Iniezione di mosche Drosophila adulte: un metodo di consegna composta o etichetta

- Preparare aghi di iniezione rastremiati tirando capillari di vetro a parete sottile utilizzando un estrattore di ago. Tenere un ago al microscopio e rompere la punta, assicurandosi che l'apertura sia abbastanza grande da perforare la cuticola di mosca adulta senza ferirla più del necessario. Misurare il volume di iniezione caricando l'ago con una soluzione sterile di colorante e tampone di sale e quindi espellerlo su una goccia di olio minerale su un micrometro di stadio. Utilizzare la bilancia sul micrometro per misurare il diametro della goccia espulsa, che può essere utilizzata per calcolare il volume erorato e calibrare l'iniettore. impostazioni di conseguenza.

Caricare l'ago con la soluzione di iniezione e montarlo su un ugello di iniezione. Anestetizzare le mosche con CO2 e disporle su un fly pad di CO2 che le manterrà anestetizzate. Una volta che le mosche sono nell'orientamento corretto per l'esperimento, procedere con le iniezioni. Nel protocollo di esempio, inietteremo mosche adulte con particelle etichettate con fluoresceina per l'imaging in vivo.

- Dopo aver tirato capillari di vetro a parete sottile con un estrattore di ago, utilizzare un micrometro per tenere l'ago al microscopio e utilizzare le pinzette in acciaio inossidabile a punta fine numero cinque per rompere la punta a un diametro della punta di 100 micrometri. Per misurare il volume di liquido che verrà iniettato in ogni mosca, caricare un ago capillare con colorante alimentare sterile al 5% in PBS ed espellere il liquido su una goccia di olio minerale su un micrometro a stadio di 0,01 millimetri.

Erogare 10 microlitri da 1,6 milligrammi per millilitro particelle su un piccolo quadrato di parafilm e tirare il liquido nell'ago. Montare l'ago nell'ugello dell'iniettore e allineare le mosche anestetizzate lungo l'area designata sul fly pad, lato ventrale verso l'alto, con le teste orientate verso la parte anteriore del pad. Posizionare le fiale nelle aree corrispondenti sul banco e iniettare le mosche nell'angolo superiore dell'addome con cinque pompe di liquido da 100 millisecondi per fornire circa 10 nanolitri di particelle in totale. Trasferire ogni mosca nella fiala appropriata così come è iniettata, notando il tempo sul flaconcino.

Successivamente, caricare un nuovo ago con soluzione Trypan Blue allo 0,4% e impostare l'iniettore pneumatico su "gated" per consentire un flusso costante di aria per spingere il liquido fuori dall'ago. 30 minuti dopo l'iniezione iniziale, iniettare ogni addome di mosca con Trypan Blue fino a quando gli addome sono pieni e distensi. Montare le mosche su vetrine al microscopio con nastro elettrico lato ventrale verso il basso, spingendo le ali sul lato della mosca per fissarle al nastro. Quindi spingere delicatamente la testa nel nastro per assicurarsi che la mosca non si muova.