ショウジョウバエナース細胞の微小注射:細胞内送達法

Overview

その大きなサイズと比較的単純な組織のために、 ショウジョウバエ の看護師細胞は、生細胞イメージング研究に理想的に適しています。このビデオでは、外因性化合物を細胞に送達するためのマイクロインジェクション法について説明し、注目のプロトコルは、内因性mRNA転写物を視覚化するために使用される分子ビーコン(MB)と呼ばれる蛍光オリゴヌクレオチドプローブによる手順を示しています。

Protocol

このプロトコルは、Catrinaらから抜粋され、生のショウジョウバエメラノガスター卵室、J.Vis. Expの内因性mRNAを視覚化および追跡する。(2019).

1. ライブセルイメージング用のMBの設計

1. 標的RNA配列を折り畳んで、mfoldサーバからの「RNA形態」を用いてmRNA標的の二次構造を予測する(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form)。
   1. ターゲットシーケンスを FASTA 形式で貼り付け/アップロードし、最適性の 5 または 10% (それぞれ MFE 値の 5 または 10% 以内に折り畳む自由エネルギーを持つ構造) を選択し、それに応じて計算された折り畳みの最大数を調整します (例えば、最適度の 10% より大きい)。
      注: MBを設計する際に最適でない二次構造を含めることで、最小自由エネルギー(MFE)構造単独で予測されるよりも柔軟または剛性の高いターゲットmRNA内の領域を同定することができ、ライブセルイメージングに適したMBの全体的な設計が改善されます。
   2. 800ヌクレオチド(nt)のmRNAターゲットの「即時ジョブ」、または801〜8,000 ntのmRNA長の「バッチジョブ」を選択します。"ss-count" ファイルを単純なテキスト ファイルとして保存します。
2. ステップ 1.1 で取得した"ss-count"ファイルを、目的のパラメータを指定したPinMolプログラム (https://bratulab.wordpress.com/software/) の入力として使用して、mRNA ターゲット用の複数の MB を設計します(https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/での PinMolプログラムの使用法を説明するチュートリアルを参照)。
   1. BLAST分析を行うことにより、選択したMBの特異性を決定する:適切なデータベースで「blastn」を使用します(例えば 、オスカー mRNA特異的なMBは、「refseq-rna」データベースと ショウジョウバエメラノガスター 生物を使用します)。
   2. mRNA標的の組織特異的発現を特定する(例えば 、オスカー mRNAフライベース>ハイスループット発現データ>フライアトラス解剖マイクロアレイまたはmodENCODE解剖学RNA-Seq; http://flybase.org/reports/FBgn0003015)そして任意の正のBLASTヒットと比較します。>50%のクロスホモロジーを示すプローブを、関心のある組織/細胞にも発現する他のmRNAと共に排除します。
3. ライブセルイメージング(例えばCy5/BHQ2)を行うために利用可能な顕微鏡のセットアップに適したフルオロフォアとクエンチャーのペアを選択します。

2. MB合成、精製、特性評価

1. 「Bratu、分子生物学の方法(2006)」、または商業プロバイダーからのサービスで説明したように、社内での合成と精製を使用して、次のラベリングスキームを使用して1〜5 MBのMB(上記の注を参照)を合成および精製します。逆相HPLCを使用して、社内で、または商業プロバイダーのサービスを使用して、MBを精製します。
   注: 自動プローブ合成に使用するホスロアミダイトは、2'-O-メチルリボヌクレオチド修飾を有する必要があります。また、ロック核酸(LNA)と2'-O-メチル修飾のキメラを使用して、短いMBとその標的mRNAとの間のハイブリッドの安定性を高めることもできます。
2. 標的となるRNA領域の配列に一致し、したがって、 インビトロ 特性評価で使用するために、MBsのプローブ領域と相補的であるDNAオリゴヌクレオチドを合成する(上記の注意点は、ステップ2.3〜2.5;を参照)。DNAオリゴヌクレオチド標的を模倣したMBのハイブリダイゼーションを最大にし、標的mRNA配列に見られる4つの追加ヌクレオチドをDNA標的の両端に含めることによって。
   注: 標的配列を検出するMBの効率のより厳密な特徴付けは、相補的なDNAオリゴヌクレオチドの代わりにインビトロ合成RNA標的を用いて行うことができる。
3. MB単独で熱変性を行い、その融解温度(Tm)を測定し、生理学的温度で望ましいヘアピン形状を想定していることを確認する。我々は、60〜90°Cの間のTm値を観察した。
4. DNAオリゴヌクレオチド標的の存在下でMBの熱変性を行い、MB:DNA標的ハイブリッドのTmを測定し、ブラトゥで前述したように 、分子生物学の方法(2006)。MB:DNAハイブリッドには55~60°Cの間のTmが望まれます。
5. 対応するDNAオリゴヌクレオチド標的とのインビトロハイブリダイゼーション反応を行い、生理学的温度でのMB:DNAハイブリッド形成の効率を判定する 、Bratu、分子生物学の方法(2006)に記載した。DNA標的模倣を用いた高速ハイブリダイゼーション動態が望まれるが、DNA標的とのハイブリダイゼーション効率が高くないMBは、インビトロおよび/またはインビボで標的mRNAでより優れた性能を有する可能性がある。

3. マイクロインジェクション用の個々の卵チャンバーの解剖と調製

1. 新しく孵化し、新鮮な酵母ペーストで2〜3日間の雌を交配。
2. CO2パッド上のハエを麻酔し、細かいピンセット(デュモン#5)を使用して、ガラスカバースリップにハロカーボンオイル700の滴に1〜2メスを移します。
3. ピンセットを使用して、目立体顕微鏡下で後側を上にフライの向きを付けます。後端で小さな切開を行い、卵巣のペアを油にそっと絞ることによって、女性の腹部を解剖する。
4. 新しいカバースリップの油滴に卵巣を出す。1つのオバリーを1つのピンビーザーでそっと持ち、もう一方のピンビーザーで卵巣の最年少段階をつまみます。 オスカー mRNAは、中間発起(段階>7)で積極的に局在しており、若い卵室(ステージ<7)は注入が難しく、長く生き残ることはできない。個々の卵巣または卵室が分離され、垂直に整列されるまで、カバースリップ(下向きの動き)をゆっくりとドラッグします。さらに、オバゾール卵鎖から不要な段階を置き換えることによって単一の卵室を分離する。
   注: 個別にからかわれた卵の部屋が油に浮かばないようにし、カバースリップに付着することを確認してください。これは、マイクロインジェクションと画像取得の成功の両方にとって重要です。

4. 卵チャンバーの看護婦細胞へのMBのマイクロインジェクション

1. 1つの分子ビーコン(例えばosk2216Cy5)、または異なるmRNAを標的とし、スペクトル的に異なるフルオロフォア(例えばosk2216Cy5およびdrongo111Cy3)で標識された2つのMBの混合物を使用して、MB溶液を調製する。HybBufferで200-300 ng/μLの濃度を使用してください(50 mMトリス-HCl - pH 7.5、1.5 mM MgCl₂ および100 mM NaCl)。HybBufferでそれぞれ200 ng/μLで同じmRNAを標的としている同じフルオロフォアで標識された4つのMBのカクテル(例えばosk82、osk1236、osk2216)。マイクロインジェクション用の針をロードする直前に、MB溶液をスピンダウンしてください。
2. 目的を選択します。適切な卵チャンバーを見つけ、マイクロインジェクションを行う場合は、40xオイルの目的をお勧めします。
3. 解剖された卵室を持つカバースリップを顕微鏡のステージに取り付けます。焦点位置で目的を持ち出し、マイクロインジェクションに適した中期から後期の発達段階で卵室を同定する(すなわち、AàP軸は針先に垂直であり、卵母細胞に近い看護婦細胞内で容易に注射を可能にする)。
4. ~1 μL MB溶液(ステップ1.1参照)で針(市販または社内で準備)をロードし、マイクロインジェクターに接続します。D. メラノガスター卵室でのマイクロインジェクションの場合は、いくつかのナースセルを穿刺しないように、針を<45°の角度で顕微鏡の段階(例えば30°)に向けます。
5. 注入圧力500-1,000 hPa、100-250 hPaの補償圧力を備えたインジェクターをセットアップする( 材料表を参照)。
6. 卵室の油滴ボイドの領域を視野に持ち込むためにゆっくりとステージを移動します。
7. マイクロマニピュレーターのジョイスティックを使用して、針を油滴にそっと下げ、視野の周囲に向かって先端を焦点にします。
8. 針の先端から空気を取り除き、針から流れがあることを確認するために「クリーン」機能を実行します。
9. 針を自宅の位置に持ち込み、卵室に集中してマイクロインジェクションし、針をフォーカスに戻し、卵室の端近くに置きます。
10. 目的のZ位置の微調整を行い、毛包細胞をナース細胞から分離する膜が焦点を合わせられます。
11. 針をナースセルに挿入し、2~5sの注射を行います。
12. 針をそっと取り出し、ホームの位置に引き込みます。
13. 目的を画像取得の目的の倍率(60-63xまたは100x)に変更し、卵の部屋に焦点を当て、取得を開始します。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectrofluorometer	Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon	n/a	Photon counting spectrofluorometer
Quartz cuvette	Fireflysci (former Precision Cells Inc.)	701MFL
Dumont #5 tweezer	World Precision Instruments	501985	Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898
Cover slip No.1 22 mm x 40 mm	VWR	48393-048
Dissecting microscope	Leica MZ6 Leica Microsystems Inc.	n/a
CO2 fruit fly anesthesia pad	Genesee Scienific	59-114
Tris-HCL pH 7.5	Sigma-Aldrich	1185-53-1
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	7791-18-6
NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Spinning disc confocal microscope	Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc.	n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera	Hamamatsu	n/a
PatchMan NP 2 Micromanipulator	Eppendorf Inc.	920000037
FemtoJet Microinjector	Eppendorf Inc.	920010504
Injection needle: Femtotips II	Eppendorf Inc.	930000043
Loading tip: 20 μL Microloader	Eppendorf Inc.	930001007
Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22 mm x 40 mm	VWR	48393-026; 48393-172
Dry yeast	Any grocery store	n/a
Computer, > 20 GB RAM			Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing