Summary
В данной статье представлен протокол количественного определения белка с использованием анализа Брэдфорда и смартфона в качестве аналитического устройства. Уровни белка в образцах могут быть количественно определены с помощью цветовых данных, извлеченных из изображения микропланшета, сделанного с помощью смартфона.
Abstract
Количественное определение белка является важной процедурой в медико-биологических исследованиях. Среди нескольких других методов анализ Брэдфорда является одним из наиболее часто используемых. Из-за его широкого распространения, ограничения и преимущества анализа Брэдфорда были исчерпывающе описаны, включая несколько модификаций оригинального метода для улучшения его характеристик. Одной из переделок оригинального метода является использование камеры смартфона в качестве аналитического инструмента. Используя преимущества трех форм красителя Coomassie Brilliant Blue, которые существуют в условиях анализа Брэдфорда, в этой статье описывается, как точно количественно определить белок в образцах, используя данные о цвете, извлеченные из одного изображения микропланшета. После проведения анализа на микропланшете с помощью камеры смартфона делается снимок, а цветовые данные RGB извлекаются из изображения с помощью бесплатного программного обеспечения для анализа изображений с открытым исходным кодом. Затем отношение интенсивности синего и зеленого (по шкале RGB) образцов с неизвестными концентрациями белка используется для расчета содержания белка на основе стандартной кривой. Существенной разницы между значениями, рассчитанными с использованием цветовых данных RGB, и значениями, рассчитанными с использованием обычных данных поглощения, не наблюдается.
Introduction
Независимо от последующего использования (например, ИФА, кинетика ферментов, вестерн-блоттинг, очистка белков и масс-спектрометрия), количественное определение белка имеет решающее значение для точного анализа в лабораториях медико-биологических наук. В дополнение к их использованию в качестве вторичных индикаторов (т.е. для вычисления относительных уровней аналитов на массу белка), уровни белка в образце также могут быть желаемым результатом. Например, можно интересоваться уровнем белка в пищевых ресурсах1 или в моче2. Существует множество методов измерения концентрации белка в образцах3, в том числе прямые показания поглощения УФ-излучения4, хелатирование белка и меди 5,6, колориметрические анализысвязывания белка с красителем 7 и флуоресцентные анализы8, связывающие белки с красителями. Об актуальности количественного определения белка свидетельствует наличие в топ-3 наиболее цитируемой литературыдвух работ, описывающих методы измерения белка 5,7 9,10. Несмотря на то, что многие авторы пренебрегают фактическим цитированием, ссылаясь на непервичные ссылки или вообще ничего не цитируя, оригинальные статьи, описывающие белковый анализ Лоури и белковый анализ Брэдфорда, насчитывают >200 000 цитированийкаждая.
Популярность теста Брэдфорда обусловлена его доступностью, простотой, скоростью и чувствительностью. Анализ основан на взаимодействии между белками и красителем Coomassie Brilliant Blue G в кислых условиях. В условиях анализа (т.е. при низком рН) краситель существует в трех формах: красная катионная форма с λmax при 470 нм; зеленая нейтральная форма с λmax на длине волны 650 нм; и синяя анионная форма с λmax при 590 нм 11,12 (рис. 1). Катионная форма преобладает при отсутствии белков. По мере того, как белки взаимодействуют с красителем, они стабилизируют синюю анионную форму, вызывая заметное изменение цвета раствора, от коричневатого до синего. Обычно изменение концентрации синей формы красителя количественно оценивают спектрофотометрически, поглощение которой при 590-595 нм пропорционально количеству белка в анализе.
Рисунок 1: Спектры поглощения G бриллиантового синего цвета Кумасси в условиях Брэдфордского анализа. Три основных пика отмечены стрелками, указывающими λmax красной (470 нм), зеленой (650 нм) и синей (590 нм) форм красителя. Спектры регистрировали в отсутствие белка (желтая линия) и в присутствии 3 мкг (серая линия) и 10 мкг (синяя линия) бычьего сывороточного альбумина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Широкое использование анализа Брэдфорда привело к выявлению ряда ограничений (например, вариабельная реакция на различные белки11 и интерференция липидов13 и детергентов7) и разработке модификаций для улучшения его характеристик (например, добавление детергентов14,15, подщелачивание14,16 и использование коэффициента абсорбции17). В дополнение к модификациям в самом анализе, также было описано использование альтернативных устройств, таких как смартфоны или камеры, для захвата аналитических сигналов 18,19,20. Действительно, разработка методов, использующих смартфоны в качестве портативных химических анализаторов, была активной областью исследований. Мотивация использования смартфонов проистекает из доступности, портативности, простоты использования и широкой доступности этих устройств.
В данной работе представлен протокол количественного определения белка с использованием теста RGBradford20, в котором в качестве аналитического устройства используется смартфон. В отличие от оригинальной публикации RGBradford20, здесь была введена процедура, которая упрощает процесс извлечения цвета. Он включает в себя использование свободно доступного программного приложения для автоматического извлечения информации о цвете из каждой лунки изображения на микропластине, что значительно экономит время и усилия. Это альтернатива предыдущему методу ручного получения цветовых данных из каждой скважины по отдельности с помощью графического редактора20. В конечном счете, уровни белка в образцах могут быть количественно определены с помощью цветовых данных, извлеченных из изображения микропланшета, сделанного с помощью смартфона.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Приготовление реагента для белкового анализа Брэдфорда
- Растворите 100 мг Coomassie Brilliant Blue G в 50 мл 95% (по массе) этанола. Перемешивайте до полного растворения Coomassie Brilliant Blue G.
ВНИМАНИЕ: Этанол легко воспламеняется и вызывает раздражение глаз. Избегайте пламени и используйте защитные очки. - К предыдущему раствору осторожно добавьте 100 мл 85% (по массе) ортофосфорной кислоты.
ВНИМАНИЕ: Ортофосфорная кислота вызывает коррозию металлов и вызывает коррозию кожи, серьезное повреждение глаз и острую пероральную токсичность. Наденьте перчатки и защитные очки. - Медленно добавьте раствор, содержащий Coomassie Brilliant Blue G, этанол и ортофосфорную кислоту, в 600 мл деионизированной воды.
- Разбавьте раствор до конечного объема 1 000 мл. Увеличение или уменьшение масштаба в зависимости от количества анализируемых образцов. Как описано в оригинальном методе7, конечные концентрации в рабочем реактиве Брэдфорда должны составлять 0,01% (масса/об) Coomassie Brilliant Blue G, 4,7% (масса/об) этанола и 8,5% (масса/об) фосфорной кислоты.
- Удалите все нерастворимые материалы, фильтруя фильтровальную бумагу (ватман #1 или эквивалент).
- Реагент стабилен в течение нескольких недель при хранении при комнатной температуре (RT) и защите от света. При необходимости процеживайте, так как со временем могут образовываться осадки.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы в продаже имеются готовые к разбавлению и использованию реагенты Bradford. Следуйте инструкциям производителя по приготовлению реагента и переходите к следующему шагу.
2. Приготовление белковых стандартных растворов
- Приготовьте исходный раствор (см. шаг 2.4) изолированного белка, который будет использоваться в качестве стандарта. Доступным и широко используемым белком является бычий сывороточный альбумин (БСА). Другими вариантами являются овальбумин и бычий гамма-глобулин.
- Если известна молярная абсорбционная способность белка, используемого в качестве стандарта, концентрацию исходного раствора проверяют в спектрофотометре.
- Для BSA обычно используется формула BSA (мг/мл) = (A280/6,6) × 10, где A280 — это поглощение при длине волны 280 нм с длиной пути 1 см, считанное с соответствующим пробелом (т. е.ε 2801% = 6,6)7. Например, 0,8 мг/мл БСА имеет абсорбцию 0,528 при 280 нм.
- Для получения стандартной кривой приготовьте несколько разведений БСА в пределах 0,025 мг/мл и 1,0 мг/мл. Это приведет к получению 0,25-10 мкг БСА на лунку после добавления объема образца 10 мкл на лунку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Белковые стандартные растворы должны быть приготовлены в среде с тем же составом (конечной концентрацией), что и среда, используемая для приготовления образцов.
3. Анализ
- Разбавляют образцы до достижения концентрации белка в пределах стандартной кривой диапазона 0,025-1,0 мг/мл. Иметь несколько (не менее 3) разведений образца в пределах диапазона.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут быть разбавлены фосфатно-солевым буфером (PBS) или любой другой средой/буферной композицией, совместимой с реагентом Брэдфорда. Конечная концентрация компонентов среды не должна отличаться между стандартными и образцами. - Добавьте по 10 мкл каждого стандартного белкового раствора в три лунки (т.е. в трех экземплярах) 96-луночного микропланшета. Для 0 (нулевой) точки белка добавьте 10 мкл буфера/среды, используемой для приготовления стандартных растворов и разведения образцов.
- К другому набору лунок добавьте по 10 мкл каждого разведения образца в три лунки (т. е. в трех экземплярах) того же 96-луночного микропланшета. Один из подходов заключается в добавлении различных объемов образца и в комплекте со средой до 10 мкл на лунку (например, 0,5 мкл, 1 мкл, 2 мкл, 4 мкл и 8 мкл образца плюс 9,5 мкл, 9 мкл, 8 мкл, 6 мкл и 2 мкл среды).
- Добавьте 250 мкл реагента для анализа белка Bradford во все лунки. Типичная схема микропланшета показана на рисунке 2. В этом примере набор пустых лунок, содержащих 260 мкл (окончательный объем на лунку) воды, был включен в качестве заготовки в считыватель микропланшетов (шаг 4.5). Это требуется только в том случае, если также будут собираться данные о поглощении.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте стандартную кривую в одном и том же микропланшете образцов каждый раз, когда выполняется анализ. Другими словами, если количество образцов требует другой пластины, подготовьте еще одну стандартную кривую во второй пластине и так далее. - Запишите результаты (раздел 4) в течение 5-15 минут.
Рисунок 2: Типичная схема планшета для анализа белка в Брэдфорде. Бланк относится к трем лункам, содержащим 260 мкл воды, которые используются в качестве заготовки в считывателе микропланшетов. ЗППП относится к белковым стандартам. S1-S6 представляют собой шесть различных образцов. SX_1-SX_4 представляют собой четыре различных разведения образца для каждого образца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
4. Запись результатов
- В хорошо освещенном помещении держите микропластину параллельно скамье на однородном белом фоне (например, бумажном листе) одной рукой. Обеспечьте точное выравнивание, поместив пузырьковый уровень на пластину.
- Другой рукой поднесите смартфон параллельно (некоторые приложения камеры полезно указывают на наклон устройства) к скамье и микропланшету и сделайте один или несколько снимков всей микропластины (рисунок 3). На устройствах iOS включите индикатор уровня камеры в настройках камеры, включив опцию «Сетка ». На устройствах Android включите индикатор уровня камеры в настройках камеры, включив подсказки кадрирования.
- Никаких специальных осветительных приборов не требуется, но будьте осторожны, чтобы избежать теней и отражений. Например, избегайте затенения пластины или фона с помощью смартфона и избегайте затенения фона с помощью микропланшета. Небольшие отражения по краям скважины не являются проблемой; Данные о цвете могут быть извлечены из очень небольшой области в центре каждой скважины.
- Кратко проверьте изображение на однородность фона, тени и отражения. Кроме того, обратите внимание на угол наклона колодцев; Центр каждого колодца должен быть виден непосредственно (т.е. не за стенками колодца).
- Если требуется сравнить показания поглощения микропланшета с данными о цвете изображения, считывание микропланшета с длиной волны 590 нм и 450 нм в считывателе21 микропланшета.
Рисунок 3: Получение результатов анализа белка в Брэдфорде. В хорошо освещенном помещении микропластину располагают одной рукой параллельно скамье на однородном фоне. Другой рукой смартфон держат параллельно скамье и микропланшету. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
5. Автоматическое извлечение цветовых данных
- Загрузите ImageJ и ReadPlate22, плагин ImageJ доступен по адресу https://imagej.nih.gov/ij/plugins/readplate/index.html (это файл .txt).
- Откройте ImageJ, нажмите « Плагины» > «Установить » и выберите файл, загруженный на шаге 6.1.
- Задайте параметры измерения, нажав « Анализ» > «Установить измерения», и отметьте следующие параметры: Площадь; Стандартное отклонение; Минимальное и максимальное значение серого; Среднее значение серого; Модальное значение серого. В нижней части окна установите Редирект на: Нет и Десятичные знаки (0-9): 3.
- Перейдите в раздел File > Open (Файл открыть ) и выберите снимок микропластины, сделанный на шаге 4.
- Перейдите в раздел «Плагины» > ReadPlate. Прочтите инструкции и нажмите кнопку ОК.
- Выберите количество лунок: 96.
- С помощью инструмента Прямоугольное выделение, автоматически загружаемого плагином, создайте прямоугольник, начинающийся в центре ячейки A1 и заканчивающийся в центре ячейки H12. Затем нажмите кнопку ОК.
- Выберите синий канал и нажмите кнопку ОК.
- Подтвердите параметры по умолчанию, нажав кнопку ОК.
- Проверьте, очертило ли программное обеспечение область внутри каждой скважины и не покрывают ли выбранные области области с аномальными тенями или отражениями. Нажмите кнопку ОК.
- Сохраните результаты и повторите шаги 5.8-5.10 для зеленого канала.
- Рассчитайте соотношение синего и зеленого, используя режим для каждого цвета.
ПРИМЕЧАНИЕ: Расчет может быть выполнен вручную или с помощью программного обеспечения настроек считывателя, такого как R, Microsoft Excel или GraphPad Prism.
6. Извлечение цветовых данных - Вручную
- Загрузите Inkscape, бесплатный графический редактор с открытым исходным кодом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Любое программное обеспечение с инструментом палитры цветов (обычно изображается в виде пипетки) может быть использовано для определения цвета и извлечения данных RGB. - Откройте Inkscape, перейдите в Файл > Открыть. Выберите снимок микропластины, сделанный на шаге 4.
- Выберите инструмент «Выделение и трансформация объектов» (S), который изображен в виде стрелки в левом верхнем углу, и нажмите на картинку. Пунктирная линия будет обозначать выбор.
- Выберите инструмент «Выбрать цвета из изображения» (D), который изображен в виде пипетки с левой стороны.
- Щелкните в центре колодца. Цвет на нижней панели ("Заливка:") изменится соответствующим образом. Нажмите на цвет, и справа появится вкладка Заливка и обводка .
- Измените раскрывающееся меню «Однотонный цвет » на RGB. Запишите значения, показанные для синего и зеленого каналов для каждой скважины.
- Рассчитайте соотношение синего и зеленого, используя записанные значения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Расчет может быть выполнен вручную или с помощью программного обеспечения настроек считывателя, такого как R, Microsoft Excel или GraphPad Prism.
7. Построение стандартных кривых и экстраполяция неизвестных
- Постройте график среднего отношения интенсивности зеленого к синему в зависимости от стандартной концентрации белка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наносите данные вручную или с помощью программного обеспечения настроек считывателя, такого как R, Microsoft Excel или GraphPad Prism. - Рассчитайте среднее отношение интенсивности зеленого к синему для каждого образца и разведения.
- Проверьте, находится ли сигнал, полученный для образца, в линейном диапазоне белкового стандарта.
- Игнорируйте любые значения ниже или выше минимальных или максимальных значений стандартной кривой.
- Используйте линейное уравнение, описывающее стандартную кривую, чтобы экстраполировать количество белка в образце. Соответственно умножьте рассчитанные значения на коэффициент разбавления.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 4 изображена микропластина, из которой были извлечены цветовые данные, и записано поглощение на длинах волн 450 нм и 590 нм. Данные о цвете RGB, представленные здесь в качестве репрезентативных, были получены автоматически, как описано в разделе 5. Типичным паттерном цветовых данных является увеличение синих значений и уменьшение красных и зеленых значений (рис. 5). Обратите внимание, что, несмотря на явное отражение во всех лунках и не идеально выровненную микропланшет (рис. 4), цветовые данные, извлеченные из рисунка, точно отражают показания абсорбции (рис. 6). Существует также линейная зависимость между разбавлением образца и сигналом как для показаний поглощения, так и для цветовых данных (рис. 7). Для получения этих репрезентативных результатов были использованы два образца: клеточный лизат BV-2 (B001) и гомогенат Galleria mellonella (G001), приготовленный, как описано выше, 20, из которых для каждой лунки использовали 0,5 мкл, 1 мкл, 2 мкл, 4 мкл и 8 мкл. Объем доводили до 10 мкл с буфером перед добавлением 250 мкл реагента Брэдфорда.
Рисунок 4: Репрезентативное изображение микропланшета Брэдфордского анализа. Обратите внимание на отражение лампы на каждом лунке и несоосность лунок (т.е. правая сторона пластины наклонена вниз). Они должны быть сведены к минимуму, насколько это возможно, но идеальное выравнивание и освещение не являются обязательными (см. репрезентативные результаты). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Интенсивность цвета от трех каналов RGB в зависимости от концентрации белка. Каждая точка представляет собой углубление стандартной кривой в микропланшете, показанном на рисунке 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Показания поглощения в сравнении с цветовыми данными RGB, извлеченными из изображения. Каждая точка представляет собой углубление стандартной кривой в микропланшете, показанном на рисунке 4. Желтая штриховка соответствует 95% доверительному интервалу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Зависимость интенсивности сигнала от объема образца. Столбцы представляют собой различные сигналы, полученные разными методами: показания поглощения (Absorbance) и извлеченные данные о цвете RGB (данные RGB). Ряды представляют собой различные образцы: клеточный лизат BV-2 (B001) и гомогенат Galleria mellonella (G001). Каждая точка представляет собой среднее значение трех лунок заданного объема пробы. Желтая штриховка соответствует 95% доверительному интервалу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Стандартная кривая (зависимость сигнала от концентрации БСА) должна быть строго линейной, как показано для репрезентативной стандартной кривой, построенной с концентрациями БСА 0,025 мг/мл, 0,05 мг/мл, 0,1 мг/мл, 0,2 мг/мл, 0,4 мг/мл, 0,6 мг/мл, 0,8 мг/мл и 1,0 мг/мл (рисунок 8).
Рисунок 8: Типичная стандартная кривая, иллюстрирующая линейность соотношения синего и зеленого цветов с концентрацией бычьего сывороточного альбумина (БСА). Концентрации, используемые для типичной стандартной кривой: 0,025 мг/мл, 0,025 мг/мл, 0,05 мг/мл, 0,1 мг/мл, 0,2 мг/мл, 0,4 мг/мл, 0,6 мг/мл, 0,8 мг/мл и 1,0 мг/мл. Каждая точка представляет собой среднее значение по трем лункам каждой концентрации БСА. Столбцы погрешности представляют собой стандартное отклонение. Желтая штриховка соответствует 95% доверительному интервалу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
В этом примере репрезентативных результатов некоторые разведения не укладывались в линейный диапазон стандартной кривой (рис. 9). Для образца B001 8 мкл приводили к сигналу выше самой высокой точки стандартной кривой. В случае G001 0,5 мкл и 1 мкл приводили к сигналам ниже самой нижней точки стандартной кривой. Для обоих образцов эти разведения, лежащие за пределами линейного диапазона стандартной кривой, должны быть отброшены. После игнорирования показаний, выходящих за пределы диапазона стандартной кривой, уровни белка, рассчитанные с использованием показаний абсорбции, не отличаются от показателей, рассчитанных с использованием данных RGB для обоих образцов (рис. 10). Сравнение данных о поглощении и данных RGB с помощью t-критерия дало p = 0,63 для образца B001 и p = 0,17 для образца G001.
Рисунок 9: Отношение синего к зеленому, полученное с помощью метода RGBradford, в зависимости от объема выборки. Горизонтальные линии разграничивают минимальное и максимальное соотношение синего и зеленого цветов стандартной кривой (рис. 8). Синие круги обозначают клеточный лизат BV-2 (B001), а красные символы представляют гомогенат Galleria mellonella (G001). Столбцы погрешности представляют собой стандартное отклонение. Обратите внимание, что некоторые разведения образца выходят за пределы диапазона стандартной кривой. Желтая штриховка соответствует 95% доверительному интервалу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 10: Концентрация белка в двух биологических образцах, количественно определенная с помощью анализа белка Брэдфорда с использованием обычных показаний абсорбции (ABS) и метода RGBradford (RGB). Синие символы обозначают клеточный лизат BV-2 (B001), а красные символы представляют гомогенат Galleria mellonella (G001). Каждый круг представляет собой одну скважину, из которой были получены данные. Ромбами обозначено среднее значение, а вертикальные линии охватывают от минимального до максимального значения для каждого образца/метода. Различий между методами нет (B001, t-критерий, p = 0,63; G001, t-критерий, p = 0,17). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Сигналы, полученные с помощью разных смартфонов. Коэффициенты корреляции Пирсона для сигнала (соотношение синего и зеленого), полученного с разных моделей смартфонов, и сигнала (A590/A450) от считывателя микропланшетов Spectramax iD3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье описывается RGBradford, метод, который использует камеру смартфона для записи данных анализа белка в Брэдфорде, извлечения цветовых данных и точного количественного определения уровня белка в биологических образцах, как первоначально было описанонедавно. Одно из отличий от оригинального метода RGBradford заключается в том, что здесь использовалась процедура автоматического получения цветовых данных с помощью плагина ImageJ22 . Основной новизной метода RGBradford является использование данных RGB в качестве аналитических сигналов; Таким образом, можно использовать любой рутинный протокол, используемый в лаборатории для определения белка с помощью Coomassie Brilliant Blue G, а затем сфотографировать его и извлечь данные о цвете. Другими словами, шаги 1-3 протокола могут быть изменены в соответствии с обычной процедурой, используемой в данной лаборатории. Учитывая существование нескольких модификаций оригинального анализа белка Брэдфорда, можно использовать ту, которая лучше подходит для его типа/природы образца, и перейти к записи данных.
Этот протокол состоит из двух критически важных этапов: захват изображения и извлечение цветовых данных. Здесь, как и ранее, не потребовалось никакого специального осветительного прибора, и были получены удовлетворительные результаты (т.е. не было никакой разницы между результатами показаний поглощения и цветовыми данными, извлеченными из изображения). Тем не менее, можно использовать платформу для оптимизации получения изображений, например, с помощью трансиллюминатора19,22. Главное – обеспечить равномерный фон и освещение. Более того, аналогичные результаты могут быть получены с разными моделями смартфонов. Несмотря на незначительные различия в сигнале, получаемом каждым устройством, между четырьмя протестированными моделями смартфонов (Samsung S22 Ultra, Apple iPhone 11, Apple iPhone 14 Pro и XIAOMI Redmi Note 9 Pro) существуют сильные (r > Пирсона 0,99) и значимые (p < 0,0001) корреляции. Существуют также значимые корреляции между сигналом, полученным с их помощью, и сигналом от считывателя пластин (дополнительный рисунок 1). В случае извлечения цветовых данных необходимо соблюдать осторожность при использовании плагина ReadPlate, особенно на этапе проверки сетки, когда необходимо проверить, соответствует ли сетка положению каждой лунки. Следует следить за тем, чтобы круги сетки не включали в себя стенки колодцев или аномальную зону (например, область с отражением света). Выравнивание сетки может быть особенно сложным, если пластина на рисунке расположена не перпендикулярно фону, что затруднит правильное рисование прямоугольного выделения лунок от центра к центру (от левого верхнего угла к правому нижнему).
Преимущества метода RGBradford, по сравнению с обычными спектроскопическими показаниями, такие же, как и у других методов, использующих смартфоны вместо специализированных устройств (например, считывателей микропланшетов). Смартфоны широко доступны, дешевле, чем спектрофотометры, работают от батареи в течение нескольких часов, имеют емкость для хранения данных и обмениваются данными по беспроводной сети и удаленно с другими устройствами. В целом, это позволяет использовать анализ белка Брэдфорда в отдаленных местах или в нестандартных лабораторных условиях, таких как пункты оказания медицинской помощи, классы, полевые экспедиции и сообщества с ограниченными ресурсами. Полученное изображение может быть дополнительно проанализировано и интерпретировано позже.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У автора нет конфликта интересов, который он мог бы декларировать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Национальным советом по научно-техническому развитию (CNPq, Бразилия) [номера грантов 428048/2018-8 и 402556/2022-4] и Университетом Бразилиа (Бразилия). Автор благодарит д-ра Дуарте Нуно Карвалью и д-ра Эвелин Сантуш (i3s, Порту, Португалия) за предоставление доступа к их смартфонам, использованным в этом исследовании.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well flat-bottom polystyrene microtiter plates | Jet Biofil, Guangzhou, China | TCP011096 | Any flat-bottom microplate compativle with optical reading will suffice. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A2153 | |
| Coomassie Brilliant Blue G | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | B0770 | |
| Ethyl alcohol | |||
| iPhone 11 | Apple | MWM02BR/A | Can be substituted with other smartphone equiped with a camera |
| iPhone 14 Pro | Apple | N/A | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 695017 | |
| Redmi Note 9 Pro | XIAOMI | N/A | |
| S22 Ultra | Samsung | N/A | |
| SpectraMax 384 Plus. Microplate reader. | Molecular Devices, San Jose, CA | PLUS 384 | Any microplate reader capable of reading at 450 nm and 590 nm will work. This is optional. The method was actually created to dismiss the need of a microplate reader. |
References
- Zaguri, M., Kandel, S., Rinehart, S. A., Torsekar, V. R., Hawlena, D. Protein quantification in ecological studies: A literature review and empirical comparisons of standard methodologies. Methods in Ecology and Evolution. 12 (7), 1240-1251 (2021).
- Koga, T., et al. Mild electrical stimulation and heat shock ameliorates progressive proteinuria and renal inflammation in mouse model of Alport syndrome. PLoS One. 7 (8), e43852 (2012).
- Peterson, G. L.
- Goldfarb, A. R., Saidel, L. J., Mosovich, E. The ultraviolet absorption spectra of proteins. The Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 397-404 (1951).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J.
- Smith, P. K., et al.
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Datki, Z., et al. Application of BisANS fluorescent dye for developing a novel protein assay. PLoS One. 14 (4), e0215863 (2019).
- Van Noorden, R., Maher, B., Nuzzo, R.
- Elsevier, B. V. Scopus. , Available from: https://www.scopus.com/ (2022).
- Compton, S. J., Jones, C. G. Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay. Analytical Biochemistry. 151 (2), 369-374 (1985).
- Chial, H. J., Thompson, H. B., Splittgerber, A. G. A spectral study of the charge forms of Coomassie Blue G. Analytical Biochemistry. 209 (2), 258-266 (1993).
- Pande, S. V., Murthy, M. S. R. A modified micro-Bradford procedure for elimination of interference from sodium dodecyl sulfate, other detergents, and lipids. Analytical Biochemistry. 220 (2), 424-426 (1994).
- Gogstad, G. O., Krutnes, M. -B. Measurement of protein in cell suspensions using the Commassie brilliant blue dye-binding assay. Analytical Biochemistry. 126 (2), 355-359 (1982).
- Friedenauer, S., Berlet, H. H. Sensitivity and variability of the Bradford protein assay in the presence of detergents. Analytical Biochemistry. 178 (2), 263-268 (1989).
- Stoscheck, C. M. Increased uniformity in the response of the Coomassie blue G protein assay to different proteins. Analytical Biochemistry. 184 (1), 111-116 (1990).
- Zor, T., Selinger, Z. Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: Theoretical and experimental studies. Analytical Biochemistry. 236 (2), 302-308 (1996).
- Gee, C. T., Kehoe, E., Pomerantz, W. C. K., Penn, R. L. Quantifying protein concentrations using smartphone colorimetry: A new method for an established test. Journal of Chemical Education. 94 (7), 941-945 (2017).
- de Camargo, C., Vicentini, M., Gobbi, A., Martinez, D., Lima, R. Smartphone for point-of-care quantification of protein by Bradford assay. Journal of the Brazilian Chemical Society. 28 (4), 689-693 (2016).
- Moreira, D. C. RGBradford: Accurate measurement of protein concentration using a smartphone camera and the blue to green intensity ratio. Analytical Biochemistry. 655, 114839 (2022).
- Ernst, O., Zor, T.
- Angelani, C. R., et al. A metabolic control analysis approach to introduce the study of systems in biochemistry: the glycolytic pathway in the red blood cell: Metabolic control analysis and the glycolytic pathway. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (5), 502-515 (2018).
