乙醇固定和 DAPI 染色：C. elegans中可视化 DNA 的方法

Overview

在这里，我们描述了一种技术，用于可视化基因组DNA在固定的，完整的线虫。该视频包括一个示例协议，以计数未受精 的C.elegans 卵母细胞中的色素。

Protocol

该协议是克拉克 等人的摘录， 操纵普洛伊迪在卡诺哈布迪蒂斯埃莱甘斯， J. Vis. Exp. （2018）.

四倍体菌株可以通过计算未受精卵母细胞中的染色体数量来验证。荧光显微镜可用于筛选未受精双体卵母细胞中的染色体对数（在染色分裂之前），如果菌株有染色体的荧光标记。在没有荧光染色体标记的情况下，可以通过固定线虫和用DNA染料染色来筛选四倍体线虫：有关乙醇固定和全动物 4+，6-二胺-2+-二氢氯化物 （DAPI） 染色的协议，请参阅下文。

整个动物DAPI染色

注： 携带12对相连染色体对的四倍体菌株可以通过DAPI染色这些动物并计算未受精卵母细胞中的DAPI体数来验证。

1. 将 5 到 10 μL 的 M9 缓冲器放在显微镜幻灯片上，然后将 6 - 10 线虫转移到下降处。
2. 在解剖显微镜下，将大部分 M9 从滴中抽取出来，而无需用无绒毛清洁组织去除线虫。然后，立即将 10 μL 的 90% 乙醇下降添加到蠕虫中。允许蠕虫完全干燥，但不超过几秒钟。
3. 乙醇一蒸发（这可以在解剖显微镜下看到），在蠕虫中再添加10微升90%乙醇。
4. 再重复步骤 3.1.3 三次。
5. 一旦最后一滴乙醇蒸发，在所选安装介质中建议的最终浓度中加入 6μL 的 DAPI 或 Hoechst 染料（例如，M9 中 2 ng/μL DAPI 库存浓度稀释 1：1，000）。对于幻灯片的长期存储，0.5% p-苯二胺溶解在 20 mM Tris-HCl 中，pH 8.8，在 90% 甘油中用作抗法德溶液，而不是仅使用 M9。
6. 用盖子盖住滑梯上的蠕虫，用指甲油密封盖片的边缘。添加盖子后至少 10 分钟在荧光显微镜（第 3.1.7 步）中得分。没有防法的幻灯片可以在评分前在 4 °C 存储几天，但几天后荧光质量开始下降。
7. 使用荧光显微镜放大100倍，在最成熟的未受精卵母细胞中对单DAPI体（大概是单染色体对）进行评分，该卵母细胞紧邻精子，尚未进入精子或子宫。
   1. 要在卵母细胞核内对单个 DAPI 体进行评分，请使用显微镜的精细对焦在计数过程中从卵母细胞核顶部缓慢移动到底部。然后，在将焦点向相反的方向（即从原子核的底部到顶部）移动时重新计算相同的原子核，以确认 DAPI 体的计数数。
8. 在两个性腺中，每个性腺中至少10个组织罗狄石（每个稳定的龙株）中得分最成熟的未受精卵母细胞。野生型卵母细胞平均有6个DAPI身体，5个自动体对，和性染色体对。稳定隆菌株的卵母细胞中存在12个DAPI体表明，该菌株中的动物要么是局部的（4组自动体，3条X染色体），要么是完整的（4组自动体，4组X染色体）四倍体。
9. 计算从多个（至少10个）每个菌株观察到的DAPI体的平均数量。有些染色体对会相互接触或相互接触，因此卵母细胞中的 DAPI 体数通常小于染色体对的实际数量。
10. （可选）进一步验证 DAPI 体的平均数量为 12 的稳定 Lon 菌株，以测试它们是否已满 （4A、4X） 或部分 （4A， 3X） 四倍体，通过免疫荧光染色剂染色体轴蛋白（如 HTP-3）。这种染色将区分染色体对，通过显示十字形模式与单个未连接染色体存在于部分四倍体。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting Microscope	Motic Microscopy	SMZ171
Name	Company	Catalog Number	Comments
Staining
Hoechst 33258, Pentahydrate	Biotium	40045
DAPI	Biotium	40011
Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol Fixation
Ethanol, Pure, 190 Proof (95%), USP	Koptec, VWR	89125-166
Name	Company	Catalog Number	Comments
M9 Buffer
Sodium chloride, Biotechnology Grade	VWR	97061-278
Potassium phosphate, Monobasic Anhydrous Grade	VWR	97062-346
Sodium phosphate, monobasic dihydrate	Fisher Scientific	AC271750025