Summary
Denna artikel tillhandahåller ett protokoll för proteinkvantifiering med hjälp av Bradford-analysen och en smartphone som analytisk enhet. Proteinnivåer i prover kan kvantifieras med hjälp av färgdata extraherade från en bild av en mikroplatta tagen med en smartphone.
Abstract
Proteinkvantifiering är en viktig procedur inom biovetenskaplig forskning. Bland flera andra metoder är Bradford-analysen en av de mest använda. På grund av dess utbredda utbredning har begränsningarna och fördelarna med Bradford-analysen rapporterats utförligt, inklusive flera modifieringar av den ursprungliga metoden för att förbättra dess prestanda. En av förändringarna i den ursprungliga metoden är användningen av en smartphonekamera som analysinstrument. Genom att dra nytta av de tre formerna av Coomassie Brilliant Blue-färgämnet som finns under Bradford-analysens förhållanden, beskriver denna artikel hur man exakt kvantifierar protein i prover med hjälp av färgdata extraherade från en enda bild av en mikroplatta. Efter att ha utfört analysen i en mikroplatta tas en bild med en smartphonekamera och RGB-färgdata extraheras från bilden med hjälp av en gratis bildanalysprogramvara med öppen källkod. Sedan används förhållandet mellan blå och grön intensitet (i RGB-skalan) för prover med okända koncentrationer av protein för att beräkna proteininnehållet baserat på en standardkurva. Ingen signifikant skillnad observeras mellan värden som beräknas med RGB-färgdata och de som beräknas med konventionella absorbansdata.
Introduction
Oavsett nedströms användning (t.ex. ELISA, enzymkinetik, western blotting, proteinrening och masspektrometri) är proteinkvantifiering avgörande för noggrann analys i biovetenskapliga laboratorier. Förutom att de används som sekundära avläsningar (dvs. för att beräkna relativa nivåer av analyter per proteinmassa) kan proteinnivåerna i ett prov också vara det önskade resultatet i sig. Man kan till exempel vara intresserad av proteinnivåer i födoämnen1 eller i urin2. Det finns många metoder tillgängliga för att mäta proteinkoncentrationen i prover3, inklusive direkta UV-absorbansavläsningar4, protein-kopparkelering 5,6, proteinfärgbindande kolorimetriska analyser7 och proteinfärgbindande fluorescerande analyser8. Relevansen av proteinkvantifiering bevisas av närvaron av två artiklar som beskriver proteinmätningsmetoder 5,7 i topp-3 av den mest citerade litteraturen 9,10. Trots det faktum att många författare försummar sin faktiska citering genom att citera icke-primära referenser eller inte citera något alls, uppgår de ursprungliga artiklarna som beskriver Lowry-proteinanalysen och Bradford-proteinanalysen > 200 000 citeringar vardera10.
Bradford-analysens popularitet beror på dess prisvärdhet, enkelhet, snabbhet och känslighet. Analysen är baserad på interaktionen mellan proteiner och färgämnet Coomassie Brilliant Blue G under sura förhållanden. Under analysbetingelserna (dvs. lågt pH) finns färgämnet i tre former: en röd katjonisk form med λmax vid 470 nm; En grön neutral form med λmax vid 650 nm. och en blå anjonisk form med λmax vid 590 nm 11,12 (figur 1). Den katjoniska formen dominerar i frånvaro av proteiner. När proteiner interagerar med färgämnet stabiliserar de den blå anjoniska formen, vilket orsakar en märkbar förändring i lösningens färg, från brunaktig till blå. Vanligtvis kvantifieras förändringen i koncentrationen av färgämnets blå form spektrofotometriskt, vars absorbans vid 590-595 nm är proportionell mot mängden protein i analysen.
Figur 1: Coomassie briljantblått G-absorptionsspektra under betingelserna för Bradford-analysen. De tre huvudtopparna är markerade med pilar som anger λmax för de röda (470 nm), gröna (650 nm) och blå (590 nm) formerna av färgämnet. Spektra registrerades i frånvaro av protein (gul linje) och i närvaro av 3 μg (grå linje) och 10 μg (blå linje) bovint serumalbumin. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Den utbredda användningen av Bradford-analysen har lett till identifiering av flera begränsningar (t.ex. varierande respons på olika proteiner11 och interferens av lipider13 och rengöringsmedel7) och utveckling av modifieringar för att förbättra dess prestanda (t.ex. tillsats av rengöringsmedel14,15, alkalinisering14,16 och användning av förhållandet mellan absorbanser17). Förutom modifieringar i själva analysen har användningen av alternativa enheter, såsom smartphones eller kameror, för att fånga analytiska signaler också beskrivits 18,19,20. Faktum är att utvecklingen av metoder som använder smartphones som bärbara kemiska analysatorer har varit ett aktivt forskningsområde. Motivationen för användningen av smartphones härrör från prisvärdheten, portabiliteten, användarvänligheten och den utbredda tillgängligheten av dessa enheter.
Denna artikel tillhandahåller ett protokoll för proteinkvantifiering med hjälp av RGBradford-analysen20, som använder en smartphone som en analytisk enhet. Till skillnad från den ursprungliga RGBradford-publikationen20 har här en procedur som effektiviserar färgextraktionsprocessen införts. Det innebär användning av en fritt tillgänglig programvara för att extrahera färginformation från varje brunn i en mikroplattbild automatiskt, vilket sparar mycket tid och ansträngning. Detta är ett alternativ till den tidigare metoden att manuellt hämta färgdata från varje brunn en efter en med hjälp av ett grafikredigeringsprogram20. I slutändan kan proteinnivåerna i prover kvantifieras med hjälp av färgdata som extraheras från en bild av en mikroplatta tagen med en smartphone.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av Bradfords proteinanalysreagens
- Lös upp 100 mg Coomassie Brilliant Blue G i 50 ml 95 % (w/v) etanol. Blanda tills Coomassie Brilliant Blue G är helt upplöst.
VARNING: Etanol är brandfarligt och orsakar ögonirritation. Undvik lågor och använd skyddsglasögon. - Tillsätt försiktigt 100 ml 85 % (vikt/volym) fosforsyra till den föregående lösningen.
VARNING: Fosforsyra är frätande för metaller och orsakar hudkorrosion, allvarliga ögonskador och akut oral toxicitet. Använd handskar och skyddsglasögon. - Tillsätt långsamt lösningen som innehåller Coomassie Brilliant Blue G, etanol och fosforsyra till 600 ml avjoniserat vatten.
- Späd lösningen till en slutlig volym på 1 000 ml. Skala upp eller ner beroende på antalet prover som ska analyseras. Som beskrivits i den ursprungliga metoden7 bör de slutliga koncentrationerna i det fungerande Bradford-reagenset vara 0,01 % (vikt/volym) Coomassie Brilliant Blue G, 4,7 % (vikt/volym) etanol och 8,5 % (vikt/volym) fosforsyra.
- Ta bort allt olösligt material som filtreras genom filterpapper (Whatman #1 papper eller motsvarande).
- Reagenset är stabilt i flera veckor när det förvaras i rumstemperatur (RT) och skyddas från ljus. Filtrera vid behov eftersom fällningar kan bildas med tiden.
OBS: Alternativt finns färdiga att späda ut och använda Bradford-reagenser kommersiellt tillgängliga. Följ tillverkarens instruktioner för beredning av reagenset och fortsätt till nästa steg.
2. Beredning av proteinstandardlösningar
- Bered en stamlösning (se steg 2.4) av ett isolerat protein som ska användas som standard. Ett prisvärt och vanligt förekommande protein är bovint serumalbumin (BSA). Andra alternativ är ovalbumin och bovint gammaglobulin.
- Om den molära absorptiviteten hos det protein som används som standard är känd, kontrollera stamlösningens koncentration i en spektrofotometer.
- För BSA är en vanlig formel BSA (mg/ml) = (A280/6,6) × 10, där A280 är absorbansen vid 280 nm med en väglängd på 1 cm avläst mot ett lämpligt blankprov (dvs. ε2801 % = 6,6)7. Till exempel har 0,8 mg/ml BSA en absorbans på 0,528 vid 280 nm.
- För att generera standardkurvan, förbered flera spädningar av BSA inom 0,025 mg/ml och 1,0 mg/ml. Dessa kommer att resultera i 0,25-10 μg BSA per brunn efter tillsats av en provvolym på 10 μL per brunn.
Anmärkning: Proteinstandardlösningar bör beredas i ett medium med samma sammansättning (slutkoncentration) som det medium som används för att bereda prover.
3. Analys
- Späd proverna för att uppnå en proteinkoncentration inom standardkurvan på 0,025-1,0 mg/ml. Ha flera (minst 3) provutspädningar inom intervallet.
OBS: Samples kan spädas med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) eller någon annan medium/buffertkomposition som är kompatibel med Bradford-reagensen. Den slutliga koncentrationen av mediekomponenter bör inte skilja sig åt mellan standard och prover. - Tillsätt 10 μl av varje proteinstandardlösning till tre brunnar (dvs. i tre exemplar) på en mikroplatta med 96 brunnar. För proteinpunkten 0 (noll) tillsätts 10 μl av den buffert/det medium som används för att bereda standardlösningarna och provutspädningarna.
- Tillsätt 10 μl av varje provutspädning till tre brunnar (dvs. i tre exemplar) på samma mikroplatta med 96 brunnar till en annan uppsättning brunnar. En metod är att lägga till olika volymer av ett prov och komplettera med ett medium på upp till 10 μL per brunn (t.ex. 0,5 μL, 1 μL, 2 μL, 4 μL och 8 μL av provet plus 9,5 μL, 9 μL, 8 μL, 6 μL och 2 μL medium).
- Tillsätt 250 μl Bradfordproteinanalysreagens till alla brunnar. En typisk mikroplattinställning visas i figur 2. I det här exemplet inkluderades en uppsättning tomma brunnar som innehöll 260 μL (den slutliga volymen per brunn) vatten för att fungera som blank i en mikroplattläsare (steg 4.5). Detta krävs endast om absorbansdata också kommer att samlas in.
OBS: Förbered en standardkurva i samma mikroplatta av samples varje gång analysen utförs. Med andra ord, om antalet prover kräver en annan platta, förbered en annan standardkurva i den andra plattan, och så vidare. - Anteckna resultat (avsnitt 4) inom 5-15 min.
Figur 2: En typisk plattlayout för Bradfordproteinanalysen. Blank avser tre brunnar som innehåller 260 μL vatten som ska användas som blank i en mikroplattläsare. STD hänvisar till proteinstandarder. S1-S6 är sex olika prover. SX_1-SX_4 är fyra olika provutspädningar för varje prov. Klicka här för att se en större version av denna figur.
4. Registrering av resultat
- I ett väl upplyst rum, håll mikroplattan parallellt med bänken mot en enhetlig vit bakgrund (t.ex. ett pappersark) med en hand. Säkerställ korrekt inriktning genom att placera ett vattenpass på plattan.
- Med den andra handen håller du smarttelefonen parallellt (vissa kameraapplikationer indikerar med fördel enhetens lutning) mot bänken och mikroplattan och tar en eller flera bilder av hela mikroplattan (Figur 3). På iOS-enheter aktiverar du kameranivåindikatorn i kamerainställningarna genom att aktivera alternativet Rutnät . På Android-enheter aktiverar du kameranivåindikatorn i kamerainställningarna genom att aktivera Inramningstips.
- Ingen speciell belysningsapparat krävs, men var noga med att undvika skuggor och reflektioner. Undvik till exempel att skugga plattan eller bakgrunden med smarttelefonen och undvik att skugga bakgrunden med mikroplattan. Små reflektioner i kanterna på brunnsområdet är inget problem; Färgdata kan extraheras från ett mycket litet område i mitten av varje brunn.
- Kontrollera kortfattat bilden för bakgrundsenhetlighet, skuggor och reflektioner. Ta också en titt på brunnarnas vinkel; Mitten av varje brunn ska vara direkt synlig (dvs. inte bakom brunnsväggar).
- Om jämförelse mellan mikroplattans absorbansavläsningar och bildfärgdata önskas, läs av mikroplattan vid 590 nm och 450 nm i en mikroplattläsare21.
Figur 3: Fånga resultaten av Bradford-proteinanalysen. I ett väl upplyst rum placeras mikroplattan parallellt med bänken mot en enhetlig bakgrund med en hand. Med den andra handen hålls smarttelefonen parallellt med bänken och mikroplattan. Klicka här för att se en större version av denna figur.
5. Extrahera färgdata automatiskt
- Ladda ner ImageJ och ReadPlate22, ett ImageJ-plugin finns på https://imagej.nih.gov/ij/plugins/readplate/index.html (detta är en .txt-fil).
- Öppna ImageJ, klicka på Plugins > Installera och välj filen som laddades ner i steg 6.1.
- Ställ in mätparametrarna genom att klicka på Analysera > Ställ in mätningar och kontrollera följande alternativ: Område; Standardavvikelse; Minsta och högsta gråvärde; Medelvärde för grått. Modalt gråvärde. Längst ned i fönstret anger du Omdirigering till: Ingen och Decimaler (0-9): 3.
- Gå till Arkiv > Öppna och välj bilden av mikroplattan som togs i steg 4.
- Gå till Plugins > ReadPlate. Läs instruktionerna och klicka sedan på OK.
- Välj antal brunnar: 96.
- Använd det rektangulära markeringsverktyget som automatiskt laddas av plugin-programmet och gör en rektangel som börjar i mitten av A1-brunnen och slutar i mitten av H12-brunnen. Klicka sedan på OK.
- Välj den blå kanalen och klicka på OK.
- Bekräfta standardparametrarna genom att klicka på OK.
- Kontrollera om programvaran avgränsade ett område inuti varje brunn och om de valda områdena inte täcker områden med onormala skuggor eller reflektioner. Klicka på OK.
- Spara resultaten och upprepa steg 5.8-5.10 för den gröna kanalen.
- Beräkna förhållandet mellan blått och grönt med hjälp av läget för varje färg.
OBS: Beräkningen kan göras manuellt eller med hjälp av programvaran för läsarinställningarna, till exempel R, Microsoft Excel eller GraphPad Prism.
6. Extrahera färgdata manuellt
- Ladda ner Inkscape, en gratis grafikredigerare med öppen källkod.
OBS: Alla program med färgväljarverktyget (vanligtvis avbildat som en ögondroppare) kan användas för att identifiera färgen och extrahera RGB-data. - Öppna Inkscape, gå till Arkiv > Öppna. Välj bilden av mikroplattan som togs i steg 4.
- Välj verktyget Markera och transformera objekt (S), som visas som en pil längst upp till vänster, och klicka på bilden. En streckad linjekant visar markeringen.
- Välj verktyget Välj färger från bild (D), som visas som en pipett på vänster sida.
- Klicka i mitten av en brunn. Färgen på den nedre panelen ("Fyllning:") ändras i enlighet med detta. Klicka på färgen så dyker fliken Fyllning och streck upp på höger sida.
- Ändra rullgardinsmenyn Platt färg till RGB. Anteckna de värden som visas för de blå och gröna kanalerna för varje brunn.
- Beräkna förhållandet mellan blått och grönt med hjälp av de registrerade värdena.
OBS: Beräkningen kan göras manuellt eller med hjälp av programvaran för läsarinställningarna, till exempel R, Microsoft Excel eller GraphPad Prism.
7. Bygga standardkurvor och extrapolera okända
- Plotta det genomsnittliga förhållandet mellan grön-och blå intensitet som en funktion av proteinets standardkoncentration.
OBS: Plotta data manuellt eller med hjälp av programvaran för läsarinställningarna, till exempel R, Microsoft Excel eller GraphPad Prism. - Beräkna det genomsnittliga förhållandet mellan grön-och blå intensitet för varje prov och utspädning.
- Kontrollera om signalen som erhålls för provet ligger inom det linjära intervallet för proteinstandarden.
- Ignorera alla värden under eller över minimi- eller maximivärdena för standardkurvan.
- Använd den linjära ekvationen som beskriver standardkurvan för att extrapolera mängden protein i provet. Multiplicera de beräknade värdena med utspädningsfaktorn i enlighet med detta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 4 är en bild av en mikroplatta från vilken färgdata extraherades och absorbans vid 450 nm och 590 nm registrerades. De RGB-färgdata som rapporteras här som representativa erhölls automatiskt enligt beskrivningen i avsnitt 5. Ett typiskt mönster för färgdata är en ökning av de blå värdena och en minskning av de röda och gröna värdena (figur 5). Observera att trots den tydliga reflektionen i alla brunnar och en inte perfekt inriktad mikroplatta (figur 4), återspeglar färgdata som extraherats från bilden korrekt absorbansavläsningar (figur 6). Det finns också ett linjärt samband mellan provutspädning och signal för både absorbansavläsningar och färgdata (figur 7). För dessa representativa resultat användes två prover, ett BV-2-celllysat (B001) och ett Galleria mellonella-homogenat (G001) framställt enligt tidigare beskrivning20, från vilket 0,5 μL, 1 μL, 2 μL, 4 μL och 8 μL användes för varje brunn. Volymen justerades till 10 μL med buffert innan 250 μL Bradford-reagens tillsattes.
Figur 4: En representativ bild av en Bradford-analysmikroplatta. Notera lamp reflektion på varje brunn och felinriktningen av brunnar (dvs den högra sidan av plattan lutar nedåt). Dessa bör minimeras som möjligt, men perfekt inriktning och belysning är inte nödvändig (se representativa resultat). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Färgintensitet från de tre RGB-kanalerna som en funktion av proteinkoncentrationen. Varje punkt representerar en brunn av standardkurvan i mikroplattan som visas i figur 4. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Absorbansavläsningar kontra RGB-färgdata extraherade från en bild. Varje punkt representerar en brunn av standardkurvan i mikroplattan som visas i figur 4. Den gula skuggningen representerar 95 % konfidensintervall. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Signalintensitet kontra samplingsvolym. Kolumner är olika signaler från olika metoder: absorbansavläsningar (absorbans) och RGB-färgdata extraherade (RGB-data). Raderna är olika prover: ett BV-2-celllysat (B001) och ett Galleria mellonella-homogenat (G001). Varje punkt är medelvärdet av tre brunnar med en given provvolym. Den gula skuggningen representerar 95 % konfidensintervall. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Standardkurvan (signal kontra BSA-koncentration) bör vara strikt linjär, vilket visas för en representativ standardkurva byggd med BSA-koncentrationer på 0,025 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,8 mg/ml och 1,0 mg/ml (figur 8).
Figur 8: En typisk standardkurva som illustrerar linjäriteten mellan det blågröna och gröna förhållandet och koncentrationen av bovint serumalbumin (BSA). Koncentrationerna som används för en typisk standardkurva är 0 mg/ml, 0,025 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,8 mg/ml och 1,0 mg/ml. Varje punkt är medelvärdet för tre brunnar med varje BSA-koncentration. Felstaplar representerar standardavvikelsen. Den gula skuggningen representerar 95 % konfidensintervall. Klicka här för att se en större version av denna figur.
I detta exempel på representativa resultat låg vissa av utspädningarna inte inom standardkurvans linjära intervall (figur 9). För prov B001 resulterade 8 μL i en signal över den högsta punkten på standardkurvan. I fallet med G001 resulterade 0,5 μL och 1 μL i signaler under den lägsta punkten på standardkurvan. För båda provexemplaren bör dessa utspädningar som ligger utanför standardkurvans linjära område förkastas. Efter att ha ignorerat avläsningar utanför standardkurvans intervall skiljer sig inte proteinnivåer som beräknats med absorbansavläsningar från de som beräknats med RGB-data för båda proverna (figur 10). Jämförelsen mellan absorbansdata och RGB-data med hjälp av ett t-test resulterade i p = 0,63 för prov B001 och p = 0,17 för prov G001.
Figur 9: Blå-till-grönt-förhållande erhållet med RGBradford-metoden kontra provvolym. De horisontella linjerna avgränsar de lägsta och högsta blå-grön-kvoterna för standardkurvan (figur 8). Blå cirklar representerar ett BV-2-celllysat (B001) och röda symboler representerar ett Galleria mellonella-homogenat (G001). Felstaplar representerar standardavvikelsen. Observera att vissa provutspädningar ligger utanför intervallet för standardkurvan. Den gula skuggningen representerar 95 % konfidensintervall. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 10: Proteinkoncentration i två biologiska prover kvantifierade med Bradfordproteinanalys med hjälp av konventionella absorbansavläsningar (ABS) och RGBradford-metoden (RGB). Blå symboler representerar ett BV-2-celllysat (B001) och röda symboler representerar ett Galleria mellonella-homogenat (G001). Varje cirkel representerar en enda brunn från vilken data erhölls. Diamanter betecknar medelvärdet, och de vertikala linjerna sträcker sig från minimi- till maximivärdena för varje prov/metod. Det finns inga skillnader mellan metoderna (B001, t-test , p = 0,63; G001, t-test , p = 0,17). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Signaler erhållna med olika smartphones. Pearsons korrelationskoefficienter för signalen (blå-till-grönt förhållande) som erhålls med olika smartphonemodeller och signalen (A590/A450) från Spectramax iD3-mikroplattläsaren. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den här artikeln beskriver RGBradford, en metod som använder en smartphonekamera för att registrera data från en Bradford-proteinanalys, extrahera färgdata och noggrant kvantifiera proteinnivåer i biologiska prover som ursprungligen beskrevsnyligen 20. En skillnad från den ursprungliga RGBradford-metoden är att här användes en procedur för att få färgdata automatiskt med ett ImageJ-plugin22 . Den största nyheten i RGBradford-metoden är användningen av RGB-data som analytiska signaler; således kan man använda vilket rutinprotokoll som helst som används i sitt labb för proteinbestämning med Coomassie Brilliant Blue G och sedan ta en bild av det och extrahera färgdata. Med andra ord kan steg 1-3 i protokollet modifieras enligt den vanliga proceduren som används i ett givet laboratorium. Med tanke på att det finns flera modifieringar av den ursprungliga Bradford-proteinanalysen kan man använda det som fungerar bäst för dess provtyp/natur och gå vidare till dataregistrering.
Detta protokoll har två kritiska steg, bildtagning och extraktion av färgdata. Här och tidigare20 behövdes ingen speciell belysningsapparat, och tillfredsställande resultat erhölls (dvs. det fanns ingen skillnad mellan resultaten från absorbansavläsningar och färgdata extraherade från en bild). Ändå kan man välja att använda en plattform för att optimera bildförvärvet, till exempel med hjälp av en transilluminator19,22. Huvudfrågan är att säkerställa en enhetlig bakgrund och belysning. Dessutom kan likvärdiga resultat erhållas med olika smartphonemodeller. Trots små skillnader i signalen som erhålls med varje enhet finns det starka (Pearsons r > 0,99) och signifikanta (p < 0,0001) korrelationer mellan fyra testade smartphonemodeller (Samsung S22 Ultra, Apple iPhone 11, Apple iPhone 14 Pro och XIAOMI Redmi Note 9 Pro). Det finns också signifikanta korrelationer mellan signalen som erhålls med dem och signalen från en plattläsare (tilläggsfigur 1). När det gäller extrahering av färgdata måste man vara försiktig när man använder ReadPlate-pluginet, särskilt i rutnätskontrollsteget, då man måste inspektera om rutnätet passar positionen för varje brunn. Man bör se till att rutnätscirklarna inte inkluderar brunnarnas väggar eller ett onormalt område (t.ex. ett område med en ljusreflektion). Rutnätsjustering kan vara särskilt svårt om plattan i bilden inte är vinkelrätt placerad mot bakgrunden, vilket gör det svårt att korrekt rita ett rektangulärt urval av brunnar från centrum till centrum (från det övre vänstra till det nedre högra hörnet).
Fördelarna med RGBradford-metoden, jämfört med de konventionella spektroskopiska avläsningarna, är desamma som andra metoder som använder smartphones istället för specialiserade enheter (t.ex. mikroplattläsare). Smartphones är allmänt tillgängliga, billigare än spektrofotometrar, fungerar på batteri i timmar, har datalagringskapacitet och kommunicerar trådlöst och på distans med andra enheter. Sammantaget möjliggör dessa användning av Bradford-proteinanalysen på avlägsna platser eller icke-standardiserade laboratorieförhållanden, såsom vårdenheter, klassrum, fältexpeditioner och samhällen med låga resurser. Den tagna bilden kan sedan analyseras ytterligare och tolkas senare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av National Council for Scientific and Technological Development (CNPq, Brasilien) [anslagsnummer 428048/2018-8 och 402556/2022-4] och University of Brasilia (Brasilien). Författaren tackar Dr. Duarte Nuno Carvalho och Dr. Evelyn Santos (i3s, Porto, Portugal) för att de gav tillgång till sina smartphones som användes i denna forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well flat-bottom polystyrene microtiter plates | Jet Biofil, Guangzhou, China | TCP011096 | Any flat-bottom microplate compativle with optical reading will suffice. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A2153 | |
| Coomassie Brilliant Blue G | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | B0770 | |
| Ethyl alcohol | |||
| iPhone 11 | Apple | MWM02BR/A | Can be substituted with other smartphone equiped with a camera |
| iPhone 14 Pro | Apple | N/A | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 695017 | |
| Redmi Note 9 Pro | XIAOMI | N/A | |
| S22 Ultra | Samsung | N/A | |
| SpectraMax 384 Plus. Microplate reader. | Molecular Devices, San Jose, CA | PLUS 384 | Any microplate reader capable of reading at 450 nm and 590 nm will work. This is optional. The method was actually created to dismiss the need of a microplate reader. |
References
- Zaguri, M., Kandel, S., Rinehart, S. A., Torsekar, V. R., Hawlena, D. Protein quantification in ecological studies: A literature review and empirical comparisons of standard methodologies. Methods in Ecology and Evolution. 12 (7), 1240-1251 (2021).
- Koga, T., et al. Mild electrical stimulation and heat shock ameliorates progressive proteinuria and renal inflammation in mouse model of Alport syndrome. PLoS One. 7 (8), e43852 (2012).
- Peterson, G. L.
- Goldfarb, A. R., Saidel, L. J., Mosovich, E. The ultraviolet absorption spectra of proteins. The Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 397-404 (1951).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J.
- Smith, P. K., et al.
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Datki, Z., et al. Application of BisANS fluorescent dye for developing a novel protein assay. PLoS One. 14 (4), e0215863 (2019).
- Van Noorden, R., Maher, B., Nuzzo, R.
- Elsevier, B. V. Scopus. , Available from: https://www.scopus.com/ (2022).
- Compton, S. J., Jones, C. G. Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay. Analytical Biochemistry. 151 (2), 369-374 (1985).
- Chial, H. J., Thompson, H. B., Splittgerber, A. G. A spectral study of the charge forms of Coomassie Blue G. Analytical Biochemistry. 209 (2), 258-266 (1993).
- Pande, S. V., Murthy, M. S. R. A modified micro-Bradford procedure for elimination of interference from sodium dodecyl sulfate, other detergents, and lipids. Analytical Biochemistry. 220 (2), 424-426 (1994).
- Gogstad, G. O., Krutnes, M. -B. Measurement of protein in cell suspensions using the Commassie brilliant blue dye-binding assay. Analytical Biochemistry. 126 (2), 355-359 (1982).
- Friedenauer, S., Berlet, H. H. Sensitivity and variability of the Bradford protein assay in the presence of detergents. Analytical Biochemistry. 178 (2), 263-268 (1989).
- Stoscheck, C. M. Increased uniformity in the response of the Coomassie blue G protein assay to different proteins. Analytical Biochemistry. 184 (1), 111-116 (1990).
- Zor, T., Selinger, Z. Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: Theoretical and experimental studies. Analytical Biochemistry. 236 (2), 302-308 (1996).
- Gee, C. T., Kehoe, E., Pomerantz, W. C. K., Penn, R. L. Quantifying protein concentrations using smartphone colorimetry: A new method for an established test. Journal of Chemical Education. 94 (7), 941-945 (2017).
- de Camargo, C., Vicentini, M., Gobbi, A., Martinez, D., Lima, R. Smartphone for point-of-care quantification of protein by Bradford assay. Journal of the Brazilian Chemical Society. 28 (4), 689-693 (2016).
- Moreira, D. C. RGBradford: Accurate measurement of protein concentration using a smartphone camera and the blue to green intensity ratio. Analytical Biochemistry. 655, 114839 (2022).
- Ernst, O., Zor, T.
- Angelani, C. R., et al. A metabolic control analysis approach to introduce the study of systems in biochemistry: the glycolytic pathway in the red blood cell: Metabolic control analysis and the glycolytic pathway. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (5), 502-515 (2018).
