Ethanol-Fixierung und DAPI-Färbung: Eine Methode zur Visualisierung von DNA in C. elegans

Overview

Hier beschreiben wir eine Technik zur Visualisierung genomischer DNA in festen, intakten Nematoden. Das Video enthält ein Beispielprotokoll zur Zählung von Chromatin in unbefruchteten C. elegans Oozyten.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Clarke et al, Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2018).

Tetraploide Stämme können validiert werden, indem die Anzahl der Chromosomen in ihren unbefruchteten Oozyten gezählt wird. Fluoreszierende Mikroskopie kann verwendet werden, um die Anzahl der Chromosomenpaare in unbefruchteten diploiden Oozyten (vor den meiotischen Teilungen) zu überprüfen, wenn der Stamm einen fluoreszierenden Marker für Chromosomen hat. In Ermangelung von fluoreszierenden Chromosomenmarkern können tetraploide Nematoden durch Fixierung der Nematoden und Färbung mit einem DNA-Farbstoff abgeschirmt werden; siehe unten für ein Protokoll für die Ethanolfixierung und Ganztier-Färbung von 4,6-Diamidin-2-Phenylindole-Dihydrochlorid (DAPI).

Ganze Tier DAPI Färbung

HINWEIS: Tetraploide Stämme mit 12 verbundenen Chromosomenpaaren können durch DAPI-Färbung dieser Tiere und Zählen der Anzahl der DAPI-Körper in ihren unbefruchteten Eizellen validiert werden.

1. Legen Sie 5 bis 10 L M9 Puffer auf einem Mikroskopschlitten, dann übertragen Sie 6 - 10 Nematoden auf den Tropfen.
2. Ziehen Sie unter einem Sezierendes Mikroskop den größten Teil des M9 aus dem Tropfen, ohne die Nematoden mit einem fusselfreien Reinigungsgewebe zu entfernen. Dann fügen Sie den Würmern sofort einen Tropfen von 90 % Ethanol von 10 l hinzu. Lassen Sie die Würmer vollständig trocknen, aber nicht länger als ein paar Sekunden.
3. Sobald das Ethanol verdunstet (dies kann unter dem Sezierendes Mikroskop gesehen werden), fügen Sie den Würmern zusätzlich 10 l 90 % Ethanol hinzu.
4. Wiederholen Sie Schritt 3.1.3 noch dreimal.
5. Sobald der letzte Tropfen Ethanol verdampft ist, fügen Sie bei der empfohlenen Endkonzentration in den Montagemedien ihrer Wahl 6 l DAPI- oder Hoechst-Farbstoff hinzu (z. B. eine Verdünnung von 1:1.000 einer DAPI-Lagerkonzentration von 2 ng/L in M9). Zur Langzeitlagerung der Dias dürfen 0,5% p-Phenylendiamin gelöst in 20 mM Tris-HCl, pH 8,8, in 90% Glycerin als Antifade-Lösung anstelle von M9 verwendet werden.
6. Bedecken Sie die Würmer auf der Rutsche mit einem Deckelschlupf und versiegeln Sie die Ränder des Coverslips mit Nagellack. Punktzahl in einem Fluoreszenzmikroskop (Schritt 3.1.7) mindestens 10 min nach Zugabe des Coverslips. Dias ohne Antifade können für ein paar Tage bei 4 °C vor dem Scoring gelagert werden, aber die Qualität der Fluoreszenz beginnt nach ein paar Tagen zu sinken.
7. Mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops bei 100-facher Vergrößerung, bewerten Sie die Anzahl der einzelnen DAPI-Körper (vermutlich einzelne Chromosomenpaare) in der ausgereiftesten unbefruchteten Oozyte, die unmittelbar neben der Spermatheca liegt und noch nicht in die Spermatheca oder Gebärmutter eingedrungen ist.
   1. Um einzelne DAPI-Körper innerhalb eines Eizellenkerns zu bewerten, verwenden Sie den feinen Fokus des Mikroskops, um sich während des Zählens langsam von der Oberseite des Eizellenkerns nach unten zu bewegen. Dann erzählen Sie den gleichen Kern, während Sie den Fokus in die entgegengesetzte Richtung bewegen(d. h.von unten nach oben des Kerns), um die gezählte Anzahl von DAPI-Körpern zu bestätigen.
8. Erzielen Sie die reifste unbefruchtete Oozyte in jedem der beiden Gonaden in mindestens zehn Hermaphroditen pro stabiler Lon-Sorte. Wilde Eizellen haben durchschnittlich 6 DAPI-Körper, 5 Autosome-Paare und das Geschlechtschromosom-Paar. Das Vorhandensein von 12 DAPI-Körpern in der Eizelle stabiler Lon-Stämme zeigt an, dass die Tiere in diesem Stamm entweder partiell (4 Sätze von Autosomen, 3 X-Chromosomen) oder vollständig (4 Sätze von Autosomen, 4 X-Chromosomen) Tetraploiden sind.
9. Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl von DAPI-Körpern, die von mehreren (mindestens 10) Eizellen pro Stamm beobachtet wurden. Einige Chromosomenpaare berühren oder direkt übereinander, so dass die Anzahl der DAPI-Körper in einer Oozyte oft kleiner ist als die tatsächliche Anzahl der Chromosomenpaare.
10. (Optional) Weitere validieren stabile Lon-Stämme, bei denen die durchschnittliche Anzahl von DAPI-Körpern 12 beträgt, um zu testen, ob sie voll (4A, 4X) oder partielle (4A, 3X) Tetraploide sind, indem Sie Immunfluoreszenz-Färbungen gegen Chromosomenachsenproteine wie HTP-3 bilden. Diese Färbung unterscheidet Chromosomenpaare, indem sie ein kreuzförmiges Muster von einzelnen nicht verbundenen Chromosomen zeigt, die im partiellen Tetraploid vorhanden sind.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting Microscope	Motic Microscopy	SMZ171
Name	Company	Catalog Number	Comments
Staining
Hoechst 33258, Pentahydrate	Biotium	40045
DAPI	Biotium	40011
Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol Fixation
Ethanol, Pure, 190 Proof (95%), USP	Koptec, VWR	89125-166
Name	Company	Catalog Number	Comments
M9 Buffer
Sodium chloride, Biotechnology Grade	VWR	97061-278
Potassium phosphate, Monobasic Anhydrous Grade	VWR	97062-346
Sodium phosphate, monobasic dihydrate	Fisher Scientific	AC271750025