برنامج تعليمي للتحليل الحسابي للحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر الوهمي: مكتبات تسلسل الحمض النووي الريبي المستهدفة
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا يوضح تركيب واستخدام خط أنابيب المعلوماتية الحيوية لتحليل بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي الوهمي المستخدمة في دراسة تفاعلات الحمض النووي الريبي: الحمض النووي الريبي في الجسم الحي .
Abstract
تم تطوير فهم التفاعلات التنظيمية الجينية في الجسم الحي للحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر (sncRNAs) ، مثل microRNAs (miRNAs) ، مع الحمض النووي الريبي المستهدف في السنوات الأخيرة من خلال الأساليب الكيميائية الحيوية التي تستخدم الربط المتقاطع متبوعا بالربط لالتقاط sncRNA: تفاعلات الحمض النووي الريبي المستهدفة من خلال تكوين الحمض النووي الريبي الوهمي ومكتبات التسلسل اللاحقة. في حين أن مجموعات البيانات من تسلسل الحمض النووي الريبي الوهمي توفر مدخلات على مستوى الجينوم وأقل غموضا إلى حد كبير من برامج التنبؤ miRNA ، فإن تقطير هذه البيانات إلى معلومات ذات مغزى وقابلة للتنفيذ يتطلب تحليلات إضافية وقد يثني الباحثين الذين يفتقرون إلى خلفية حسابية. يقدم هذا التقرير برنامجا تعليميا لدعم علماء الأحياء الحاسوبية للمبتدئين في تثبيت وتطبيق أداة برمجية حديثة مفتوحة المصدر: خط أنابيب تحليل الحمض النووي الريبي الخيمري الصغير (SCRAP). يتم توفير متطلبات النظام الأساسي والتحديثات وشرح خطوات خط الأنابيب ومعالجة متغيرات إدخال المستخدم الرئيسية. إن تقليل الحاجز أمام علماء الأحياء لاكتساب رؤى من مناهج تسلسل الحمض النووي الريبي الوهمي لديه القدرة على بدء التحقيقات القائمة على الاكتشاف لتفاعلات الحمض النووي الريبي (sncRNA) التنظيمية: تفاعلات الحمض النووي الريبي المستهدفة في سياقات بيولوجية متعددة.
Introduction
تمت دراسة الحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر بدرجة عالية لأدوارها بعد النسخ في تنسيق التعبير من مجموعات الجينات في عمليات متنوعة مثل التمايز والتطوير ومعالجة الإشارات والمرض1،2،3. تعد القدرة على تحديد النصوص المستهدفة بدقة للحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر (sncRNAs) ، بما في ذلك الحمض النووي الريبي الصغير (miRNAs) ، ذات أهمية لدراسات بيولوجيا الحمض النووي الريبي على المستويين الأساسي والانتقالي. تم استخدام خوارزميات المعلوماتية الحيوية التي تستغل التكامل المتوقع بين تسلسل بذور miRNA وأهدافه المحتملة بشكل متكرر للتنبؤ بتفاعلات miRNA: الحمض النووي الريبي المستهدف. في حين أن هذه الخوارزميات المعلوماتية الحيوية كانت ناجحة ، إلا أنها يمكن أن تؤوي أيضا نتائج إيجابية خاطئة وسلبية خاطئة ، كما تمت مراجعته في مكان آخر4،5،6. في الآونة الأخيرة ، تم تصميم وتنفيذ العديد من الأساليب الكيميائية الحيوية التي تسمح بتحديد لا لبس فيه وشبه كمي لتفاعلات الحمض النووي الريبي في الجسم الحي: تفاعلات الحمض النووي الريبي المستهدفة عن طريق التشابك في الجسم الحي وما يترتب على ذلك من دمج خطوة ربط لربط sncRNA فعليا بهدفه لتشكيل RNA خيمري واحد4،5،7،8،9،10. يسمح الإعداد اللاحق لمكتبات التسلسل من الحمض النووي الريبي الوهمي بتقييم تفاعلات sncRNA: الحمض النووي الريبي المستهدف عن طريق المعالجة الحسابية لبيانات التسلسل. يوفر هذا الفيديو برنامجا تعليميا لتثبيت واستخدام خط أنابيب حسابي يسمى خط أنابيب تحليل الحمض النووي الريبي الوهمي الصغير (SCRAP) ، والذي تم تصميمه للسماح بتحليل قوي وقابل للتكرار لتفاعلات sncRNA: الهدف من تفاعلات الحمض النووي الريبي من مكتبات تسلسل الحمض النووي الريبي الوهمي6.
الهدف من هذا البرنامج التعليمي هو مساعدة الباحثين في تجنب الاعتماد المفرط على خوارزميات المعلوماتية الحيوية التنبؤية البحتة عن طريق تقليل الحواجز أمام تحليل البيانات الناتجة عن الأساليب الكيميائية الحيوية التي توفر قراءات جزيئية وهمية لتفاعلات الحمض النووي الريبي المستهدف: sncRNA. يوفر هذا البرنامج التعليمي خطوات ونصائح عملية لتوجيه علماء الحوسبة المبتدئين من خلال استخدام خط أنابيب ، SCRAP ، تم تطويره لتحليل بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي الخيمري ، والتي يمكن إنشاؤها بواسطة العديد من البروتوكولات البيوكيميائية الحالية ، بما في ذلك التشابك والربط وتسلسل الهجينة (CLASH) والربط التساهمي للحمض النووي الريبي الداخلي المرتبط ب Argonaute – التشابك والترسيب المناعي (CLEAR-CLIP) 7,9.
يوفر استخدام SCRAP العديد من المزايا لتحليل بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي الوهمي ، مقارنة بخطوط الأنابيب الحسابية الأخرى6. تتمثل إحدى المزايا البارزة في التعليق التوضيحي الشامل ودمج الاستدعاءات إلى نصوص المعلوماتية الحيوية المدعومة جيدا والمحدثة بشكل روتيني داخل خط الأنابيب ، مقارنة بخطوط الأنابيب البديلة التي تعتمد غالبا على البرامج النصية المخصصة و / أو غير المدعومة للخطوات في خط الأنابيب. تضفي هذه الميزة الاستقرار على SCRAP ، مما يجعلها أكثر جدوى للباحثين للتعرف على خط الأنابيب ودمج استخدامه في سير عملهم. كما ثبت أن SCRAP يتفوق على خطوط الأنابيب البديلة في استدعاء قمم sncRNA: تفاعلات الحمض النووي الريبي المستهدف ولديه وظائف عبر الأنظمة الأساسية ، كما هو مفصل في منشور سابق6.
بنهاية هذا البرنامج التعليمي ، سيتمكن المستخدمون من (i) معرفة متطلبات النظام الأساسي ل SCRAP وتثبيت خطوط أنابيب SCRAP ، (ii) تثبيت الجينومات المرجعية وإعداد معلمات سطر الأوامر ل SCRAP ، و (iii) فهم معايير استدعاء الذروة وإجراء ذروة الاتصال والتعليق التوضيحي للذروة.
سيصف هذا الفيديو بالتفصيل العملي كيف يمكن للباحثين الذين يدرسون بيولوجيا الحمض النووي الريبي تثبيت واستخدام خط الأنابيب الحسابي ، SCRAP ، على النحو الأمثل لتحليل تفاعلات sncRNA مع الحمض النووي الريبي المستهدف ، مثل الحمض النووي الريبي المرسال ، في بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي الوهمية التي تم الحصول عليها من خلال أحد الأساليب الكيميائية الحيوية التي تمت مناقشتها لإعداد مكتبة التسلسل.
SCRAP هي أداة مساعدة لسطر الأوامر. بشكل عام ، باتباع الدليل أدناه ، سيحتاج المستخدم إلى (i) تنزيل وتثبيت SCRAP (https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP) ، (ii) تثبيت الجينومات المرجعية وتشغيل SCRAP ، و (iii) إجراء ذروة الاتصال والتعليقات التوضيحية.
يمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول الخطوات الحسابية في هذا الإجراء في https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP. ستوفر هذه المقالة معلومات الإعداد والخلفية للسماح للمحققين ذوي المهارات الحسابية للمبتدئين بتثبيت SCRAP وتحسينه واستخدامه على مجموعات بيانات مكتبة تسلسل الحمض النووي الريبي الوهمي.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تصميم هذا البروتوكول الخاص باستخدام خط أنابيب SCRAP لتحليل تفاعلات sncRNA: RNA المستهدفة لمساعدة الباحثين الذين يدخلون في التحليل الحسابي. من المتوقع أن يؤدي إكمال البرنامج التعليمي إلى توجيه الباحثين ذوي الخبرة الحسابية للمبتدئين أو أكبر من خلال الخطوات المطلوبة لتثبيت واستخدام خط الأنابي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أعضاء مختبر Meffert على المناقشات المفيدة ، بما في ذلك BH Powell و WT Mills IV ، على التعليقات النقدية حول وصف تركيب وتنفيذ خط الأنابيب. تم دعم هذا العمل من خلال جائزة مؤسسة Braude ، وبرنامج إطلاق صندوق أبحاث الخلايا الجذعية في ماريلاند ، وجائزة Blaustein Endowment for Pain Research and Education ، و NINDS RO1NS103974 و NIMH RO1MH129292 إلى M.K.M.
Materials
| Genomes | UCSC Genome browser | N/A | https://genome.ucsc.edu/ or https://www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/ |
| Linux | Linux | Ubuntu 20.04 or 22.04 LTS recommended | |
| Mac | Apple | Mac OSX (>11) | |
| Platform setup | GitHub | N/A | https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP/blob/main/PLATFORM-SETUP.md] |
| SCRAP pipeline | GitHub | N/A | https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP |
| Unix shell | Unix operating system | bash >=5.0 | |
| Unix shell | Unix operating system | zsh (5.9 recommended) | |
| Windows | Windows | WSL Ubuntu 20.04 or 22.04 LTS |
References
- Morris, K. V., Mattick, J. S. The rise of regulatory RNA. Nature Reviews Genetics. 15 (6), 423-437 (2014).
- Li, X., Jin, D. S., Eadara, S., Caterina, M. J., Meffert, M. K. Regulation by noncoding RNAs of local translation, injury responses, and pain in the peripheral nervous system. Neurobiology of Pain (Cambridge, Mass.). 13, 100119 (2023).
- Shi, J., Zhou, T., Chen, Q. Exploring the expanding universe of small RNAs. Nature Cell Biology. 24 (4), 415-423 (2022).
- Broughton, J. P., Lovci, M. T., Huang, J. L., Yeo, G. W., Pasquinelli, A. E. Pairing beyond the seed supports microRNA targeting specificity. Molecular Cell. 64 (2), 320-333 (2016).
- Grosswendt, S., et al. Unambiguous identification of miRNA:target site interactions by different types of ligation reactions. Molecular Cell. 54 (6), 1042-1054 (2014).
- Mills, W. T., Eadara, S., Jaffe, A. E., Meffert, M. K. SCRAP: a bioinformatic pipeline for the analysis of small chimeric RNA-seq data. RNA. 29 (1), 1-17 (2023).
- Helwak, A., Kudla, G., Dudnakova, T., Tollervey, D. Mapping the human miRNA interactome by CLASH reveals frequent noncanonical binding. Cell. 153 (3), 654-665 (2013).
- Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis. Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).
- Moore, M. J., Zhang, C., Gantman, E. C., Mele, A., Darnell, J. C., Darnell, R. B. Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis. Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).
- Bjerke, G. A., Yi, R. Integrated analysis of directly captured microRNA targets reveals the impact of microRNAs on mammalian transcriptome. RNA. 26 (3), 306-323 (2020).
- Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11 (1), 129 (2010).
- Moore, M. J., et al. miRNA-target chimeras reveal miRNA 3′-end pairing as a major determinant of Argonaute target specificity. Nature Communications. 6 (1), 8864 (2015).
- Travis, A. J., Moody, J., Helwak, A., Tollervey, D., Kudla, G. Hyb: a bioinformatics pipeline for the analysis of CLASH (crosslinking, ligation and sequencing of hybrids) data. Methods (San Diego, Calif.). 65 (3), 263-273 (2014).
