Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

RGBradford: स्मार्टफोन कैमरा के साथ प्रोटीन क्वांटिटेशन

Published: September 8, 2023 doi: 10.3791/65547
Automatic Translation
1
1Research Center in Morphology and Applied Immunology, Faculty of Medicine, University of Brasilia

Summary

यह पत्र ब्रैडफोर्ड परख और एक विश्लेषणात्मक उपकरण के रूप में एक स्मार्टफोन का उपयोग करके प्रोटीन मात्रा का ठहराव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है। स्मार्टफोन से ली गई माइक्रोप्लेट की तस्वीर से निकाले गए रंग डेटा का उपयोग करके नमूनों में प्रोटीन के स्तर को निर्धारित किया जा सकता है।

Abstract

प्रोटीन की मात्रा का ठहराव जीवन विज्ञान अनुसंधान में एक आवश्यक प्रक्रिया है। कई अन्य तरीकों में, ब्रैडफोर्ड परख सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले में से एक है। इसकी व्यापकता के कारण, ब्रैडफोर्ड परख की सीमाओं और लाभों को पूरी तरह से रिपोर्ट किया गया है, जिसमें इसके प्रदर्शन को बेहतर बनाने के लिए मूल विधि के कई संशोधन शामिल हैं। मूल विधि के परिवर्तनों में से एक विश्लेषणात्मक उपकरण के रूप में स्मार्टफोन कैमरे का उपयोग है। ब्रैडफोर्ड परख की स्थितियों में मौजूद कूमासी ब्रिलियंट ब्लू डाई के तीन रूपों का लाभ उठाते हुए, यह पत्र बताता है कि माइक्रोप्लेट की एक तस्वीर से निकाले गए रंग डेटा का उपयोग करके नमूनों में प्रोटीन को सटीक रूप से कैसे निर्धारित किया जाए। माइक्रोप्लेट में परख करने के बाद, स्मार्टफोन कैमरे का उपयोग करके एक तस्वीर ली जाती है, और आरजीबी रंग डेटा को एक मुफ्त और ओपन-सोर्स इमेज एनालिसिस सॉफ्टवेयर एप्लिकेशन का उपयोग करके तस्वीर से निकाला जाता है। फिर, प्रोटीन की अज्ञात सांद्रता वाले नमूनों की नीले से हरे रंग की तीव्रता (आरजीबी पैमाने में) के अनुपात का उपयोग मानक वक्र के आधार पर प्रोटीन सामग्री की गणना करने के लिए किया जाता है। आरजीबी रंग डेटा का उपयोग करके गणना किए गए मूल्यों और पारंपरिक अवशोषण डेटा का उपयोग करके गणना किए गए मूल्यों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया है।

Introduction

डाउनस्ट्रीम उपयोग (जैसे, एलिसा, एंजाइम कैनेटीक्स, पश्चिमी सोख्ता, प्रोटीन शुद्धि, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री) के बावजूद, जीवन विज्ञान प्रयोगशालाओं में सटीक विश्लेषण के लिए प्रोटीन मात्रा का ठहराव महत्वपूर्ण है। माध्यमिक रीडआउट के रूप में उनके उपयोग के अलावा (यानी, प्रोटीन के प्रति द्रव्यमान विश्लेषण के सापेक्ष स्तर की गणना करने के लिए), एक नमूने में प्रोटीन का स्तर भी वांछित आउटपुट हो सकता है। उदाहरण के लिए, खाद्य संसाधनों1 या मूत्र2 में प्रोटीन के स्तर में रुचि हो सकती है। नमूनों में प्रोटीन एकाग्रता को मापने के लिए कई तरीके उपलब्ध हैं3, प्रत्यक्ष यूवी अवशोषण रीडिंग4, प्रोटीन-कॉपर केलेशन 5,6, प्रोटीन-डाई बाध्यकारी वर्णमिति परख7, और प्रोटीन-डाई बाध्यकारी फ्लोरोसेंट परख8 सहित। प्रोटीन मात्रा की प्रासंगिकता सबसे उद्धृत साहित्य 9,10 के शीर्ष -3 में प्रोटीन माप विधियों 5,7 का वर्णन करने वाले दो पत्रों की उपस्थिति से स्पष्ट है। इस तथ्य के बावजूद कि कई लेखक गैर-प्राथमिक संदर्भों का हवाला देते हुए या कुछ भी उद्धृत नहीं करके अपने वास्तविक उद्धरण की उपेक्षा करते हैं, लोरी प्रोटीन परख और ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख का वर्णन करने वाले मूल कागजात प्रत्येक10 में > 200,000 उद्धरण देते हैं।

ब्रैडफोर्ड परख की लोकप्रियता इसकी सामर्थ्य, सादगी, गति और संवेदनशीलता से उपजी है। परख अम्लीय परिस्थितियों में प्रोटीन और डाई कूमासी ब्रिलियंट ब्लू जी के बीच बातचीत पर आधारित है। परख (यानी, कम पीएच) की शर्तों के तहत, डाई तीन रूपों में मौजूद है: 470 एनएम पर λmax के साथ एक लाल धनायनित रूप; 650 एनएम पर λmax के साथ एक हरा तटस्थ रूप; और 590 एनएम11,12 (चित्रा 1) पर λmax के साथ एक नीला आयनिक रूप। प्रोटीन की अनुपस्थिति में धनायनित रूप प्रबल होता है। जैसे ही प्रोटीन डाई के साथ बातचीत करते हैं, वे नीले आयनिक रूप को स्थिर करते हैं, जिससे समाधान के रंग में भूरे से नीले रंग में ध्यान देने योग्य परिवर्तन होता है। आमतौर पर, डाई के नीले रूप की एकाग्रता में परिवर्तन स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक रूप से निर्धारित किया जाता है, जिसका अवशोषण 590-595 एनएम पर परख में प्रोटीन की मात्रा के लिए आनुपातिक होता है।

Figure 1
चित्रा 1: ब्रैडफोर्ड परख की शर्तों के तहत कूमासी शानदार नीले जी अवशोषण स्पेक्ट्रा। तीन मुख्य चोटियों को तीर के साथ चिह्नित किया जाता है जो डाई के लाल (470 एनएम), हरे (650 एनएम), और नीले (590 एनएम) रूपों के λमैक्स को दर्शाता है। स्पेक्ट्रा प्रोटीन (पीली रेखा) की अनुपस्थिति में और गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन के 3 μg (ग्रे लाइन) और 10 μg (नीली रेखा) की उपस्थिति में दर्ज किए गए थे। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

ब्रैडफोर्ड परख के व्यापक उपयोग कई सीमाओं की पहचान के लिए नेतृत्व किया है (जैसे, विभिन्न प्रोटीन11 के लिए चर प्रतिक्रियाओं, और लिपिड13 और डिटर्जेंट7 द्वारा हस्तक्षेप) और संशोधनों के विकास के लिए अपने प्रदर्शन में सुधार करने के लिए (जैसे, डिटर्जेंट14,15 के अलावा, क्षारीकरण14,16 और अवशोषण17 के अनुपात का उपयोग). परख में ही संशोधनों के अलावा, विश्लेषणात्मक संकेतों को पकड़ने के लिए स्मार्टफोन या कैमरों जैसे वैकल्पिक उपकरणों का उपयोग भी 18,19,20 वर्णित किया गया है। दरअसल, पोर्टेबल रासायनिक विश्लेषक के रूप में स्मार्टफोन का उपयोग करने वाले तरीकों का विकास अनुसंधान का एक सक्रिय क्षेत्र रहा है। स्मार्टफोन के उपयोग की प्रेरणा इन उपकरणों की सामर्थ्य, पोर्टेबिलिटी, उपयोग में आसानी और व्यापक उपलब्धता से उपजी है।

यह पेपर RGBradford परख20 का उपयोग करके प्रोटीन परिमाणीकरण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है, जो एक विश्लेषणात्मक उपकरण के रूप में स्मार्टफोन का उपयोग करता है। मूल RGBradford प्रकाशन20 के विपरीत, यहां, रंग निष्कर्षण प्रक्रिया को सुव्यवस्थित करने वाली एक प्रक्रिया पेश की गई है। इसमें माइक्रोप्लेट चित्र के प्रत्येक कुएं से स्वचालित रूप से रंग जानकारी निकालने के लिए स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर एप्लिकेशन का उपयोग शामिल है, जिससे महत्वपूर्ण समय और प्रयास की बचत होती है। यह एक ग्राफिक्स संपादक सॉफ्टवेयर अनुप्रयोग20 का उपयोग करके एक-एक करके प्रत्येक अच्छी तरह से मैन्युअल रूप से रंग डेटा प्राप्त करने की पिछली विधि का एक विकल्प है। अंततः, नमूनों में प्रोटीन के स्तर को स्मार्टफोन के साथ ली गई माइक्रोप्लेट की तस्वीर से निकाले गए रंग डेटा का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख अभिकर्मक की तैयारी

  1. 50 एमएल 95% (डब्ल्यू / वी) इथेनॉल में कूमासी ब्रिलियंट ब्लू जी के 100 मिलीग्राम को भंग करें। तब तक मिलाएं जब तक कि कूमासी ब्रिलियंट ब्लू जी पूरी तरह से घुल न जाए।
    सावधानी: इथेनॉल ज्वलनशील है और आंखों में जलन का कारण बनता है। आग की लपटों से बचें और काले चश्मे का उपयोग करें।
  2. पिछले समाधान के लिए, 85% (डब्ल्यू / वी) फॉस्फोरिक एसिड के 100 एमएल को ध्यान से जोड़ें।
    चेतावनी: फॉस्फोरिक एसिड धातुओं के लिए संक्षारक है और त्वचा के क्षरण का कारण बनता है, गंभीर आंखों की क्षति, और तीव्र मौखिक विषाक्तता. दस्ताने और काले चश्मे पहनें।
  3. Coomassie ब्रिलियंट ब्लू जी, इथेनॉल, और फॉस्फोरिक एसिड युक्त समाधान धीरे-धीरे 600 एमएल विआयनीकृत पानी के लिए जोड़ें।
  4. 1,000 एमएल की अंतिम मात्रा के लिए समाधान पतला. विश्लेषण किए जाने वाले नमूनों की संख्या के अनुसार ऊपर या नीचे स्केल करें। जैसा कि मूल विधि7 में वर्णित है, काम करने वाले ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक में अंतिम सांद्रता 0.01% (डब्ल्यू / वी) कूमासी ब्रिलियंट ब्लू जी, 4.7% (डब्ल्यू / वी) इथेनॉल, और 8.5% (डब्ल्यू / वी) फॉस्फोरिक एसिड होना चाहिए।
  5. फिल्टर पेपर (व्हाटमैन # 1 पेपर या समकक्ष) के माध्यम से छानने वाली किसी भी अघुलनशील सामग्री को हटा दें।
  6. अभिकर्मक कई हफ्तों के लिए स्थिर है जब कमरे के तापमान (आरटी) पर संग्रहीत और प्रकाश से संरक्षित. आवश्यकतानुसार फ़िल्टर करें क्योंकि अवक्षेप समय के साथ बन सकते हैं।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, ब्रैडफोर्ड अभिकर्मकों को पतला करने और उपयोग करने के लिए तैयार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। अभिकर्मक तैयार करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें और अगले चरण पर आगे बढ़ें।

2. प्रोटीन मानक समाधान की तैयारी

  1. मानक के रूप में उपयोग किए जाने वाले एक पृथक प्रोटीन का एक स्टॉक समाधान (चरण 2.4 देखें) तैयार करें। एक सस्ती और आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला प्रोटीन गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) है। अन्य विकल्प ओवलब्यूमिन और गोजातीय गामा ग्लोब्युलिन हैं।
  2. यदि मानक के रूप में उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन की दाढ़ अवशोषण ज्ञात है, तो स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में स्टॉक समाधान की एकाग्रता की जांच करें।
  3. बीएसए के लिए, आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला सूत्र बीएसए (मिलीग्राम/एमएल) = (ए280/6.6) × 10 है, जहां ए280 280 एनएम पर अवशोषण है, जिसकी पथ लंबाई 1 सेमी है, जो एक उपयुक्त रिक्त स्थान (यानी, ε2801% = 6.6)7 के खिलाफ पढ़ा जाता है। उदाहरण के लिए, 0.8 mg/mL BSA में 280 nm पर 0.528 का अवशोषण होता है।
  4. मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए, 0.025 मिलीग्राम/एमएल और 1.0 मिलीग्राम/एमएल के भीतर बीएसए के कई कमजोर पड़ने तैयार करें। ये अच्छी तरह से प्रति 10 माइक्रोन की नमूना मात्रा जोड़ने के बाद प्रति अच्छी तरह से बीएसए के 0.25-10 माइक्रोग्राम में परिणाम होगा।
    नोट: प्रोटीन मानक समाधान नमूने तैयार करने के लिए उपयोग किए जाने वाले माध्यम की एक ही संरचना (अंतिम एकाग्रता) के साथ एक माध्यम में तैयार किया जाना चाहिए।

3. परख

  1. 0.025-1.0 मिलीग्राम / एमएल के मानक वक्र रेंज के भीतर प्रोटीन एकाग्रता प्राप्त करने के लिए नमूनों को पतला। सीमा के भीतर कई (कम से कम 3) नमूना कमजोर पड़ने है।
    नोट: नमूने फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) या ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक के साथ संगत किसी अन्य मध्यम / बफर संरचना के साथ पतला किया जा सकता है। मध्यम घटकों की अंतिम एकाग्रता मानक और नमूनों के बीच भिन्न नहीं होनी चाहिए।
  2. 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट के तीन कुओं (यानी, तीन प्रतियों में) में प्रत्येक प्रोटीन मानक समाधान के 10 माइक्रोन जोड़ें। 0 (शून्य) प्रोटीन बिंदु के लिए, मानक समाधान और नमूना कमजोर पड़ने तैयार करने के लिए उपयोग किए जाने वाले बफर/माध्यम के 10 माइक्रोन जोड़ें।
  3. कुओं के एक और सेट के लिए, एक ही 96 अच्छी तरह से microplate के तीन कुओं (यानी, तीन प्रतियों में) के लिए प्रत्येक नमूना कमजोर पड़ने के 10 माइक्रोन जोड़ें. एक दृष्टिकोण एक नमूने के विभिन्न संस्करणों को जोड़ना है और 10 माइक्रोन प्रति अच्छी तरह से (जैसे, 0.5 माइक्रोन, 1 माइक्रोन, 2 एल, 4 माइक्रोन, और नमूना के 8 डिग्री एल) के माध्यम से पूरा करना प्लस 9.5 माइक्रोन, 9 एल, 8 एल, 6 माइक्रोन, और मध्यम के 2 माइक्रोन)।
  4. सभी कुओं में ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख अभिकर्मक के 250 माइक्रोन जोड़ें। एक विशिष्ट माइक्रोप्लेट सेटअप चित्रा 2 में दिखाया गया है. इस उदाहरण में, 260 माइक्रोन (अच्छी तरह से प्रति अंतिम मात्रा) पानी युक्त रिक्त कुओं का एक सेट एक माइक्रोप्लेट रीडर (4.5 कदम) में रिक्त के रूप में सेवा करने के लिए शामिल किया गया था. यह केवल तभी आवश्यक है जब अवशोषण डेटा भी एकत्र किया जाएगा।
    नोट: हर बार परख किए जाने पर नमूनों के एक ही माइक्रोप्लेट में एक मानक वक्र तैयार करें। दूसरे शब्दों में, यदि नमूनों की संख्या के लिए एक और प्लेट की आवश्यकता होती है, तो दूसरी प्लेट में एक और मानक वक्र तैयार करें, और इसी तरह।
  5. रिकॉर्ड परिणाम (अनुभाग 4) 5-15 मिनट के भीतर.

Figure 2
चित्रा 2: ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख के लिए एक विशिष्ट प्लेट लेआउट। रिक्त तीन कुओं को संदर्भित करता है जिसमें 260 माइक्रोन पानी होता है जिसे माइक्रोप्लेट रीडर में रिक्त के रूप में उपयोग किया जाता है। एसटीडी प्रोटीन मानकों को संदर्भित करता है। S1-S6 छह अलग-अलग नमूने हैं। SX_1-SX_4 प्रत्येक नमूने के लिए चार अलग-अलग नमूना कमजोर पड़ने वाले हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

4. रिकॉर्डिंग परिणाम

  1. एक अच्छी तरह से रोशन कमरे में, एक हाथ से एक समान सफेद पृष्ठभूमि (जैसे, एक पेपर शीट) के खिलाफ बेंच के समानांतर माइक्रोप्लेट पकड़ें। प्लेट पर एक बुलबुला स्तर रखकर सटीक संरेखण सुनिश्चित करें।
  2. दूसरे हाथ से, स्मार्टफोन को समानांतर रूप से पकड़ें (कुछ कैमरा एप्लिकेशन उपयोगी रूप से डिवाइस के झुकाव का संकेत देते हैं) बेंच और माइक्रोप्लेट पर और पूरे माइक्रोप्लेट (चित्रा 3) की एक या कई तस्वीरें लें। iOS डिवाइस में, ग्रिड विकल्प को सक्षम करके कैमरा सेटिंग्स में कैमरा स्तर सूचक चालू करें। Android डिवाइस में, फ़्रेमिंग संकेत सक्षम करके कैमरा सेटिंग में कैमरा स्तर सूचक चालू करें।
  3. किसी विशेष प्रकाश उपकरण की आवश्यकता नहीं है, लेकिन छाया और प्रतिबिंबों से बचने के लिए ध्यान रखें। उदाहरण के लिए, स्मार्टफोन के साथ प्लेट या पृष्ठभूमि को छायांकन करने से बचें और माइक्रोप्लेट के साथ पृष्ठभूमि को छायांकन करने से बचें। अच्छी तरह से क्षेत्र के किनारों में छोटे प्रतिबिंब एक समस्या नहीं हैं; रंग डेटा प्रत्येक कुएं के केंद्र में एक बहुत छोटे से क्षेत्र से निकाला जा सकता है।
  4. पृष्ठभूमि एकरूपता, छाया और प्रतिबिंबों के लिए चित्र को संक्षेप में देखें। इसके अलावा, कुओं के कोण पर एक नज़र डालें; प्रत्येक कुएं का केंद्र सीधे दिखाई देना चाहिए (यानी, अच्छी तरह से दीवारों के पीछे नहीं)।
  5. यदि माइक्रोप्लेट अवशोषण रीडिंग और चित्र रंग डेटा के बीच तुलना वांछित है, तो माइक्रोप्लेट रीडर21 में 590 एनएम और 450 एनएम पर माइक्रोप्लेट पढ़ें।

Figure 3
चित्रा 3: ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख के परिणामों को कैप्चर करना। एक अच्छी तरह से रोशन कमरे में, माइक्रोप्लेट को एक हाथ से एक समान पृष्ठभूमि के खिलाफ बेंच के समानांतर स्थित किया जाता है। दूसरी ओर, स्मार्टफोन बेंच और माइक्रोप्लेट के समानांतर पकड़ में है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

5. रंग डेटा निकालना-स्वचालित रूप से

  1. ImageJ और ReadPlate22 डाउनलोड करें, एक ImageJ प्लगइन https://imagej.nih.gov/ij/plugins/readplate/index.html पर उपलब्ध है (यह एक .txt फ़ाइल है)।
  2. ImageJ खोलें, प्लगइन्स > इंस्टॉल पर क्लिक करें और चरण 6.1 में डाउनलोड की गई फ़ाइल का चयन करें।
  3. माप मापदंडों का विश्लेषण करें > माप सेट करें पर क्लिक करके माप पैरामीटर सेट करें और निम्नलिखित विकल्पों की जांच करें: क्षेत्र; मानक विचलन; न्यूनतम और अधिकतम ग्रे मूल्य; मतलब ग्रे मूल्य; मोडल ग्रे मूल्य। विंडो के नीचे, इस पर रीडायरेक्ट करें: कोई नहीं और दशमलव स्थान (0-9): 3 पर रीडायरेक्ट करें सेट करें.
  4. के लिए जाओ फ़ाइल > खुला हुआ और चरण 4 में लिए गए माइक्रोप्लेट की तस्वीर का चयन करें।
  5. रीडप्लेट > प्लगइन्स पर जाएं। निर्देश पढ़ें और फिर ठीक क्लिक करें।
  6. कुओं की संख्या का चयन करें: 96
  7. प्लगइन द्वारा स्वचालित रूप से लोड किए गए आयताकार चयन उपकरण का उपयोग करके, A1 कुएं के केंद्र में शुरू होने वाली एक आयत बनाएं और H12 कुएं के केंद्र में समाप्त हो। उसके बाद, ठीकक्लिक करें।
  8. ब्लू चैनल का चयन करें और ओके पर क्लिक करें।
  9. OK पर क्लिक करके डिफ़ॉल्ट पैरामीटर की पुष्टि करें।
  10. जांचें कि क्या सॉफ्टवेयर ने प्रत्येक कुएं के अंदर एक क्षेत्र को चित्रित किया है और यदि चयनित क्षेत्र असामान्य छाया या प्रतिबिंब वाले क्षेत्रों को कवर नहीं कर रहे हैं। ओके पर क्लिक करें।
  11. परिणाम सहेजें और हरे चैनल के लिए चरण 5.8-5.10 दोहराएँ.
  12. प्रत्येक रंग के लिए मोड का उपयोग करके नीले-से-हरे अनुपात की गणना करें।
    नोट:: गणना मैन्युअल रूप से या पाठक वरीयताओं, जैसे R, Microsoft Excel या GraphPad प्रिज्म के सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर किया जा सकता है।

6. रंग डेटा निकालना - मैन्युअल रूप से

  1. Inkscape डाउनलोड करें, एक स्वतंत्र और खुला स्रोत ग्राफिक्स संपादक।
    नोट: रंग बीनने वाले उपकरण (आमतौर पर आई ड्रॉपर के रूप में चित्रित) वाले किसी भी सॉफ़्टवेयर का उपयोग रंग की पहचान करने और आरजीबी डेटा निकालने के लिए किया जा सकता है।
  2. Inkscape खोलें, File > Open पर जाएं। चरण 4 में लिए गए माइक्रोप्लेट के चित्र का चयन करें।
  3. सेलेक्ट एंड ट्रांसफॉर्म ऑब्जेक्ट्स (एस) टूल चुनें, जिसे ऊपरी-बाईं ओर एक तीर के रूप में दर्शाया गया है, और चित्र पर क्लिक करें। एक धराशायी रेखा सीमा चयन को इंगित करेगी।
  4. छवि (डी) टूल से रंग चुनें, जिसे बाईं ओर एक आई ड्रॉपर के रूप में दर्शाया गया है।
  5. एक कुएं के केंद्र में क्लिक करें। निचले पैनल पर रंग ("भरें:") तदनुसार बदल जाएगा। रंग पर क्लिक करें और एक भरण और स्ट्रोक टैब दाईं ओर पॉप अप होगा।
  6. Flat Color ड्रॉपडाउन मेनू को RGB में बदलें। प्रत्येक कुएं के लिए नीले और हरे रंग के चैनलों के लिए दिखाए गए मूल्यों को रिकॉर्ड करें।
  7. रिकॉर्ड किए गए मूल्यों का उपयोग करके नीले-से-हरे अनुपात की गणना करें।
    नोट:: गणना मैन्युअल रूप से या पाठक वरीयताओं, जैसे R, Microsoft Excel या GraphPad प्रिज्म के सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर किया जा सकता है।

7. मानक घटता का निर्माण और अज्ञात को एक्सट्रपलेशन करना

  1. प्रोटीन मानक एकाग्रता का एक समारोह के रूप में औसत हरे से नीले रंग की तीव्रता अनुपात प्लॉट करें.
    नोट:: डेटा मैन्युअल रूप से या पाठक प्राथमिकताओं, जैसे R, Microsoft Excel या GraphPad प्रिज्म के सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके प्लॉट करें।
  2. प्रत्येक नमूने और कमजोर पड़ने के लिए औसत हरे से नीले तीव्रता अनुपात की गणना.
  3. जांचें कि क्या नमूना के लिए प्राप्त संकेत प्रोटीन मानक की रैखिक सीमा के भीतर है।
  4. मानक वक्र के न्यूनतम या अधिकतम मानों से नीचे या ऊपर किसी भी मान पर ध्यान न दें।
  5. नमूने में प्रोटीन की मात्रा को एक्सट्रपलेशन करने के लिए मानक वक्र का वर्णन करने वाले रैखिक समीकरण का उपयोग करें। तदनुसार कमजोर पड़ने कारक द्वारा गणना किए गए मूल्यों को गुणा करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

चित्रा 4 एक माइक्रोप्लेट की एक तस्वीर है जिसमें से रंग डेटा निकाला गया था, और 450 एनएम और 590 एनएम पर अवशोषण दर्ज किया गया था। प्रतिनिधि के रूप में यहां रिपोर्ट किए गए आरजीबी रंग डेटा स्वचालित रूप से प्राप्त किए गए थे जैसा कि धारा 5 में वर्णित है। रंग डेटा का एक विशिष्ट पैटर्न नीले मूल्यों में वृद्धि और लाल और हरे रंग के मूल्यों (चित्रा 5) में कमी है। ध्यान दें कि सभी कुओं में स्पष्ट प्रतिबिंब और पूरी तरह से गठबंधन माइक्रोप्लेट (चित्रा 4) के बावजूद, चित्र से निकाले गए रंग डेटा सटीक रूप से अवशोषण रीडिंग(चित्रा 6)को दर्शाता है। नमूना कमजोर पड़ने और अवशोषण रीडिंग और रंग डेटा(चित्रा 7)दोनों के लिए संकेत के बीच एक रैखिक संबंध भी है। इन प्रतिनिधि परिणामों के लिए, दो नमूनों का उपयोग किया गया था, एक बीवी -2 सेल लाइसेट (बी 001) और एक गैलेरिया मेलोनेला होमोजेनेट (जी 001) पहले वर्णित20 के रूप में तैयार किया गया था, जिसमें से 0.5 माइक्रोन, 1 माइक्रोन, 2 माइक्रोन, 4 माइक्रोन, और 8 माइक्रोन प्रत्येक कुएं के लिए उपयोग किए गए थे। ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक के 250 माइक्रोन के अलावा से पहले मात्रा को बफर के साथ 10 माइक्रोन में समायोजित किया गया था।

Figure 4
चित्रा 4: ब्रैडफोर्ड परख माइक्रोप्लेट की एक प्रतिनिधि तस्वीर। प्रत्येक कुएं पर दीपक प्रतिबिंब और कुओं के गलत संरेखण पर ध्यान दें (यानी, प्लेट का दाहिना भाग नीचे झुका हुआ है)। इन्हें यथासंभव कम से कम किया जाना चाहिए, लेकिन सही संरेखण और प्रकाश व्यवस्था आवश्यक नहीं है (प्रतिनिधि परिणाम देखें)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: प्रोटीन एकाग्रता के एक समारोह के रूप में तीन आरजीबी चैनलों से रंग तीव्रता। प्रत्येक बिंदु चित्रा 4 में दिखाए गए माइक्रोप्लेट में मानक वक्र के एक कुएं का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: एक तस्वीर से निकाले गए आरजीबी रंग डेटा बनाम अवशोषण रीडिंग। प्रत्येक बिंदु चित्रा 4 में दिखाए गए माइक्रोप्लेट में मानक वक्र के एक कुएं का प्रतिनिधित्व करता है। पीला छायांकन 95% विश्वास अंतराल का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: सिग्नल तीव्रता बनाम नमूना मात्रा। कॉलम विभिन्न तरीकों से अलग-अलग संकेत हैं: अवशोषण रीडिंग (अवशोषण) और आरजीबी रंग डेटा निकाला गया (आरजीबी डेटा)। पंक्तियाँ अलग-अलग नमूने हैं: एक BV-2 सेल लाइसेट (B001) और एक गैलेरिया मेलोनेला होमोजेनेट (G001)। प्रत्येक बिंदु किसी दिए गए नमूना मात्रा के तीन कुओं का औसत मूल्य है। पीला छायांकन 95% विश्वास अंतराल का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

मानक वक्र (सिग्नल बनाम बीएसए एकाग्रता) सख्ती से रैखिक होना चाहिए, जैसा कि 0.025 मिलीग्राम/एमएल, 0.05 मिलीग्राम/एमएल, 0.1 मिलीग्राम/एमएल, 0.2 मिलीग्राम/एमएल, 0.4 मिलीग्राम/एमएल, 0.6 मिलीग्राम/एमएल, 0.8 मिलीग्राम/एमएल, और 1.0 मिलीग्राम/एमएल(चित्रा 8)की बीएसए सांद्रता के साथ निर्मित प्रतिनिधि मानक वक्र के लिए दिखाया गया है।

Figure 8
चित्रा 8: एक विशिष्ट मानक वक्र गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) एकाग्रता के साथ नीले-से-हरे अनुपात की रैखिकता को दर्शाता है। एक विशिष्ट मानक वक्र के लिए उपयोग की जाने वाली सांद्रता 0 mg/mL, 0.025 mg/mL, 0.05 mg/mL, 0.1 mg/mL, 0.2 mg/mL, 0.4 mg/mL, 0.6 mg/mL, 0.8 mg/mL, और 1.0 mg/mL हैं। प्रत्येक बिंदु प्रत्येक बीएसए एकाग्रता के तीन कुओं का औसत मूल्य है। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं। पीला छायांकन 95% विश्वास अंतराल का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्रतिनिधि परिणामों के इस उदाहरण में, कुछ कमजोर पड़ने मानक वक्र (चित्रा 9) की रैखिक सीमा के भीतर नहीं थे। नमूना B001 के लिए, 8 माइक्रोन के परिणामस्वरूप मानक वक्र के उच्चतम बिंदु से ऊपर एक संकेत हुआ। G001 के मामले में, 0.5 माइक्रोन और 1 माइक्रोन के परिणामस्वरूप मानक वक्र के निम्नतम बिंदु से नीचे संकेत मिले। दोनों नमूनों के लिए, मानक वक्र की रैखिक सीमा के बाहर झूठ बोलने वाले इन कमजोर पड़ने को त्याग दिया जाना चाहिए। मानक वक्र की सीमा के बाहर रीडिंग की अनदेखी करने के बाद, अवशोषण रीडिंग का उपयोग कर गणना की गई प्रोटीन का स्तर दोनों नमूनों(चित्रा 10)के लिए आरजीबी डेटा का उपयोग करके गणना किए गए लोगों से भिन्न नहीं होता है। टी परीक्षण का उपयोग करके अवशोषण डेटा और आरजीबी डेटा के बीच तुलना के परिणामस्वरूप नमूना B001 के लिए p = 0.63 और नमूना G001 के लिए p = 0.17 हुआ।

Figure 9
चित्रा 9: नमूना मात्रा बनाम आरजीब्रैडफोर्ड विधि का उपयोग करके प्राप्त ब्लू-टू-ग्रीन अनुपात। क्षैतिज रेखाएं मानक वक्र (चित्रा 8) के न्यूनतम और अधिकतम नीले-से-हरे अनुपात का परिसीमन करती हैं। नीले वृत्त एक BV-2 सेल लाइसेट (B001) का प्रतिनिधित्व करते हैं, और लाल प्रतीक एक गैलेरिया मेलोनेला होमोजेनेट (G001) का प्रतिनिधित्व करते हैं। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं। ध्यान दें कि कुछ नमूना dilutions मानक वक्र की सीमा के बाहर हैं. पीला छायांकन 95% विश्वास अंतराल का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 10
चित्रा 10: पारंपरिक अवशोषण रीडिंग (एबीएस) और आरजीब्रैडफोर्ड विधि (आरजीबी) का उपयोग करके ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख के साथ मात्रा निर्धारित दो जैविक नमूनों में प्रोटीन एकाग्रता। नीले प्रतीक एक BV-2 सेल लाइसेट (B001) का प्रतिनिधित्व करते हैं, और लाल प्रतीक एक गैलेरिया मेलोनेला होमोजेनेट (G001) का प्रतिनिधित्व करते हैं। प्रत्येक सर्कल एक एकल कुएं का प्रतिनिधित्व करता है जिससे डेटा प्राप्त किया गया था। हीरे माध्य को दर्शाते हैं, और ऊर्ध्वाधर रेखाएं प्रत्येक नमूने/विधि के लिए न्यूनतम से अधिकतम मूल्यों तक फैली होती हैं। विधियों के बीच कोई अंतर नहीं है (B001, t परीक्षण, p = 0.63; G001, t परीक्षण, p = 0.17)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 1: विभिन्न स्मार्टफोन का उपयोग करके प्राप्त सिग्नल। स्पेक्ट्रामैक्स iD590 माइक्रोप्लेट रीडर से सिग्नल (A450/A3) के साथ प्राप्त सिग्नल (ब्लू-टू-ग्रीन अनुपात) और सिग्नल (A590/A3) के लिए पियर्सन सहसंबंध गुणांक। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यह पत्र आरजीब्रैडफोर्ड का वर्णन करता है, एक विधि जो ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख से डेटा रिकॉर्ड करने, रंग डेटा निकालने और जैविक नमूनों में प्रोटीन के स्तर को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए स्मार्टफोन कैमरा का उपयोग करती है, जैसा कि मूल रूप से हाल ही में20 वर्णित है। मूल RGBradford विधि से एक अंतर यह है कि यहां ImageJ प्लगइन22 के साथ स्वचालित रूप से रंग डेटा प्राप्त करने की प्रक्रिया का उपयोग किया गया था। RGBradford विधि की मुख्य नवीनता विश्लेषणात्मक संकेतों के रूप में RGB डेटा का उपयोग है; इस प्रकार, कोई भी कूमासी ब्रिलियंट ब्लू जी के साथ प्रोटीन निर्धारण के लिए अपनी प्रयोगशाला में उपयोग किए जाने वाले नियमित प्रोटोकॉल का उपयोग कर सकता है और फिर इसकी एक तस्वीर ले सकता है और रंग डेटा निकाल सकता है। दूसरे शब्दों में, प्रोटोकॉल के चरण 1-3 को किसी दिए गए प्रयोगशाला में उपयोग की जाने वाली सामान्य प्रक्रिया के अनुसार संशोधित किया जा सकता है। मूल ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख के कई संशोधनों के अस्तित्व को देखते हुए, कोई भी अपने नमूना प्रकार / प्रकृति के लिए बेहतर काम करता है और डेटा रिकॉर्डिंग के लिए आगे बढ़ सकता है।

इस प्रोटोकॉल में दो महत्वपूर्ण चरण हैं, चित्र कैप्चर और रंग डेटा निष्कर्षण। यहां और पहले20, कोई विशेष प्रकाश उपकरण की आवश्यकता नहीं थी, और संतोषजनक परिणाम प्राप्त किए गए थे (यानी, अवशोषण रीडिंग और चित्र से निकाले गए रंग डेटा के परिणामों के बीच कोई अंतर नहीं था)। फिर भी, कोई चित्र अधिग्रहण को अनुकूलित करने के लिए एक मंच का उपयोग करना चुन सकता है, उदाहरण के लिए, एक ट्रांसइल्यूमिनेटर19,22 का उपयोग करना। मुख्य मुद्दा एक समान पृष्ठभूमि और प्रकाश व्यवस्था का आश्वासन देना है। इसके अलावा, विभिन्न स्मार्टफोन मॉडल के साथ समान परिणाम प्राप्त किए जा सकते हैं। प्रत्येक डिवाइस के साथ प्राप्त सिग्नल में मामूली अंतर के बावजूद, परीक्षण किए गए चार स्मार्टफोन मॉडल (सैमसंग S22 अल्ट्रा, Apple iPhone 11, Apple iPhone 14 Pro, और XIAOMI Redmi Note 9 Pro) के बीच मजबूत (पियर्सन का r > 0.99) और महत्वपूर्ण (p < 0.0001) सहसंबंध हैं। उनके साथ प्राप्त संकेत और प्लेट रीडर (अनुपूरक चित्रा 1) से संकेत के बीच भी महत्वपूर्ण सहसंबंध हैं। रंग डेटा निष्कर्षण के मामले में, रीडप्लेट प्लगइन का उपयोग करते समय देखभाल की जानी चाहिए, विशेष रूप से ग्रिड चेक-अप चरण में, जब किसी को यह निरीक्षण करना चाहिए कि ग्रिड प्रत्येक कुएं की स्थिति में फिट बैठता है या नहीं। किसी को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि ग्रिड सर्कल में कुओं की दीवारें या असामान्य क्षेत्र (जैसे, प्रकाश प्रतिबिंब वाला क्षेत्र) शामिल नहीं है। ग्रिड संरेखण विशेष रूप से मुश्किल हो सकता है अगर तस्वीर में प्लेट लंबवत पृष्ठभूमि है, जो यह मुश्किल ठीक से कुओं के एक केंद्र से केंद्र आयताकार चयन (ऊपरी-बाएँ से निचले-दाएँ कोने से) आकर्षित करने के लिए कर देगा करने के लिए तैनात नहीं है.

पारंपरिक स्पेक्ट्रोस्कोपिक रीडिंग की तुलना में RGBradford विधि के फायदे, अन्य तरीकों के समान हैं जो विशेष उपकरणों (जैसे, माइक्रोप्लेट रीडर) के बजाय स्मार्टफोन का उपयोग करते हैं। स्मार्टफोन व्यापक रूप से उपलब्ध हैं, स्पेक्ट्रोफोटोमीटर की तुलना में सस्ता है, बैटरी पर घंटों तक कार्य करता है, डेटा भंडारण क्षमता है, और अन्य उपकरणों के साथ वायरलेस और दूरस्थ रूप से संचार करता है। कुल मिलाकर, ये दूरस्थ स्थानों या गैर-मानक प्रयोगशाला स्थितियों, जैसे पॉइंट-ऑफ-केयर इकाइयों, कक्षाओं, क्षेत्र अभियानों और कम-संसाधन समुदायों में ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख के उपयोग की अनुमति देते हैं। कैप्चर की गई तस्वीर का बाद में विश्लेषण और व्याख्या की जा सकती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस कार्य को नेशनल काउंसिल फॉर साइंटिफिक एंड टेक्नोलॉजिकल डेवलपमेंट (CNPq, ब्राजील) [अनुदान संख्या 428048/2018-8 और 402556/2022-4] और ब्रासीलिया विश्वविद्यालय (ब्राजील) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। लेखक इस शोध में उपयोग किए गए अपने स्मार्टफ़ोन तक पहुंच प्रदान करने के लिए डॉ. डुटर्टे नूनो कार्वाल्हो और डॉ. एवलिन सैंटोस (i3s, पोर्टो, पुर्तगाल) को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well flat-bottom polystyrene microtiter plates  Jet Biofil, Guangzhou, China TCP011096 Any flat-bottom microplate compativle with optical reading will suffice. 
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A2153
Coomassie Brilliant Blue G Sigma-Aldrich, St. Louis, MO B0770
Ethyl alcohol
iPhone 11 Apple MWM02BR/A Can be substituted with other smartphone equiped with a camera
iPhone 14 Pro Apple N/A
Phosphoric acid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 695017
Redmi Note 9 Pro XIAOMI  N/A
S22 Ultra Samsung  N/A
SpectraMax 384 Plus. Microplate reader. Molecular Devices, San Jose, CA PLUS 384 Any microplate reader capable of reading at 450 nm and 590 nm will work. This is optional. The method was actually created to dismiss the need of a microplate reader.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zaguri, M., Kandel, S., Rinehart, S. A., Torsekar, V. R., Hawlena, D. Protein quantification in ecological studies: A literature review and empirical comparisons of standard methodologies. Methods in Ecology and Evolution. 12 (7), 1240-1251 (2021).
  2. Koga, T., et al. Mild electrical stimulation and heat shock ameliorates progressive proteinuria and renal inflammation in mouse model of Alport syndrome. PLoS One. 7 (8), e43852 (2012).
  3. Peterson, G. L. Determination of total protein. Methods in Enzymology. 91, 95-119 (1983).
  4. Goldfarb, A. R., Saidel, L. J., Mosovich, E. The ultraviolet absorption spectra of proteins. The Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 397-404 (1951).
  5. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. The Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).
  6. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  7. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  8. Datki, Z., et al. Application of BisANS fluorescent dye for developing a novel protein assay. PLoS One. 14 (4), e0215863 (2019).
  9. Van Noorden, R., Maher, B., Nuzzo, R. The top 100 papers. Nature. 514 (7524), 550-553 (2014).
  10. Elsevier, B. V. Scopus. , Available from: https://www.scopus.com/ (2022).
  11. Compton, S. J., Jones, C. G. Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay. Analytical Biochemistry. 151 (2), 369-374 (1985).
  12. Chial, H. J., Thompson, H. B., Splittgerber, A. G. A spectral study of the charge forms of Coomassie Blue G. Analytical Biochemistry. 209 (2), 258-266 (1993).
  13. Pande, S. V., Murthy, M. S. R. A modified micro-Bradford procedure for elimination of interference from sodium dodecyl sulfate, other detergents, and lipids. Analytical Biochemistry. 220 (2), 424-426 (1994).
  14. Gogstad, G. O., Krutnes, M. -B. Measurement of protein in cell suspensions using the Commassie brilliant blue dye-binding assay. Analytical Biochemistry. 126 (2), 355-359 (1982).
  15. Friedenauer, S., Berlet, H. H. Sensitivity and variability of the Bradford protein assay in the presence of detergents. Analytical Biochemistry. 178 (2), 263-268 (1989).
  16. Stoscheck, C. M. Increased uniformity in the response of the Coomassie blue G protein assay to different proteins. Analytical Biochemistry. 184 (1), 111-116 (1990).
  17. Zor, T., Selinger, Z. Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: Theoretical and experimental studies. Analytical Biochemistry. 236 (2), 302-308 (1996).
  18. Gee, C. T., Kehoe, E., Pomerantz, W. C. K., Penn, R. L. Quantifying protein concentrations using smartphone colorimetry: A new method for an established test. Journal of Chemical Education. 94 (7), 941-945 (2017).
  19. de Camargo, C., Vicentini, M., Gobbi, A., Martinez, D., Lima, R. Smartphone for point-of-care quantification of protein by Bradford assay. Journal of the Brazilian Chemical Society. 28 (4), 689-693 (2016).
  20. Moreira, D. C. RGBradford: Accurate measurement of protein concentration using a smartphone camera and the blue to green intensity ratio. Analytical Biochemistry. 655, 114839 (2022).
  21. Ernst, O., Zor, T. Linearization of the Bradford Protein Assay. Journal of Visualized Experiments. (38), 1918 (2010).
  22. Angelani, C. R., et al. A metabolic control analysis approach to introduce the study of systems in biochemistry: the glycolytic pathway in the red blood cell: Metabolic control analysis and the glycolytic pathway. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (5), 502-515 (2018).

Tags

बायोकेमिस्ट्री अंक 199 स्मार्टफोन कैमरा विश्लेषणात्मक उपकरण कूमासी ब्रिलियंट ब्लू डाई कलर डेटा माइक्रोप्लेट इमेज एनालिसिस सॉफ्टवेयर ब्लू टू ग्रीन तीव्रता प्रोटीन की अज्ञात सांद्रता मानक वक्र अवशोषण डेटा
RGBradford: स्मार्टफोन कैमरा के साथ प्रोटीन क्वांटिटेशन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moreira, D. C. RGBradford: Protein… More

Moreira, D. C. RGBradford: Protein Quantitation with a Smartphone Camera. J. Vis. Exp. (199), e65547, doi:10.3791/65547 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter