klouda, T., Kim, H., Kim, J., Visner, G., Yuan, K. Precision cut lung slices as an efficient tool for ex vivo pulmonary vessel structure and contractility studies. Journal of Visualized Experiments. (171), e62392 (2021).
  30. Ghaidan, H., et al. Reduction of primary graft dysfunction using cytokine adsorption during organ preservation and after lung transplantation. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
  31. Guenthart, B. A., et al. Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform. Nature Communications. 10 (1), 1985 (1985).
  32. Ruaro, B., et al. The history and mystery of alveolar epithelial type II cells: focus on their physiologic and pathologic role in lung. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2566 (2021).
  33. Crapo, J. D., Barry, B. E., Gehr, P., Bachofen, M., Weibel, E. R. Cell number and cell characteristics of the normal human lung. The American Review of Respiratory Disease. 126 (2), 332-337 (1982).
  34. Evans, K. V., Lee, J. -H. Alveolar wars: The rise of in vitro models to understand human lung alveolar maintenance, regeneration, and disease. Stem Cells Translational Medicine. 9 (8), 867-881 (2020).
  35. Chen, J. -X., et al. Sirtuin 3 ameliorates lung senescence and improves type II alveolar epithelial cell function by enhancing the FoxO3a-dependent antioxidant defense mechanism. Stem Cells and Development. 30 (17), 843-855 (2021).
  36. Zacharias, W. J., et al. Regeneration of the lung alveolus by an evolutionarily conserved epithelial progenitor. Nature. 555 (7695), 251-255 (2018).
  37. Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (10), 891-901 (2010).

Tags

חתך ויברטומי אוטומטי רקמת ריאה משובצת אגרוז דימות פלואורסצנטי מולטיפלקס עיבוד רקמת ריאה הטבעה פרפין הטבעה OCT מיקרוטום קריוסטט פרוסות ריאה חתוכות במדויק תרבית רקמת ריאה ראשונית קריאות הדמיית אור מתקדמות הדמיה הניתנת לשחזור נוגדנים תאימות מינים צינור עיבוד רקמות רקמת ריאה קבועה חתך ויברטומי אוטומטי עובי קטעי ריאה שליפת אנטיגן שימור רקמות טבעיות ביטוי חלבון מרחבי כימות פגיעה ריאתית והתחדשות
חתך ויברטומי אוטומטי של רקמת ריאה משובצת אגרוז להדמיית פלואורסצנטיות מרובת משתתפים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Q., Bechet, N. B., Lindstedt,… More

Wang, Q., Bechet, N. B., Lindstedt, S. Automated Vibratome Sectioning of Agarose-Embedded Lung Tissue for Multiplex Fluorescence Imaging. J. Vis. Exp. (200), e65943, doi:10.3791/65943 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter