Summary
在这里，我们提出了一个协议，展示了生物信息学管道的安装和使用，以分析用于研究 体内 RNA：RNA相互作用的嵌合RNA测序数据。
Abstract
近年来，通过生化方法，通过使用交联和连接，通过形成嵌合 RNA 和随后的测序文库来捕获 sncRNA：靶标 RNA 相互作用，从而推进了对小非编码 RNA （sncRNA） 等小非编码 RNA （sncRNA） 与其靶 RNA 的 体内 基因调控相互作用的理解。虽然来自嵌合RNA测序的数据集提供了全基因组的输入，并且比miRNA预测软件的模糊性要少得多，但将这些数据提炼成有意义和可操作的信息需要额外的分析，并且可能会劝阻缺乏计算背景的研究人员。本报告提供了一个教程，以支持入门级计算生物学家安装和应用最新的开源软件工具：小嵌合 RNA 分析管道 （SCRAP）。提供了平台要求、更新以及管道步骤和关键用户输入变量操作的说明。减少生物学家从嵌合RNA测序方法中获得见解的障碍，有可能在多种生物学背景下对调节性sncRNA：靶RNA相互作用进行基于发现的研究。
Introduction
小的非编码 RNA 因其在不同过程中协调基因套件表达（如分化和发育、信号处理和疾病）中的转录后作用而受到高度研究 1,2,3。准确测定基因调控小非编码 RNA （sncRNA） 的靶转录本（包括 microRNA （miRNA）的能力对于基础和翻译水平的 RNA 生物学研究都很重要。利用miRNA种子序列与其潜在靶标之间预期互补性的生物信息学算法已经常用于预测miRNA：靶标RNA相互作用。虽然这些生物信息学算法已经成功，但它们也可能同时存在假阳性和假阴性结果，正如在其他地方所回顾的那样 4,5,6。最近，已经设计并实施了几种生化方法，这些方法允许通过体内交联和随后的连接步骤掺入将 sncRNA 物理连接到其靶标以形成单个嵌合 RNA 4,5,7,8,9,10 .随后从嵌合RNA制备测序文库，可以通过对测序数据的计算处理来评估sncRNA：靶RNA的相互作用。本视频提供了安装和使用称为小型嵌合 RNA 分析流程 （SCRAP） 的计算管道的教程，该流程旨在对嵌合 RNA 测序文库6 中的 sncRNA：靶标 RNA 相互作用进行稳健且可重复的分析。
本教程的目标是通过降低分析通过提供 sncRNA：靶 RNA 相互作用的嵌合分子读数的生化方法生成的数据的障碍，帮助研究人员避免过度依赖纯粹的预测性生物信息学算法。本教程提供了实用步骤和技巧，以指导入门级计算科学家使用管道 SCRAP，该管道是为分析嵌合 RNA 测序数据而开发的，这些数据可以由几种现有的生化方案生成，包括交联、连接和杂交种测序 （CLASH） 和内源性 Argonaute 结合 RNA 的共价连接 - 交联和免疫沉淀 （CLEAR-CLIP）7,9。
与其他计算管道相比，使用 SCRAP 为嵌合 RNA 测序数据的分析提供了几个优势6.一个突出的优点是，与通常依赖自定义和/或不支持的脚本进行管道步骤的替代管道相比，它具有广泛的注释，并将标注纳入管道中支持良好且定期更新的生物信息学脚本。此功能为 SCRAP 提供了稳定性，使研究人员更值得熟悉管道并将其使用纳入他们的工作流程。SCRAP也被证明在调用sncRNA：靶RNA相互作用的峰方面优于替代管道，并具有跨平台功能，详见先前的出版物6。
在本教程结束时，用户将能够 （i） 了解 SCRAP 的平台要求并安装 SCRAP 管道，（ii） 安装参考基因组并设置 SCRAP 的命令行参数，以及 （iii） 了解峰值调用标准并执行峰值调用和峰值注释。
本视频将详细描述研究 RNA 生物学的研究人员如何安装并优化使用计算管道 SCRAP，以分析嵌合 RNA 测序数据中的 sncRNA 与靶 RNA（如信使 RNA）的相互作用，这些数据是通过讨论的测序文库制备生化方法之一获得的。
SCRAP 是一个命令行实用程序。通常，按照以下指南，用户需要 （i） 下载并安装 SCRAP （https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP），（ii） 安装参考基因组并运行 SCRAP，以及 （iii） 执行峰值检出和注释。
有关此过程中计算步骤的更多详细信息，请参见 https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP。本文将提供设置和背景信息，使具有入门级计算技能的研究人员能够在嵌合 RNA 测序文库数据集上安装、优化和使用 SCRAP。
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Protocol
注：该协议将从下载和安装使用 SCRAP 分析嵌合 RNA 测序文库所需的软件开始。
1. 安装
- 在安装 SCRAP 之前，请在要用于分析的计算机上安装依赖项 Git 和 Miniconda。Git 可能已安装。例如，在 Mac OSX 平台上，使用哪个 git 验证这一点，以查看“ git ”实用程序是否存在并安装在此目录中。检查 Miniconda 是否使用 哪个 conda 安装。如果未返回任何内容，请安装 Miniconda。Miniconda 需要 400 MB 的磁盘空间才能安装。
- 有几种方法可以安装 Miniconda，它们因平台而异。请参阅 Meffert Lab GitHub 存储库 [https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP/blob/main/PLATFORM-SETUP.md] 上的 PLATFORM-SETUP markdown 文件，其中包含有关在 Windows、MacOS 和 Ubuntu 上安装的更多说明。对于 Linux 用户，Linux 有自己的默认包管理器 （apt）。在本研究的特定情况下，使用命令 brew install Miniconda 使用现有包管理器 brew 安装 Miniconda 。
注意：“Homebrew”，称为“brew”，是一种开源软件包管理系统，可简化 Apple 操作系统 macOS 上的软件安装。 - 如果是首次安装 conda，请为正在使用的特定 shell 运行 conda init 。在此示例中，正在使用的 shell 是 zsh。然后，关闭并重新打开外壳。如果 conda 安装成功，将看到在终端会话中激活 的基本 环境。
- 有几种方法可以安装 Miniconda，它们因平台而异。请参阅 Meffert Lab GitHub 存储库 [https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP/blob/main/PLATFORM-SETUP.md] 上的 PLATFORM-SETUP markdown 文件，其中包含有关在 Windows、MacOS 和 Ubuntu 上安装的更多说明。对于 Linux 用户，Linux 有自己的默认包管理器 （apt）。在本研究的特定情况下，使用命令 brew install Miniconda 使用现有包管理器 brew 安装 Miniconda 。
- 下载 SCRAP 源代码并安装其依赖项。
- 获取 SCRAP 源代码的首选方法是使用 Git。通过运行 git clone https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP 来访问它以获取源代码的最新副本。
- 安装 mamba（一个改进的 conda 包求解器），并使用以下命令将 SCRAP 的所有依赖项从 SCRAP_environment.yml 安装到它自己的 conda 环境中：
conda 安装 -n 基础 conda-forge：：mamba
mamba env create -f SCRAP/SCRAP_environment.yml -n SCRAP
- 接下来，运行 SCRAP 的参考安装。参考装置中使用的参数将特定于正在分析其 sncRNA-mRNA 相互作用的生物体。
bash SCRAP/bin/Reference_Installation.sh -r full/path/to/SCRAP/ -m 有 -g hg38 -s 人类- 提供 SCRAP 源文件夹的目录以供参考安装。然后，将使用 fasta 和 annotation 文件夹中的文件执行安装步骤。列出不带任何速记的完整路径。以斜杠结尾。
- 请参阅 README.md 中的表格，了解正确的 miRbase 物种缩写。最新的参考基因组可以在 https://genome.ucsc.edu/ 或 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/ 找到。在此示例中，hg38 将用于小鼠 GRCm38 基因组。
- 目前纳入注释的物种是 人类、小鼠和 蠕虫。查看 SCRAP 源文件夹中 annotation 目录下对应的 species.annotation.bed 文件。 如果需要使用不同的物种进行分析，请提供遵循相同命名方案 species.annotation.bed 的 annotation.bed 文件。
2. 运行 SCRAP
- 现在，依赖项和 SCRAP 已安装，请运行脚本 SCRAP.sh
bash SCRAP/bin/SCRAP.sh -d full/path/to/CLASH_Human/ -a full/path/to/CLASH_Human/CLASH_Human_Adapters.txt -p no -f yes -r full/path/to/SCRAP/ -m has -g hg38- 列出示例目录的整个路径，不带任何速记。使用与示例名称完全匹配的文件夹名称来格式化示例目录，如 图 1 所示。
- 请注意，列出的路径是包含所有示例文件夹的目录的路径，而不是任何单个示例文件夹或示例文件的路径（请参阅步骤 2.1 中的命令行）。
- 接下来，列出适配器文件的整个路径。确保适配器文件中的示例名称与前面提到的文件夹名称和文件名匹配（请参阅步骤 2.1 中的命令行）。
- 指示样品是否为配对末端，以及是否将进行前 miRNA 和/或 tRNA 的过滤。如果需要，添加用于 rRNA 清洁的过滤器（请参阅步骤 2.1 中的命令行）。
注意：用户可能会也可能不会决定使用这些过滤器，具体取决于样品类型和实验目标。根据实验设计，pre-miRNA、tRNA 和 rRNA 可以消耗真实 sncRNA：靶标 RNA 嵌合体的可用测序深度，用户可以使用过滤器来排除它们。然而，在某些情况下，用户可能希望避免这种过滤（例如，将sncRNA靶标映射到包含线粒体rRNA的线粒体基因组）。 - 接下来，列出参考目录的整个路径、miRbase 缩写和参考基因组缩写（请参阅步骤 2.1 中的命令行）。
注意：该脚本可能需要几个小时才能完成，具体取决于数据集大小和所用计算机的 CPU。
3. 峰值调用和注释
- 完成 SCRAP 运行后，检查输出是否包括 SAMPLE.aligned.unique.bam 文件等文件。这是一个二进制文件，包含靶RNA与用户提供的参考基因组的比对。
- 现在通过运行 Peak_Calling.sh来执行峰值呼叫。
bash SCRAP/bin/Peak_Calling.sh -d CLASH_Human/ -a CLASH_Human/CLASH_Human_Adapters.txt -c 3 -l 2 -f no -r SCRAP/ -m has -g hg38
注意：峰值检出是 SCRAP 的一项功能，旨在使研究人员能够轻松评估其嵌合 RNA 文库中最稳健且可重复的小非编码 RNA：靶 RNA 相互作用。例如，此功能可以帮助研究人员识别他们可能想要选择以进行进一步研究的相互作用。下面的步骤3.2.2描述了用户如何设置他们希望用于定义峰调用严格性的标准 - 这包括唯一相互作用或测序读数的数量，这些相互作用必须发生才能被调用峰，以及必须发生这种特定相互作用的文库数量。- 同样，列出包含示例文件夹和适配器文件的目录的完整路径（请参阅步骤 3.2 中的命令行）。
- 接下来，设置要调用峰所需的最小测序读数（请参阅步骤3.2中的命令行）。
- 设置必须包含峰才能调用的不同测序文库的最小数量（请参阅步骤 3.2 中的命令行）。
注：3.2.2 和 3.2.3 的值选择将取决于测序样本的性质以及样本数量或样本类型。在这里，一个样本中至少需要 3 个嵌合测序读长才能调用峰，并且该峰必须得到至少 2 个样本的支持。例如，在评估数据集时，如果某个数据集中有许多针对给定条件的测序文库重复，则研究人员可能会决定要求在更多的样本测序文库中存在读段。 - 指示同一家族的 sncRNA 是否必须对同一峰做出贡献。例如，由于同一家族的miRNA共享种子序列，因此这些miRNA可以结合共享和重叠的基因靶标集;用户可能希望通过评估这些目标的集体峰值来确定一个系列对这些目标的全面影响（请参阅步骤 3.2 中的命令行）。
- 接下来，指示参考目录的完整路径、miRBase 缩写和参考基因组缩写（请参阅步骤 3.2 中的命令行）。
- 峰值调用完成后，运行峰值注释。
bash SCRAP/bin/Peak_Annotation.sh -p CLASH_Human/peaks.bed -r SCRAP/ -s 人类- 列出从峰值调用中生成的 peaks.bed（或 peaks.family.bed ）文件的完整路径、参考目录的完整路径以及注释所需的物种。
4. 可视化数据
注意：使用 SCRAP 进行分析的所有步骤现已完成。为了可视化数据，建议采用以下几种方法：
- 将所有需要可视化的 .bam（二进制 SAM 文件）文件合并在一起 （samtools 合并）。
- 对生成的合并的 .bam 文件进行排序（samtools 排序）。文件内容逐行排序，以便 samtools 可以编制索引。
- 为排序的 .bam 文件（samtools 索引）编制索引。生成 BAI（二进制 samtools 格式索引）文件，以允许在综合基因组学查看器 （IGV） 中进行可视化。
- 最后，在 IGV 中打开生成的排序的 .bam 和索引的 .bai 文件。
注意：SncRNA：目标RNA相互作用可以通过多种研究特定方式优先进行随访。一种通用的初始方法是评估最嵌合测序读长支持峰的相互作用。通过从检测到的相互作用11 输入 sncRNA 和靶 RNA 的序列，也可以使用 RNAstructure 包中的 DuplexFold Web Server 来可视化感兴趣的相互作用。对于每个峰，染色体（第一列）和基因组坐标（开始：第一列结束：第二列）可以在峰注释中生成的peaks.bed.species.annotation.txt文件中找到。特别是对于miRNA，虽然可重复和功能性相互作用可能缺乏广泛的种子匹配结合（例如，相互作用可能使用3'补偿性结合），但靶RNA的同源结合基序中种子匹配位点的存在仍然可以被评估为功能上重要的检测到的相互作用的验证特征4,12.辅助数据处理可能包括比较不同生物学条件下峰之间的差异读取覆盖率，以及使用通路分析工具评估受调控基因聚类到通路中的可能性。
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Representative Results
在使用 CLEAR-CLIP9 制备的先前发表的测序数据集上，由 SCRAP 的修改版本（SCRAP 版本 2.0，实现了 rRNA 过滤的修改）检测到的 sncRNA：靶 RNA 的结果如 图 2 和 表 1 所示。用户可以欣赏到在SCRAP中通过峰检出分离高置信度相互作用后发生的与内含子区域的相对部分miRNA相互作用的减少。使用 SCRAP 进行分析的其他数据也可在本管道6 的初始出版物中找到。根据实验方法的不同，可能需要从制备的嵌合RNA文库中过滤测序数据，以减少结果中的伪影。测序文库的次优生化制备和/或测序数据的次优过滤可能导致不正确包含不是由 Argonaute 结合的 sncRNA 和靶 RNA 连接产生的读长。这些伪影读段可以包括引物二聚体或接头二聚体、rRNA 和前 miRNA。 表 2 描述了可能在结果中检测到的可能伪影和潜在的解决方案。
图 1：数据目录的格式设置。 包含每个测序文库的原始读段的文件必须以 .fastq.gz 格式提供。（A） 如果文库不是成对的，则分析将使用单个.fastq.gz文件。此文件应命名为“SAMPLE.fastq.gz”，其中 SAMPLE 是用户在适配器文件中提供的确切示例名称。该文件应包含在与示例名称完全匹配的文件夹中。（B） 对于双端测序文库，将使用两个.fastq.gz文件。这些文件应命名为“SAMPLE-R1.fastq.gz”和“SAMPLE-R2.fastq.gz”，并且应位于与示例名称完全匹配的文件夹中。所有名为 SAMPLE 的此类目录都应位于同一父目录中，用户将该父目录作为“示例目录”提供给 SCRAP。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：按靶标类型和峰值检出方法划分的 miRNA：靶标 RNA 相互作用比例。使用 SCRAP （SRR2413277 - SRR2413295）9 制备的文库中的嵌合 sncRNA：靶 RNA 测序已发表数据，使用 SCRAP 的修改版本（SCRAP 2.0 版）进行分析，并实施 rRNA 过滤。过滤 pre-miRNA、tRNA 和 rRNA，并使用不同的峰检出设置进行“高置信度”（最少 3 个读长和 2 个文库）和“所有相互作用”（最少 1 个读长和 1 个文库）。相互作用按miRNA家族分组或未分组。计算并绘制了类别（CDS、5' UTR、基因间、内含子、3'UTR）嵌合 RNA 读数的相对分数。请点击这里查看此图的较大版本.
| 所有交互 | 高置信度交互 | |||
| 单个 miRNA | miRNA 家族 | 单个 miRNA | miRNA 家族 | |
| CDS系列 | 8675 | 8679 | 925 | 1046 |
| 5' UTR | 338 | 338 | 38 | 43 |
| 基因间 | 2230 | 2230 | 320 | 339 |
| 内含 子 | 9522 | 9519 | 382 | 406 |
| 3' UTR | 6814 | 6813 | 548 | 644 |
| 总互动： | 31033 | 31034 | 4219 | 4597 |
表1：按靶标类型和峰检出方法划分的miRNA：靶标RNA相互作用的嵌合读取计数。 使用 CLEAR-CLIP （SRR2413277 - SRR2413295）9 制备的文库发表的嵌合 sncRNA：靶标 RNA 测序数据，使用改进版的 SCRAP（SCRAP 2.0 版）进行分析，并实施 rRNA 过滤。过滤pre-miRNA、tRNA和rRNA，并使用不同的峰检出设置进行高置信度（最少3个读长和2个文库）和所有（最少1个读长和1个文库）相互作用，按miRNA家族分组或未分组。对于每种情况，列出了检测到的 miRNA：靶标 RNA 相互作用的总计数，其中靶标 RNA 相互作用映射到编码序列 （CDS）、5' 非翻译区 （5' UTR）、基因间区、内含子或 3' 非翻译区 （3'UTR） 的类别。
| 潜在污染物 | 检测为 | 原因 | 潜在的解决方案 | |||
| 引物二聚体 | 在序列与扩增引物的 5' 端匹配的 miRNA 与序列与引物的其余部分匹配的靶 RNA 之间检测到的相互作用。 | 扩增后PCR产物的尺寸分离（即凝胶提取）不当。 | 由于长度小，大多数引物二聚体在去除接头后会被 SCRAP 忽略。如果它们仍然存在，请考虑将引物序列添加到过滤器中。 | |||
| rRNAs（rRNA） | 任意 miRNA 与已知 rRNA 或 lncRNA Gm26917 和 Gm42418 之间的相互作用 | Argonaute复合物的无效分离（即免疫沉淀和凝胶分离）。 | 当 rRNA 污染丰富时，通常需要进行 rRNA 过滤。 | |||
| tRNA 和 pre-miRNA | tRNA 片段是相同 tRNA 的降解产物或由同一前体 miRNA 产生的 5p 和 3p miRNA 之间的相互作用。 | 真正的 sncRNA：靶 RNA 嵌合体丰度低或组织 Argonaute 表达低。 | tRNA过滤和pre-miRNA过滤。 | |||
表2：潜在污染物测序读数和溶液。
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Discussion
本关于使用 SCRAP 管道分析 sncRNA：靶标 RNA 相互作用的协议旨在帮助正在进入计算分析的研究人员。本教程的完成预计将指导具有入门级或更高计算经验的研究人员完成安装和使用该管道及其应用以分析从嵌合 RNA 测序文库获得的数据所需的步骤。完成此协议的关键步骤包括正确的参考安装和运行 SCRAP，这可能非常耗时，并且可能是错误的根源，尤其是在使用 Anaconda 安装依赖项或键入命令行参数时未小心的情况下。
在这里，特别关注的是实际使用 SCRAP 管道分析嵌合 sncRNA：靶标 RNA 测序文库的技巧和步骤。研究发现，SCRAP 在检测 sncRNA：靶标 RNA 相互作用方面优于其他嵌合 RNA 分析平台 6,13。这可能是由于 SCRAP 的峰值调用特征，该特征是专门为检测由于嵌合 RNA 形成所涉及的生化步骤而观察到的特征（例如 3' 肩部）而开发的。已经开发了用于不同生化方法的其他峰检出方法，例如染色质免疫沉淀测序 （CHIP-seq） 应用的下游，用于检测数据中的峰，这些峰对称分布在平均值附近，通常在检测嵌合 sncRNA：靶标 RNA 文库的峰特征方面表现不佳。但是，用户可能希望测试其他计算管道的使用，这些管道可以更好地满足他们的需求，特别是如果他们的数据不符合此描述。
虽然 SCRAP 的硬件要求最低，但 SCRAP 运行时随数据集大小的缩放性很差。超出新手水平或拥有大量数据集或测序覆盖率高的数据集的研究人员可能希望以可以加快分析步骤的方式使用 SCRAP。由于大型数据集（通常> 10 亿次读取）需要增强的文件存储能力和数据的读/写速度，因此可能需要在高性能计算 （HPC） 集群上运行 SCRAP 来分析较大的数据集。GitHub （https://github.com/Meffert-Lab/） 上将提供 SCRAP 优化，该优化应提供并行化和改进的性能。SCRAP 的更新版本（2.0 版）还改进了 rRNA 和其他污染物的过滤器。
与任何界面一样，用户在使用命令行界面时可能不可避免地遇到困难。其中最常见的包括拼写错误、不正确的路径和包安装/版本控制。建议调查人员在编写命令行参数时谨慎行事，避免拼写错误，并准确复制文件或文件夹的路径（使用“选项卡”自动完成可以帮助解决这个问题）。SCRAP 的依赖项通过 Anaconda 进行管理，因此调查人员不太可能遇到包安装或版本更新问题。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢 Meffert 实验室的成员进行有益的讨论，包括 BH Powell 和 WT Mills IV，感谢他们对描述管道安装和实施的重要反馈。这项工作得到了布劳德基金会奖、马里兰州干细胞研究基金启动计划、布劳斯坦疼痛研究与教育基金会以及 NINDS RO1NS103974 和 NIMH 对 MKM RO1MH129292的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Genomes | UCSC Genome browser | N/A | https://genome.ucsc.edu/ or https://www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/ |
| Linux | Linux | Ubuntu 20.04 or 22.04 LTS recommended | |
| Mac | Apple | Mac OSX (>11) | |
| Platform setup | GitHub | N/A | https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP/blob/main/PLATFORM-SETUP.md] |
| SCRAP pipeline | GitHub | N/A | https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP |
| Unix shell | Unix operating system | bash >=5.0 | |
| Unix shell | Unix operating system | zsh (5.9 recommended) | |
| Windows | Windows | WSL Ubuntu 20.04 or 22.04 LTS |
References
- Morris, K. V., Mattick, J. S.
- Li, X., Jin, D. S., Eadara, S., Caterina, M. J., Meffert, M. K. Regulation by noncoding RNAs of local translation, injury responses, and pain in the peripheral nervous system. Neurobiology of Pain (Cambridge, Mass.). 13, 100119 (2023).
- Shi, J., Zhou, T., Chen, Q. Exploring the expanding universe of small RNAs. Nature Cell Biology. 24 (4), 415-423 (2022).
- Broughton, J. P., Lovci, M. T., Huang, J. L., Yeo, G. W., Pasquinelli, A. E. Pairing beyond the seed supports microRNA targeting specificity. Molecular Cell. 64 (2), 320-333 (2016).
- Grosswendt, S., et al. Unambiguous identification of miRNA:target site interactions by different types of ligation reactions. Molecular Cell. 54 (6), 1042-1054 (2014).
- Mills, W. T., Eadara, S., Jaffe, A. E., Meffert, M. K. SCRAP: a bioinformatic pipeline for the analysis of small chimeric RNA-seq data. RNA. 29 (1), 1-17 (2023).
- Helwak, A., Kudla, G., Dudnakova, T., Tollervey, D. Mapping the human miRNA interactome by CLASH reveals frequent noncanonical binding. Cell. 153 (3), 654-665 (2013).
- Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis. Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).
- Moore, M. J., Zhang, C., Gantman, E. C., Mele, A., Darnell, J. C., Darnell, R. B. Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis. Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).
- Bjerke, G. A., Yi, R. Integrated analysis of directly captured microRNA targets reveals the impact of microRNAs on mammalian transcriptome. RNA. 26 (3), 306-323 (2020).
- Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11 (1), 129 (2010).
- Moore, M. J., et al. miRNA-target chimeras reveal miRNA 3′-end pairing as a major determinant of Argonaute target specificity. Nature Communications. 6 (1), 8864 (2015).
- Travis, A. J., Moody, J., Helwak, A., Tollervey, D., Kudla, G. Hyb: a bioinformatics pipeline for the analysis of CLASH (crosslinking, ligation and sequencing of hybrids) data. Methods (San Diego, Calif.). 65 (3), 263-273 (2014).
