C. 埃莱甘斯 戈纳德挤压：快速解剖技术

Overview

此视频描述了一种从成人 C. elegans 草药中解剖性腺的方法，从而产生适合免疫染色和荧光成像的组织。

Protocol

本协议摘自格瓦斯和阿鲁尔，空间和时间分析活跃ERK在C.埃莱甘斯格姆林。J. 维斯(2016).

1. 成人蠕虫的解剖获取性腺体

1. 在 1.5 mL 微中量管中的 100 μL M9 缓冲器中，在所需的特定发育阶段（L1、L2、L3、L4、成人 等）中选择 100 - 150 WT （N2） 或所需的基因型蠕虫。
2. 用 900 μL 的 M9 缓冲器填充微中燃料管（参见 材料表）。在环境温度下，以 1，000 x g 的速度在微中心中将管子离心 1 分钟。
3. 轻轻取出 M9 缓冲器中的 900 μL 并丢弃。在解剖显微镜下取出缓冲器，以确保蠕虫不会意外移除。
4. 每次用新鲜的 M9 缓冲器重复步骤 1.2 - 1.3 两次。这确保了与蠕虫一起携带的任何细菌被有效地冲走。
5. 最后洗涤后，从管中取出 900 μL 的 M9 缓冲器并丢弃。
6. 将剩余的 100 μL M9 缓冲器（包含 100 - 150 蠕虫）与 200μL 微皮尖转移到平底玻璃表盘中。确保在使用前在 10 μL 标记处切割微皮尖。不切尖会导致蠕虫的剪切。
7. 在含有 M9 缓冲器中的蠕虫的玻璃表盘中加入 1 - 3 μL 的 0.1 M levamisole。轻轻地旋转利瓦米索尔和M9，使均匀混合，直到蠕虫停止移动。
   注： Levamisole 库存可存储在 -20 °C 以进行长期存储。在这里，使用比文献中描述的浓度高1-3米（0.2-0.25米）的列瓦米索尔，以获得动物的快速移动性损失。如果动物在液体悬浮中飞来飞去太久，性腺中导致的dpERK模式可能是可变的（由于压力或缺乏营养或两者兼有）。通过 1 - 3 mM levamisole 进行解剖，实现了更可重复的染色模式。
8. 将两个 25 G 针连接到两个 1 mL 注射器（注射器的大小并不重要，针头的仪表至关重要）。将一个注射器放在每只手上（图1）。
9. 在解剖显微镜下，将每根针放在 图 1 中显示的每根蠕虫下和上面，并在剪刀状运动中将细切放在第二个噬菌体球附近的蠕虫上。在蠕虫一次切开后，移动到下一个动物，直到菜中的所有动物都至少被切一次。
   注： 请注意，步骤 1.8 - 1.9 对时间敏感。在五分钟内解剖菜中的所有蠕虫，以获得可重复的 dpERK 模式。更长的解剖时间将导致 dpERK 信号的关闭，尤其是在区域 1 中。如有必要，调整每轮解剖的蠕虫数量（即50 蠕虫 对 150），以保持在规定的时间范围内。
   1. 如果在解剖过程中看不到挤压的性腺，不要尝试在同一动物中再次切开。通常，这只会剪断动物，不会导致性腺挤压。相反，移动到下一个动物。性腺不挤出的蠕虫会以此类样出现在幻灯片上，该幻灯片将在第 6 节中制作，在成像过程中可以忽略
      注： 通过所有的解剖和处理步骤，重要的是要记住，性腺将保持附着在身体/尸体上。不要用针头强迫性腺和身体分开。通常，在试图切断性腺体从身体的异常撕裂可能会导致虚假的抗体信号。在成像步骤中可以忽略身体/尸体，并且只能对性腺进行成像。此外，有时肠道细胞也可以作为被检测抗体的内部控制/体格控制。

图1：解剖期间针头位置的演示。 左图：过程中解剖的照片。右图：指蠕虫的针头位置。 请单击此处查看此图的更大版本。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flat bottom glass watch dish	Agar Scientific	AGL4161	We use glass because dissected gonads often stick to plastic
25 G needles	BD PrecisionGlide	305122
Syringes (could be 1 or 5 mL)	BD Syringes	1 mL: BD 309659
Microscope slides (25 x 75 x 1.0 mm)	Fisherbrand	12-550-343
Clinical bench top centrifuge
*M9 solution
Levamisole	Sigma	L9756
*M9 Buffer Recipe			3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L.