Iniezione di mosche Drosophila adulte: un metodo di consegna composta o etichetta

Overview

Questo video descrive come eseguire un'iniezione di mosche adulte vive e include un protocollo di esempio in cui particelle etichettate e blu trypan vengono iniettate negli addome di mosca per saggiare la fagocitosi.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Nazario-Toole e Wu, Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay, J. Vis. Exp.

1. Preparare le particelle di fluoresceina per l'iniezione

1. Ricostituire 10 mg di particelle batteriche uccise dal calore disponibili in commercio etichettate con fluoresceina (vedi Tabella dei materiali)ad una concentrazione di 10 mg/mL aggiungendo 990 μL sterile 1x PBS e 10 μL 50 mM di azide di sodio. Vortice da mescolare.
   1. Dividere in aliquote singole da 8 μL in tubi da 0,2 ml e conservare in una scatola scura a 4 °C per ridurre al minimo la sensibilità associata alla luce.
      NOTA: Il conservante dell'azide di sodio è facoltativo e può essere omesso se le scorte di 10 mg/mL sono fatte con 1 mL sterile 1x PBS, aliquota e conservate a -20 °C.
2. Creare una soluzione da 10 ml di colorazione alimentare al 5% in 1x PBS mescolando la colorazione del cibo verde filtrata con siringa da 500 μL e 1x PBS sterile da 9,5 ml.
3. Lavare le particelle prima dell'iniezione per rimuovere l'azide di sodio. Mescolare 42 μL sterile 1x PBS e 8 μL di 10 mg/mL in un tubo da 1,7 ml. Centrifuga a velocità massima per 2,5 minuti a temperatura ambiente.
   1. Rimuovere il supernatante, aggiungere 50 μL 1x PBS e centrifugare alla velocità massima per 2,5 minuti a temperatura ambiente.
   2. Ripetere i passaggi 1.3 e 1.3.1 2x, per un totale di 3 lavaggi.
   3. Dopo il lavaggio finale, scartare il supernatante e sospendere di nuovo le particelle a 1,6 mg/mL in 50 μL di colorante alimentare al 5% in 1x PBS.
   4. Avvolgere il tubo in un foglio di alluminio per proteggere dalla luce. Conservare a 4 °C, scartare dopo 1 settimana.

2. Preparare la stazione di iniezione e vola

1. Preparare il cuscinetto di iniezione. Per iniettare fino a 4 genotipi di mosche contemporaneamente, utilizzare il nastro di laboratorio per dividere un fly pad rettangolare di CO₂ in 4 sezioni. Sulla panca vicino al microscopio, designare le aree per posizionare le fiale una volta che le mosche sono state allineate sul pad (una per ogni angolo del pad).
2. Prepara fiale di mosche abbinate all'età, di 4-7 giorni, iniettate. Per ogni ceppo da testare, trasferire 5 maschi e 5 femmine in una fiala fresca ed etichettata di cibo mosca preparato e conservare a 25 °C.
3. Preparare l'iniettore pneumatico (vedi Tabella dei materiali) impostando lo strumento su una modalità TIMED da 100 ms (brevi raffiche di pressione del gas per espellere il liquido, consentendo l'erogazione di volumi sub-nanoliter).
4. Preparare le diapositive del microscopio. Tagliare strisce da 1,5 pollici di nastro elettrico, piegare in un anello con il lato adesivo fuori e posizionarlo su uno scivolo del microscopio etichettato.

3. Preparare aghi capillari in vetro

1. Tirare aghi di vetro (sottili capillari in vetro da parete) usando un estrattore di ago.
   1. Tenere l'ago al microscopio con un micrometro e rompere la punta utilizzando una pinzetta in acciaio inossidabile #5 punto fine. Le punte da 100 μm sono sufficienti per perforare la cuticola della mosca riducendo al minimo le ferite.
   2. Misurare il volume di liquido che verrà iniettato in ogni mosca. Caricare l'ago con colorante alimentare sterile al 5% in 1x PBS ed espellere il liquido su una goccia di olio minerale su un micrometro a stadio di 0,01 mm.
      NOTA: Se la goccia liquida è sferica, il volume in picoliter viene calcolato come (dimensione)³/1910. Un ago con un diametro di 100 μm espellerà ~2 nL in 100 ms.

4. Iniettare mosche

1. Pipetta 10 μL di particelle da 1,6 mg/mL su un piccolo quadrato di parafilm.
   1. Tirare il liquido nell'ago e montare nell'ugello dell'iniettore (vedere Tabella dei materiali).
   2. Anestetizza le mosche con CO₂ e allineale nella loro area designata sul flypad, con il lato ventrale verso l'alto e le teste orientate verso la parte anteriore del pad. Posizionare fiale nelle aree corrispondenti sul banco.
   3. Iniettare mosche nell'angolo superiore dell'addome con pompe di liquido da 5.100 ms (~ 10 nL totali).
   4. Trasferire le mosche iniettate sulle fiale appropriate, notare il tempo sul flaconcino. Conservare a 25 °C.
2. Caricare un nuovo ago con soluzione blu Trypan 0.4%.
3. Impostare l'iniettore pneumatico su GATED, che consente un flusso costante di aria per spingere il liquido fuori dall'ago.
4. Anestetizza le mosche dopo aver riposato per 30 minuti e iniettato Trypan Blue fino a quando l'addome è pieno e disteso.
   NOTA: Quando si esamina la maturazione fagoma con particelle etichettate con un colorante sensibile al pH, lasciare riposare le mosche per 1 h e non iniettare blu tripano prima di montare le mosche.
5. Montare le mosche su vetrini al microscopio con nastro elettrico, lato ventrale verso il basso. Spingere le ali sul lato della mosca e fissarle al nastro. Inoltre, spingere delicatamente la testa nel nastro per assicurarsi che la mosca non si muova.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5430-10 PicoNozzle Kit	World Precision Instruments	5430-10	Holder for 1.0mm pipette
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2861	Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)
Needle Pipette Puller	David Kopf Instruments	Model 725
Pneumatic PicoPump PV820	World Precision Instruments	SYS-PV820	The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms "TIMED" mode.
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-3	Needles for injection. OD = 1.0 mm
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma	T8154	Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.