Overview
Denna video beskriver en teknik för att snabbt screena en enda nematod för en genetisk markör genom PCR screening. I exempelprotokollet screenar vi för CRISPR-baserad genomredigering.
Protocol
Följande protokoll är ett utdrag från Prior et al, A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins, J. Vis. Exp. (2018).
PCR och genotypning med en mask
- Efter 1 - 2 dagars äggläggning överför du F1s till enskilda PCR-bandrörslock som innehåller 7 μL Worm Lysis Buffer med hjälp av en maskplockning(tabell 1, figur 1D, dag 4 - 5).
- Centrifug PCR-rör med maximal hastighet i 1 min vid rumstemperatur för att föra djur till rörbotten och frysa rör vid -80 °C i 1 timme.
OBS: Maskar kan förvaras vid -80 °C på obestämd tid. - Lysfrysta maskar i en termocyklist med följande program: 60 °C i 60 min, 95 °C i 15 min, 4 °C håll.
- Set-up PCR mastermix enligt tabell 2.
- Tillsätt 21 μL PCR mastermix i rena PCR-rör och tillsätt sedan 4 μL masklys från steg 3. Blanda väl med en pipett och kör PCR-program enligt tillverkarens riktlinjer (se Materialtabell).
- Rena PCR-reaktionerna med hjälp av ett DNA Clean and Concentrate-kit enligt tillverkarens instruktioner (se materialtabellen). Eluera DNA genom att tillsätta 10 μL vatten till spinnkolonnen.
- Set-up begränsning enzym mastermix som visas i tabell 3.
- Tillsätt 10 μL av begränsningsenzymet mastermix till varje rengjord PCR-reaktion och inkubera i 1- 2 h vid 37 °C.
- Separera smälta PCR-produkter på en 1,5% agarose gel som körs vid 120 V med 1x Tris-acetat-EDTA (TAE) buffert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1. CRISPR-Cas9 ingenjörskonst avC. eleganssod-1 locus. (A)Schematisk illustration som visar exon-intronstrukturen hos sod-1 locus i C. elegans. Den röda stapeln anger platsen för G93 i exon 3. Primerparet noteras av de röda pilarna (F1-R1). (B) Sekvensjustering av humana och C. elegans (mask) SOD-1 proteiner. De riktade G93-resterna markeras i rött. C) Överstvisas en del av genomiskt DNA som omger G93-kodon som referens, och PAM-platserna (gröna) och sgRNA-mål (blå) markeras. Bottenvisas den enda strandade oligonukleotid (ssODN) homology directed repair (HDR) mallen som innehåller: kodonredigeringen som ändrar G93 till A93, en tyst förändring av PAM-motivet för att förhindra klyvning av sgRNA-Cas9-komplexet, en tyst förändring för att införa en unik HindIII-begränsningsenzymplats (gul låda) och flankerande 5' och 3' 50 bp homologi armar (svarta staplar). Alla nukleotidförändringar som är utformade i ssODN är markerade röda. (D) Schematisk illustration av rörledningen för generering och identifiering av CRISPR-Cas9 RNP-baserade punktmutanter. På dag 0, injicera 10 - 15 P0 djur med injektionsblandning. På dag 2 - 3, identifiera framgångsrikt injicerade P0 djur av dem som innehåller fluorescerande F1 avkomma, och välj tre P0 plattor med den mest fluorescerande avkomman. Från var och en av de tre P0-plattorna, enstaka 8 fluorescerande F 1-avkomma. På dag 4 - 5, (a) steg 1 plockas enskilda F1s och placeras i PCR-rör som innehåller Lysis Buffer; b) Steg 2, efter frysning vid -80 °C, lyss PCR-rör som innehåller F1-maskar för att frigöra genomiskt DNA, som används som PCR-mall. PCR-produkterna rengörs och smälts sedan med det unika restriktionsenzymet; c) Steg 3, enzymsmälta produkter löses på en agarosgel där vilda typer (+/+), heterozygösa (m/+) och homozygösa (m/m) djur kan identifieras genom begränsningsmönster för smältband. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Reagens | [Slutlig] |
| KCl (kcl) | 50 mM |
| Tris-HCl pH 8,3 | 10 mM |
| MgCl2 (olika) | 2,5 mM |
| NP-40 | 0.45% |
| Interpolering-20 | 0.45% |
| Proteinas K | 1 mg/ml |
Tabell 1. Worm Lysis buffert recept. Proteinas K ska tillsättas färsk före varje användning.
| Reagens | 1x | 24x |
| 2X Q5 Mastermix | 12,5 μL | 300 μL |
| Primer F1 (10 μM) | 1,25 μL | 30 μL |
| Primer R1 (10 μM) | 1,25 μL | 30 μL |
| Mask Lysis | 4 μL | ---- |
| ddH2O (ddH2O) | 6 μL | 144 μL |
| Slutlig volym | 25 μL | 504 μL |
Tabell 2. PCR Mastermix. PCR mastermix bör blandas väl genom pipetting tills lösningen är homogen. 21 μL pcr mastermix ska tillsättas till rena PCR-rör, och sedan ska 4 μL av enskilda masklyat tillsättas korrekt märkta rör.
| Reagens | 1x | 24x |
| 10X enzymbuffert | 2 μL | 48 μL |
| Rengjord PCR-reaktion | 10 μL | ---- |
| ddH2O (ddH2O) | 7 μL | 168 μL |
| Restriktionsenzym (10 U/μL) | 1 μL | 24 μL |
| Slutlig volym | 20 μL | 240 μL |
Tabell 3. Begränsning Enzym Mastermix. Begränsningsenzym mastermix bör blandas väl genom pipetting tills lösningen är homogen. 10 μL av begränsningsenzymet mastermix ska tillsättas till 10 μL rengjord PCR-produkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
