PCR med en mask: En metod för att extrahera och förstärka genomiskt DNA

In This Article

Abstract

Källa: Prior, H., et al. En snabb och facile pipeline för att generera genomiska punktmutanter i C. elegans med CRISPR / Cas9 Ribonucleoproteins. J. Vis. Exp. (2018).

Denna video beskriver en teknik för att snabbt screena en enda nematod för en genetisk markör genom PCR screening. I exempelprotokollet screenar vi för CRISPR-baserad genomredigering.

Protocol

Följande protokoll är ett utdrag från Prior et al, A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins, J. Vis. Exp. (2018).

PCR och genotypning med en mask

Efter 1 - 2 dagars äggläggning överför du F₁s till enskilda PCR-bandrörslock som innehåller 7 μL Worm Lysis Buffer med hjälp av en maskplockning(tabell 1, figur 1D, dag 4 - 5).
Centrifug PCR-rör med maximal hastighet i 1 min vid rumstemperatur för att föra djur till rörbotten och frysa rör vid -80 °C i 1 timme.
OBS: Maskar kan förvaras vid -80 °C på obestämd tid.
Lysfrysta maskar i en termocyklist med följande program: 60 °C i 60 min, 95 °C i 15 min, 4 °C håll.
Set-up PCR mastermix enligt tabell 2.
Tillsätt 21 μL PCR mastermix i rena PCR-rör och tillsätt sedan 4 μL masklys från steg 3. Blanda väl med en pipett och kör PCR-program enligt tillverkarens riktlinjer (se Materialtabell).
Rena PCR-reaktionerna med hjälp av ett DNA Clean and Concentrate-kit enligt tillverkarens instruktioner (se materialtabellen). Eluera DNA genom att tillsätta 10 μL vatten till spinnkolonnen.
Set-up begränsning enzym mastermix som visas i tabell 3.
Tillsätt 10 μL av begränsningsenzymet mastermix till varje rengjord PCR-reaktion och inkubera i 1- 2 h vid 37 °C.
Separera smälta PCR-produkter på en 1,5% agarose gel som körs vid 120 V med 1x Tris-acetat-EDTA (TAE) buffert.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

figure-results-1
Figur 1. CRISPR-Cas9 ingenjörskonst avC. eleganssod-1 locus. (A)Schematisk illustration som visar exon-intronstrukturen hos sod-1 locus i C. elegans. Den röda stapeln anger platsen för G93 i exon 3. Primerparet noteras av de röda pilarna (F1-R1). (B) Sekvensjustering av humana och C. elegans (mask) SOD...