Overview
يصف هذا الفيديو طريقة لتشريح الغند من البالغين C. elegans hermaphrodites، مما يؤدي إلى الأنسجة التي هي مناسبة لاحتواء المناعة والتصوير الفلوري.
Protocol
هذا البروتوكول هو مقتطف من جيرفيه وأرور، التحليل المكاني والزمني ل ERK النشط في C. elegans Germline. ج. فيس إكسب. (2016).
1. تشريح الديدان الكبار للحصول على النواد
- اختيار 100 - 150 WT (N2) أو النمط الجيني المطلوب من الديدان في المرحلة التنموية المطلوبة ومحددة (L1، L2، L3، L4، الكبار، الخ.)في 100 ميكرولتر من العازلة M9 في أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل.
- املأ أنبوب الطرد المركزي الدقيق ب 900 ميكرولتر من المخزن المؤقت M9 (انظر جدول المواد). طرد مركزي الأنابيب في 1000 x ز في جهاز الطرد المركزي الدقيق لمدة 1 دقيقة في درجة الحرارة المحيطة.
- إزالة بلطف 900 ميكرولتر من المخزن المؤقت M9 وتجاهل. قم بإزالة العازلة تحت مجهر تشريح للتأكد من أن الديدان لا تتم إزالتها عن طريق الخطأ.
- كرر الخطوات من 1.2 إلى 1.3 مرتين إضافيتين باستخدام المخزن المؤقت M9 الطازج في كل مرة. وهذا يضمن أن أي البكتيريا التي تم ترحيلها مع الديدان يتم غسلها بشكل فعال.
- بعد غسل النهائي إزالة 900 ميكرولتر من المخزن المؤقت M9 من الأنبوب وتجاهل.
- نقل المتبقية 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت M9 التي تحتوي على 100-150 الديدان مع طرف 200 ميكرولتر micropipette إلى طبق ساعة زجاجية مسطحة أسفل. تأكد من قطع طرف الميكروبايت عند علامة 10 ميكرولتر قبل الاستخدام. عدم قطع طرف سيؤدي إلى القص من الديدان.
- إضافة 1 - 3 ميكرولتر من 0.1 M levamisole إلى طبق ساعة زجاجية تحتوي على الديدان في المخزن المؤقت M9. دوامة بلطف levamisole و M9 لتمكين حتى خلط حتى تتوقف الديدان تتحرك.
ملاحظة: يمكن تخزين مخزون ليفاميسول عند -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل. هنا ، استخدم تركيز أعلى من 1 - 3 mM مما تم وصفه في literature23 من 0.2 - 0.25 mM من levamisole من أجل الحصول على فقدان سريع للحركة في الحيوانات. إذا كانت الحيوانات سلخ حول لفترة طويلة جدا في تعليق السائل، وأنماط الناتجة من dpERK في النواد يمكن أن تكون متغيرة (بسبب الإجهاد أو نقص التغذية أو كليهما). وقد تم تحقيق المزيد من أنماط تلطيخ استنساخها مع 1 - 3 mM levamisole للتشريح. - إرفاق اثنين من الإبر 25 G إلى اثنين من المحاقن 1 مل (حجم الحقنة لا يهم، وقياس الإبرة أمر بالغ الأهمية). وضع حقنة واحدة في كل يد (الشكل 1).
- تحت المجهر تشريح، وضع كل إبرة تحت وعلى كل دودة كما هو مبين في الشكل 1 ووضع قطع غرامة على الدودة بالقرب من لمبة البلعوم الثاني في حركة تشبه مقص. بعد قطع واحد في الدودة الانتقال إلى الحيوان التالي حتى تم قطع جميع الحيوانات في الطبق مرة واحدة على الأقل.
ملاحظة: ضع في اعتبارك أن الخطوات من 1.8 إلى 1.9 حساسة للوقت. تشريح جميع الديدان في الطبق في أقل من خمس دقائق لنمط dpERK استنساخها. ستؤدي أوقات التشريح الأطول إلى إيقاف تشغيل إشارة dpERK ، خاصة في المنطقة 1. ضبط عدد الديدان لكل جولة من تشريح(أي، 50 الديدان مقابل 150) إذا لزم الأمر للبقاء في الإطار الزمني المخصص.- في حالة عدم رؤية النخر المقشر أثناء التشريح ، لا تحاول قطعا آخر في نفس الحيوان. عادة ما يؤدي ذلك إلى قص الحيوان فقط ولا يؤدي إلى قذف النعود. بدلا من ذلك، انتقل إلى الحيوان التالي. الديدان حيث الغوناد لا تقذف سوف تظهر على هذا النحو على الشرائح التي سيتم إجراؤها في القسم 6 ويمكن تجاهلها أثناء التصوير
ملاحظة: من خلال جميع خطوات التشريح والمعالجة ، من المهم أن نضع في اعتبارنا أن الوند سيظل ملتصقا بالجسم / الذبيحة. لا تجبر النند والجسم على الانفصال عن الإبرة. في كثير من الأحيان يمكن أن يؤدي تمزق منحرف في أنسجة الغدد التناسلية في محاولة لقطع الغدد التناسلية من الجسم إلى إشارة جسم مضاد زائفة. يمكن تجاهل الجسم / الذبيحة أثناء خطوات التصوير ، وصورت فقط النند. بالإضافة إلى ذلك ، في بعض الأحيان يمكن للخلايا المعوية أيضا أن تكون بمثابة ضوابط داخلية / ضوابط جسدية للأجسام المضادة التي يتم فحصها.
- في حالة عدم رؤية النخر المقشر أثناء التشريح ، لا تحاول قطعا آخر في نفس الحيوان. عادة ما يؤدي ذلك إلى قص الحيوان فقط ولا يؤدي إلى قذف النعود. بدلا من ذلك، انتقل إلى الحيوان التالي. الديدان حيث الغوناد لا تقذف سوف تظهر على هذا النحو على الشرائح التي سيتم إجراؤها في القسم 6 ويمكن تجاهلها أثناء التصوير
الشكل 1: إظهار مواقف إبرة أثناء تشريح. إلى اليسار: صورة لتشريح قيد التنفيذ. اليمين: وضع الإبرة مع الإشارة إلى الدودة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flat bottom glass watch dish | Agar Scientific | AGL4161 | We use glass because dissected gonads often stick to plastic |
| 25 G needles | BD PrecisionGlide | 305122 | |
| Syringes (could be 1 or 5 mL) | BD Syringes | 1 mL: BD 309659 | |
| Microscope slides (25 x 75 x 1.0 mm) | Fisherbrand | 12-550-343 | |
| Clinical bench top centrifuge | |||
| *M9 solution | |||
| Levamisole | Sigma | L9756 | |
| *M9 Buffer Recipe | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. |
