成人 ショウジョウバエ の注射:化合物または標識の送達方法

Overview

このビデオでは、生きた成体ハエの注入を行う方法を説明し、標識粒子とトリパンブルーをフライ腹部に注入して食細胞節をアッセイするプロトコルの例を示します。

Protocol

このプロトコルは、ナザリオ・ツールとウーからの抜粋であり、フルーツフライの細胞性免疫応答を評価し、ショウジョウバエメラノガスター、インビボファゴサイトシスアッセイを使用して、J.Vis.Exp.(2019)。

1. フッ素粒子の注射準備

1. 市販の10mgの熱死菌粒子を、990μL無菌1x PBSおよび10μL50 mMのアジドナトリウムを添加して10mg/mLのストック濃度にフルオレセイン( 材料表を参照)を示す。混ぜる渦。
   1. 0.2 mLチューブで8μLのアリコートを1本使用に分割し、4°Cの暗い箱に保管して、光に関連する感度を最小限に抑えます。
      注: アジドナトリウム保存剤は任意であり、10 mg/mLストックが1 mLの無菌1x PBSで作られ、アリクォートされ、-20°Cで保存される場合は省略することができます。
2. 500 μL のフィルターグリーン食品着色と 9.5 mL 滅菌 1x PBS を混合して、1x PBS で 5% 食品着色液を 10 mL にします。
3. 注射前に粒子を洗浄してアジドナトリウムを除去する。42 μL滅菌1x PBSと10 mg/mLの8 μLを1.7 mLチューブに混ぜます。室温で2.5分の最高速度で遠心分離機。
   1. 上清を取り出し、50 μL 1x PBSを加え、室温で2.5分間最大速度で遠心分離機を加えます。
   2. ステップ 1.3 と 1.3.1 2x を繰り返し、合計で 3 回の操作を行います。
   3. 最終洗浄後、上清粒子を捨て、1xPBSで5%の食品着色料の50 μLで1.6mg/mLに再懸濁します。
   4. チューブをアルミニウム箔で包み、光から保護します。4°Cで保管し、1週間後に廃棄します。

2. 射出ステーションとハエを準備する

1. 射出パッドを準備します。同時にハエの4つの遺伝子型を注入するには、実験室用テープを使用して長方形の_CO2 フライパッドを4つのセクションに分割します。顕微鏡の近くのベンチで、ハエがパッドに並んだらバイアルを配置する領域を指定します(パッドの各コーナーに1つずつ)。
2. 年齢に一致した、4-7日齢のバイアルを準備し、注射のために飛ぶ。検査する各菌株について、5人の男性と5人の女性を新鮮な、準備されたフライフードのバイアルに移し、25°Cに保ちます。
3. 空気圧インジェクター( 材料表を参照)を、器具を100 ms(液体を排出するためのガス圧の短いバースト–サブナノリットルのボリュームの送達を可能にする )TIMED モードに設定して準備します。
4. 顕微鏡スライドを準備します。1.5インチの電気テープを切り、接着剤の側面を外にしてループに折り畳み、ラベル付き顕微鏡スライドの上に置きます。

3. ガラスの毛細血管針を準備する

1. 針の引き手を使用してガラスの針(薄い壁のガラス毛細血管)を引っ張ります。
   1. マイクロメートルで顕微鏡の下に針を保持し、細かい点#5ステンレス鋼ピンセットを使用して先端を壊します。100 μm の先端は、傷を最小限に抑えながら、ハエのキューティクルを突き刺すのに十分です。
   2. 各フライに注入される液体の量を測定します。1x PBSで無菌5%の食品着色剤で針をロードし、0.01mmの段階マイクロメートルでミネラルオイルの滴に液体を排出します。
      注: 液滴が球状の場合、ピコリターの体積は(サイズ⁾³/1910として計算されます。直径100μmの針は100msで2nLを排出します。

4. ハエを注入する

1. ピペット10 μLの1.6 mg/mL粒子を小さなパラフィルムの正方形に取り付けます。
   1. 液体を針に引き込み、インジェクタノズルに取り付けます( 材料表を参照)。
   2. CO₂ でハエを麻酔し、腹側を上にして頭をパッドの前面に向けて、フライパッドの指定された領域に並べる。ベンチの対応する領域にバイアルを配置します。
   3. 腹部の上部に、5,100msの液体ポンプ(合計10nL)でハエを注入します。
   4. 注入されたハエを適切なバイアルに移し、バイアルの時間に注意してください。25°Cに保ちます。
2. 0.4%トリパンブルーソリューションで新しい針をロードします。
3. 空気インジェクターを GATEDに設定し、空気の一定の流れが液体を針から押し出すことができます。
4. 彼らは30分間休んだ後にハエを麻酔し、腹部がいっぱいになるまでトリパンブルーで注入し、膨張します。
   注: pH感受性染料で標識された粒子でファゴソーム成熟を調べる場合、ハエは1時間休み、ハエを取り付ける前にトリパンブルーで注入しないでください。
5. マウントは、電気テープ、腹側を下に顕微鏡スライドに飛びます。翼をハエの側面に押し付け、テープに固定します。また、テープに頭をそっと押し込んで、フライが動かないようにします。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5430-10 PicoNozzle Kit	World Precision Instruments	5430-10	Holder for 1.0mm pipette
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2861	Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)
Needle Pipette Puller	David Kopf Instruments	Model 725
Pneumatic PicoPump PV820	World Precision Instruments	SYS-PV820	The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms "TIMED" mode.
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-3	Needles for injection. OD = 1.0 mm
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma	T8154	Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.