C. elegans Gonade Extrusie: Een Snelle Dissectie Techniek

Overview

Deze video beschrijft een methode om geslachtsklieren te ontleden van volwassen C. elegans hermafrodieten, wat resulteert in weefsels die geschikt zijn voor immunostaining en fluorescerende beeldvorming.

Protocol

Dit protocol is een uittreksel uit Gervaise en Arur, Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline. J.Vis. Exp. (2016).

1. Dissectie van volwassen wormen voor het verkrijgen van geslachtsklieren

1. Kies 100 - 150 WT (N2) of het gewenste genotype wormen in de gewenste en specifieke ontwikkelingsfase (L1, L2, L3, L4, volwassen, enz.)in 100 μL M9-buffer in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
2. Vul de microcentrifugebuis met 900 μL M9-buffer (zie materialentabel). Centrifugeer de buizen op 1.000 x g in een microcentrifuge gedurende 1 min bij omgevingstemperatuur.
3. Verwijder voorzichtig 900 μL van de M9-buffer en gooi deze weg. Verwijder de buffer onder een ontleedmicroscoop om ervoor te zorgen dat de wormen niet per ongeluk worden verwijderd.
4. Herhaal stap 1.2 - 1.3 nog twee keer met elke keer een nieuwe M9-buffer. Dit zorgt ervoor dat alle bacteriën die met de wormen zijn overgedragen effectief worden weggespoeld.
5. Verwijder na de laatste wasbeurt 900 μL M9-buffer uit de buis en gooi deze weg.
6. Breng de resterende 100 μL M9-buffer met de 100 - 150 wormen met een 200 μL-micropipettip over in een glazen horlogeschaal met platte bodem. Zorg ervoor dat de micropipetpunt voor gebruik op de 10 μL-markering is gesneden. Het niet snijden van de punt zal resulteren in het scheren van de wormen.
7. Voeg 1 - 3 μL levamisole van 0,1 M toe aan de glazen horlogeschaal met de wormen in M9-buffer. Wervel voorzichtig de levamisole en de M9 om gelijkmatig mengen mogelijk te maken totdat de wormen stoppen met bewegen.
   OPMERKING: Levamisole-voorraden kunnen worden bewaard bij -20 °C voor langdurige opslag. Gebruik hier de hogere concentratie van 1 - 3 mM dan in de literatuur is beschreven23 van 0,2 - 0,25 mM levamisole om snel verlies van mobiliteit bij de dieren te verkrijgen. Als de dieren te lang in de vloeibare suspensie rondfladderen, kunnen de resulterende patronen van dpERK in de geslachtsklieren variabel zijn (vanwege stress of gebrek aan voeding of beide). Meer reproduceerbare kleuringspatronen zijn bereikt met 1 - 3 mM levamisole voor dissectie.
8. Bevestig twee naalden van 25 G aan twee spuiten van 1 ml (de grootte van de spuit doet er niet toe, de maat van de naald is kritiek). Plaats één spuit in elke hand (figuur 1).
9. Plaats onder een ontleedmicroscoop elke naald onder en over elke worm zoals weergegeven in figuur 1 en plaats een fijne snede op de worm in de buurt van de tweede faryngeale bol in een schaarachtige beweging. Nadat de ene snede in de worm is doorgesneden, gaat u door naar het volgende dier totdat alle dieren in de schaal ten minste één keer zijn gesneden.
   OPMERKING: Houd er rekening mee dat stap 1.8 - 1.9 tijdgevoelig zijn. Ontleed alle wormen in de schaal in minder dan vijf minuten voor een reproduceerbaar dpERK-patroon. Langere dissectietijden zullen resulteren in het uitschakelen van het dpERK-signaal, vooral in Zone 1. Pas het aantal wormen per dissectieronde(d.w.z.50 wormen versus 150) indien nodig aan om binnen het toegewezen tijdsbestek te blijven.
   1. In het geval dat een geëxtrudeerde gonade niet zichtbaar is tijdens de dissectie, probeer dan niet nog een snee in hetzelfde dier. Meestal zal dat alleen het dier scheren en niet resulteren in extrusie van de geslachtsklier. Ga in plaats daarvan verder met het volgende dier. Wormen waarbij de geslachtsklieren niet extruderen, verschijnen als zodanig op de dia's die in sectie 6 worden gemaakt en kunnen worden genegeerd tijdens beeldvorming
      OPMERKING: Door alle ontledings- en verwerkingsstappen is het belangrijk om in gedachten te houden dat de geslachtsklier aan het lichaam / karkas blijft gehecht. Forceer de geslachtsklier en het lichaam niet uit elkaar met de naald. Vaak kan een afwijkende scheur in het gonadale weefsel in een poging om de geslachtsklier van het lichaam te scheiden, resulteren in een vals antilichaamsignaal. Het lichaam / karkas kan worden genegeerd tijdens de beeldvormingsstappen en alleen de geslachtsklier kan worden afgebeeld. Bovendien kunnen de darmcellen soms ook dienen als interne controles/somatische controles voor het antilichaam dat wordt onderzocht.

Figuur 1: Demonstratie van naaldposities tijdens dissecties. Links: Foto van een dissectie in behandeling. Rechts: Naaldposities ten opzichte van de worm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flat bottom glass watch dish	Agar Scientific	AGL4161	We use glass because dissected gonads often stick to plastic
25 G needles	BD PrecisionGlide	305122
Syringes (could be 1 or 5 mL)	BD Syringes	1 mL: BD 309659
Microscope slides (25 x 75 x 1.0 mm)	Fisherbrand	12-550-343
Clinical bench top centrifuge
*M9 solution
Levamisole	Sigma	L9756
*M9 Buffer Recipe			3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L.