Etanolfixering och DAPI-färgning: En metod för att visualisera DNA i C. elegans

Overview

Här beskriver vi en teknik som används för att visualisera genomiskt DNA i fasta, intakta nematoder. Videon innehåller ett exempelprotokoll för att räkna kromatin i obefruktade C. elegans oocyter.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Clarke et al, Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2018).

Tetraploidstammar kan valideras genom att räkna antalet kromosomer i deras obefruktade oocyter. Fluorescerande mikroskopi kan användas för att screena för antalet kromosompar i obefruktade diploidoocyter (före de meiotiska indelningarna), om stammen har en fluorescerande markör för kromosomer. I avsaknad av fluorescerande kromosommarkörer kan tetraploida nematoder screenas genom att fästa nematoderna och färga med ett DNA-färgämne. Se nedan för ett protokoll för etanolfixering och 4′,6-diamidin-2′-fenylindoldikydroklorid (DAPI) färgning.

Hel djur DAPI färgning

OBS: Tetraploida stammar som transporterar 12 anslutna kromosompar kan valideras genom dapi-färgning av dessa djur och räknar antalet DAPI-kroppar i dess obefruktade oocyter.

1. Placera 5 till 10 μL M9-buffert på en mikroskopbild och överför sedan 6- 10 nematoder till droppen.
2. Under ett dissekerande mikroskop, dra det mesta av M9 från droppen utan att ta bort nematoderna med en luddfri rengöringsvävnad. Tillsätt sedan omedelbart en 10 μL droppe 90% etanol på maskarna. Låt maskarna torka helt, men inte längre än ett par sekunder.
3. Så snart etanolen avdunstar (detta kan ses som det händer under dissekeringsmikroskopet), tillsätt ytterligare 10 μL 90% etanol på maskarna.
4. Upprepa steg 3.1.3 tre gånger till.
5. När den sista droppen etanol har avdunstat, tillsätt 6 μL DAPI- eller Hoechst-färgämne vid rekommenderad slutlig koncentration i det valda monteringsmediet (till exempel en utspädning på 1:1 000 av en 2 ng/μL DAPI-stamkoncentration i M9). För långtidslagring av diabilderna får 0,5% p-fenylendiamin upplöst i 20 mM Tris-HCl, pH 8,8, i 90% glycerol som antifadelösning, istället för endast M9, användas.
6. Täck maskarna på bilden med ett täckskydd och försegla kanterna på täcket med nagellack. Poäng i ett fluorescensmikroskop (steg 3.1.7) minst 10 min efter tillsats av täckglaset. Diabilder utan antifade kan lagras i några dagar vid 4 °C innan du gör mål, men kvaliteten på fluorescensen börjar sjunka efter några dagar.
7. Använd ett fluorescerande mikroskop vid 100X förstoring, poäng antalet enskilda DAPI-kroppar (förmodligen enstaka kromosompar) i den mest mogna ofertiliserade oocyten, som ligger omedelbart intill spermatheca och ännu inte har gått in i spermatheca eller livmodern.
   1. För att få enskilda DAPI-kroppar i en oocytkärna, använd mikroskopets fina fokus för att långsamt flytta från toppen av oocytkärnan till botten under räkningen. Berätta sedan om samma kärna medan du flyttar fokus i motsatt riktning (dvs.från botten till toppen av kärnan) för att bekräfta det räknade antalet DAPI-kroppar.
8. Poäng de mest mogna obefruktade oocyt i var och en av de två gonaderna i minst tio hermafroditer per stabil Lon stam. Vilda typ oocyter har 6 DAPI kroppar i genomsnitt, 5 autosome par och kön kromosom par. Förekomsten av 12 DAPI-kroppar i oocyt av stabila Lon-stammar indikerar att djuren i denna stam antingen är partiella (4 uppsättningar Autosomes, 3 X-kromosomer) eller kompletta (4 uppsättningar autosomer, 4 X-kromosomer) tetraploider.
9. Beräkna det genomsnittliga antalet DAPI-kroppar som observerats från flera (minst 10) äggceller per stam. Vissa kromosompar kommer att röra eller precis ovanpå varandra, så antalet DAPI-kroppar i en oocyt är ofta mindre än det faktiska antalet kromosompar.
10. (Valfritt) Validera ytterligare stabila Lon-stammar där det genomsnittliga antalet DAPI-kroppar är 12 för att testa om de är fulla (4A, 4X) eller partiella (4A, 3X) tetraploider genom immunofluorescensfärgning mot kromosomaxelproteiner som HTP-3. Denna färgning kommer att skilja kromosom par genom att visa ett korsband mönster från enstaka osammanhängande kromosomer som finns i den partiella tetraploid.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting Microscope	Motic Microscopy	SMZ171
Name	Company	Catalog Number	Comments
Staining
Hoechst 33258, Pentahydrate	Biotium	40045
DAPI	Biotium	40011
Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol Fixation
Ethanol, Pure, 190 Proof (95%), USP	Koptec, VWR	89125-166
Name	Company	Catalog Number	Comments
M9 Buffer
Sodium chloride, Biotechnology Grade	VWR	97061-278
Potassium phosphate, Monobasic Anhydrous Grade	VWR	97062-346
Sodium phosphate, monobasic dihydrate	Fisher Scientific	AC271750025