इथेनॉल निर्धारण और DAPI धुंधला: सी elegans में डीएनए कल्पना करने के लिए एक विधि

Overview

यहां, हम एक तकनीक का वर्णन करते हैं जो निश्चित, अक्षुण्ण सूत्रकृमि में जीनोमिक डीएनए की कल्पना करने के लिए उपयोग की जाने वाली है। वीडियो में अनिषेचित सी एलिगेंस ओसाइट्स में क्रोमेटिन की गिनती करने के लिए एक उदाहरण प्रोटोकॉल शामिल है।

Protocol

यह प्रोटोकॉल क्लार्क एट अल, कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस, जे विस एक्सपी (2018) में प्लॉयडी में हेरफेर का एक अंश है।

टेट्राप्लाइड उपभेदों को उनके अनिषेचित ओसाइट्स में गुणसूत्रों की संख्या गिनकर मान्य किया जा सकता है। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग अनिषेचित डिप्लोइड ओसाइट्स (मेयोटिक डिवीजनों से पहले) में गुणसूत्र जोड़े की संख्या के लिए स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है, यदि तनाव में गुणसूत्रों के लिए फ्लोरोसेंट मार्कर होता है। फ्लोरोसेंट गुणसूत्र मार्कर की अनुपस्थिति में, टेट्राप्लॉयड नेमाटोड को नेमाटोड को ठीक करके और डीएनए डाई के साथ धुंधला करके जांचा जा सकता है; इथेनॉल फिक्सिंग और पूरे-पशु 4', 6-डायमिडीन-2'-फेनिलिडोल डाइहाइड्रोक्लोराइड (DAPI) धुंधला के लिए एक प्रोटोकॉल के लिए नीचे देखें।

पूरे जानवर DAPI धुंधला

नोट: 12 कनेक्टेड क्रोमोसोम जोड़े ले जाने वाले टेट्राप्लाइड उपभेदों को इन जानवरों को धुंधला करके और अपने अनिषेचित ओसाइट्स में डीएपीआई निकायों की संख्या की गिनती करके मान्य किया जा सकता है।

1. एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर M9 बफर के 5 से 10 μL रखें, फिर ड्रॉप करने के लिए 6 -10 सूत्रकृमि स्थानांतरित करें।
2. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, एक लिंट मुक्त सफाई ऊतक के साथ सूत्रकृमि को हटाने के बिना ड्रॉप से M9 के अधिकांश आकर्षित । फिर, तुरंत कीड़े पर 90% इथेनॉल की 10 माइक्रोन ड्रॉप जोड़ें। कीड़े को पूरी तरह से सूखने दें, लेकिन कुछ सेकंड से अधिक समय तक नहीं।
3. जैसे ही इथेनॉल वाष्पित हो जाता है (इसे देखा जा सकता है क्योंकि यह विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत होता है), कीड़े पर 90% इथेनॉल का अतिरिक्त 10 माइक्रोल जोड़ें।
4. दोहराएं चरण 3.1.3 तीन बार।
5. एक बार इथेनॉल की अंतिम बूंद सुखाया है, पसंद के बढ़ते मीडिया में अनुशंसित अंतिम एकाग्रता पर DAPI या Hoechst डाई के 6 μL जोड़ें (उदाहरण के लिए, M9 में एक 2 एनजी/μL DAPI स्टॉक एकाग्रता के एक 1:1,000 कमजोर पड़ने) । स्लाइड्स के दीर्घकालिक भंडारण के लिए, 20 एमएम ट्राइस-एचसीएल, पीएच 8.8 में भंग 0.5% पी-फेनीलेन्डिमाइन, 90% ग्लाइस्रोल में एंटीफैड समाधान के रूप में, केवल एम 9 के बजाय, उपयोग किया जा सकता है।
6. स्लाइड पर कीड़े को कवरलिप के साथ कवर करें और नेल पॉलिश के साथ कवरस्लिप के किनारों को सील करें। कवरस्लिप जोड़ने के बाद कम से कम 10 मिनट में फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप (चरण 3.1.7) में स्कोर करें। बिना एंटीफैड के स्लाइड स्कोरिंग से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर कुछ दिनों के लिए स्टोर किया जा सकता है, लेकिन कुछ दिनों के बाद फ्लोरेसेंस की गुणवत्ता में गिरावट शुरू हो जाते हैं।
7. 100X आवर्धन पर फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, सबसे परिपक्व अनिषेचित ओसाइट में एकल डीएपीआई निकायों (संभवतः एकल गुणसूत्र जोड़े) की संख्या स्कोर करें, जो तुरंत शुक्राणुओं के निकट है और अभी तक शुक्राणु या गर्भाशय में प्रवेश नहीं किया है।
   1. एक ओसाइट नाभिक के भीतर व्यक्तिगत DAPI निकायों स्कोर करने के लिए, माइक्रोस्कोप ठीक ध्यान का उपयोग करने के लिए गिनती के दौरान नीचे करने के लिए oocyte नाभिक के ऊपर से धीरे-धीरे चलते हैं । फिर, DAPI निकायों की गिनती संख्या की पुष्टि करने के लिए विपरीत दिशा में ध्यान केंद्रित करते समय(यानी,नाभिक के नीचे से ऊपर तक) को याद करें।
8. स्थिर लोन तनाव के अनुसार कम से कम दस हर्मेफ्रोडाइट्स में दो गोंड़ में से प्रत्येक में सबसे परिपक्व अनिषेषित ओसाइट स्कोर करें। वाइल्ड टाइप ओसाइट्स में औसतन 6 डैपी बॉडी, 5 ऑटोसोम जोड़े और सेक्स क्रोमोसोम जोड़ी होती है। स्थिर लॉन उपभेदों के ओसाइट में 12 DAPI निकायों की उपस्थिति इंगित करती है कि इस तनाव में जानवर या तो आंशिक (ऑटोसोम्स के 4 सेट, 3 एक्स-क्रोमोसोम) या पूर्ण (ऑटोसोम्स के 4 सेट, 4 एक्स-क्रोमोसोम) टेट्राप्लॉइड हैं।
9. कई (कम से कम 10) oocytes प्रति तनाव से मनाया DAPI निकायों की औसत संख्या की गणना करें। कुछ गुणसूत्र जोड़े एक-दूसरे के शीर्ष पर छू या सही होंगे, इसलिए एक ओसाइट में दापी निकायों की संख्या अक्सर गुणसूत्र जोड़े की वास्तविक संख्या से छोटी होती है।
10. (वैकल्पिक) इसके अलावा स्थिर लोन उपभेदों को मान्य करें जहां डीएपीआई निकायों की औसत संख्या यह परीक्षण करने के लिए 12 है कि क्या वे पूर्ण (4A, 4X) या आंशिक (4A, 3X) टेट्राप्लॉइड हैं, जो एचटीपी-3 जैसे गुणसूत्र धुरी प्रोटीन के खिलाफ धुंधला हैं। यह धुंधला आंशिक टेट्राप्लाइड में मौजूद एकल असंबद्ध गुणसूत्रों से एक क्रूसिफॉर्म पैटर्न दिखाकर गुणसूत्र जोड़े को अलग करेगा।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting Microscope	Motic Microscopy	SMZ171
Name	Company	Catalog Number	Comments
Staining
Hoechst 33258, Pentahydrate	Biotium	40045
DAPI	Biotium	40011
Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol Fixation
Ethanol, Pure, 190 Proof (95%), USP	Koptec, VWR	89125-166
Name	Company	Catalog Number	Comments
M9 Buffer
Sodium chloride, Biotechnology Grade	VWR	97061-278
Potassium phosphate, Monobasic Anhydrous Grade	VWR	97062-346
Sodium phosphate, monobasic dihydrate	Fisher Scientific	AC271750025