Summary
Dette papiret gir en protokoll for proteinkvantifisering ved hjelp av Bradford-analysen og en smarttelefon som analytisk enhet. Proteinnivåer i prøver kan kvantifiseres ved hjelp av fargedata hentet fra et bilde av en mikroplate tatt med en smarttelefon.
Abstract
Proteinkvantifisering er en viktig prosedyre i biovitenskapelig forskning. Blant flere andre metoder er Bradford-analysen en av de mest brukte. På grunn av sin utbredte har begrensningene og fordelene ved Bradford-analysen blitt grundig rapportert, inkludert flere modifikasjoner av den opprinnelige metoden for å forbedre ytelsen. En av endringene i den opprinnelige metoden er bruken av et smarttelefonkamera som et analytisk instrument. Ved å dra nytte av de tre formene for Coomassie Brilliant Blue-fargestoffet som eksisterer under forholdene i Bradford-analysen, beskriver dette papiret hvordan man nøyaktig kvantifiserer protein i prøver ved hjelp av fargedata ekstrahert fra et enkelt bilde av en mikroplate. Etter å ha utført analysen i en mikroplate, tas et bilde ved hjelp av et smarttelefonkamera, og RGB-fargedata ekstraheres fra bildet ved hjelp av et gratis bildeanalyseprogram med åpen kildekode. Deretter brukes forholdet mellom blå og grønn intensitet (i RGB-skalaen) av prøver med ukjente konsentrasjoner av protein til å beregne proteininnholdet basert på en standardkurve. Det observeres ingen signifikant forskjell mellom verdier beregnet ved hjelp av RGB-fargedata og verdier beregnet ved hjelp av konvensjonelle absorbansdata.
Introduction
Uavhengig av nedstrøms bruk (f.eks. ELISA, enzymkinetikk, vestlig blotting, proteinrensing og massespektrometri), er proteinkvantifisering avgjørende for nøyaktig analyse i biovitenskapslaboratorier. I tillegg til deres bruk som sekundære avlesninger (dvs. for å beregne relative nivåer av analytter per masse protein), kan proteinnivåer i en prøve også være ønsket utgang selv. For eksempel kan man være interessert i proteinnivåer i matressurser1 eller i urin2. Det er mange metoder tilgjengelig for å måle proteinkonsentrasjon i prøver3, inkludert direkte UV-absorbansavlesninger4, protein-kobberkelering 5,6, proteinbindende kolorimetriske analyser7 og proteinbindende fluorescerende analyser8. Relevansen av proteinkvantifisering fremgår av tilstedeværelsen av to artikler som beskriver proteinmålemetoder 5,7 i topp-3 av den mest siterte litteraturen 9,10. Til tross for at mange forfattere forsømmer deres faktiske sitering ved å sitere ikke-primære referanser eller ikke sitere noe i det hele tatt, utgjør de originale papirene som beskriver Lowry-proteinanalysen og Bradford-proteinanalysen > 200 000 siteringer hver10.
Populariteten til Bradford-analysen stammer fra overkommelig pris, enkelhet, hastighet og følsomhet. Analysen er basert på samspillet mellom proteiner og fargestoffet Coomassie Brilliant Blue G under sure forhold. Under betingelsene for analysen (dvs. lav pH) eksisterer fargestoffet i tre former: en rød kationisk form med λmax ved 470 nm; en grønn nøytral form med λmax ved 650 nm; og en blå anionisk form med λmax ved 590 nm 11,12 (figur 1). Den kationiske formen dominerer i fravær av proteiner. Når proteiner interagerer med fargestoffet, stabiliserer de den blå anioniske formen, noe som forårsaker en merkbar forandring i løsningens farge, fra brunaktig til blå. Vanligvis er endringen i konsentrasjonen av den blå formen av fargestoffet kvantifisert spektrofotometrisk, hvis absorbans ved 590-595 nm er proporsjonal med mengden protein i analysen.
Figur 1: Coomassie brilliant blue G absorpsjonsspektra under betingelsene i Bradford-analysen. De tre hovedtoppene er merket med piler som indikerer λmax av de røde (470 nm), grønne (650 nm) og blå (590 nm) formene av fargestoffet. Spektra ble registrert i fravær av protein (gul linje) og i nærvær av 3 μg (grå linje) og 10 μg (blå linje) bovint serumalbumin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Den utbredte bruken av Bradford-analysen har ført til identifisering av flere begrensninger (f.eks. Variable responser på forskjellige proteiner11 og interferens av lipider13 og vaskemidler7) og utvikling av modifikasjoner for å forbedre ytelsen (f.eks. Tilsetning av vaskemidler14,15, alkalisering14,16 og bruk av forholdet mellom absorbanser17). I tillegg til modifikasjoner i selve analysen, er bruk av alternative enheter, for eksempel smarttelefoner eller kameraer, for å fange analytiske signaler også beskrevet 18,19,20. Faktisk har utviklingen av metoder som bruker smarttelefoner som bærbare kjemiske analysatorer vært et aktivt forskningsområde. Motivasjonen for bruk av smarttelefoner stammer fra overkommelig pris, bærbarhet, brukervennlighet og utbredt tilgjengelighet av disse enhetene.
Dette papiret gir en protokoll for proteinkvantifisering ved hjelp av RGBradford-analysen20, som bruker en smarttelefon som analytisk enhet. I motsetning til den opprinnelige RGBradford-publikasjonen20, her er det innført en prosedyre som effektiviserer fargeutvinningsprosessen. Det innebærer bruk av et fritt tilgjengelig program for å trekke ut fargeinformasjon fra hver brønn i et mikroplatebilde automatisk, noe som sparer betydelig tid og krefter. Dette er et alternativ til den forrige metoden for manuelt å skaffe fargedata fra hver brønn en etter en ved hjelp av et grafikkredigeringsprogram20. Til slutt kan proteinnivåer i prøver kvantifiseres ved hjelp av fargedata hentet fra et bilde av en mikroplate tatt med en smarttelefon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av Bradford-proteinanalysereagenset
- Løs opp 100 mg Coomassie Brilliant Blue G i 50 ml 95% (w/v) etanol. Bland til Coomassie Brilliant Blue G er helt oppløst.
FORSIKTIG: Etanol er brannfarlig og forårsaker øyeirritasjon. Unngå flammer og bruk vernebriller. - Tilsett forsiktig 100 ml 85 % (w/v) fosforsyre til den forrige oppløsningen.
FORSIKTIG: Fosforsyre er etsende på metaller og forårsaker hudkorrosjon, alvorlig øyeskade og akutt oral toksisitet. Bruk hansker og vernebriller. - Tilsett oppløsningen som inneholder Coomassie Brilliant Blue G, etanol og fosforsyre sakte til 600 ml avionisert vann.
- Fortynn oppløsningen til et endelig volum på 1000 ml. Skaler opp eller ned i henhold til antall prøver som skal analyseres. Som beskrevet i den opprinnelige metoden7, bør endelige konsentrasjoner i det arbeidende Bradford-reagenset være 0,01% (w / v) Coomassie Brilliant Blue G, 4,7% (w / v) etanol og 8,5% (w / v) fosforsyre.
- Fjern all uoppløselig materialfiltrering gjennom filterpapir (Whatman #1 papir eller tilsvarende).
- Reagenset er stabilt i flere uker når det oppbevares ved romtemperatur (RT) og beskyttet mot lys. Filtrer etter behov siden utfellinger kan dannes over tid.
MERK: Alternativt er klar til å fortynne og bruke Bradford-reagenser kommersielt tilgjengelige. Følg produsentens instruksjoner for klargjøring av reagenset og fortsett til neste trinn.
2. Fremstilling av proteinstandardløsninger
- Klargjør en stamløsning (se trinn 2.4) av et isolert protein som skal brukes som standard. Et rimelig og vanlig brukt protein er bovint serumalbumin (BSA). Andre alternativer er ovalbumin og bovint gammaglobulin.
- Hvis molar absorpsjon av proteinet som brukes som standard er kjent, kontroller konsentrasjonen av stamløsningen i et spektrofotometer.
- For BSA er en vanlig brukt formel BSA (mg / ml) = (A280 / 6,6) × 10, hvor A280 er absorbansen ved 280 nm med en banelengde på 1 cm lest mot et passende tomt (dvs.ε 2801% = 6,6) 7. For eksempel har 0,8 mg/ml BSA en absorbans på 0,528 ved 280 nm.
- For å generere standardkurven, lag flere fortynninger av BSA innen 0,025 mg/ml og 1,0 mg/ml. Disse vil resultere i 0,25-10 μg BSA per brønn etter tilføring av et prøvevolum på 10 μL per brønn.
MERK: Proteinstandardløsninger skal fremstilles i et medium med samme sammensetning (endelig konsentrasjon) av mediet som brukes til å fremstille prøver.
3. Analyse
- Fortynn prøvene for å oppnå en proteinkonsentrasjon innenfor standardkurveområdet 0,025-1,0 mg/ml. Ha flere (minst 3) prøvefortynninger innenfor området.
MERK: Prøver kan fortynnes med fosfatbufret saltvann (PBS) eller en hvilken som helst annen medium/buffersammensetning som er kompatibel med Bradford-reagenset. Den endelige konsentrasjonen av mediumkomponenter bør ikke avvike mellom standard og prøver. - Tilsett 10 μL av hver proteinstandardløsning til tre brønner (dvs. i triplikat) av en 96-brønns mikroplate. For proteinpunktet 0 (null) tilsettes 10 μL av bufferen/mediet som brukes til å fremstille standardløsningene og prøvefortynningene.
- Til et annet sett med brønner, tilsett 10 μL av hver prøvefortynning til tre brønner (dvs. i triplikat) av samme 96-brønns mikroplate. En tilnærming er å legge til forskjellige volumer av en prøve og fullføre med et medium på opptil 10 μL per brønn (f.eks. 0,5 μL, 1 μL, 2 μL, 4 μL og 8 μL av prøven pluss 9,5 μL, 9 μL, 8 μL, 6 μL og 2 μL medium).
- Tilsett 250 μL Bradford-proteinanalysereagens til alle brønner. Et typisk mikroplateoppsett er vist i figur 2. I dette eksemplet ble et sett med tomme brønner som inneholdt 260 μL (det endelige volumet per brønn) vann inkludert for å tjene som tomt i en mikroplateleser (trinn 4.5). Dette er bare nødvendig hvis absorbansdata også vil bli samlet inn.
MERK: Forbered en standardkurve i samme mikroplate av prøver hver gang analysen utføres. Med andre ord, hvis antall prøver krever en annen plate, må du forberede en annen standardkurve i den andre platen, og så videre. - Registrer resultater (seksjon 4) innen 5-15 min.
Figur 2: Et typisk plateoppsett for Bradford-proteinanalysen. Blank refererer til tre brønner som inneholder 260 μL vann som skal brukes som tomt i en mikroplateleser. STD refererer til proteinstandarder. S1-S6 er seks forskjellige prøver. SX_1-SX_4 er fire forskjellige prøvefortynninger for hver prøve. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
4. Registrere resultater
- I et godt opplyst rom, hold mikroplaten parallelt med benken mot en jevn hvit bakgrunn (f.eks. et papirark) med en hånd. Sørg for nøyaktig justering ved å plassere et boblenivå på platen.
- Med den andre hånden holder du smarttelefonen parallelt (noen kameraapplikasjoner angir enhetens helning) til benken og mikroplaten og tar ett eller flere bilder av hele mikroplaten (figur 3). På iOS-enheter slår du på kameranivåindikatoren i kamerainnstillingene ved å aktivere alternativet Rutenett . På Android-enheter slår du på kameranivåindikatoren i kamerainnstillingene ved å aktivere innrammingshint.
- Ingen spesielle belysningsapparater er nødvendig, men pass på å unngå skygger og refleksjoner. Unngå for eksempel å skyggelegge platen eller bakgrunnen med smarttelefonen, og unngå å skyggelegge bakgrunnen med mikroplaten. Små refleksjoner i kantene av brønnområdet er ikke noe problem; Fargedata kan trekkes ut fra et svært lite område i midten av hver brønn.
- Sjekk bildet kort for bakgrunnsuniformitet, skygger og refleksjoner. Ta også en titt på vinkelen på brønnene; Midten av hver brønn skal være direkte synlig (dvs. ikke bak brønnvegger).
- Hvis sammenligningen mellom mikroplateabsorbansavlesninger og bildefargedata er ønskelig, les mikroplaten ved 590 nm og 450 nm i en mikroplateleser21.
Figur 3: Fange resultatene av Bradford-proteinanalysen. I et godt opplyst rom er mikroplaten plassert parallelt med benken mot en jevn bakgrunn med en hånd. Med den annen side holdes smarttelefonen parallelt med benken og mikroplaten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
5. Trekke ut fargedata - automatisk
- Last ned ImageJ og ReadPlate22, en ImageJ plugin er tilgjengelig på https://imagej.nih.gov/ij/plugins/readplate/index.html (dette er en .txt fil).
- Åpne ImageJ, klikk på Plugins > Installer og velg filen som ble lastet ned i trinn 6.1.
- Still inn måleparametrene ved å klikke på Analyser > Angi målinger og merk av for følgende alternativer: Område; Standardavvik; Min &maks grå verdi; Gjennomsnittlig grå verdi; Modal grå verdi. Nederst i vinduet setter du Omdiriger til: Ingen og Desimaler (0-9): 3.
- Gå til File > Open og velg bildet av mikroplaten tatt i trinn 4.
- Gå til Plugins > ReadPlate. Les instruksjonene, og klikk deretter OK.
- Velg antall brønner: 96.
- Bruk det rektangulære utvalgsverktøyet automatisk lastet av pluginet, og lag et rektangel som begynner i midten av A1-brønnen og slutter i midten av H12-brønnen. Klikk deretter OK.
- Velg den blå kanalen, og klikk OK.
- Bekreft standardparametrene ved å klikke på OK.
- Sjekk om programvaren avgrenset et område inne i hver brønn, og hvis de valgte områdene ikke dekker områder med unormale skygger eller refleksjon. Klikk OK.
- Lagre resultatene, og gjenta trinn 5.8–5.10 for den grønne kanalen.
- Beregn forholdet mellom blått og grønt ved hjelp av modusen for hver farge.
MERK: Beregningen kan gjøres manuelt eller ved hjelp av programvaren til leserinnstillingene, for eksempel R, Microsoft Excel eller GraphPad Prism.
6. Trekke ut fargedata-manuelt
- Last ned Inkscape, en gratis grafikkredigerer med åpen kildekode.
MERK: All programvare med fargevelgerverktøyet (vanligvis avbildet som en øyedråper) kan brukes til å identifisere fargen og trekke ut RGB-data. - Åpne Inkscape, gå til Fil > Åpne. Velg bildet av mikroplaten tatt i trinn 4.
- Velg verktøyet Merk og transformer objekter (S), som er vist som en pil øverst til venstre, og klikk på bildet. En stiplet linjekantlinje vil indikere valget.
- Velg verktøyet Velg farger fra bilde (D), som er avbildet som en pipette på venstre side.
- Klikk i midten av en brønn. Fargen på bunnpanelet ("Fyll:") endres tilsvarende. Klikk på fargen og en Fyll og strek-fane dukker opp på høyre side.
- Endre rullegardinmenyen Flat farge til RGB. Registrer verdiene som vises for de blå og grønne kanalene for hver brønn.
- Beregn forholdet mellom blått og grønt ved hjelp av de registrerte verdiene.
MERK: Beregningen kan gjøres manuelt eller ved hjelp av programvaren til leserinnstillingene, for eksempel R, Microsoft Excel eller GraphPad Prism.
7. Bygningsstandardkurver og ekstrapolering av ukjente
- Plott det gjennomsnittlige intensitetsforholdet mellom grønt og blått som en funksjon av proteinstandardkonsentrasjon.
MERK: Plott dataene manuelt eller bruk programvaren til leserinnstillingene, for eksempel R, Microsoft Excel eller GraphPad Prism. - Beregn gjennomsnittlig intensitetsforhold fra grønt til blått for hver prøve og fortynning.
- Sjekk om signalet som er oppnådd for prøven, ligger innenfor det lineære området for proteinstandarden.
- Ignorer verdier under eller over minimums- eller maksimumsverdiene for standardkurven.
- Bruk den lineære ligningen som beskriver standardkurven for å ekstrapolere mengden protein i prøven. Multipliser de beregnede verdiene med fortynningsfaktoren tilsvarende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 4 er et bilde av en mikroplate som fargedata ble hentet fra, og absorbans ved 450 nm og 590 nm ble registrert. RGB-fargedataene som her rapporteres som representative, ble innhentet automatisk som beskrevet i avsnitt 5. Et typisk mønster av fargedata er en økning i de blå verdiene og en reduksjon i de røde og grønne verdiene (figur 5). Merk at til tross for tydelig refleksjon i alle brønner og en mikroplate som ikke er perfekt justert (figur 4), gjenspeiler fargedata hentet fra bildet nøyaktig absorbansavlesninger (figur 6). Det er også et lineært forhold mellom prøvefortynning og signal for både absorbansavlesninger og fargedata (figur 7). For disse representative resultatene ble det brukt to prøver, et BV-2-cellelysat (B001) og et Galleria mellonella-homogenat (G001) fremstilt som tidligere beskrevet20, hvorav 0,5 μL, 1 μL, 2 μL, 4 μL og 8 μL ble brukt for hver brønn. Volumet ble justert til 10 μL med buffer før tilsetning av 250 μL Bradford-reagens.
Figur 4: Et representativt bilde av en Bradford-analyse mikroplate. Legg merke til lamperefleksjonen på hver brønn og feiljusteringen av brønner (dvs. høyre side av platen er vippet ned). Disse bør minimeres som mulig, men perfekt justering og belysning er ikke nødvendig (se representative resultater). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Fargeintensitet fra de tre RGB-kanalene som funksjon av proteinkonsentrasjon. Hvert punkt representerer en brønn av standardkurven i mikroplaten vist i figur 4. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Absorbansavlesninger kontra RGB-fargedata trukket ut fra et bilde. Hvert punkt representerer en brønn av standardkurven i mikroplaten vist i figur 4. Den gule skyggeleggingen representerer 95 % konfidensintervall. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Signalintensitet versus prøvevolum. Kolonner er forskjellige signaler fra forskjellige metoder: absorbansavlesninger (absorbans) og RGB-fargedata ekstrahert (RGB-data). Rader er forskjellige prøver: et BV-2-cellelysat (B001) og et Galleria mellonella-homogenat (G001). Hvert punkt er gjennomsnittsverdien av tre brønner av et gitt prøvevolum. Den gule skyggeleggingen representerer 95 % konfidensintervall. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Standardkurven (signal versus BSA-konsentrasjon) bør være strengt lineær, som vist for en representativ standardkurve bygget med BSA-konsentrasjoner på 0,025 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,8 mg/ml og 1,0 mg/ml (figur 8).
Figur 8: En typisk standardkurve som illustrerer lineariteten til forholdet mellom blått og grønt med konsentrasjonen av bovint serumalbumin (BSA). Konsentrasjonene som brukes for en typisk standardkurve er 0 mg/ml, 0,025 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,8 mg/ml og 1,0 mg/ml. Hvert punkt er gjennomsnittsverdien av tre brønner i hver BSA-konsentrasjon. Feilfelt representerer standardavviket. Den gule skyggeleggingen representerer 95 % konfidensintervall. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
I dette eksemplet med representative resultater var noen av fortynningene ikke innenfor det lineære området til standardkurven (figur 9). For prøve B001 resulterte 8 μL i et signal over det høyeste punktet på standardkurven. For G001 resulterte 0,5 μL og 1 μL i signaler under det laveste punktet på standardkurven. For begge prøvene skal disse fortynningene som ligger utenfor det lineære området for standardkurven kasseres. Etter å ha ignorert avlesninger utenfor standardkurvens område, skiller proteinnivåene beregnet ved hjelp av absorbansavlesninger seg ikke fra de som beregnes ved hjelp av RGB-data for begge prøvene (figur 10). Sammenligningen mellom absorbansdata og RGB-data med t-test resulterte i p = 0,63 for prøve B001 og p = 0,17 for prøve G001.
Figur 9: Blå-til-grønt-forhold som oppnådd ved bruk av RGBradford-metoden versus prøvevolum. De horisontale linjene avgrenser minimums- og maksimumsforholdet mellom blått og grønt for standardkurven (figur 8). Blå sirkler representerer et BV-2-cellelysat (B001), og røde symboler representerer et Galleria mellonella-homogenat (G001). Feilfelt representerer standardavviket. Merk at noen prøvefortynninger er utenfor området for standardkurven. Den gule skyggeleggingen representerer 95 % konfidensintervall. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: Proteinkonsentrasjon i to biologiske prøver kvantifisert med Bradford-proteinanalysen ved bruk av konvensjonelle absorbansavlesninger (ABS) og RGBradford-metoden (RGB). Blå symboler representerer et BV-2-cellelysat (B001), og røde symboler representerer et Galleria mellonella-homogenat (G001). Hver sirkel representerer en enkelt brønn hvorfra data ble oppnådd. Diamanter angir gjennomsnittet, og de vertikale linjene spenner fra minimums- til maksimumsverdiene for hver prøve/metode. Det er ingen forskjell mellom metodene (B001, t-test , p = 0,63; G001, t test, p = 0,17). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 1: Signaler innhentet ved hjelp av forskjellige smarttelefoner. Pearson-korrelasjonskoeffisienter for signalet (blå-til-grønt-forhold) oppnådd med forskjellige smarttelefonmodeller og signalet (A590/A450) fra Spectramax iD3 mikroplateleser. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papiret beskriver RGBradford, en metode som bruker et smarttelefonkamera til å registrere data fra en Bradford-proteinanalyse, trekke ut fargedata og nøyaktig kvantifisere proteinnivåer i biologiske prøver som opprinnelig beskrevet nylig20. En forskjell fra den opprinnelige RGBradford-metoden er at her ble det brukt en prosedyre for å skaffe fargedata automatisk med et ImageJ-plugin22 . Den viktigste nyheten med RGBradford-metoden er bruken av RGB-data som analytiske signaler; Dermed kan man bruke hvilken som helst rutineprotokoll som brukes i laboratoriet for proteinbestemmelse med Coomassie Brilliant Blue G og deretter ta et bilde av det og trekke ut fargedata. Med andre ord kan trinn 1-3 i protokollen endres i henhold til den vanlige prosedyren som brukes i et gitt laboratorium. Gitt eksistensen av flere modifikasjoner av den opprinnelige Bradford-proteinanalysen, kan man bruke den som fungerer bedre for prøvetypen / naturen og fortsette til dataopptak.
Denne protokollen har to kritiske trinn, bildeopptak og fargedatautvinning. Her og tidligere20 var det ikke nødvendig med noe spesielt belysningsapparat, og tilfredsstillende resultater ble oppnådd (dvs. det var ingen forskjell mellom resultatene fra absorbansavlesninger og fargedata hentet fra et bilde). Likevel kan man velge å bruke en plattform for å optimalisere bildeopptak, for eksempel ved hjelp av en transilluminator19,22. Hovedproblemet er å sikre en jevn bakgrunn og belysning. Videre kan tilsvarende resultater oppnås med forskjellige smarttelefonmodeller. Til tross for små forskjeller i signalet som er oppnådd med hver enhet, er det sterke (Pearsons r > 0.99) og signifikante (p < 0.0001) korrelasjoner mellom fire testede smarttelefonmodeller (Samsung S22 Ultra, Apple iPhone 11, Apple iPhone 14 Pro og XIAOMI Redmi Note 9 Pro). Det er også signifikante sammenhenger mellom signalet som oppnås med dem og signalet fra en plateleser (tilleggsfigur 1). Når det gjelder fargedatautvinning, må man være forsiktig når man bruker ReadPlate-pluginet, spesielt i rutenettkontrolltrinnet, når man må inspisere om rutenettet passer til posisjonen til hver brønn. Man bør sørge for at gittersirklene ikke inkluderer veggene i brønnene eller et unormalt område (f.eks. et område med lysrefleksjon). Rutenettjustering kan være spesielt vanskelig hvis platen i bildet ikke er vinkelrett plassert i bakgrunnen, noe som vil gjøre det vanskelig å tegne et rektangulært utvalg av brønner fra midten til midten (fra øvre venstre til nedre høyre hjørne).
Fordelene med RGBradford-metoden, sammenlignet med konvensjonelle spektroskopiske avlesninger, er de samme som andre metoder som bruker smarttelefoner i stedet for spesialiserte enheter (f.eks. mikroplatelesere). Smarttelefoner er allment tilgjengelige, billigere enn spektrofotometre, fungerer på batteri i flere timer, har datalagringskapasitet og kommuniserer trådløst og eksternt med andre enheter. Til sammen tillater disse bruk av Bradford-proteinanalysen på avsidesliggende steder eller ikke-standardiserte laboratorieforhold, for eksempel pasientnære enheter, klasserom, feltekspedisjoner og lavressurssamfunn. Det fangede bildet kan deretter analyseres videre og tolkes senere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har ingen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av National Council for Scientific and Technological Development (CNPq, Brasil) [stipendnummer 428048/2018-8 og 402556/2022-4] og Universitetet i Brasilia (Brasil). Forfatteren takker Dr. Duarte Nuno Carvalho og Dr. Evelyn Santos (i3s, Porto, Portugal) for å gi tilgang til smarttelefonene som brukes i denne undersøkelsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well flat-bottom polystyrene microtiter plates | Jet Biofil, Guangzhou, China | TCP011096 | Any flat-bottom microplate compativle with optical reading will suffice. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A2153 | |
| Coomassie Brilliant Blue G | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | B0770 | |
| Ethyl alcohol | |||
| iPhone 11 | Apple | MWM02BR/A | Can be substituted with other smartphone equiped with a camera |
| iPhone 14 Pro | Apple | N/A | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 695017 | |
| Redmi Note 9 Pro | XIAOMI | N/A | |
| S22 Ultra | Samsung | N/A | |
| SpectraMax 384 Plus. Microplate reader. | Molecular Devices, San Jose, CA | PLUS 384 | Any microplate reader capable of reading at 450 nm and 590 nm will work. This is optional. The method was actually created to dismiss the need of a microplate reader. |
References
- Zaguri, M., Kandel, S., Rinehart, S. A., Torsekar, V. R., Hawlena, D. Protein quantification in ecological studies: A literature review and empirical comparisons of standard methodologies. Methods in Ecology and Evolution. 12 (7), 1240-1251 (2021).
- Koga, T., et al. Mild electrical stimulation and heat shock ameliorates progressive proteinuria and renal inflammation in mouse model of Alport syndrome. PLoS One. 7 (8), e43852 (2012).
- Peterson, G. L.
- Goldfarb, A. R., Saidel, L. J., Mosovich, E. The ultraviolet absorption spectra of proteins. The Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 397-404 (1951).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J.
- Smith, P. K., et al.
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Datki, Z., et al. Application of BisANS fluorescent dye for developing a novel protein assay. PLoS One. 14 (4), e0215863 (2019).
- Van Noorden, R., Maher, B., Nuzzo, R.
- Elsevier, B. V. Scopus. , Available from: https://www.scopus.com/ (2022).
- Compton, S. J., Jones, C. G. Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay. Analytical Biochemistry. 151 (2), 369-374 (1985).
- Chial, H. J., Thompson, H. B., Splittgerber, A. G. A spectral study of the charge forms of Coomassie Blue G. Analytical Biochemistry. 209 (2), 258-266 (1993).
- Pande, S. V., Murthy, M. S. R. A modified micro-Bradford procedure for elimination of interference from sodium dodecyl sulfate, other detergents, and lipids. Analytical Biochemistry. 220 (2), 424-426 (1994).
- Gogstad, G. O., Krutnes, M. -B. Measurement of protein in cell suspensions using the Commassie brilliant blue dye-binding assay. Analytical Biochemistry. 126 (2), 355-359 (1982).
- Friedenauer, S., Berlet, H. H. Sensitivity and variability of the Bradford protein assay in the presence of detergents. Analytical Biochemistry. 178 (2), 263-268 (1989).
- Stoscheck, C. M. Increased uniformity in the response of the Coomassie blue G protein assay to different proteins. Analytical Biochemistry. 184 (1), 111-116 (1990).
- Zor, T., Selinger, Z. Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: Theoretical and experimental studies. Analytical Biochemistry. 236 (2), 302-308 (1996).
- Gee, C. T., Kehoe, E., Pomerantz, W. C. K., Penn, R. L. Quantifying protein concentrations using smartphone colorimetry: A new method for an established test. Journal of Chemical Education. 94 (7), 941-945 (2017).
- de Camargo, C., Vicentini, M., Gobbi, A., Martinez, D., Lima, R. Smartphone for point-of-care quantification of protein by Bradford assay. Journal of the Brazilian Chemical Society. 28 (4), 689-693 (2016).
- Moreira, D. C. RGBradford: Accurate measurement of protein concentration using a smartphone camera and the blue to green intensity ratio. Analytical Biochemistry. 655, 114839 (2022).
- Ernst, O., Zor, T.
- Angelani, C. R., et al. A metabolic control analysis approach to introduce the study of systems in biochemistry: the glycolytic pathway in the red blood cell: Metabolic control analysis and the glycolytic pathway. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (5), 502-515 (2018).
